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Implementao de um Mtodo para a Determinao de

Hidrocarbonetos Alifticos Saturados em leo de Girassol


por Cromatografia Gasosa

Ana Catarina do Carmo Correia Rodrigues Machado

Dissertao para a obteno do Grau de Mestre em


Engenharia Alimentar

Orientador: Professor Doutor Miguel Mourato


Co-orientador: Engenheira Paula Vasconcelos

Jri:
Presidente:
Vogais:

Doutora Maria Suzana Leito Ferreira Dias Vicente, Professora Auxiliar do


Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa.

Doutora Maria Lusa Louro Martins, Professora Auxiliar do Instituto Superior de


Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa;

Doutor Miguel Pedro de Freitas Barbosa Mourato, Professor Auxiliar do Instituto


Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa;

Licenciada Paula Maria Machado George de Vasconcelos de Azevedo e Castro,


Tcnica Superior do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica
de Lisboa, na qualidade de especialista.

Lisboa, 2011

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a todos aqueles que directa ou indirectamente contriburam para a
realizao deste trabalho.
Ao meu orientador, Professor Doutor Miguel Mourato e Professora Doutora Lusa Louro
Martins pela oportunidade que me deram de realizar este trabalho, pela disponibilidade e
apoio constantes ao longo do desenvolvimento do mesmo, pelas sugestes e tambm pela
forma muito simptica como sempre me acolheram.
Engenheira Paula Vasconcelos, co-orientadora deste trabalho, pela maneira como me
acolheu no Laboratrio de Estudos Tcnicos e pela disponibilidade e abertura com que me
cedeu todas as informaes necessrias para o desenvolvimento deste trabalho,
contribuindo com valorosas crticas.
A todas as pessoas que trabalham no Laboratrio de Estudos Tcnicos, mais conhecido
como Laboratrio de Azeites do Instituto Superior de Agronomia, nomeadamente
Engenheira Helena Alegre pelo auxlio prestado durante a execuo do trabalho prtico e
pela disponibilidade para me ajudar nas mais variadas situaes.
A todos aqueles, famlia, amigos e colegas, que directa ou indirectamente, deram o seu
contributo, encorajando-me para que este trabalho tivesse sido possvel. Agradeo
especialmente e carinhosamente Mainha e NN, que muito me apoiaram, dando-me
nimo nos momentos mais difceis da realizao deste trabalho.
Aos meus pais e NN um agradecimento muito especial, pois a eles devo tudo o que sou
e tudo o que tenho, incluindo este curso.
A todos, o meu muito obrigada.

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Resumo
O leo mineral um subproduto derivado da destilao do petrleo, aplicvel a nvel
cosmtico, farmacutico e alimentar, usado como aditivo alimentar, quando de grau prprio
para tal. No entanto, pode tambm ser considerado uma contaminao, especialmente
importante no leo de girassol devido ao episdio das 100.000 toneladas de leo de girassol
Ucraniano altamente contaminado. Este trabalho tem como objectivo a implementao de
um mtodo para a determinao de hidrocarbonetos alifticos saturados em leo de girassol
por cromatografia gasosa em coluna capilar, com injeco on column e detector FID. Para
tal foram avaliados parmetros como linearidade, gama de trabalho, limiares analticos,
preciso, exactido e robustez do mtodo. Os resultados mostram que o mtodo linear
para uma gama de trabalho entre 15 e 60 mg.kg-1, com um limite de repetibilidade de 6,11
mg.kg-1 e uma variabilidade de resultados associados ao mtodo de 0,48 mg.kg -1. O mtodo
permite detectar e quantificar o analito a partir de 21 mg.kg-1 e 24 mg.kg-1, respectivamente.
Face aos resultados obtidos em ensaios de recuperao e aos Z-score de 0,5 e 0,04 obtidos
em ensaios interlaboratoriais, o mtodo exacto. Verifica-se tambm a robustez do mesmo,
sendo um mtodo sensvel ao modo de integrao dos resultados.

Palavras-chave: hidrocarbonetos alifticos saturados, leo mineral, leo de girassol,


cromatografia gasosa.

ii

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Abstract
Mineral oil is a by-product derived from petroleum distillation, applicable in the areas of
cosmetics, pharmaceuticals and food, used as food additive when in the proper grade of
purity for this propose. However, it can also be considered a contaminant, especially
important in sunflower oil, due to the episode of the 100.000 tons of highly contaminated
Ukrainian sunflower oil. This experimental work aims at implementing a method for the
determination of saturated aliphatic hydrocarbons in sunflower oil by capillary gas
chromatography with on column injection and FID detector. For such purpose parameters
like linearity, working range, thresholds, precision, accuracy and robustness of the method
were evaluated. The results show that the method is linear in the range between 15 and 60
mg.kg-1, with a repeatability limit of 6,11 mg.kg-1 and a variability of results obtained by this
method of 0,48 mg.kg-1. The method allows to detect and quantify the analyte from 21 mg.kg1

and 24 mg.kg-1, respectively. Considering the results obtained in recovery tests and Z-score

of 0,5 and 0,04 obtained in inter-laboratory tests, the method is accurate. The robustness of
this method is also verified, although it is sensible to the way the integration is performed.

Key - words: saturated aliphatic hydrocarbons, mineral oil, sunflower oil, gas
chromatography.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Extended Abstract
Mineral oil is a by-product derived from the distillation of petroleum, chemically inert and
composed essentially by alkanes with between 15 and 40 carbons and cyclic paraffins, that
can be found in a great variety of food, like nuts, grains of coffee, rice, bread and bakery
products. The origin of this contamination is extremely diversified, highlighting the fact that
mineral oil can be used as lubricant of fibers that make up food packaging, in pesticide
formulation and as release agent in the area of bakery and pastry. This mixture of
compounds can also be used as food additives as long as it is a white mineral oil, that is, a
highly refined mineral oil from which aromatic hydrocarbons, harmful to human health, have
been removed. Even so, the contact of mineral oil with human body can be accomplished not
only by food products, but also through cosmetics, pharmaceuticals and due to pollution.
However, the interaction of this set of compounds with human body has never been
considered a health hazard, until the incident of the 100,000 tons of Ukrainian sunflower oil,
crude and refined, contaminated with high concentrations of mineral oil. From this moment, it
was established in the European Union that there was a need to control the quality of
vegetable oils, especially sunflower oil imported from Ukraine, instituting that a control of the
amount of saturated aliphatic hydrocarbons especially of mineral origin would have to be
made, which may not exceed a maximum level of 50 mg.kg-1, both for refined and crude
sunflower oil.
This experimental work aims at implementing an internal method for the determination of
saturated aliphatic hydrocarbons in sunflower oil by capillary gas chromatography with on
column injection and FID detector. In this method, a pre-treatment of the sample in column
chromatography is performed, using silica gel treated with silver nitrate and as eluent
chromatography-grade n-hexane. For validation purposes some parameters were evaluated,
including working range and linearity, analytical thresholds limits of detection and
quantification precision through repeatability and intermediate precision, accuracy through
recovery experiments and inter-laboratory tests as there are no certified reference materials
for the analysis of mineral oil and the robustness of the method. The results obtained in
these experiments show that the method is linear in the range between 15 and 60 mg.kg -1
and has a sensitivity of 0,0309 kg.mg-1. The repeatability limit, calculated on the basis of an
assay in repeatability conditions is 6,11 mg.kg-1 and the variability of results associated to the
method, calculated in the basis of an assay in condition of intermediate precision with
variation of the day of analysis, is 0,48 mg.kg-1. The method allows detection of the analyte
from 21 mg.kg-1, but quantification can only be accomplished from 24 mg.kg-1. Given the
results obtained in recovery experiments with recovery rates from 90 % to 110 % in an
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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
assessment carried out with samples of sunflower and soybean oils, both crude and refined,
and the Z-score of 0.5 for a sample of sunflower oil and 0.04 for a soybean oil, obtained in
inter-laboratory assays, the method is considered accurate. The robustness of the method is
also verified, however being sensible to the way the integration is performed, it is important
to define objective criteria to successfully complete this stage of the process. To minimize the
possibility of introducing errors in the results, originating from the integration mode, there is a
need for standardization of methods used to perform this determination, which can be
achieved with the implementation of ISO guidelines that are still awaiting approval. In
addition, it was confirmed the need to use chromatography-grade n-hexane instead just
analytical purity, as it introduces a contamination with mineral oil in the sample that distorts
the results upwards. In comparing the method used in this experimental work with ISO
guidelines, which will be the basis for this determination in the future, it was found that there
are no significant differences in the results obtained. It was verified, thus, through validation
that this method allows the attainment of trustworthy results for the determination of
saturated aliphatic hydrocarbons of mineral origin in sunflower oil, taking into account the
results of the assessment of objective criteria that include the validation of a test method.
That is, it was verified that this method allows determining whether a specific sample is within
the legal limits in terms of food quality, thus allowing its commercialization. Although the
method is specific to sunflower oil, there is also the possibility of applying it to other
vegetable oils such as soybean oil, which was tested in this work in inter-laboratory trials and
recovery tests, or even applicable to another types of food.
As mineral oil, besides being a major contamination of human body accounting for the
accumulation of approximately 1 g of this mixture of compounds in human body fat and in
extreme cases of 10 g is also one of the most common contaminants found in food and
usually with unknown origin, its control is essential, especially in food, in order to control the
quality of ingested food. The inspection of this type of contamination becomes especially
important since this can happen with white mineral oil, also called food grade mineral oil or
technical grade oil, which is a mineral oil containing high amounts of aromatic hydrocarbons,
used for technical work as lubrication and equipment maintenance and therefore not fitted for
human consumption, what could adversely affect health of consumers, depending on the
degree of contamination.

Key - words: saturated aliphatic hydrocarbons, mineral oil, sunflower oil, gas
chromatography.
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
ndice
ndice de Figuras

viii

ndice de Quadros

ix

Lista de Abreviaturas

I.

Enquadramento do tema

II. Introduo

II.1. leos e gorduras na indstria alimentar

II.2. Importncia nutricional dos leos vegetais

II.3. reas de aplicao dos leos vegetais

II.4. O girassol

II.4.1. A cultura do girassol

II.4.2. leo de girassol

II.5. A soja

12

II.5.1. A cultura da soja

12

II.5.2. leo de soja

14

II.6. Modo de produo de um leo vegetal

17

II.7. leo mineral

19

II.7.1. Aplicaes do leo mineral

20

II.7.2. leo mineral em alimentos

20

II.7.3. Toxicidade do leo mineral

22

II.8. Cromatografia gasosa

25

II.9. Validao de um mtodo analtico

29

III. Parte experimental


III.1.Materiais e reagentes

39
39

III.1.1. Materiais

39

III.1.2. Reagentes

39

III.2.Procedimento experimental

40

III.2.1. Preparao de gel de slica prateado

40

III.2.2. Preparao da coluna cromatogrfica de pr-tratamento

40

III.2.3. Fraccionamento do leo

41

III.2.4. Separao cromatogrfica

41

III.2.5. Determinaes quantitativas

42

III.3.Anlises efectuadas

43
vi

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
III.3.1. Limiares analticos

43

III.3.2. Curva de calibrao

44

III.3.3. Repetibilidade

44

III.3.4. Exactido

44

III.3.5. Robustez

44

IV. Resultados e discusso

46

IV.1. Curva de calibrao e sensibilidade

47

IV.2. Limiares analticos

51

IV.3. Preciso

56

IV.3.1. Repetibilidade

57

IV.3.2. Reprodutibilidade

60

IV.3.3. Preciso Intermdia

61

IV.4. Exactido

63

IV.4.1. Materiais de Referncia Certificados (MRC)

63

IV.4.2. Comparaes interlaboratoriais

63

IV.4.3. Ensaios de recuperao

67

IV.5. Robustez

68

V. Propostas para trabalho futuro

77

VI. Concluses

78

VII. Referncias bibliogrficas

81

VIII. Anexos

87

vii

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
ndice de Figuras
Figura 1: Variao da produo mundial de leos vegetais (em milhes de toneladas)
ao longo de seis anos.

Figura 2: Esquema representativo da estrutura de um triglicrido.

Figura 3: Evoluo da produo mundial dos principais leos vegetais, ao longo de


35 anos.

Figura 4: Produo mundial de girassol em kg/ha.

Figura 5: Produo nacional de girassol.

Figura 6: Principais pases de produo e consumo de leo de girassol.

10

Figura 7: Principais pases produtores de soja (dados de 2009/2010).

13

Figura 8: Principais produtores e consumidores de leo de soja (dados de 2009/2010). 15


Figura 9: Esquematizao da estrutura de um cromatgrafo gasoso.

26

Figura 10: Esquematizao da estrutura de um detector de ionizao por chama.

28

Figura 11: Rampa de temperatura do forno, na anlise cromatogrfica de leo


mineral.

42

Figura 12: Correlao entre concentrao de padres de parafina e sinal obtido em


termos de rea correspondente a leo mineral.

