PROTOCOLO PARA LA DETERMINACIN DE DEMANDA BIOQUIMICA DE OXIGENO

1. OBJETO. Describir la metodologa a seguir para determinar la demanda bioqumica

de oxgeno, DBO5 en aguas.
2. APLICACIN. El ensayo de los 5 das de incubacin para determinar DBO (SM
5210 B) es aplicable en muestras de agua superficial, marinas, subterrneas,
residual industrial y domstica.
El anlisis de DBO se requiere en los anlisis de aguas residuales para valorar los
efectos de las descargas de los efluentes domsticos e industriales sobre la
calidad de los cuerpos receptores; asimismo, para evaluar la eficiencia de remocin
de los sistemas de tratamiento y para el control de contaminacin de corrientes.
Los datos de la prueba de DBO se utilizan en ingeniera para disear las plantas de
tratamiento de aguas residuales.
3. DEFINICIONES.
DBO (Demanda Bioqumica de Oxgeno): es una medida de la cantidad de oxgeno
requerido para degradar la materia orgnica de una muestra de agua, por medio de una
poblacin microbiana heterognea. La informacin obtenida en la prueba corresponde
a la materia orgnica biodegradable.
Degradar: transformar una sustancia compleja en otras de constitucin ms sencilla.
Materia orgnica: comprende a las molculas naturales y artificiales que contienen
carbono e hidrgeno. Cantidad de sustancia orgnica en el efluente que ejerce un efecto
adverso en el cuerpo receptor de agua.
Inoculacin: adicin de microorganismos a un sitio contaminado, los cuales pueden
adicionarse junto con nutrientes.
4. FUNDAMENTO DEL MTODO:
La prueba de la DBO es un procedimiento experimental, tipo bioensayo, que mide el
oxgeno requerido por los organismos en sus procesos metablicos al consumir la materia
orgnica presente en las aguas residuales o naturales. Las condiciones estndar del
ensayo incluyen incubacin en la oscuridad a 20C por un tiempo determinado,
generalmente cinco das. Las condiciones naturales de temperatura, poblacin biolgica,
movimiento del agua, luz solar y la concentracin de oxgeno no pueden ser reproducidas
en el laboratorio. Los resultados obtenidos deben tomar en cuenta los factores anteriores
para lograr una adecuada interpretacin.
Las muestras de agua residual o una dilucin conveniente de las mismas, se incuban por
cinco das a 20C en la oscuridad. La disminucin de la concentracin de oxgeno disuelto
(OD) durante el periodo de incubacin, produce una medida de la DBO.

5. LIMITACIONES E INTERFERENCIAS:
Existen numerosos factores que afectan la prueba de la DBO, entre ellos la relacin de la
materia orgnica soluble a la materia orgnica suspendida, los slidos sedimentables, los
flotantes, la presencia de hierro en su forma oxidada o reducida, la presencia de
compuestos azufrados y las aguas no bien mezcladas. Al momento no existe una forma
de corregir o ajustar los efectos de estos factores.
La oxidacin de las formas reducidas del nitrgeno como amoniaco y nitrgeno orgnico,
mediada por los microorganismos, ejercen una demanda nitrogencea, que ha sido
considerada como una interferencia en la prueba; sin embargo, esta puede ser eliminada
con la adicin de inhibidores qumicos. Cuando se inhibe la demanda nitrogencea de
oxgeno, se reportan los resultados como demanda bioqumica de oxgeno carboncea
(DBOC5); cuando no se inhibe, se reportan los resultados como DBO5.
6. TOMA Y PRESERVACIN DE MUESTRAS:
Muestras simples. Si el anlisis se inicia en el intervalo de 2 h despus de la recoleccin
no es necesario refrigerarlas; de lo contrario, guardar la muestra a 4C o menos.
Comenzar el anlisis dentro de las 6 horas de la recogida de la muestra, y cuando el
sitio de muestreo es distante del laboratorio y el anlisis no se puede comenzar
dentro de las 6 horas de la recogida se debe almacenar a 4C y reportar con los
resultados el tiempo y la temperatura de almacenamiento. En ningn caso iniciar el
anlisis despus de 24 horas de haber tomado la muestra.
Muestras compuestas. Mantener las muestras a 4C o menos durante el proceso de
composicin, que se debe limitar a 24 h. Aplicar los mismos criterios que para las
muestras sencillas, contando el tiempo transcurrido desde el final del perodo de
composicin. Especificar el tiempo y las condiciones de almacenamiento como parte de
los resultados.
7. MATERIALES Y EQUIPOS
- Botellas Winkler de 300 mL de capacidad, lavadas con detergente, enjuagadas
varias veces, y escurridas antes de utilizarlas.
- Incubadora DBO HACH modelo 205, a 20 1 C.
- Probeta de 1000 mL para medir el agua de dilucin.
- Balones Clase A de volumen adecuado para medir las muestras y preparar diluciones
cuando se requiera.
- Pelcula y tapa plstica para botellas Winkler.
- Varias pipetas graduadas y aforadas, preferiblemente estriles, para dosificar los
nutrientes
- Frasco lavador con agua desionizada

- Balanza analtica
- pHmetro con termmetro
- Dispositivo oxigenador con manguera

Mtodo Electrodo de Membrana SM 4500 - O G

- Oxmetro YSI ProODO.

