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EXTRACTO:
Las clulas epiteliales alveolares del tipo II (AEII), son una estructura clave de defenza, pero tambin son
objetivo en muchas enfermedades pulmonares, como el sndrome agudo respiratorio, como en una
lesin pulmonar inducida por el ventilador, y fibrosis pulmonar. Wesought a establecido un mtodo
ptimo para el alto mantenimiento, rendimiento y una lista larga de caractersticas de las clulas AEII, y
as facilitar la investigacin de los mecanismos de las enfermedades pulmonares a diferentes niveles.
Los tejidos normales perifricos humanos de pulmn, de pacientes con cncer, se recogieron mediante
reseccin. Se aislaron las clulas AEII e identificaron la expresin de la protena pro-surfactante (SP) C,
canal de sodio epitelial (aENaC) y citoqueratina (CK) -8, los cuerpos lamelares especficos para las
clulas AEII, y fueron confirmados por estudios histolgicos mediante microscopa electrnica. Las
clulas de fenotipo AEII se caracterizan por la expresin de protenas pro-surfactantes (SP-A, SP-B, SPC, SP-D), CK-8, KL-6, aENaC, y acuaporina (AQP) -3.Se ha optimizado un mtodo para el aislamiento,
de alta pureza y largo mantenimiento, del fenotipo humano de clulas AEII en cultivo primario. Este
mtodo proporciona una herramienta importante para estudios destinados a los mecanismos
moleculares de las enfermedades pulmonares exclusivamente en clulas AEII.
INTRODUCCIN:
El epitelio alveolar de pulmn, est compuesto de clulas de tipo I y tipo II ( Mason 2006 ). Las
clulas epiteliales alveolares tipo II ( AEII ) son cbicas, y constituyen el 60 % de todo el tejido.
Estas, desempean un papel importante en el mantenimiento de la funcin integral del alveolo
pulmo nar ( Driscoll et al., 1995 ) , y sirven como progenitoras de las clulas AEI que
contribuyen a la reparacin del epitelio alveolar ( UHAL 1997 ; Fehrenbach 2001 ) . Las clulas
AEII son consideradas defensoras de los alvolos, dadas sus funciones fisiolgicas y
biolgicas, como sintetizar, segregar y reciclar los componentes del surfactante que controla la
tensin superficial alveolar. Las clulas AEII regulan el transporte de iones de sodio del epitelio
al despacho de fluidos alveolares; modulan el equilibrio de la fibrinolisis y la coagulacin; por lo
tanto, contribuyen a la defensa del sistema husped. Las clulas AEII no slo guan los
neutrfilos en el espacio alveolar durante su emigracin; sino, actuan como clulas efectoras
mediante la interaccin con clulas mviles, ya sea directamente por el contacto clula-clula o
indirctamente por contacto ligando-receptor a travs de la liberacin de citoquinas y factores
de crecimiento. Las AEII son particularmente vulnerables a la tensin mecnica, como se
evidencia en el sndrome de distrs respiratorio agudo (SDRA) y en la lesin pulmonar inducida
por el ventilador.
Para comprender los mecanismos de SDRA y la lesin pulmonar inducida por el ventilador a
nivel celular y molecular, nuestros investigadores se centraron en la mecano-transduccin, la
reparacin y el fenotipo de transicin; esto se realiz utilizando clulas epiteliales bronquiales
humanas (es decir, BEAS-2B), clulas AEII (es decir, A549), o clulas AEII primarias, de
roedores. En varios, han surgido preocupaciones acerca de las diferencias de activacin de las
vas de seal observadas entre las clulas bronquiales y las clulas del epitelio alveolarl, la
prdida de fenotipo de clulas AEII humana en als lneas celulares transformadas y clulas de
las diferentes funciones de AEII, entre humanos y animales. Distintos grupos han desarrollado
mtodos para aislar clulas AEII en cultivos primarios. En diferentes condiciones de cultivo, las
clulas AEII primarios tendieron a diferenciarse en clulas AEI demostrando, hasta la fecha,
dificultad en mantener las clulas AEII humanas en cultivos surfactantes. Para superar los
problemas mencionados anteriormente, se combin tcnicas anteriores modificandolas
(Ehrhardtet al., 2005; . Yu et al 2007;. Bove et al 2010) para para clulas humanas AEII de la
periferia del tejido pulmonar libre de tumores, de los pacientes sometidos a la reseccin
pulmonar. Nuestro enfoque se centra en la mejora y el mantenimiento del fenotipo de las
clulas AEII y su funcin.