48

Figura 13: Correlao entre concentrao de padres de parafina e rea


normalizada correspondente a leo mineral.

48

Figura 14:Exemplificao da integrao da banda larga correspondente a leo mineral


num cromatograma referente a leo de girassol refinado.

73

Figura 15: Exemplificao da integrao pico a pico dos hidrocarbonetos alifticos


normais num leo para o mesmo leo de girassol refinado apresentado na Figura 13.

74

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
ndice de Quadros
Quadro I: Composio genrica de leos alimentares.

Quadro II: Teor de cidos gordos de diversos leos vegetais.

Quadro III: Composio nutricional mdia do leo de girassol (valores por 100 g).

11

Quadro IV: Comparao da composio em cidos gordos de leo de girassol


tradicional e leo de girassol com elevado teor em cido oleico.

12

Quadro V: Composio nutricional mdia do leo de soja (valores por 100 g).

16

Quadro VI: Composio tpica em cidos gordos do leo de soja.

16

Quadro VII: Parmetros de validao a avaliar conforme o tipo de ensaio.

30

Quadro VIII: Compilao dos resultados de avaliao de qualidade do mtodo usado. 51


Quadro IX: Resultados obtidos (em mg.kg-1) nos dez replicados para determinao
dos limiares analticos.

52

Quadro X: Smula dos valores obtidos para os limites de deteco e de quantificao


pelos dois mtodos de clculo.

54

Quadro XI: Resultados obtidos (mg.kg-1) na determinao da repetibilidade.

57

Quadro XII: Resultados obtidos nos dez ensaios para a avaliao da preciso
intermdia.

61

Quadro XIII: Resultados obtidos (mg.kg-1) nos ensaios interlaboratoriais, para as


amostras de leo de girassol refinado e leo de soja bruto.

64

Quadro XIV: Resultados obtidos (mg.kg-1) pelo LET, na anlise de amostras de leo
de girassol refinado e leo de soja bruto, englobadas no ensaio interlaboratorial.

66

Quadro XV: Resultados obtidos nos ensaios de recuperao, para o estudo da


exactido do mtodo.

68

Quadro XVI: Resultados dos ensaios para testar a necessidade de filtrao de


amostras com impurezas.

70

Quadro XVII: Comparao de sistemas de integrao atravs da inspeco de


resultados obtidos para a anlise dos limiares analticos.

72

Quadro XVIII: Resultados da comparao entre mtodos.

75
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Lista de Abreviaturas
ADI Admissible Dialy Intake Dose Diria de Ingesto Aceitvel
AVC Acidente Vascular Cerebral
EFSA European Food Safety Authority
FDA Food and Drug Administration
FID - Flame Ionization Detector - Detector de Ionizao por Chama
GC - Gas Chromatography - Cromatografia Gasosa
HPLC High Performance Liquid Chromatography Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia
IRMM Institute for Reference Materials and Measurements
JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives
LC Liquid Chromatography Cromatografia Lquida
LD Limite de Deteco
LDL Low Density Lipoprotein
LET Laboratrio de Estudos Tcnicos
LQ Limite de Quantificao
MRC Materiais de Referncia Certificados
NIST National Institute of Standards and Technology
NOAEL No Observed Adverse Effect Level
SE Solvente Evaporation Evaporao de solvente
VLDL Very Low Density Lipoprotein

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
I. Enquadramento do tema
Os hidrocarbonetos de origem mineral - comummente designados por leo mineral - podem
ser encontrados numa grande variedade de alimentos, desde nozes, gros de caf, arroz,
po e produtos de padaria e ainda nos vegetais, sendo a provenincia desta contaminao
extremamente diversificada, destacando-se o facto de o leo mineral ser usado como
lubrificante de fibras que compem embalagens para alimentos, em formulaes de
pesticidas e ainda como agente antiaderente no ramo da padaria e pastelaria. Ainda assim,
o contacto do leo mineral com o organismo humano pode ser feito no s por via de
produtos alimentares, mas tambm atravs da cosmtica ou produtos farmacuticos ou
ainda devido poluio. No entanto este tipo de contaminao nunca havia sido
considerado perigoso para a sade, at ao incidente das toneladas de leo de girassol,
proveniente da Ucrnia, contaminado com elevadas concentraes de leo mineral (em
2008), existindo mesmo, leo de girassol bruto contaminado com 7000 mg.kg-1 e leo de
girassol refinado com 2000 mg.kg-1 de contaminao com esta mistura de compostos. A
partir deste momento, estabeleceu-se na Unio Europeia que havia necessidade de controlo
da qualidade dos leos vegetais, especialmente do leo de girassol importando da Ucrnia,
instituindo-se que deveria ser feito um controlo quantidade de hidrocarbonetos alifticos
saturados no leo de girassol, no devendo estes exceder um nvel mximo de 50 mg.kg-1,
tanto para leo de girassol refinado como bruto.
Assim se justifica o aparecimento de mtodos de ensaio para a determinao de
hidrocarbonetos alifticos saturados em leos vegetais, com o intuito de controlar a
qualidade dos leos que a Europa importa, visto que o consumo de leos vegetais tem
aumentado entre a populao, que procura uma alimentao mais saudvel.

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
II. Introduo
II.1. leos e gorduras na indstria alimentar
Os leos e gorduras so parte significativa dum vasto grupo de compostos designados
genericamente lpidos - cuja caracterstica comum o facto de serem geralmente solveis
em solventes orgnicos e insolveis, ou fracamente solveis, em gua - podendo ser
encontrados em clulas de origem animal, vegetal e microbiana. A distino entre leos ou
gorduras lquidas e gorduras faz-se pelo facto de serem lquidos ou slidos temperatura
ambiente, respectivamente. Estes compostos so conjuntamente com as protenas e
glcidos, os principais componentes estruturais de todas as clulas vivas, sendo a mais
concentrada fonte de energia (da sua oxidao resultam 9 kcal/g, enquanto da oxidao das
protenas e dos glcidos resultam apenas 4 kcal/g), fonte de cidos gordos essenciais (cido
linoleico - mega 6 - e cido linolnico - mega 3) e vitaminas lipossolveis (vitamina A, D,
E, K), o que lhes confere grande importncia nutricional (Lopes, 2000). So ingeridas como
gorduras visveis - manteiga, banha, leos de tempero, entre outros - ou como constituintes
dos alimentos, por exemplo, no leite, queijo ou carne. Contribuem para o sabor e
palatabilidade, flavour (como precursores de aroma) e textura dos alimentos e aumentam a
sensao de saciedade, aps a sua ingesto (Lopes, 2000).
Os pases ocidentais utilizaram durante muitos sculos essencialmente gorduras animais
para suprir as suas necessidades em termos de gordura, existindo, no entanto, algumas
excepes, em que eram utilizados leos produzidos localmente, podendo citar-se o
exemplo do azeite nos pases mediterrnicos e da colza em Frana e na Polnia, sendo
que, a manteiga e o sebo se mantiveram como as gorduras mais importantes na Europa at
meados do sculo XIX. Com a introduo, no final desse sculo, da prensagem hidrulica e
a extraco por solventes, os leos vegetais comearam a ganhar vantagem. Para alm
disto, aquando das conquistas coloniais, as oleaginosas tropicais, nomeadamente, o
amendoim, comearam a chegar Europa a preos muito baixos, fazendo concorrncias
aos produtos nacionais. No entanto, no final da Segunda Guerra Mundial, como
consequncia do aumento do preo do amendoim no mercado internacional, o Ocidente
comeou a desenvolver algumas culturas oleaginosas: o girassol em Frana e no leste da
Europa; a colza no Canad, Frana, Polnia, Alemanha e Sucia; e paralelamente, nos EUA
comeou a desenvolver-se a cultura da soja (Lopes, 2000).
Actualmente existe no mercado uma grande variedade de leos vegetais, tendo-se
verificado um aumento da produo dos mesmos ao longo dos ltimos anos - de
aproximadamente 119 milhes de toneladas em 2005/06 para aproximadamente 147
2

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
milhes de toneladas em 2010/11 (Carvalho, 2010). Ao nvel dos leos vegetais destacamse os de Palma, Soja, Colza e Girassol, como os de maior produo mundial (Figura 1).

50

Produo Mundial de leos Vegetais


(em milhes de toneladas)

45
40

Coco
Algodo
Azeite
Palma
Palmiste
Amendoim
Colza
Soja
Girassol

35
30
25
20
15
10
5
0
2005/06

2006/07

2007/08

2008/09

2009/10

2010/11

Ano
Figura 1: Variao da produo mundial de leos vegetais (em milhes de toneladas) ao longo
de seis anos.
Adaptado de Carvalho (2010).

II.2. Importncia nutricional dos leos vegetais


Quimicamente um leo composto por duas fraces (Quadro I):

Fraco saponificvel (representa cerca de 99 % de um leo): insolvel em gua,


constituda essencialmente por triglicridos, mas tambm por mono e diglicridos
resultantes da hidrlise dos primeiros. Contm ainda cidos gordos livres, fosfatdeos,
glucsidos e pigmentos verdes que contm clorofila e produtos resultantes da sua
decomposio. Muitas das caractersticas fsicas, qumicas e metablicas de um leo
dependem da composio desta fraco (Lopes, 2000; Silva, 2001);

Fraco insaponificvel (representa entre 0,5 e 1,5 % de um leo): solvel em gua,


constituda por componentes menores, os quais compreendem hidrocarbonetos,
esteris, ceras, lcoois, substncias corantes e aromticas, vitaminas, tocoferis e
polifenis. Esta a fraco responsvel pelo valor biolgico, nutricional e pela
resistncia oxidao de um leo. A sua concentrao depende do tipo de leo, no
entanto, esta fraco sempre maior no leo bruto do que no refinado,
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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
independentemente do tipo de leo e, portanto, diminui com o processamento (Lopes,
2000; Silva, 2001).

Quadro I: Composio genrica de leos alimentares.

Componente

Componente

ppm

Tocoferis

150 2000

Triglicridos

90 99

Tocotrienis

0,0 1500

Diglicridos

0,0 0,2

Fenis

0,0 50

Monoglicridos

0,0 0,2

Clorofilas e derivados

0,0 20

cidos Gordos Livres

0,2 9,5

Carotenides

0,0 500

Fosfolpidos

0,01 0,1

Metais

0,01 2,5

Esteris

0,4 2,0

Materiais oxidados

0,01 2,5

Humidade

0,0 0,1

Protenas

0,0 0,01

Gomas

0,0 2,0

Fonte: Lopes, 2000.

Os triglicridos compostos em que cada grupo hidroxilo do glicerol esterificado com uma
molcula de um cido gordo (Figura 2), num processo que controlado pelo metabolismo
da planta - so compostos especialmente importantes no que respeita s propriedades
fsicas, qumicas e biolgicas dos leos, no s porque so os componentes maioritrios
dos mesmos, mas tambm porque a posio e o tipo de cidos gordos num triglicrido vo
influenciar essas mesmas propriedades.
Glicerol
cido Gordo Livre

Triglicrido

Figura 2: Esquema representativo da estrutura de um triglicrido.


Fonte: http://www.medicinapreventiva.com.ve/laboratorio/trigliceridos.htm

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Os cidos gordos que constituem os triglicridos dos leos so predominantemente cidos
alifticos monocarboxlicos de cadeia linear e nmero par de tomos de carbono, de C4 a
C24, podendo estes ser saturados quando possuem apenas ligaes simples entre os
tomos de carbono da cadeia carbonada - monoinsaturados ou polinsaturados quando
possuem uma ou mais ligaes duplas na cadeia carbonada, respectivamente. Dentre os
cidos gordos presentes em leos vegetais destacam-se o cido oleico (C18:1) como cido
gordo monoinsaturado, o cido linoleico (C18:2) como polinsaturado e o cido palmtico
(C16:0), na categoria dos cidos gordos saturados. O Quadro II apresenta a composio
mdia em cidos gordos de alguns leos vegetais.

Quadro II: Teor de cidos gordos de diversos leos vegetais.

cidos Gordos Polinsaturados

cidos gordos

cidos Gordos

saturados

Monoinsaturados

cido Linoleico

cido Linolnico

Colza

6%

58 %

26 %

10 %

Girassol

11 %

2%

69 %

Palma

48 %

40 %

10 %

Azeite

14 %

77 %

8%

<1%

Soja

15 %

24 %

54 %

7%

leos

Adaptado de Reda & Carneiro (2007).