- Buffer de fosfatos. Para un litro de solucin: Disolver 8,5 g KH 2PO4, 21,75 g de K2HPO4 ,
33,4 g Na2HPO4.7H2O, y 1,7 g NH4Cl en unos 500 mL de agua destilada y diluir a 1
litro. El pH debe estar en 7,2 sin ms ajustes, debe almacenarse siempre en la nevera
a 4 C. Descartar cualquier reactivo si se ve alguna seal de crecimiento biolgico en la
botella stock. Alternativamente disolver 42.5 g de KH2PO4 y 1.7 g de NH4Cl en cerca
de 700 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con NaOH al 30% y diluir a 1 L. Para
preparar 500 mL: Disolver 4.25 KH 2PO4, 10.875 g de K 2HPO4, 16.7 g
Na2HPO4.7H2O, y 0,85 g NH4Cl en unos 250 mL de agua desionizada y diluir a 500 mL.
Alternativamente disolver 21.25 g de KH2PO4 y 0.85 g de NH4Cl en cerca de 350 mL de
agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con NaOH al 30% y diluir a 1 L.
- Solucin de Sulfato de magnesio. Para un litro de solucin, disolver 22,5 g MgSO 4.7H2O
en agua destilada y diluir a 1 litro. Para preparar 500 mL, disolver 11,25 g de
MgSO4.7H2O en agua destilada y diluir a 500 mL.
- Solucin de Cloruro de calcio. Para un litro de solucin, disolver 27,5 g CaCl 2 en
agua destilada y diluir a 1 litro. Para preparar 500 mL, disolver 13.75 g de CaCl 2 en
agua destilada y diluir a 500 mL.
- Solucin de Cloruro frrico. Para un litro de solucin, disolver 0,25 g FeCl 3.6H2O
o 0,15 g FeCl3 en agua destilada y diluir a 1 litro. Para preparar 500 mL, disolver
0,125 g FeCl3.6H2O o 0,075 g FeCl3 en agua destilada y diluir a 500 mL.
- Solucin cida 1 N. Se utiliza para neutralizar las muestras en el rango de 6,5 7,5
unidades. Aada lentamente 28 mL de H2SO4 concentrado al agua destilada y diluya a
1litro.
- Solucin alcalina 1N. Se utiliza para neutralizar las muestras en el rango de 6,5 7,5
unidades. Disolver 40 g de NaOH en agua destilada y diluir a 1litro.

- Solucin de sulfito de sodio. Se utiliza para eliminar el cloro residual de las muestras.
Disolver 1,575 g de Na2SO3 en 1litro de agua destilada. Preparar diariamente, pues esta
solucin no es estable.

- Solucin de glucosa - cido glutmico: Secar glucosa y cido glutmico grado

reactivo a 103 C por una hora. Aadir 150 mg de glucosa y 150 mg de cido
glutmico a agua desionizada y diluir hasta 1litro. Preparar solucin fresca o conservar
a 4 C o menos por no ms de 1 semana. Esta solucin tiene una DBO5 terica de
aproximadamente 198 30.5 mg/L.
- Agua de dilucin: usar agua destilada o desionizada para realizar las diluciones de las
muestras.
8. PROCEDIMIENTO:
Preparacin de agua de dilucin: Transferir agua desionizada en cantidad suficiente
(para las diluciones, los controles y duplicados) a recipiente plstico de 20L con llave
dosificadora. Adaptar dispositivo oxigenador con manguera; la manguera debe quedar
sumergida en el agua, guardar en incubadora de DBO a 20C con el oxigenador
conectado, oxigenar agua a esas condiciones mnimo por 2 horas. Antes de iniciar el
procedimiento, chequear que el oxgeno disuelto est en al menos 7,5 mg/L; si esto no
se cumple, seguir aireando hasta conseguir un valor igual o superior a una temperatura
de 20 3 C. Agregar 1 mL de cada una de las siguientes soluciones: buffer de fosfato,
solucin de sulfato de magnesio, solucin de cloruro de calcio y solucin de cloruro frrico
por cada litro de agua destilada para proporcionar los nutrientes y el pH adecuado
para el crecimiento bacterial dentro de las botellas;
Si el agua de dilucin muestra un consumo mayor a 0,20 mg/L a los cinco das, se debe
mejorar la calidad de la misma o usar agua de otra fuente.
Preparacin de oxmetro: calibracin oxmetro YSI ProOBO: verificar que el equipo est
limpio y en buen estado, retirar protector de sonda. Tomar una botella Winkler y llenar
hasta un tercio de su capacidad con agua, tapar y agitar por 20 segundos para saturar el
aire en su interior. Paralelamente, encender el equipo, esperar a que muestre lectura
estable y luego presionar el botn Cal, seleccionar la opcin OD, presionar Enter,
seleccionar DO%, presionar Enter, introducir sonda en la botella previamente agitada,
observar lecturas y con la tabla del Apndice A Valores de calibracin de OD% del
manual del equipo, interpolar con la presin baromtrica reportada el valor
correspondiente de D.O.% (como la presin ambiente oscila entre 700 730 mmHg, el
porcentaje de saturacin lo obtenemos multiplicando el valor de la presin dada por el
equipo por 0.1316 segn una regresin de datos hecha en dicho intervalo de presiones
con datos del apndice A), esperar a que se estabilice y al momento de coincidir la
presin con la D.O.%, presionar el botn Enter para aceptar la calibracin.
Pretratamiento y preparacin de la muestra:
Llevar las muestras a 20 3 C antes de efectuar la prueba. Agitar suavemente la
muestra. Verificar pH; si este no se encuentra entre 6.0 y 8.0 ajustar el pH entre 7.0 y 7.2
usando una solucin de cido sulfrico o hidrxido de sodio de tal fuerza que no diluya la
muestra en ms del 0.5%.