MTODOS:
El estudio fue aprobado por el Consejo tico de Investigacin del Primer Hospital Afiliado de la
Universidad Mdica de Guangzhou (201.232) para el uso del aislamiento material humano de
clulas AEII primarios. Las muestras y mtodo de aislamiento fueron establecidos por la
adaptacin y modificacin de varios protocolos anteriores. En condiciones estriles, la muestra
de las porciones distales de tejido pulmonar normal (6-10 g) se obtuvo de los pacientes
sometidos a reseccin pulmonar. La muestra se cort en 1 cm3 de tamao y se lava con buffer
HEPES solucin salina balanceada (BSS) hasta que se aclare. Las piezas de pulmn se picada
(0,5 mm3) con unas tijeras ojo y luego se transfirieron a un vaso de precipitados esterilizado
que contiene 50 ml de BSS. Despus de mezcla suave, la solucin de tejido se filtr pasando
througha malla (150 lm) filtro de clulas. El tejido restante se lav al menos tres veces, y se
incub en una solucin que contiene 3 ml de tripsina (10.000 U / ml; Sigma, Saint Louis, MO) y
300 LL de la elastasa (5,1 U / ml; Worthington, Lakerwood, NJ) durante 45 minutos en un bao
de agua con agitacin a 37 C. DNasa I en 2 mL (10000 U / ml, Sigma, Saint Louis, MO)
durante 15 min. La actividad enzimtica se detuvo utilizando 40 ml solucin de inhibicin (30 ml
DMEM / F-12, 1: 1, Invitrogen; GrandIsland, NY 10 ml de FBS y 1 ml de DNasa I 10000 U / ml)
.La suspensin digerida despus se diluy mediante la adicin de 400 ml BSS y whiffled a
fondo durante 10 min con una pipeta Pasteur. La suspensin se filtr a travs de clulas
formadores en el tamao de 150, 75, y 40 lm en tndem para recaudar los de la suspensin
celular en bruto. Despus de la centrifugacin AT400 g durante 10 min a aire de la habitacin,
el sedimento celular se resuspendi en medio de adhesin para macrfagos y fibroblastos
(22,5 ml DMEM / F-12, 1: 1; 22,5 ml manera de aire pequeo medio de crecimiento de clulas
epiteliales, SAGM, Lonza, Walkersville, MD; 5 ml de FBS y 1 ml de DNasa I 10000 U / ml) y se
transfiri a 100 mm placas de Petri (10 ml de cada uno) .Despus de la incubacin a 37 C
durante 150 min, un tiempo optimizado de nuestros estudios piloto, los macrfagos y las
fibroblastos adjuntos en los platos de cultivo celular fueron separados de las clulas epiteliales
que tuvieron ms tiempo para ser adjunta enel medium.This procedimiento de adhesin
diferencial se repiti tres veces, y luego las clulas se recogieron AEII suavemente y se
centrifug a 300 g durante 10 min a aire de la habitacin . Los sedimentos celulares se
resuspendieron en 3 ml de DME / F12 y la suspensin celular en bruto se estratific en un
1,040 a 1,089 g / ml gradientes discontinuos de Percoll. Una solucin de 40 ml de un gradiente
de luz (1,040 g / ml) contena 4 ml de PBS 109,12.55 ml de solucin de Percoll, y 23,45 ml de
agua destilada. Una solucin de 40 ml gradiente pesado (1,089 g / ml) contena 4 ml de PBS
solucin 109,25.96 ml de Percoll (MP Biomedical), 10,04 ml. agua destilada, y una gota de rojo
de fenol. Cada solucin en 3 ml de volumen se carg suavemente en FBS del 15-mLcentrifuge
tubos, seguido por centrifugacin a 300 g durante 20 min a 4 C utilizando un batiente rotor
para generar una capa enriquecida de clulas AEII en la interfaz entre los dos capas de
gradientes de Percoll. La desaceleracin se logr mediante la desconexin de la alimentacin
cuando se alcanz el tiempo de centrifugacin deseado. Los sedimentos celulares enriquecidas
se transfirieron a un tubo de centrfuga de 15 ml que contena 13 ml de BSS y se centrifugaron
dos veces a 300 g durante 10 min a aire de la habitacin. Los grnulos de clulas se
resuspendieron en 2 ml de BSS y un enfoque de separacin de perlas magnticas se aplic
para eliminar cualquier posible contaminacin de los macrfagos (anti-CD14 microbolas;
Miltenyi Biotec, Bergisch Glad-Bach, Alemania). Las clulas AEII aisladas se centrifugaron a
300 g durante 10 min a aire de la habitacin, se resuspendieron en 2 ml. SAGM que contiene
1% de SFB, y se incubaron en
Tabla 1. Comparacin de los diferentes protocolos utilizados para el aislamiento de clulas AEII
humanos.