Os cidos gordos desempenham diversas funes ao nvel da nutrio humana, podendo


ocasionar, consoante o tipo de cido gordo em questo, efeitos benficos ou prejudiciais
para a sade. O aumento de cidos gordos saturados na dieta induz a hipercolesterolemia,
ou seja, um aumento do colesterol total e da fraco aterognica (colesterol LDL),
enquanto os cidos gordos polinsaturados possuem o efeito contrrio reduo da
hipercolesterolemia. H vrias explicaes sobre os mecanismos pelos quais os cidos
gordos afectam as concentraes de colesterol plasmtico, podendo referir-se a mudana
na composio das lipoprotenas, alteraes na produo de LDL (Low Density Lipoprotein)
e VLDL (Very Low Density Lipoprotein) pelo fgado e ainda alterao da actividade dos
receptores da LDL (Moraes & Colla, 2006).
De entre os cidos gordos convm salientar o papel de dois cidos gordos essenciais - o
cido linoleico e o cido linolnico. Relativamente ao cido linoleico, o principal cido gordo
mega 6, possui um papel importante no organismo humano, visto que, num ser humano
saudvel ser convertido em cido gama-linolnico, sendo este posteriormente convertido
5

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
em cido araquidnico, que atravs da via metablica da cascata do mesmo cido, produz
eicosanides, importantes compostos hormonais que desempenham um papel de extrema
importncia em muitas funes corporais, tais como reaco anti-inflamatria e participao
na estrutura das membranas celulares - influenciando a viscosidade sangunea,
permeabilidade dos vasos, aco antiagregadora e presso arterial (Guin & Henriques,
2011). Convm ainda salientar o papel do cido linolnico, a partir do qual so sintetizados,
no organismo humano, os cidos gordos de cadeia longa da famlia mega 3, sendo este
cido um precursor primordial das prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos, substncias
que possuem actividade anti-inflamatria, anti-coagulante, vasodilatadora e anti-agregante
(Moraes & Colla, 2006). Alm do papel nutricional na dieta, os cidos gordos mega 3
podem ajudar a prevenir uma variedade de doenas, incluindo doenas do corao, cancro,
artrite, depresso e Alzheimer. As deficincias de mega 3 esto relacionadas com a
diminuio da memria e capacidades mentais, baixa viso, maior tendncia para a
formao de cogulos sanguneos, diminuio da imunidade, entre outros (Guin &
Henriques, 2011). importante salientar que necessrio um equilbrio apropriado entre os
dois tipos de cidos gordos essenciais mega 3 e mega 6 visto que estes trabalham
em conjunto com o objectivo da promoo da sade. A deficincia ou o desequilbrio no
fornecimento destes dois cidos gordos ao organismo est relacionado com graves
condies de sade, de que so exemplo, ataque cardaco, cancro, asma, lpus, depresso,
envelhecimento acelerado, acidente vascular cerebral (AVC), hiperactividade e sndrome de
dfice de ateno (Guin & Henriques, 2011).
Relativamente aos cidos gordos monoinsaturados, para alm de serem eficazes redutores
de colesterol, estes possuem tambm outros efeitos benficos, tais como a diminuio da
oxidao do colesterol LDL e melhoria da palatabilidade dos alimentos (Moraes & Colla,
2006).
Assim, as recomendaes dietticas avanam no sentido de diminuir as gorduras saturadas
numa dieta, em favor das mono e polinsaturadas, sem que estas ltimas ultrapassem 10 %
das calorias totais (Moraes & Colla, 2006).

II.3. reas de aplicao dos leos vegetais


Um leo possui diversas aplicaes ao nvel alimentar, das quais se podem destacar o uso
para fins culinrios, fritura - quer domstica, quer industrial - panificao, produo de
margarinas, leo de tempero, entre outros. Os critrios de escolha de um leo alimentar
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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
para determinada aplicao esto intimamente relacionados com a mesma: aroma e textura
do produto onde o leo seleccionado vai ser utilizado, gosto residual que deixa aps a sua
ingesto, estabilidade aromtica, disponibilidade no mercado, custo, necessidades
nutricionais especficas e ainda requisitos explcitos do consumidor alvo. De entre os
factores mencionados tem-se verificado uma predominncia da preocupao em termos
nutricionais - optando-se sempre que possvel, em termos das caractersticas desejadas
para o produto final, por leos com baixo teor em gordura saturada - e ainda em termos de
custos e disponibilidade no mercado (Lopes, 2000).
Convm ainda salientar que as especificaes para leos alimentares tm sofrido alteraes
ao longo do tempo, especialmente devido ao desenvolvimento de tcnicas analticas que
permitem conhecimentos mais detalhados ao nvel da qualidade nutricional e funcional dos
mesmos. Verifica-se que os factores que actualmente mais importncia possuem ao nvel
das caractersticas de um leo alimentar so o facto de ser totalmente de origem vegetal,
rico em cidos gordos polinsaturados e pobre em saturados, virtualmente livre de cidos
gordos trans, sem adio de leos hidrogenados e de corantes (Lopes, 2000).
Neste trabalho pretende-se implementar um mtodo para avaliar um dos parmetros de
qualidade associados ao leo de girassol determinao de hidrocarbonetos alifticos
saturados, mais comummente designada por contaminao com leo mineral - e ainda
extrapolar algumas concluses para o leo vegetal que se manteve durante muitos anos

Produo Mundial de leos Vegetais


(milhes de toneladas por ano)

como o de maior produo e consumo a nvel mundial leo de soja (Figura 3).

leo de Palma

leo de Soja
leo de Colza

leo de Girassol

Ano

Figura 3: Evoluo da produo mundial dos principais leos vegetais, ao longo de 35 anos.
Fonte: Rosillo-Calle et al, 2009.

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
II.4. O girassol
II.4.1. A cultura do girassol
O girassol (Helianthus annuus L.) uma planta anual, da famlia das Asteraceae, originria
da Amrica do Norte. As flores desta planta so caracterizadas por possurem grandes
inflorescncias do tipo captulo (flores inseridas num receptculo discide ou arredondado
protegido por brcteas), que podem variar dos 7 aos 30,5 cm na diagonal, com disco floral
escuro e lgulas radiais de cor amarela, nos casos mais comuns, mas que tambm podem
ter cor vermelho mogno, laranja ou branco e um caule, que pode atingir at trs metros de
altura. Uma caracterstica peculiar do girassol o heliotropismo - movimento da planta em
direco ao sol - da qual deriva o seu nome comum. A flor do girassol contm no seu interior
vrias centenas de sementes, com um comprimento entre 0,8 e 1,7 centmetros e largura
entre 0,4 e 0,9 centmetros, sendo que a cor das mesmas varia de acordo com a variedade
de girassol, podendo ir do preto, ao branco, passando por preto com listas verticais brancas
(Grompone, 2005; RaB et al, 2008).
Os girassis tiveram a sua origem em 3000 a.C. nos povos indgenas da Amrica do Norte
que os cultivavam para alimentao, no entanto, apenas no sculo XVI as sementes desta
planta foram levadas para a Europa (Grompone, 2005). Actualmente cultivada em todo o
mundo (Figura 4), sendo uma oleaginosa que apresenta caractersticas agronmicas muito
importantes, como o rpido crescimento, elevada resistncia seca, s temperaturas baixas
e ao calor, o que lhe confere grande adaptabilidade a diferentes condies climatricas. Em
Portugal, devido capacidade de adaptao da cultura do girassol ao clima seco e quente,
a quase totalidade da produo nacional ocorre no Alentejo (Figura 5).

Produo de girassol em kg/ha


Figura 4: Produo mundial de girassol em kg/ha.
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Sunflower.

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Esta grande versatilidade ainda reforada pelas vrias aplicaes relativas ao girassol,
das quais se podem destacar:

dos frutos, mais comummente chamados de sementes, extrado o leo de girassol,


utilizado na alimentao humana - para cozinhar, em cru ou em margarinas - na rea
dos cosmticos e na produo de biodisel;

tambm as sementes desta planta podem ser utilizadas na alimentao humana;

das flores do girassol pode ser produzido


mel;

em

substituio

de

outros

gros,

semente de girassol muitas vezes


utilizada na alimentao animal, assim
como as suas folhas;

a flor comercializada como ornamento,


sendo algumas variedades especialmente
produzidas para este fim;

Figura 5: Produo nacional de girassol.

o girassol pode ser usado em adubao

Fonte: INE, 2011.

verde, devido ao seu desenvolvimento inicial rpido, eficincia desta planta na


reciclagem de nutrientes e como agente protector dos solos contra a eroso e infestao
de invasoras, atravs do fenmeno da alelopatia - capacidade que as plantas possuem
de produzirem substncias qumicas que, libertadas no ambiente de outras, influenciam
de forma favorvel ou desfavorvel o seu desenvolvimento;

os caules desta planta possuem uma fibra que pode ser utilizada na produo de papel.

II.4.2. leo de girassol


A grande importncia econmica do cultivo de girassol a nvel mundial deve-se excelente
qualidade do leo comestvel que se extrai da semente desta planta, que considerado
dentro dos leos vegetais, um dos que possui melhor qualidade a nvel nutricional e
organolptico (aroma e sabor). Alm disso, a massa resultante da extraco do leo altamente proteca - pode ser utilizada para produo de alimentao animal (Grompone,
2005).
Os maiores produtores de leo de girassol a nvel mundial so a Ucrnia, Rssia, Europa e
Argentina, no entanto, os maiores consumidores so a Europa, a Rssia e a Turquia
(Carvalho, 2010). A importncia de um leo em termos de consumo reflecte, em parte, a
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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
distribuio geogrfica da produo de sementes ou frutos associados a esse leo, bem
como dos usos e costumes do povo em questo. Assim, se justifica a elevada produo de
leo de girassol em regies de grande abundncia de sementes, onde o seu consumo
muito reduzido e pases com baixa produo de leo face s necessidades de consumo.

Produo e Consumo
(em milhares de toneladas)

5000
4000

Consumo
Produo

3000
2000
1000
0

Pas
Figura 6: Principais pases de produo e consumo de leo de girassol.
Adaptado de Carvalho, 2010.

O leo de girassol essencialmente constitudo por triacilgliceris (98 - 99 %) e uma


pequena fraco de fosfolpidos, tocoferis, esteris e ceras (fraco insaponificvel).
Possui um elevado teor em cidos gordos insaturados (cerca de 83 %), mas um teor
reduzido em cido linolnico ( 0,2 %), sendo rico essencialmente em cido linoleico, um
dos cidos gordos essenciais. As variaes no teor deste cido gordo so consequncia
no s da variedade, como de diferenas climticas durante o seu cultivo. Dois factores que
favorecem este leo em termos de qualidade nutricional so o facto de proporcionar um
cido gordo essencial (cido linoleico) e possuir, simultaneamente, baixa quantidade de
cido palmtico que se pensa aumentar o colesterol LDL no sangue (Grompone, 2005).
Para alm disto, o cido linoleico presente no leo de girassol, pertencente ao grupo dos
cidos gordos mega 6, transformado pelo organismo humano em cido araquidnico e
em outros cidos gordos polinsaturados. Os mega 6 derivados do cido linoleico exercem
um importante papel fisiolgico ao participarem na estrutura das membranas celulares,
influenciando a viscosidade sangunea, permeabilidade dos vasos, aco anti-agregadora,
presso arterial, reaco inflamatria e funes plaquetrias (Moraes & Colla, 2006).

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Este leo possui como constituinte maioritrio da sua fraco tocoferlica a forma tocoferol, ao contrrio da maioria dos leos vegetais que tm a forma - tocoferol. O tocoferol presente no leo de girassol apresenta, a temperaturas elevadas, menor actividade
antioxidante do que o - tocoferol dos leos em que mais abundante, mas, por outro lado,
o leo de girassol apresenta maior actividade em vitamina E do que os leos onde
predomina a forma tocoferol (Grompone, 2005).

Quadro III: Composio nutricional mdia do leo de girassol (valores por 100 g).

Valores nutricionais por 100 g


Energia

884 kcal

Hidratos de carbono
Gordura

0g
100 g

Saturada

10,3 g

Monoinsaturada

19,5 g

Polinsaturada

65,7 g

Protena

0g

Vitamina E

41,08 mg

Vitamina K

5,4 g

Adaptado de Grosvenor & Smolin, 2002; Karleskind, 1996.

Para alm do leo de girassol rico em cido linoleico, existem hoje disponveis no mercado
outros tipos de leo de girassol (Karleskind, 1996):

leo de girassol com alto teor de cido linoleico (leo de girassol tradicional);

leo de girassol com elevado teor de cido oleico (aproximadamente 82 % de cido


oleico);

leo de girassol com teor mdio de cido oleico (aproximadamente 69 % de cido


linoleico).

As variaes nos perfis de cidos gordos so fortemente influenciadas tanto por factores
genticos da cultura, como pelo clima, sendo que se justifica o aparecimento deste tipo de
leos de girassol modificados de forma a aumentar a estabilidade oxidativa do mesmo diminuindo o contedo em cidos gordos polinsaturados e aumentando os monoinsaturados
- mantendo o baixo nvel de gordura saturada (Quadro IV) e a riqueza em vitamina E.
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Quadro IV: Comparao da composio em cidos gordos de leo de girassol tradicional e leo de
girassol com elevado teor em cido oleico.
Composio (%)
cido gordo

leo de girassol

leo de girassol com elevado teor em

tradicional

cido oleico

cido Palmtico (C16:0)

cido Esterico (C18:0)

cido Linoleico (C18:2)

70

cido Oleico (C18:1)

16

83

cido Linolnico (C18:3)

Pequenas quantidades

Pequenas quantidades

Adaptado de Karleskind, 1996.