Preparacin del blanco:

Llenar tres botellas Winkler con agua de dilucin, luego proceder de manera similar a la
lectura del oxgeno disuelto como se explica en la seccin de Preparacin de las
muestras.
Preparacin del control:
Proceder de manera similar que en la seccin Preparacin de las muestras.
Preparacin de las muestras (diluciones): De acuerdo al tipo de agua, establecer la
dilucin aproximada de la misma, de tal manera que presenten un consumo de oxgeno
de al menos 2.0 mg/L y un oxgeno residual superior a 1,0 mg/L despus de los 5 das de
incubacin. Utilizar los siguientes porcentajes y volmenes de dilucin cuando se
preparen las diluciones:
Tipos de aguas
Residuales
industriales fuertes
Residuales crudas y
tratadas
Efluentes tratados
biolgicamente
Superficiales
contaminadas

% de dilucin
0.01 a 1

mL de dilucin
0.03 - 3

1a5

3 - 15

5 a 25

15 - 75

25 a 100

75 - 300

Realizar al menos tres diluciones de la muestra con diferentes volmenes. Marcar cada
botella con el cdigo de muestra, la dilucin preparada y la fecha de lectura. Adicionar la
cantidad de muestra apropiada a cada botella. Llenar aproximadamente a dos tercios de
su capacidad total con agua de dilucin, luego adicionar 2 mL de suspensin con
microorganismos si es necesario (para muestras que no contengan una poblacin
microbiana suficiente, por ejemplo: efluentes industriales sin tratamiento, aguas
desinfectadas, efluentes con elevada temperatura o con valores extremos de pH; esta
suspensin puede ser agua residual domstica clarificada o superficial), en caso contrario
continuar llenado hasta la mitad del cuello de la botella para que al introducir el electrodo
y/o la tapa no haya prdida de muestra. Introducir sonda de oxgeno disuelto, evitando
prdida alguna de muestra, presionar el botn Enter del oxmetro YSI, esperar a que
estabilice la lectura y repetir hasta que el mismo valor sea reportado por el equipo dos
veces, registrar el volumen del inculo agregado, en el formato AM-FR-06 Determinacin
de DBO5 das y OD por electrodo de membrana SM 5210 B, 4500 O-G. Tapar botella,
sellar con pelcula y tapa plstica para evitar intercambio de oxgeno con el ambiente,
guardar en incubadora de DBO HACH modelo 205 a una temperatura de 20 1C por 5
das 6 h.

Determinacin final de oxgeno disuelto: despus de 5 das 6 h., determinar oxgeno

disuelto en todas las diluciones, blancos y controles, con oxmetro YSI, de la misma forma
en que se midi al momento previo de incubar las botellas.
Clculos:
1. Para cada botella que tenga una disminucin de OD mnima de 2.0 mg/L y por
encima de 1.0 mg/L de OD residual, calcular la DBO como sigue:

DB O5 , mg/L=

( D 1D2 )( S ) V s
P

Donde:
D1= OD de la muestra diluida al inicio, mg/L
D2 = OD de la muestra despus de 5 das de incubacin a 20C, mg/L
S = absorcin de oxgeno por los microorganismos, OD/ mL suspensin de
microorganismos adicionada por botella (S = 0 si las muestras no han sido sembradas).
Vs = Volumen de semilla en la respectiva botella, mL.
P = fraccin volumtrica de la muestra (1/P = factor de dilucin).
2. Si el consumo de OD es menor a 2 mg/L y la muestra no tiene dilucin (aunque
tenga inculo y soluciones), el clculo de la disminucin puede ser reportado como
su DBO.
3. Cuando todas las diluciones tienen un OD residual menor a 1 mg/L, seleccionar la
botella que tenga el ms bajo valor de OD (la mayor dilucin), realizar el clculo y
reportar como DBO > (mayor a) el clculo realizado con base en la ecuacin:

DB O 5 , mg /L>

( D 1D2 ) ( S ) V s
P

Reporte de resultados: Promediar el resultado de las pruebas para todas las botellas
calificadas dentro de cada serie de diluciones.