Protocolo
Tejido
Perfusin
Tampn de
digestin
Filtracin
Eliminacin de
fibroblastos
Eliminacin de
macrfagos
Estudio actual
Referencia Yu et al
(2007)
Porciones distales
de tejido pulmonar
normal, de cncer de
pulmn sometidos a
reseccin pulmonar
No aplicado
Pulmn Cadaveric
disminuido en red de
donantes
El uso de tripsina (
10.000 U / ml) para
picar el tejido
pulmonar, y elastasa
( 5 U / ml) para la
digestin
150 , 75 y 40 lm en
tndem
Medianas
adherencia, 150 min
3 veces
El medio de cultivo
Perlas magnticas
medio Adhesin anti
- CD14
SAGM+1%FBS
Morfologa
Quistes alveolares
Marcadores de
clulas
Cuerpos lamelares ,
SP -A, SP- B , SP -C
, SP -D; Cytokaretin 8, KL -6, AQP - 3
12 , 21, 28 das
Perfusin de la
arteria pulmonar
El uso de 13 U / ml
de elastasa para la
digestin
150 , 30 lm en
tndem
NO
Perlas magnticas
anti - CD14
MEM + 10 % FBS +
2 % de alto factor de
crecimiento matrigel
Quistes alveolares
Cuerpos lamelares
de Papanicolaou ,
Prosp -C
4 das
Referencia
Ehrhardt et al.
(2005)
Porciones distales
de tejido pulmonar
normal de cncer de
pulmn sometidos a
reseccin pulmonar
No aplicado
El uso de tripsina (
10.000 U / ml) para
picar el tejido
pulmonar, y elastasa
( 60 U / ml) para la
digestin
40 lm
Medianas
adherencia, 90 min
perlas magnticas,
una vez, y antifibroblastos
Adhesin medio anti
- CD14
SAGM
Referencia Bove et
al. (2010)
Pulmonares
normales rechazada
para el trasplante
150 , 40 lm en
tndem
NO
IgG platos
recubiertos con
anticuerpos
DMEM+10%FBS
Epiteliales alveolares
tipo I
Papanicolaous
guijarro
6-10 das
5 das
Cuerpos lamelares ,
Prosp -C
Longitud del
producto
SP-C
Sentido
CTCATCGTCGTGGTGATTGTTG
Antisentido
TGGAGAAGGTGGCAGTGGT
154 bp
SP-A
Sentido
CGACTTTAGACATCAAATCCTGC
Antisentido
CTCGGTACCAGTTGGTGTAGTTT
305 bp
SP-A
Sentido
CAGGTAGTGTTCCAGCAGGGTG
Antisentido
ATCTGAAGGCGGCTCTAGGTCA
149 bp
SP-B
Sentido
AGAGCAGGAGCCAGGGATGT
Antisentido
AGCAGGATGACGGAGTAGCG
324 bp
SP-B
Sentido
CCAAGCCATGATTCCCAAGGGTG
Antisentido
CGAGCAGGATGACGGAGTAGCG
122 bp
SP-D
Sentido
AGGAGCAAAGGGAGAAAGTGG
Antisentido
GCTGTGCCTCCGTAAATGGT
197 bp
KL-6
Sentido
GTGCCGCCGAAAGAACTAC
Antisentido
CTGCTGCCACCATTACCTG
165 bp
CK-8
Sentido
GAGGCATCACCGCAGTTAC
Antisentido
TTGCTTCGAGCCGTCTTCT
223 bp
AQP-3
Sentido
TGACCAGTTCATAGGCACAGC
Antisentido
ACACGAAGACACCCGCAAT
296 bp
AQP-3
Sentido
CTCGTGAGCCCTGGATCAAGCT
Antisentido
GTTGTCGGCGAAGTGCCAGATTT
119 bp
AQP-5
Sentido
GCCACCTTGTCGGAATCTAC
Antisentido
CCAGTCCTCGTCAGGCTCATA
233 bp
AQP-5
Sentido
CACCCCCCACCTTCCCCAACCCT
Antisentido
CTAAACACCAGCAGCCCCACGCA
169 bp
IL-6
Sentido
GGAGACTTGCCTGGTGAAA
Antisentido
CTGAGGTGCCCATGCTAC
330 bp
IL-6
Sentido
Antisentido
Sentido
Antisentido
CAGCAGGCAACACCAGGAGCAG
C
CCCTACAACAGACCCACA
125 bp
IL-8
GAGCCCACCGGGAACGAAAGAG
A
GCCAAGGAGTGCTAAAGA
IL-8
Sentido
TACTCCAAACCTTTCCACCC
Antisentido
AACTTCTCCACAACCCTCTG
158 bp
MCP-1
Sentido