O leo de girassol , assim, uma fonte importante de cidos gordos essenciais e de vitamina
E, que pode ser utilizado a frio directamente sobre os alimentos, em molhos para saladas,
maionese, entre outros. Entra ainda na composio de numerosas margarinas e cremes
vegetais de barrar, em combinao com outros componentes de ponto de fuso mais
elevado e na produo de produtos de panificao e de conservas, tendo em conta que o
seu teor de gordura saturada mais baixo do que o de leos de milho ou soja, por exemplo.
Tambm pode ser utilizado como leo de fritura, em especial as variedades ricas em cido
oleico, cuja estabilidade s alteraes pelo aquecimento superior das variedades com
teores elevados de cido linoleico.

II.5. A soja
II.5.1. A cultura da soja
A soja (Glycine max), originria do leste Asitico, pertencente famlia Fabaceae, uma
leguminosa rica em protena, que cultivada para alimentao humana e animal e ainda
para a produo de biodiesel. Esta leguminosa foi durante muito tempo um alimento
desconhecido, excepto para segmentos muito especficos da populao - por exemplo, os
vegetarianos - no entanto, hoje amplamente usada na alimentao humana, quer na forma
de bebida (mais conhecida como leite de soja), quer na forma de tofu ou como ingrediente
de sumos de fruta e iogurtes.
A soja uma planta anual, cultivada nos meses mais quentes - com temperaturas entre os
20 e 40 C - sendo uma cultivar muito rentvel, visto que uma planta muito resistente a
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
parasitas. A altura desta leguminosa pode variar entre os 20 centmetros e os 2 metros; as
vagens, caules e folhas esto cobertos de pequenos plos castanhos ou cinzentos e as
folhas so trifoliadas, com trs a quatro folhetos por cada folha. As flores frteis nascem na
axila da folha e podem possuir cor branca, rosa ou roxa, sendo que, antes das sementes
atingirem a maturidade, caem as folhas. O fruto, que cresce em aglomerados de trs ou
quatro, uma vagem peluda de 3 a 8 centmetros e contm cerca de duas a quatro
sementes no seu interior. A semente da soja possui um invlucro duro, resistente gua e
com funo de proteco da mesma, podendo este possuir vrias cores, incluindo preto,
castanho, azul, amarelo e verde. A semente constituda por aproximadamente 40 % de
protena, 21 % de leo, 34 % de hidratos de carbono e 5 % de cinzas (Wolf & Cowan, 1975).
A cultura da soja teve a sua origem no leste Asitico, onde possuiu um importante papel
como parte da dieta das populaes durante sculos. No inicio do sculo XVIII esta cultura
foi introduzida na Europa e em 1765 nas colnias britnicas da Amrica do Norte, onde foi
inicialmente cultivada para forragem. No entanto, apenas em 1910 a cultura da soja ganhou
a devida importncia alimentar fora do continente Asitico, sendo que na Amrica foi
considerada apenas um produto industrial, at 1920, altura em que comeou a ser
considerada mais importante a nvel alimentar (Wolf & Cowan, 1975). Actualmente os
maiores produtores de soja a nvel mundial so os Estados Unidos da Amrica, Brasil e
Argentina (Figura 7), tendo, entre 1970 e 2007, os dois ltimos vindo a aumentar a produo
desta leguminosa, relativamente aos Estados Unidos da Amrica. A produo mundial desta
semente em 2009/2010 foi de aproximadamente 260 milhes de toneladas (The AOCS Lipid
Library, 2011).

6%

3% 3% 1%

EUA

4%
35%

Brasil
Argentina

21%

China
ndia
27%

Paraguai
Canad
Outros

Figura 7: Principais pases produtores de soja (dados de 2009/2010).


Adaptado de The AOCS Lipid Library, 2011.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
A soja considerada uma fonte completa de protena, pois contem quantidades
significativas de todos os aminocidos essenciais, que tm necessariamente de ser
fornecidos ao organismo humano, visto que este no possui capacidade de os sintetizar.
Para alm disto, esta leguminosa e os seus derivados, ricos em isoflavonas, desempenham
um papel importante na atenuao ou tratamento dos sintomas associados menopausa
(calores, afrontamentos, dores articulares, aumento de peso, etc.). O seu elevado teor de
fibra de extrema importncia para o trnsito intestinal e para evitar picos de glucose no
sangue, visto que retarda a absoro de acares, sendo extremamente benfico para
diabticos. Para indivduos com estmago sensvel, a soja pode no ser tolerada, devendose, neste caso, optar pelos derivados fermentados, sendo que a fermentao leva a um
aumento do teor de vitamina B12, que quase exclusiva de alimentos animais, pelo que,
este tipo de alimento essencial para uma dieta vegetariana (Silva, 2001; Wolf & Cowan,
1975).

II.5.2. leo de soja


As sementes da soja podem ser processadas de variadas maneiras, originando refeies de
soja, farinha, leite de soja, tofu, protena vegetal texturizada usada na preparao de vrios
alimentos vegetarianos, lecitina de soja e leo de soja. No entanto, a maioria da cultura
desta leguminosa destina-se produo do correspondente leo vegetal, resultando da
extraco do mesmo uma pasta com elevado teor proteico, que utilizada para alimentao
animal. Apenas uma pequena quantidade do cultivo da soja destinado ao consumo
humano directo (Silva, 2001).
A produo de leo de soja altamente dependente do mercado existente para o respectivo
bagao e/ou produtos base de gro integral, comparativamente com os outros leos
vegetais. A importncia da protena de soja tem conduzido a elevadas produes de leo de
soja, apesar deste ter um elevado nvel de cidos gordos polinsaturados, que o tornam
susceptvel oxidao e consequentemente promove o desenvolvimento de odores e
sabores estranhos, bem como um elevado contedo em fosfatdeos, que necessitam de ser
removidos, mas que constituem uma importante fonte comercial de lecitina. Uma
possibilidade em questo para a resoluo deste obstculo passa pelo melhoramento
gentico da cultura da soja, com a finalidade de obter sojas do tipo oleico, que representam
uma gordura mais estvel em termos de oxidao (Silva, 2001).

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Os maiores produtores e consumidores de leo de soja, a nvel mundial, so os Estados
Unidos da Amrica, China, Brasil e Argentina, sendo que a Europa consome pouco mais do
que aquilo que produz (Figura 8). Segundo dados de 2009/2010, tanto a produo como o
consumo mundial deste leo aproxima-se das 38 milhes de toneladas (The AOCS Lipid
Library, 2011).

Produo e Consumo de leo de Soja


(milhes de toneladas)

12
Produo

10

Consumo
8
6
4
2
0

Pas
Figura 8: Principais produtores e consumidores de leo de soja (dados de 2009/2010).
Adaptado de The AOCS Lipid Library, 2011.

A semente da soja possui aproximadamente 20 % de leo, que um dos mais consumidos


a nvel mundial, exceptuando apenas o leo de palma (Carvalho, 2010). O leo de soja
bruto constitudo tipicamente por 96 % de triglicridos, 2 % de fosfolpidos, 1,6 % de
matria insaponificvel (maioritariamente esteris e tocoferis), 0,5 % de cidos gordos
livres, bem como, pequenas quantidades de pigmentos carotenides, sendo que, aps
refinao do leo, a fraco no triglicerdica fica reduzida a menos de 1 % (Silva, 2001). A
composio em cidos gordos do leo de soja depende da variedade e das condies de
cultura, mas uma composio tpica ser de 10 - 18 g de gordura saturada, 17 - 26 g de
monoinsaturada e 54 - 72 g de polinsaturada, por cada 100 g de leo de soja. Os cidos
gordos insaturados maioritrios no leo de soja (Quadro VI) compreendem 4 a 10% de cido
-linolnico (C18:3), 50 a 62 % de cido linoleico (C18:2) e 17 a 26 % de cido oleico
(C18:1). Contm ainda cidos gordos saturados aproximadamente 2 a 5 % de cido
esterico (C18:0) e 8 a 13 % de cido palmtico (C16:0) que so cidos gordos saturados
de cadeia longa (Karleskind, 1996).

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Quadro V: Composio nutricional mdia do leo de soja (valores por 100 g).
Valores nutricionais por 100 g
Energia

886 kcal

Hidratos de carbono

0g

Gordura

98,5 g
Saturada

15,5 g

Monoinsaturada

22,1 g

Polinsaturada

55,6 g

Protena

0g

Vitamina E

16 mg
Adaptado de Grosvenor & Smolin, 2002; Karleskind, 1996.

O leo de soja possui aplicaes alimentcias diversificadas tais como leo de cozinha,
tempero de saladas, produo de margarinas, gordura vegetal, maionese, entre outras. Uma
vantagem do leo de soja relativamente aos outros leos vegetais o seu baixo preo
aliado excelente qualidade. Para alm disto, os bagaos resultantes da extraco do leo
de soja so ricos em protena e por isso so procurados como suplemento proteico, no s
para raes animais, mas tambm como suplemento proteico vegetal na alimentao
humana, que , a nvel mundial, muito pobre em protenas de origem vegetal (Silva, 2001).

Quadro VI: Composio tpica em cidos gordos do leo de soja.


cido gordo

Composio (%)

cido Palmtico (C16:0)

8 13

cido Esterico (C18:0)

25

cido Linoleico (C18:2)

50 62

cido Oleico (C18:1)

17 26

cido Linolnico (C18:3)

4 - 10

Adaptado de Karleskind, 1996.

O facto do leo de soja ser rico em gorduras polinsaturadas, torna-o importante como fonte
de cidos godos essenciais cido linoleico e linolnico que possuem como funo a
proteco das artrias da deposio do colesterol, facilitam ainda o processo digestivo e
promovem a absoro de vitaminas lipossolveis (A, D, E, K) (Guin & Henriques, 2011).

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
II.6. Modo de produo de um leo vegetal
Os leos vegetais podem ter origem na polpa dos frutos ou em sementes oleaginosas,
sendo que, os mtodos de extraco de um leo variam consoante a matria-prima de
partida, tendo em conta que as sementes podem ser armazenadas, enquanto a polpa de
frutos necessita de ser imediatamente processada, para evitar decomposio lipdica, que
se inicia imediatamente aps a colheita.
No entanto, a maioria dos leos vegetais obtido a partir de sementes oleaginosas por
processos de extraco, que originam um leo bruto, o qual sofre posteriormente refinao.
Este processo pode dividir-se em trs blocos com vrias etapas (Freire, 2002):

Pr-tratamentos: seleco e limpeza das sementes, secagem, descasque, triturao


e cozedura;

Obteno do leo: extraco, eliminao de solventes;

Refinao: desgomagem, neutralizao, branqueamento e desodorizao.

Relativamente etapa de pr-tratamento h a salientar que antes de se proceder


extraco do leo necessrio averiguar a qualidade das sementes e a rentabilidade do
processo. Os aspectos da colheita, armazenamento e manuseamento de oleaginosas so
factores importantes a ponderar na avaliao do seu valor comercial. Material estranho, tal
como folhas verdes, sementes imaturas, insectos, pigmentos, humidade e temperatura
podem provocar oxidao e deteriorao da matria-prima.
Aps a colheita, as sementes oleaginosas so sujeitas a um processo de secagem, o que
permitir um armazenamento prolongado, com o mnimo de deteriorao. Procede-se em
seguida remoo de impurezas recorrendo para tal a aspiradores, peneiras e ims. Este
um passo de extrema importncia para a obteno de um leo de elevada qualidade e
tambm para prevenir que ocorram danos nos equipamentos. Aps a eliminao de
impurezas, muitas sementes necessitam de ser descascadas, de que exemplo, as
sementes de girassol, sendo que, este passo serve para aumentar a capacidade de
extraco. Em seguida procede-se cozedura, um passo importante na inactivao de
enzimas lipolticas ou outras indesejveis e para promover o rompimento da estrutura da
clula (Freire, 2002).
O passo seguinte aps o pr-tratamento das sementes a obteno propriamente dita
do leo, sendo que, a extraco, na maioria dos casos, se realiza mediante presso,
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
seguida de extraco com um solvente orgnico. Nesta segunda extraco tritura-se o
resduo, seca-se e submete-se a uma extraco por percolao, habitualmente em
contracorrente. A mistura solvente/leo separa-se por destilao com recuperao de
solvente. Um dos solventes permitidos e dos mais usados o hexano, que, apesar de ser
inflamvel, menos txico do que os outros possveis solventes. O bagao resultante do
processo de remoo de solvente destinado alimentao animal (Freire, 2002).
O produto obtido por presso e extraco das sementes oleaginosas um leo bruto, que
contm 10 a 15 % de impurezas, principalmente cidos gordos livres e fosfolpidos, que so
posteriormente eliminados atravs de um processo de refinao. necessria a eliminao
destes compostos, pois podem conferir sabor, cheiro e aparncia desagradveis e diminuir a
estabilidade do produto final. A refinao engloba quatro processos (Freire, 2002):
a) Desgomagem: uma etapa que visa remover fosfatdios que, devido ao seu poder
emulsionante, conduziriam a perdas de leo durante o processo de refinao. Na
desgomagem procede-se hidratao dos fosfatdios usando solues aquosas de
cido fosfrico ou ctrico a 60 80 C. Os fosfatdios tornam-se insolveis no leo, sendo
removidos por centrifugao ou filtrao.
b) Neutralizao: a segunda etapa do processo de refinao, sendo necessria pelo facto
de os leos brutos possurem teores elevados de cidos gordos livres, que um risco
acrescido de deteriorao oxidativa do leo em questo. Uma colheita cuidada e um
armazenamento adequado das sementes so muito importantes para a obteno de um
leo bruto com um teor em cidos gordos livres reduzido. Estes compostos provocam
odores desagradveis, irritao na lngua e garganta, pelo que, tm de ser removidos
para que leo se torne edvel. Para a remoo dos cidos gordos livres, os leos so
tratados com hidrxido de sdio (NaOH) ou potssio (KOH) a quente. Os cidos gordos
precipitam na forma de sabo e podem ser eliminados por adio de gua e
decantao/centrifugao. Na soluo alcalina tambm podem ser eliminadas outras
impurezas como protenas, fosfolpidos e sais minerais.
c) Branqueamento: o seu principal objectivo a remoo dos compostos corados
indesejveis presentes nos leos brutos ou parcialmente refinados. O mtodo baseia-se
na oxidao/absoro de pigmentos, recorrendo-se para tal a terras ou carbono
activados, o que origina um produto sem cor. Nesta fase podem ainda ser eliminados
perxidos, ies de metais pesados, aflotoxinas e alguns pesticidas.
d) Desodorizao: normalmente o ltimo passo na refinao de leos. Consiste
basicamente em eliminar algumas substncias, no eliminadas nas fases anteriores e/ou
resultantes de degradaes ocorridas ao longo do processo de refinao, que produzem
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
odores desagradveis, como aldedos, cetonas ou resduos de cidos gordos livres.
Recorre-se para tal a destilao a presso reduzida e temperaturas prximas de 200 C,
devendo evitar-se aquecimentos prolongados que podem originar polimerizao. A
remoo destas substncias assegura a estabilidade do produto, garantindo-lhe um
perodo de vida aceitvel.

Em geral no se quantificam com rigor as caractersticas do leo aps cada etapa de


refinao, no entanto, imprescindvel um controlo eficaz de todas as operaes unitrias,
de modo a satisfazer as especificaes impostas por lei, para cada tipo de leo. As
caractersticas finais do leo refinado so avaliadas com base em anlises fsico-qumicas e
organolpticas, recorrendo-se, para tal a um painel de provadores.
A extraco recorrendo a hexano continua a ser uma questo problemtica no
desenvolvimento da indstria dos leos. O hexano usado comercialmente no n-hexano
puro, mas uma fraco do petrleo, que consiste numa mistura de hidrocarbonetos
saturados com seis tomos de carbono, da qual o n-hexano pode estar na percentagem de
50 a 90 % em volume (iso-hexano e metilciclopentano costumam estar presentes em
quantidades apreciveis). No controlo de qualidade do solvente deve ter-se em ateno que
o ponto de ebulio no pode ser inferior a 65 C, no deve conter enxofre (produz odores
indesejveis e cria problemas na refinao e hidrogenao) e os teores em benzeno e
outros compostos aromticos devem ser baixos, dada a sua toxicidade. As principais
desvantagens do hexano relacionam-se com a alta inflamabilidade e dependncia do
petrleo como matria-prima (Freire, 2002).
Para o objectivo deste trabalho a implementao de um mtodo para a determinao de
contaminao por leo mineral, em leo de girassol importante saber o modo de
produo de um leo, visto que, nesta etapa que, mais provavelmente, o leo de girassol
pode ser contaminado atravs do contacto com hexano impuro.

II.7. leo mineral


O leo mineral, tambm chamado de parafina lquida, vaselina lquida ou leo branco, um
produto secundrio derivado da destilao do petrleo no processo de produo de
gasolina, sendo, consequentemente, produzido em grandes quantidades e logo, um produto
de baixo custo. Caracteriza-se por ser um leo transparente, incolor e quimicamente quase

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
inerte, composto essencialmente por alcanos - tipicamente entre 15 e 40 carbonos - e
parafinas cclicas (Karasek et al, 2010).

II.7.1. Aplicaes do leo mineral


As possibilidades de utilizao deste leo so diversas:

como leo de refrigerao e isolamento de transformadores elctricos;

para transporte e armazenamento de metais alcalinos (evitando a reaco destes com a


humidade atmosfrica);

na rea medicinal, como laxante;

como hidratante em cremes e loes;

como auxiliar tecnolgico (por exemplo, como lubrificante);

na forma de emulso (numa mistura de gua, sabo e leo mineral) no combate a


pulges e colchonilhas em plantas, ou seja, como produto fitossanitrio, sendo este
classificado ao nvel ecotoxicolgico como isento, ou seja, no apresenta problemas ao
nvel ambiental e para a sade humana, podendo mesmo ser usado em agricultura
biolgica;

como aditivo alimentar (por exemplo, como agente de revestimento).

Devido a esta diversidade de aplicaes, este leo produzido em dois graus de pureza:
em grau tcnico e em grau medicinal ou grau alimentar, sendo este ltimo uma fraco do
leo mineral ao qual foram extrados, com recurso a solventes, os hidrocarbonetos
aromticos e subsequentemente sujeito a hidrogenao para converter o resduo de
hidrocarbonetos aromticos em hidrocarbonetos saturados.

II.7.2. leo mineral em alimentos


A presena de hidrocarbonetos de origem mineral em vrios alimentos conhecida desde o
incio de 1990. So exemplos disso, as nozes, gros de caf, arroz e outros alimentos que
so vulgarmente transportados e armazenados em embalagens de sisal e juta, que
possuem frequentemente contaminao por leo mineral, libertado das fibras lubrificadas.
Este lubrificante das fibras no de grau alimentar, pelo que, possui elevadas quantidades
de hidrocarbonetos aromticos e poliaromticos. Outro exemplo, compreende salame,
bombons, mel e outros produtos que entram em contacto com materiais de embalagem
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
contendo leo mineral, como o caso de papel encerado, caixas revestidas com papel
encerado ou latas revestidas de parafina. Tambm o po, biscoitos e outros produtos de
padaria

podem

aparecer

contaminados

com

hidrocarbonetos

de

origem

mineral

provenientes da utilizao de leo mineral como agente antiaderente, ou seja, para facilitar o
desenformar dos produtos de padaria (Fiorini et al, 2008; Karasek et al, 2010; Moret et al,
1997). Alimentos secos para bebs e cereais podem apresentar este tipo de contaminao
resultante da migrao dos componentes mais volteis, da mistura que se designa leo
mineral, do papel reciclado de que feita a cartonagem ou das impresses feitas na mesma
- uma vez que, as tintas usadas para ilustrar as cartonagens que embalam os alimentos so
uma mistura de componentes que compreendem, entre outros, produtos derivados do leo
mineral de elevado ponto de ebulio (Droz & Grob, 1997; Vollmer et al, 2011). Os vegetais
tambm podem apresentar este tipo de contaminao proveniente de poluio ambiental ou
de resduos de formulaes de pesticidas (Fiorini et al, 2008).
No entanto, a contaminao com hidrocarbonetos de origem mineral nunca havia sido
considerada perigosa para a sade at ao incidente, em 2008, das 100 000 toneladas de
leo de girassol proveniente da Ucrnia contaminado com elevadas concentraes de leo
mineral, tendo em conta que dentre as vrias toneladas contaminadas, existia leo de
girassol bruto contaminado com at 7000 mg/kg e leo de girassol refinado com 2000
mg/kg. A provenincia desta contaminao elevadssima nunca chegou a ser confirmada,
mas as autoridades suspeitam de fraude, com a adio intencional de leo mineral ao leo
de girassol (Biedermann & Grob, 2009).
A contaminao de leo de girassol por leo mineral pode ocorrer em trs situaes
distintas, sendo, na maioria dos casos, difcil rastrear a origem de tal contaminao:
Contaminao com resduos de produtos fitossanitrios, o que uma situao rara, visto
que, o pesticida que contm na sua formulao leo mineral (chamado leo de vero)
considerado isento em termos toxicolgicos, pelo que, no persiste por perodos longos
nos produtos onde aplicado e, assim, considera-se que no perigoso para a sade;
Contaminao durante a etapa de extraco do leo, o que pode ocorrer por utilizao de
n-hexano (solvente de extraco) contaminado ou por fugas de leo dos equipamentos
ou ainda por contacto do leo vegetal com leo utilizado para efeitos de limpeza e
manuteno desses mesmos equipamentos, sendo esta a justificao mais comum para
o aparecimento deste tipo de contaminao;
Deposio de leo mineral nas sementes de girassol a partir do ar, ou seja, resultante de
poluio, que pode ter um contributo extremamente elevado e importante para a
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
contaminao de produtos alimentcios com leo mineral, resultante de gases expelidos
do tubo de exausto de motores a diesel, poeiras de estradas pavimentadas, gases
libertados de motores a gasolina, fumos da operao de transformar industrialmente
carnes e fumaa da queima de madeira - listados por ordem de importncia (Neukom et
al, 2002).