CAGCCAGATGCAATCAATGC
Antisentido
GTGGTCCATGGAATCCTGAA
198 bp
ICAM-1
Sentido
GGAGCCAATTTCTCGTGC
Antisentido
GGAGTCGTTGCCATAGGTG
267 bp
ICAM-1
Sentido
GATTGTCATCATCACTGTGGTAG
Antisentido
GCCTGTTGTAGTCTGTATTTCTT
111 bp
GAPDH
Sentido
TCCTCCACCTTTGACGCT
Antisentido
TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC
177 bp
329 bp
RESULTADOS:
RENDIMIENTO, PUREZA , VIABILIDAD Y MORFOLOGA:
Nuestro proceso de aislamiento dando como resultado aproximadamente 2 a 7 septiembre 105
clulas AEII humanos por gramo de tejido pulmonar perifrico en 60 h de cultivo celular. La
viabilidad fue del 95 % en promedio 2 a partir de 28 pulmones durante 60 h . No hubo
diferencias en el crecimiento celular entre el uso de medio de cultivo diferente, pero la
morfologa de las clulas AEII pareca ser ptima bajo la condicin de SAGM que contiene 1 %
de FBS , pero no bajo la de DMEM que contena 1 % o 10 % de FBS que contiene 10 o SAGM
% de FBS (datos no mostrados). El nivel de duplicacin de la poblacin era de
aproximadamente 6 veces al da 28 (fig . 1A ) . Las clulas formaron unin estrecha despus
de alcanzar la confluencia como se refleja por una lectura constante de ECIS (Fig. 1B ) . Los
cuerpos y microvellosidades lamelares tpicos se observaron en las clulas AEII bajo la
microscopa electrnica de transmisin (Fig. 1Cand D).
MOLECULARES DE LAS CLULAS AEII:
Las clulas AEII se caracterizaron por la expresin de protenas especfico para clulas AEII
incluyendo pro- SP- C (Fig. 2B ) y citoqueratina - 8 (Fig. 2C) . Cuerpos lamelares como
caracterstica especfica de las clulas AEII (Williams 1977; . Witherden et al 2004) se
identificaron positivamente por NOM -26 manchas en el citoplasma (Fig 2E y F . ) . Los cuerpos
lamelares no se encontraron en el epitelio bronquial humano de pulmn de clulas BEAS -2B
(Fig. 2G y H) y los fibroblastos de pulmn humano examinados ( Fig . 2I y J).
Para supervisar el fenotipo de las clulas AEII despus del aislamiento , las clulas se
cultivaron en SAGM que contiene 1 % de FBS durante un mximo de 28 das . La expresin de
aENaC (Fig. 3A) , la protena de unin estrecha E -cadherina, y la protena AEII SPB (Fig. 3B )
y la SPC (Fig. 4 ) , pero no la protena vimentina mesenquimales (Fig. 3B ) y la protena theAEI
AQP - 5 (Fig. 4 ) , era detectable. No hubo diferencia en la expresin de E- cadherina y SPB en
el da 21 entre las condiciones de cultivo lquidos y aire -lquido ( Fig . 3B ) . El tejido pulmonar
total a partir del cual se aislaron las clulas AEII mostr fuerte expresin de vimentina (Fig. 3B )
.Por otra parte , la expresin de genes de protenas de agentes tensioactivos , CK- 8 , KL- 6 , y
AQP - 3 como marcadores AEII ( Driscoll et al . 1995 ; Armstrong et al. 2004 ; Bove et al. 2010 )
se observ en 12 ( paso 1 ) , mantenida en el da 21 , y la disminucin en el da 28 (Fig . 3C ) .