II.7.3. Toxicidade do leo mineral


Os hidrocarbonetos de origem mineral podem entrar em contacto com o corpo humano, no
s pela via alimentar, mas tambm atravs de cosmticos, produtos farmacuticos e pelo
ambiente.
A nvel toxicolgico, o leo mineral de grau alimentar ou medicinal geralmente seguro para
o contacto e consumo por parte do ser humano e foi aprovado pela Food and Drug
Administration - FDA o seu uso ao nvel de cuidados pessoais e produtos cosmticos, assim
como aditivo alimentar, possuindo uma dose de ingesto diria aceitvel (ADI) de 10 mg/kg
de peso vivo (Fiorini, 2010). Assim, o leo mineral de grau alimentar tambm conhecido
como leo mineral branco no constitui um perigo toxicolgico, podendo mesmo ser usado
como aditivo alimentar (que declarado no rtulo dos alimentos em que utilizado como
tal), no entanto, uma presena inesperada de leo mineral num dado alimento deve ser
sempre considerado um alerta, visto no existir informao acerca da provenincia e
composio desse leo mineral.
Ainda relativamente investigao da toxicidade do leo mineral, foi efectuado um estudo
pela Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) para avaliao
toxicolgica do mesmo, sendo, para tal, os derivados do leo mineral agrupados em classes
(Grundbck et al, 2010):
O leo mineral considerado de baixa toxicidade desde que seja altamente refinado ou
um leo branco (leo de grau alimentar), ou seja, constitudo exclusivamente por
hidrocarbonetos saturados e com massa molecular suficientemente elevada para que a
absoro por parte do organismo seja o mais baixa possvel (massa relativa de pelo
menos 480 Da e menos de 5 % de componentes abaixo dos C25), possuindo neste caso,
um nvel dirio de ingesto aceitvel de 10 mg/kg de peso vivo;
leos minerais com baixas massas moleculares e mais de 5 % de componentes abaixo
dos C25, possuem um ADI 1000 vezes mais baixo, ou seja 0,01 mg/kg de peso vivo.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Neste estudo (Grundbck et al, 2010) verificou-se que a maior parte das contaminaes
contabilizadas pertence segunda classe considerada, logo, assumindo um peso de 60 kg e
o consumo dirio de 1 kg de alimentos contaminados com leo mineral deste tipo, o limite
legal ser de 0,6 mg por kg de alimento. No entanto, estes clculos no tm em conta que,
segundo este mesmo estudo, a maior parte dos leos minerais que contaminam os
alimentos no so de grau alimentar e, portanto, contm compostos aromticos. Assim,
tendo em conta os dados dos estudos toxicolgicos efectuados pela JECFA neste mbito,
verifica-se que nem um valor de 0,6 mg/kg para o limite de contaminao por leo mineral
no prprio para fins alimentares, pode no ser considerado seguro.
O que se verifica ao nvel de estudos toxicolgicos (Grundbck et al, 2010; EFSA, 2009)
que se tem negligenciado o facto de o leo mineral ser extremamente importante em termos
de toxicidade para o organismo humano, visto que um dos contaminantes alimentares
mais encontrados nos diversos alimentos, normalmente com origem desconhecida, e um
dos maiores contaminantes no organismo humano, tendo uma pessoa em mdia 1 g de
parafinas minerais acumulada na gordura, atingindo em casos extremos as 10 g (Concin et
al, 2008; Fiorini et al, 2008; Grundbck et al, 2010).
Estimativas conservadoras indicam que o consumo dirio de parafinas minerais, a nvel
Europeu, oscila entre 0,39 e 0,91 mg por kg de peso vivo, por dia, para um adulto e na
ordem de 0,75 a 1,77 mg por kg de peso vivo, por dia, para uma criana (Tennant, 2004),
sendo as fontes de tal exposio o mais variadas possvel, dadas as aplicaes do leo
mineral a nvel alimentar. Estes valores correspondem a uma concentrao mdia de leo
mineral nos alimentos de 25 a 60 mg/kg, tendo como referncia o consumo de um
quilograma de alimento por dia. O organismo humano tem ainda contacto com
hidrocarbonetos minerais atravs de cosmticos e medicamentos, no entanto, para este tipo
de produtos no existem estudos sobre exposio.
Tendo em conta a informao disponvel em termos de estudos toxicolgicos, efectuados
com animais (EFSA, 2009; Nash et al, 1996) no existem evidncias que sugiram que a
exposio tpica crnica ou sub-crnica a leo mineral branco, ou seja, altamente refinado,
produza mudanas significativas ou alteraes histopatolgicas ao nvel dos rgos internos
ou nos locais de aplicao. Analogamente, no existe evidncia de que exposio tpica
crnica a leos minerais brancos produza qualquer efeito adverso ou diminua o tempo de
vida dos animais onde tais estudos foram efectuados. A preocupao relativamente
exposio a leos minerais est amplamente relacionada com os resultados obtidos num
estudo com ratos, onde a ingesto durante noventa dias de leo mineral produziu
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
granulomas ao nvel do fgado e histiocitose nos linfonodos mesentricos, sem qualquer
toxicidade clnica evidente, sendo que se verificou posteriormente, por reproduo do estudo
com outras espcies, que estes sintomas s acontecem especificamente nesta espcie.
Para alm disso, a importncia das alteraes histopatolgicas, verificadas nessa espcie
isoladamente, so questionveis, dada a ausncia de toxicidade clnica ou impacto
mensurvel no bem-estar ou esperana mdia de vida do animal (EFSA, 2009; Nash et al,
1996).
Em estudos de toxicidade a curto prazo do leo mineral toxicidade aguda (EFSA, 2009),
foram efectuados testes em ratos utilizando uma grande diversidade de tipos de leos
minerais, desde leos de baixa viscosidade, at elevada viscosidade. Verificou-se que os
leos de maior viscosidade no induziram qualquer efeito histopatolgico; os leos de mdia
viscosidade no produziram efeitos adversos, apesar de existirem evidncias da presena
de hidrocarbonetos minerais no fgado; relativamente ao leo de mais baixa viscosidade
verificaram-se efeitos ao nvel do fgado e dos nodos linfticos, consistindo as alteraes
num aumento do peso dos rgos, presena de hidrocarbonetos minerais no fgado e
alteraes granulomtricas no mesmo, assim como aparecimento de histiocitose. Assim, o
grau de toxicidade aguda do leo mineral est inversamente relacionado com viscosidade
do mesmo. Estes estudos permitiram calcular um NOAEL (No Observed Adverse Effect
Level) de 2000 mg/kg de peso vivo/dia para leos de alta e mdia viscosidade.
Algumas consideraes farmacodinmicas importantes aps exposio oral ou tpica a leo
mineral possuem impacto na deposio e potencial de alteraes patolgicas atribudas a
essa administrao de leo. razovel assumir que, aps administrao oral, os
hidrocarbonetos minerais absorvidos pelo tracto gastrointestinal so transportados para o
fgado pela circulao normal, sendo assim o fgado exposto a concentraes relativamente
elevadas de hidrocarbonetos minerais, podendo resultar em alguma acumulao, como uma
resposta fisiolgica natural. Similarmente, os linfonodos mesentricos estaro expostos
inicialmente a quantidades relativamente elevadas de hidrocarbonetos minerais aps uma
dose de ingesto oral, comparativamente com outros tecidos mais distantes. Tambm, dada
a absoro limitada de leos minerais por parte da pele, torna-se pouco provvel, mesmo
que sob condies extremas, que uma quantidade significativa de material esteja disponvel
para distribuio por outros tecidos, como por exemplo, os linfonodos mesentricos.
Ao nvel do leo de girassol ficou estabelecido, pelo Standing Committee on The Food Chain
and Animal Health e pela Comisso Europeia, em 2008, aquando do episdio de leo de
girassol Ucraniano contaminado, um limite mximo de 50 mg/kg de leo de mineral, tanto
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
em leo de girassol bruto, como em leo de girassol refinado (Fiselier & Grob, 2009;
Karasek et al, 2010).

II.8. Cromatografia gasosa


Para a determinao de hidrocarbonetos alifticos saturados com origem em leo mineral, o
mtodo especificado neste trabalho, assim como a norma ISO relativa a esta determinao,
utilizam cromatografia gasosa em coluna capilar com injeco on column e detector FID.
A cromatografia a designao dada a uma tcnica de separao, que permite separar e
detectar analitos especficos em misturas complexas e diversificadas. Esta tcnica baseia-se
na interaco diferenciada dos analitos a separar entre uma fase mvel e uma fase
estacionria, podendo definir-se diferentes tipos de cromatografia consoante o tipo destas
duas fases. Quando a fase mvel um gs, esta chama-se cromatografia gasosa, podendo
ainda ser classificada de cromatografia gs-slido, quando a fase estacionria um slido e
cromatografia gs-lquido quando a fase estacionria um lquido.
Na cromatografia gs-lquido a separao tem lugar numa coluna empacotada com um
material poroso, inerte sobre o qual o lquido, constituindo a fase estacionria se encontra
depositado sob a forma de um fino filme lquido. A amostra injectada no bloco de injeco
aquecido onde se evapora ou mais especificamente, neste caso, directamente na coluna
cromatogrfica (injeco on column) arrastada ao longo da coluna pelo gs, que
constitui a fase mvel. Durante este perodo, as molculas dos componentes, passam parte
do tempo na fase estacionria e outra parte na fase mvel, sendo assim, arrastadas atravs
do percurso cromatogrfico. O atraso relativo sofrido no percurso por cada componente,
leva a que surjam no final da coluna, a tempos diferentes. O tempo total de reteno vai ser
a soma do tempo que as molculas passam exclusivamente na fase mvel, com o tempo de
interaco com a fase estacionria (Dias, 2009).
A estrutura tpica de um cromatgrafo gasoso encontra-se esquematizada na Figura 9.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Forno

Hidrognio

Seringa

Ar comprimido

Injector

Electrnica do
detector,
amplificador e
interface

Detector FID

Azoto

Coluna

Figura 9: Esquematizao da estrutura de um cromatgrafo gasoso.


Adaptado de Kvasnicov & Balinov, 2006.

Os componentes de um cromatgrafo gasoso (Dias, 2009; Skoog et al, 1998)


compreendem:

Reservatrio de Gs

O gs de arraste deve ser inerte de modo que no interaja nem com a amostra, nem com a
fase estacionria. Os gases mais comummente usados so hlio, azoto e hidrognio, tendo
este ltimo o inconveniente de ser explosivo. Os caudais so regulados atravs de vlvulas
redutoras de alta presso.

Injector

As amostras a analisar podem ser gasosas, lquidas ou slidas, sendo o mtodo de injeco
diferente para cada caso. Neste trabalho especificamente as amostras a analisar encontrarse-o no estado lquido e a injeco efectuada on column. Numa injeco on column os
compostos a analisar so introduzidos directamente dentro da coluna. A injeco
efectuada a frio e a seringa, apropriada para o efeito, entra dentro da coluna. Este modo de
injeco utilizado para compostos de peso molecular elevado, termicamente instveis.

Coluna

A coluna chamada o corao do cromatgrafo, visto que aqui que se d a separao


dos compostos de interesse. As colunas podem ser classificadas em colunas de enchimento
e colunas capilares, tendo no entanto, as primeiras, entrado em desuso. As colunas
capilares so tubos capilares normalmente com dimetros internos de 0,05 a 0,50 mm e
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
com comprimentos que podem ir de 10 a 100 metros, revestidas interiormente por uma
camada muito fina de fase lquida. Estas colunas so mais eficientes que as colunas
empacotadas, obtendo-se melhores separaes a baixa temperatura e para menores
intervalos de tempo.

Detector

Existem vrios tipos de detectores, como detectores de ionizao por chama (FID), de
condutividade trmica, captura electrnica ou fotmetro de chama, no entanto, porque este
mtodo usa um detector FID, ser o detector de ionizao por chama o abordado nesta
anlise.

O design de um detector varia de fabricante para fabricante, no entanto, os princpios em


que se baseia a construo de um detector deste tipo so sempre os mesmos (Figura 10). O
eluente que sai da coluna cromatogrfica entra no forno do detector, sendo este forno
necessrio para assegurar que logo que o eluente deixa a coluna no abandona a fase
gasosa, o que levaria deposio do mesmo na interface entre a coluna e o detector,
resultando em perda de eluente e erros ao nvel da deteco. medida que o eluente viaja
ao longo do detector, primeiramente misturado com hidrognio e depois com o oxidante. A
mistura eluente/combustvel/oxidante continua a viajar ao longo do detector at fonte da
chama onde existe uma tenso positiva, que serve para afastar os ies de carbono
reduzidos, criados na chama num processo de pirlise. Os ies criados so ento repelidos
em direco aos pratos colectores, que esto conectados a um ampermetro extremamente
sensvel que vai detectar o choque dos ies com esses pratos, passando esse sinal depois
para o amplificador, em seguida para o integrador e depois ainda para o sistema de exibio
de resultados. Os produtos da chama so no final do processo expelidos para fora do
detector pela porta de escape (Skoog et al, 1998).

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Gases de Combusto

Conexo com o
elctrodo

Elctrodos
Cilndricos Isolados
Chama

Isolamento
Conexo com o
pulverizador

Pulverizador
electricamente isolado
Isolamento

Hidrognio

Ar ou Oxignio para
suportar a combusto

Fase mvel da coluna capilar


Figura 10: Esquematizao da estrutura de um detector de ionizao por chama.
Adaptado de http://www.chromatography-online.org/Chrial-GC/The-Flame-Ionization-Detector-FID.html.

Assim, o funcionamento de um sistema de cromatografia gasosa com injeco on column e


detector FID pode resumir-se da seguinte forma: as amostras so introduzidas no incio da
coluna cromatogrfica por intermdio de uma seringa apropriada para injeco directa na
coluna. A amostra arrastada pela fase mvel (gs de arraste) ao longo da coluna
cromatogrfica. Pela aplicao de um programa de rampas de temperaturas, os diferentes
compostos da mistura so separados. Estes compostos saem da coluna dissolvidos no gs
de arraste e passam pelo detector FID, onde iro sofrer pirlise temperatura da chama de
ar, pela aco de hidrognio, produzindo ies e electres que conduzem electricidade e
podem ser detectados (Dias, 2009).
Um aspecto a salientar o facto de nesta determinao de hidrocarbonetos alifticos
saturados em leo de girassol ser necessrio um pr tratamento da amostra por
cromatografia em coluna, com gel de slica prateada, antes da anlise por cromatografia
gasosa. Tal etapa importante, visto que, a maioria dos leos vegetais contm uma elevada
quantidade de alcanos lineares, que dificultam a quantificao de parafinas minerais - que
se apresentam numa bossa por baixo dos picos correspondentes aos n-alcanos especialmente quando a concentrao de leo mineral presente na amostra pequena. A

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
utilizao de gel de slica prateado permite ultrapassar esta limitao, uma vez que, retm nalcanos de cadeia longa (Fiorini et al, 2010; Fiselier & Grob, 2009).
A tcnica de cromatografia gasosa com deteco por FID foi a tcnica eleita para este tipo
de determinao, visto assumir-se que a resposta do detector FID constante para todos os
hidrocarbonetos alifticos e este um equipamento disponvel na maioria dos laboratrios
de anlise de alimentos. Existem, no entanto, outros tipos de tcnicas que podem ser
usadas para efectuar esta determinao permitindo diminuir o tempo de anlise,
minimizando o consumo de solvente e a manipulao da amostra, mas que, no entanto,
exigem equipamentos que no esto acessveis maioria dos laboratrios de anlises
alimentares e so extremamente caros. Exemplos de tcnicas alternativas cromatografia
gasosa com deteco por FID so sistemas que acoplam cromatografia lquida a
cromatografia gasosa (LC-GC) (Fiorini et al, 2010) ou sistemas que executam cromatografia
gasosa a duas dimenses (GC GC) (Ventura et al, 2008) ou a utilizao de cromatografia
gasosa a duas dimenses aps pr separao em cromatografia lquida de alta eficincia
(HPLC - GC GC) (Biedermann & Grob, 2009) ou ainda um sistema que acopla HPLC
evaporao de solvente HPLC GC FID (Moret et al, 1996). Claro que, sistemas mais
complexos permitem uma melhor caracterizao da mistura de compostos que se denomina
leo mineral, possibilitando, para alm da quantificao, a determinao da sua composio
e portanto a identificao da origem de tal contaminao - contaminao por leo mineral
tcnico ou de grau prprio para fins alimentares, o que uma tcnica mais simples como GCFID no permite.

II.9. Validao de um mtodo analtico


A primeira razo da existncia de um laboratrio de anlises qumicas a necessidade de
obter resultados dessas mesmas anlises, no entanto, esta misso s ser cumprida se os
resultados produzidos tiverem a qualidade adequada ao uso que lhes ser dado. Assim,
assume-se como princpio bsico a validao de resultados:
Um resultado para ser dado como vlido tem de satisfazer os requisitos de qualidade que
lhe sejam exigidos. (Relacre, 1996).
O desenvolvimento, adaptao ou implementao de um mtodo implica um processo de
avaliao que permita estimar a sua eficincia na rotina do laboratrio, ou seja, que permita
assegurar que esse mtodo possui as caractersticas adequadas para a obteno de
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
resultados com a qualidade requerida para determinada situao. A este processo d-se o
nome de validao de um mtodo analtico e implica a avaliao de diversos parmetros,
tendo sempre em conta a finalidade do mtodo visado e os pr-requisitos estabelecidos.
Os requisitos mnimos para a validao de um mtodo analtico dependem do tipo de
mtodo (Quadro VII) e compreendem o estudo de diversos parmetros (Coordenao Geral
de Acreditao, 2010), os quais sero abordados na validao levada a cabo neste trabalho:

Selectividade;

Linearidade/ Gama de trabalho;

Limiares analticos (Limite de Deteco e Limite de Quantificao);

Sensibilidade;

Preciso (Repetibilidade, Reprodutibilidade e Preciso Intermdia);

Exactido;

Robustez.

Quadro VII: Parmetros de validao a avaliar conforme o tipo de ensaio.

Tipo de ensaio
Parmetros
Qualitativo

Preciso
Selectividade

Exactido
Robustez

Determinao do

Anlise de

componente (analito)

elementos

em maior teor

menores e traos

Propriedades
Fsicas

Sensibilidade/
Linearidade/ Gama
de Trabalho
Limite de deteco

Limite de

x
x

Quantificao
Fonte: Coordenao Geral de Acreditao (2010).

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
De seguida ser abordado, de forma sumria, cada um dos parmetros de validao.

Selectividade
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da medio,
sendo que, estes podem aumentar ou reduzir o sinal, sendo a magnitude desta interferncia
muitas vezes dependente da concentrao.
A selectividade a capacidade de um mtodo identificar e distinguir um analito em particular
numa mistura complexa, sem interferncia dos outros componentes. Esta caracterstica
essencialmente funo do princpio de medida utilizado, mas depende, no entanto, do tipo
de compostos a analisar (Relacre, 2000).
Um mtodo diz-se especfico quando permite discriminar o analito relativamente a outras
substncias, eventualmente presentes na amostra a analisar, ou seja, quando oferece
garantias de que a grandeza medida provm apenas do analito (Relacre, 2000).

Linearidade, gama de trabalho, faixa linear e sensibilidade


A quantificao num mtodo analtico requer que se conhea a dependncia entre a
resposta medida e a concentrao do analito, sendo que, este objectivo conseguido pela
calibrao - processo pelo qual a resposta dum sistema de medida se relaciona com uma
concentrao ou uma quantidade de substncia conhecida. A linearidade , assim, obtida
por padronizao interna ou externa e formulada como expresso matemtica para o clculo
da concentrao do analito a ser determinada numa amostra real, sendo a equao que
relaciona estas duas variveis:

sendo:
y = resposta medida;
x = concentrao;
a = ordenada na origem;
b = declive da curva analtica = sensibilidade.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Em geral, usual recorrer-se a vrios nveis de concentrao (num mnimo de cinco) para a
construo da curva analtica, sendo o nmero de replicados em cada nvel de concentrao
dependente da rotina do laboratrio (Relacre, 2000).
A linearidade do mtodo pode ser observada pela representao dos resultados dos ensaios
em funo da concentrao de analito e verificada a partir da equao da regresso linear,
que determinada pelo mtodo dos mnimos quadrados. Para atingir este objectivo deve
ser verificada a ausncia de valores discrepantes para cada nvel de concentrao e ainda a
homocedasticidade homogeneidade de varincias - dos dados (Coordenao Geral de
Acreditao, 2010).
Alguns procedimentos analticos no demonstram linearidade, mesmo aps a utilizao de
ferramentas de transformao linearizante, sendo, nestes casos, a resposta analtica
descrita por uma outra funo que modela a concentrao de analito na amostra.
Para alm disto, para qualquer mtodo analtico, existe uma gama de trabalho, ou seja, uma
faixa de concentraes do analito ou valores da propriedade, para a qual o mtodo em
causa pode ser aplicado. A gama de trabalho deve abranger a gama de aplicao para a
qual o ensaio vai ser utilizado e a concentrao mais esperada ou mais relevante deve,
sempre que possvel, situar-se no centro da gama de trabalho. No limite inferior da gama de
trabalho, o factor limitante o valor do limite de quantificao e no limite superior, o factor
limitante est relacionado com o sistema de resposta do equipamento de medio. Em
alguns casos especficos poder existir dentro da faixa de trabalho uma faixa de resposta
linear e dentro desta, a resposta do sinal correspondente ao analito ter uma relao linear
com o analito ou propriedade em anlise (Coordenao Geral de Acreditao, 2010).
Quer a anlise da gama de trabalho, quer da linearidade do mtodo devem ser encaradas
como um estudo que deve ser realizado durante a fase de validao/implementao do
mtodo de ensaio ou sempre que se justifique. No entanto, quando a gama de trabalho se
encontra claramente definida em referncia bibliogrfica reconhecida, pode tornar-se
desnecessrio a sua anlise. Isto , em rotina, apenas a linearidade da curva de calibrao
utilizada num determinado mtodo analtico dever ser avaliada atravs da sua
representao grfica, juntamente com a anlise do coeficiente de correlao (Coordenao
Geral de Acreditao, 2010; Relacre, 2000).
Relativamente sensibilidade do mtodo utilizado numa determinao, esta pode ser
definida como o quociente entre o acrscimo do valor lido e a variao da concentrao
correspondente a esse acrscimo. Esta caracterstica avalia a capacidade do mtodo ou
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


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equipamento em questo distinguir pequenas diferenas de concentrao do analito, ou
seja, a sensibilidade a derivada de primeira ordem da curva de calibrao nessa zona de
concentrao (Relacre, 2000).
Esta grandeza tem grande interesse pelo seu aspecto relativo, ou seja, quando se pretende
averiguar a evoluo da sensibilidade ao longo do tempo ou quando se compara a
sensibilidade de vrios mtodos analticos, baseados em modelos lineares, para o mesmo
analito ou ainda quando se compara a sensibilidade para vrios analitos diferentes.

Limite de Deteco (LD)


O limite de deteco o teor mnimo a partir do qual possvel detectar a presena do
analito, com uma certeza estatstica razovel. Ou seja, este limiar analtico corresponde
mais pequena quantidade de substncia a analisar que pode ser detectada numa amostra,
mas no necessariamente quantificada com valor exacto. De salientar que, uma leitura
inferior ao limite de deteco no significa, obviamente, a ausncia de analito a medir,
apenas se pode afirmar que, com uma probabilidade definida, a concentrao do
componente a analisar ser inferior a um certo valor (IPAC, 2005; Relacre, 2000).
Em termos qualitativos, este conceito corresponde concentrao mnima que possvel
distinguir do branco, ou seja, de uma amostra que contm a mesma matriz mas no contm
o analito.
Estatisticamente, para a correcta definio do limite de deteco necessrio introduzir dois
conceitos simples:
- erro do tipo I, que a probabilidade de concluir pela presena do componente em
anlise quando de facto no existe esse componente na amostra;
- erro do tipo II, que a probabilidade de concluir pela ausncia do componente em
anlise, quando ele de facto existe.
Sendo que, para uma correcta anlise dos limiares analticos, estes dois tipos de erros tm
de ser minimizados (Relacre, 2000).

33

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Limite de Quantificao (LQ)
O limite de quantificao corresponde menor quantidade medida a partir da qual
possvel a quantificao do analito, com uma determinada preciso e exactido. Na prtica,
este limiar analtico corresponde ao padro de calibrao de menor concentrao, excluindo
o branco (IPAC, 2005).
A actualizao dos limiares analticos limite de deteco e limite de quantificao dever
ser efectuada sempre que ocorram alteraes de factores de influncia, tais como mudana
de analista, alterao dos reagentes ou equipamentos usados na determinao, entre
outros, ou sempre que se elabora uma nova curva de calibrao, e se utiliza os dados da
mesma para o clculo dos limiares, sendo que, poder ser feito um estudo ao longo do
tempo e adoptar como limiares analticos a mdia aritmtica dos limites de deteco e
quantificao calculados recorrendo a uma srie significativa de curvas de calibrao, desde
que se observe estabilidade nos valores dos limiares obtidos ao longo do tempo (Relacre,
2000).

Preciso
A preciso um termo geral que pretende avaliar a disperso dos resultados entre ensaios
independentes, repetidos sobre uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres,
em condies definidas. Um factor importante a salientar que ser mais realista o estudo
da preciso do mtodo usando amostras, com a finalidade de minimizar o efeito de matriz
(Coordenao Geral de Acreditao, 2010; Relacre, 2000).
Para a avaliao da disperso dos resultados existem duas medidas extremas, a
repetibilidade e a reprodutibilidade, sendo que entre estas duas existe uma situao
intermdia, que se designa preciso intermdia ou variabilidade intralaboratorial.
A repetibilidade exprime a preciso de um mtodo efectuado em condies idnticas, isto ,
refere-se a ensaios efectuados sobre uma mesma amostra, em condies to estveis
quanto possvel, tais como, o mesmo laboratrio, o mesmo analista, o mesmo equipamento
e mesmo tipo de reagentes, em curtos intervalos de tempo. Estes ensaios permitem calcular
o limite de repetibilidade, que o valor abaixo do qual se deve situar, com uma
probabilidade especfica (normalmente 95 %), a diferena absoluta entre dois resultados de
ensaio, obtidos em condies de repetibilidade (Eurachem, 1998; Relacre, 1996; Relacre,
2000).
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


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A reprodutibilidade refere-se preciso de um mtodo efectuado em condies de ensaio
diferentes, ou seja, utilizando o mesmo mtodo de ensaio, sobre a mesma amostra,
fazendo-se variar as condies de medio, tais como, diferentes laboratrios, diferentes
operadores, diferentes equipamentos e/ou diferentes pocas. Tambm para o caso da
reprodutibilidade possvel calcular o respectivo limite, que o valor abaixo do qual se deve
situar, com uma probabilidade especfica (normalmente 95 %) a diferena absoluta entre
dois resultados de ensaio, obtidos em condies de reprodutibilidade (Eurachem, 1998;
Relacre, 1996; Relacre, 2000).
Embora a determinao da reprodutibilidade no seja executada por um nico laboratrio,
considerado um parmetro importante quando um laboratrio procura a verificao de
desempenho dos seus mtodos em relao aos dados de validao obtidos por meio de
comparao interlaboratorial.
A preciso intermdia refere-se preciso avaliada, sobre a mesma amostra, amostras
idnticas ou padres, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio ou em laboratrios
diferentes, mas definindo exactamente quais as condies a variar (uma ou mais), de entre
diferentes analistas, diferentes equipamentos ou diferentes tempos. Esta medida da
preciso representa a variabilidade dos resultados num laboratrio (Eurachem, 1998;
Relacre, 1996; Relacre, 2000).
Um outro modo alternativo de estudar a preciso de um mtodo consiste na comparao da
preciso entre mtodos, ou seja, consiste na comparao dos resultados obtidos utilizando
o mtodo a ser validado com os resultados conseguidos atravs de um mtodo de
referncia validado. O objectivo desta comparao estudar o grau de proximidade dos
resultados obtidos pelos dois mtodos, sendo as anlises efectuadas em replicado,
utilizando os dois mtodos em separado, sobre as mesmas amostras, em toda a gama de
concentraes em que se pretende validar o mtodo (Relacre, 2000).