Hubo poca expresin de AQP - 5 en el da 12 y que desapareci despus ( Fig . 3C ) . El perfil
gen AEII se confirm usando los mtodos QPCT en tiempo real (Fig. 3D) . En contraste , las
clulas A549 epiteliales adenocarcinomic humanos no mostraron ninguna expresin de las
protenas de agentes tensioactivos y AQP - 3 (Fig. 3C) .
Figura. 3
Figura. 4
LA RESPUESTA FUNCIONAL DE LAS CLULAS AEII A LA ESTIMULACIN:
Para examinar la funcionalidad de las clulas AEII primarios , las clulas fueron estimuladas
con diferentes dosis de TNF -a durante 24 h. Hubo un aumento dependiente de la dosis en la
expresin gnica de IL- 6 , IL- 8 , MCP - 1 , e ICAM - 1 , as como las concentraciones de
protena de IL- 6 y IL- 8 en los sobrenadantes de cultivo en respuesta a las la estimulacin con
TNF -a ( Fig. 5 ) ) .
DISCUSIN:
Hay un par de toques de luz en el presente estudio mtodo con respecto al aislamiento y
mantenimiento de las clulas AEII humana principales: (1) El alto rendimiento se logr
mediante la aplicacin combinada de tripsina en la digestin elastasa que preserva el tejido
pulmonar durante la cosecha; (2) La alta pureza se obtuvo por la separacin de los macrfagos
y fibroblastos a partir de clulas epiteliales en un momento optimizado utilizando anticuerpos
medianas adherencia para la seleccin negativa; y (3) el mantenimiento prolongado de AEII
fenotipo se llev a cabo mediante la optimizacin de los componentes del medio de cultivo que
contienen una concentracin de FBS apropiado. AEII clulas, como las clulas madre de tejido,
tienen funciones muy importantes. Es necesario establecer cultivo primario de clulas AEII
inducida por la ventilacin. (. Dobbs et al 1986) Desde Dobbs public por primera vez un
mtodo de aislamiento y cultivo de clulas ATII de rata adulta, un nmero de estudios se han
llevado a cabo para aislar clulas AEII en los seres humanos (Fuchs et al 2003;. Bove et al.
2010) y en roedores (Bates et al 2002;. Witherden et al 2004;. Lazrak et al 2012).. Los estudios
han demostrado que las clulas AEII humanos aislados funcin in vitro ejercen (Wang et al
2007, 2011;. Ballard et al.2010; Qian et al.2013; Bove et al 2014).. Sin embargo, varias
preocupaciones principales han surgi incluyendo la prdida rpida de la funcin celular,
especialmente la prdida de expresin de la protena surfactante (Dobbs 1990;. Bates et al
2002;. Witherden et al 2004) y de clulas diferenciadas en ATI fenotipo dentro de unos pocos
das (Bates et al . 2002;. Bove et al 2010). Mantenimiento de caractersticas de las clulas
depende no slo la fuente de tejido, sino tambin los mtodos de aislamiento y los
componentes del medio de cultivo. En este estudio, hemos modificado los protocolos de varios
estudios previos para el aislamiento de clulas AEII, caracterizacin, y la cultura. En primer
lugar, se utiliz el tejido pulmonar perifrica normal de pacientes sometidos a reseccin
pulmonar como nuestra fuente de tejido. En segundo lugar, la aplicacin combinada de la
tripsina con elastasa fue capaz de disminuir la dosis de tripsina y por lo tanto puede haber
contribuido a reducir la lesin del tejido y la mejora de la cosecha (Waymouth 1974). En tercer
lugar, creemos que la eliminacin de los fibroblastos es un paso crucial durante el
procedimiento de aislamiento y purificacin (Komiyama et al 2003;. Kaushik et al. 2008).
Finalmente, el SAGM que contiene 1% de FBS era una receta importante en el mantenimiento
de las caractersticas biolgicas de las clulas AEII humanos y la prevencin de su
diferenciacin en clulas AEI. Hay varios tipos de medios, incluyendo los medios de
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