Exactido
A exactido a concordncia entre o resultado de um ensaio e o valor de referncia
convencionalmente aceite como verdadeiro. Este termo, quando aplicado a uma srie de
resultados de ensaios implica uma combinao de componentes de erros aleatrios e
sistemticos. Os processos normalmente empregues para avaliao da exactido de uma
metodologia so, entre outros, a anlise de materiais de referncia, a participao em

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ensaios interlaboratoriais ou em testes comparativos (Coordenao Geral de Acreditao,
2010; Relacre, 2000).
Relativamente aos Materiais de Referncia Certificados (MRC) estes devem, sempre que
possvel ser utilizados no processo de validao de um mtodo de ensaio e constituem uma
excelente ferramenta no controlo externo de qualidade de uma anlise qumica. Um MRC
tem um valor de concentrao (ou outra grandeza de interesse) para cada parmetro e uma
incerteza associada. O uso correcto desta ferramenta consiste na sua anlise para avaliar o
desempenho do laboratrio, sendo que, os valores obtidos pelo mesmo - mdia e desvio
padro amostral de uma srie de ensaios em replicado - devem ser comparados com os
valores certificados do material de referncia. Quando o valor obtido no estiver contido no
intervalo de incerteza indicado para o valor certificado, deve-se procurar as causas para
esse desvio e tentar elimin-las ou minimiz-las, podendo em caso de no as conseguir
eliminar, aceit-las, uma vez que, cada laboratrio pode adoptar critrios de aceitao
diferentes para a aceitao dos resultados dos MRC (Coordenao Geral de Acreditao,
2010; Relacre, 1996; Relacre, 2000).
Para alm do uso de materiais de referncia certificados, para avaliao de um determinado
mtodo de ensaio pode desenvolver-se um circuito interlaboratorial, existindo vrios tipos
consoante o objectivo a que se destinam:
- Ensaio Interlaboratorial de Aptido, que se destina a avaliar o desempenho dos
laboratrios participantes, estando normalmente associado a um MRC, podendo geralmente
os participantes usar o mtodo que entenderem;
- Ensaio Interlaboratorial de Normalizao, que se destina a estudar as caractersticas de
um mtodo de anlise, nomeadamente a sua reprodutibilidade e repetibilidade, sendo que
neste caso, uma condio de acesso a utilizao exclusiva do mtodo em causa (Relacre,
2000).
Os testes comparativos, tal como no caso da preciso, so um contributo importante na
validao de um mtodo interno de ensaio, em que se procede comparao de resultados
obtidos a partir desse mtodo com os resultados obtidos atravs de um mtodo de
referncia. O objectivo principal deste tipo de ensaio o de estudar a proximidade de
resultados obtidos pelos dois mtodos de ensaio, isto , avaliar a exactido do mtodo
interno em validao, relativamente ao de referncia (Relacre, 2000).

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Para alm das possibilidades mencionadas anteriormente, a exactido do mtodo pode
ainda ser avaliada recorrendo a ensaios de recuperao, em que a recuperao do analito
em estudo pode ser estimada pela anlise de amostras fortificadas com quantidades
conhecidas do mesmo (spike). As amostras podem ser fortificadas com o analito em
diferentes concentraes, por exemplo, em baixa, mdia e alta concentrao, de acordo
com a gama de trabalho a que o mtodo se aplica. A limitao deste procedimento o facto
de o analito adicionado no estar necessariamente na mesma forma que se apresentaria na
amostra, sendo que, a presena de analitos adicionados numa forma mais facilmente
detectvel pode ocasionar

avaliaes excessivamente optimistas da recuperao

(Coordenao Geral de Acreditao, 2010; Eurachem, 1998; Relacre, 2000).

Robustez
A robustez de um mtodo mede a sensibilidade que o mesmo apresenta face a pequenas
variaes, sendo que, um mtodo se diz robusto se se revelar praticamente insensvel a
pequenas variaes que possam ocorrer quando est a ser executado. Convm ainda
salientar que quanto maior for a robustez de um determinado mtodo, maior ser a
confiana desse relativamente sua preciso (Coordenao Geral de Acreditao, 2010;
Eurachem, 1998; Relacre, 2000).
Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio pode-se recorrer ao teste de Youden
(Coordenao Geral de Acreditao, 2010; Relacre, 2000), que se trata de um teste que
permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm seriar a influncia de cada uma
das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia (por excesso ou por
defeito) de cada uma dessas variaes.

Finalmente, convm salientar que todos os dados relevantes no processo de validao


planeamento, experincia e resultados obtidos devem ser documentados e registados de
forma a possibilitar a rastreabilidade de todo o processo, sendo esta documentao de
validao importante para fins de avaliao do mtodo e pode tambm ser exigida em
alguns casos especficos, como por exemplo, por organismos reguladores. Aps o processo
de validao, de extrema importncia a elaborao de um procedimento operacional para
que o mtodo possa ser implementado de maneira clara e sem ambiguidades, sendo que, a
documentao apropriada auxilia a aplicao consistente do mtodo, permitindo que, o

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


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desempenho real do mesmo corresponda ao previsto na validao. O que se pretende que
a documentao minimize a introduo de variaes acidentais no mtodo. Esta
documentao deve ser clara, precisa e concisa, dentro dos limites estabelecidos pelo
campo de aplicao (Coordenao Geral de Acreditao, 2010; Eurachem, 1998; Relacre,
2000).

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


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III. Parte experimental
Para a implementao/validao do mtodo de ensaio interno, para a determinao de
hidrocarbonetos alifticos saturados em leo de girassol por cromatografia gasosa, foram
analisados vrios parmetros, utilizando sempre o mesmo procedimento experimental para
efectuar cada uma das anlises. O procedimento adoptado neste trabalho, e que ser
descrito mais frente neste captulo, foi desenvolvido pelo Instituto de La Grasa (Sevilha)
em 2008.

III.1. Materiais e reagentes


III.1.1. Materiais

Coluna de vidro, para cromatografia em coluna, de aproximadamente 15 mm de


dimetro interno e 50 cm de comprimento, provida de placa de porcelana e torneira no
extremo inferior;

Balana tcnica com preciso de 0,1 g (Sartorius BL 3100);

Balana analtica com preciso de 0,0001 g (Sartorius Basic BA 210 S);

Evaporador rotativo (Bcki com banho arsplus e bomba Rietschle);

Cromatgrafo gasoso com injeco on column para colunas capilares, forno de


temperatura programvel e detector FID (Perkin Elmer 8600);

Sistema de tratamento de dados com capacidade de integrao manual (Turbochrom


Navigator e Clarity);

Coluna capilar de slica fundida de 15 metros de comprimento, 0,32 mm de dimetro


interno e 0,10 m de espessura de filme (Sugerlabor, SGL 5);

Microseringa de capacidade 5 L, provida de agulha adequada para injeco on column


(SGE Analytical Science);

Material de vidro recorrente em laboratrio.

III.1.2. Reagentes

Gel de slica para cromatografia em coluna de granulometria compreendida entre 60 e


200 m (70 230 mesh) (Merck);

Nitrato de prata de pureza analtica (Panreac, 99,8 % de pureza);

Sulfato de sdio anidro de pureza analtica (Panreac, 99,0 % de pureza);


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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

Areia de mar lavada (Riedel de Han);

n-eicosano (Fluka Analytical, 99,8 % de pureza);

n-hexano para cromatografia (Panreac, 99,0 % de pureza);

n-hexano de pureza analtica (Panreac, 99,0 % de pureza);

n-heptano de pureza analtica (Fisher Scientific, 96,86 % de pureza);

Parafina lquida (Merck).

III.2.Procedimento Experimental
III.2.1. Preparao de gel de slica prateado
Para a preparao de gel de slica prateado (suficiente para trs colunas) pesou-se 4,5 g de
nitrato de prata e dissolveu-se esta quantidade em 6 mL de gua destilada. Pesou-se, de
seguida, 45 g de gel de slica num balo de fundo redondo de 500 mL, forrado exteriormente
com papel de alumnio, e com a ajuda de uma pipeta Pasteur, adicionou-se gota a gota,
agitando, a soluo de nitrato de prata em gua, preparada anteriormente. Em seguida,
colocou-se o balo no evaporador rotativo, funcionando este apenas em modo de agitao,
durante 30 minutos. Aps este tempo procedeu-se colocao do contedo do balo num
frasco de vidro opaco, tambm este envolto em papel de alumnio, ficando o mesmo no
escuro durante 12 horas, at poder ser usado na preparao das colunas cromatogrficas
para o pr-tratamento.

III.2.2. Preparao da coluna cromatogrfica de pr-tratamento


Anteriormente preparao da coluna de vidro provida de placa de porcelana na parte
inferior, utilizou-se uma pequena quantidade de n-hexano para a lavagem da mesma.
Pesou-se de seguida num copo 18,5 g de gel de slica prateado e misturou-se esta
quantidade em 40 mL de n-hexano. Verteu-se, depois, esta mistura, para a coluna aplicando
vibraes, com a finalidade de eliminar possveis bolhas de ar. Logo de seguida envolveu-se
a coluna em papel de alumnio. Adiciona-se coluna, sobre o gel de slica,
aproximadamente 0,5 cm de sulfato de sdio anidro e depois 1 cm de areia de mar lavada.
Elimina-se, seguidamente, o excesso de solvente de eluio.

40

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
III.2.3. Fraccionamento do leo
Na etapa de fraccionamento do leo, pesou-se num copo, 1 g do leo e adicionou-se 1 mL
da soluo padro de n-eicosano 0,05 mg/kg (preparada pesando 0,0050 g de padro neicosano num escorredor, sendo esta quantidade posteriormente transferida para um balo
de 100 mL, perfazendo-se o volume com n-hexano especfico para cromatografia). Com a
ajuda de uma pipeta Pasteur transferiu-se a mistura para o topo da coluna cromatogrfica.
Desprezou-se o volume correspondente a esta mistura, ou seja, deixou-se correr a mistura
at ao topo da camada de areia de mar lavada, no procedendo recolha do volume
correspondente para posterior anlise no cromatgrafo. Adicionou-se, de seguida, por duas
vezes, 1 mL de n-hexano ao copo de pesagem e adicionou-se com a mesma pipeta Pasteur
estes volumes coluna cromatogrfica, sendo que tambm se desprezaram estes dois
volumes. Seguidamente, colocou-se um balo de fundo redondo de 100 mL no extremo da
coluna e adicionou-se 55 mL de n-hexano, procedendo-se eluio dos compostos de
interesse, a um ritmo de 15 gotas por cada 10 segundos.
Aps recolhido o volume de eluio procedeu-se evaporao do solvente no evaporador
rotativo, a presso reduzida e num banho de aproximadamente 30 C. Para eliminar
possveis vestgios de solvente utilizou-se uma corrente de azoto, dissolvendo-se em
seguida o resduo obtido em 0,5 mL de n-heptano.

III.2.4. Separao cromatogrfica


O resduo dissolvido em 0,5 mL de n-heptano a base da anlise cromatogrfica, utilizandose 2 L desta mistura na anlise por cromatografia gasosa.
As condies cromatogrficas bsicas utilizadas so:

Temperatura do forno: inicialmente a 60 C durante 1 minuto, aps o qual a


temperatura comea a aumentar a uma razo de 12 C/minuto at aos 350 C,
temperatura que se mantm durante 4 minutos (Figura 11);

Presso de hidrognio na cabea de coluna: 15 psi (105 kPa);

Temperatura do detector: 350 C;

Volume de injeco: 2 L.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

400

Temperatura (C)

350
300
250
200
150
100
50
0
0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Tempo (min)

Figura 11: Rampa de temperatura do forno, na anlise cromatogrfica de leo mineral.

III.2.5. Determinaes quantitativas


No cromatograma que se obtm da anlise cromatogrfica da fraco eluda da
cromatografia em coluna com gel de slica, dever observar-se um pico estreito e bem
definido, que tem incio e termina na linha de base, correspondente ao pico do padro
interno. Se a amostra possuir contaminao com leo mineral dever aparecer um pico
largo correspondente a uma mistura complexa mal resolvida, que ter sobre ela outros picos
estreitos e bem definidos, correspondentes a hidrocarbonetos alifticos normais num leo.
Assim, a rea de interesse num cromatograma deste tipo a correspondente ao pico da
mistura mal resolvida.
Para avaliar quantitativamente o contedo em hidrocarbonetos alifticos saturados de
origem mineral, primeiro necessrio determinar a concentrao de hidrocarbonetos
alifticos saturados totais. Para tal, procede-se integrao do pico correspondente ao
padro interno e ao pico correspondente mistura mal resolvida, contabilizando todo o pico
desde o seu comeo at atingir novamente a linha de base. ainda de salientar o facto de
que, o pico do padro interno pode aparecer sobre o pico da mistura mal resolvida e nesse
caso integra-se juntamente com esse pico largo. Atravs dessas reas e aplicando a
expresso 1 procede-se ao clculo dos hidrocarbonetos alifticos totais:

42

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
onde:

a rea de todos os picos menos a rea do padro interno;

a rea do pico correspondente ao padro interno;

a massa do padro interno adicionado ao leo em miligramas (

a massa de leo analisada em gramas.

= 0,05 mg);

Depois de calculada a fraco correspondente aos hidrocarbonetos alifticos saturados


totais, necessrio proceder ao clculo da fraco de hidrocarbonetos alifticos saturados
normais num leo. Este clculo efectuado recorrendo novamente rea do padro interno
e rea dos picos correspondentes a hidrocarbonetos alifticos normais num leo, que so
os picos que se situam por cima da banda larga da mistura mal resolvida. Assim, procede-se
integrao de todos os picos que aparecem sobre a banda larga, correspondente
mistura mal resolvida e aplica-se novamente a expresso 1 para este clculo, obtendo-se os
hidrocarbonetos alifticos normais num leo (H.A.Normais).
Finalmente, a fraco correspondente a hidrocarbonetos alifticos saturados de origem
mineral, ou mais simplesmente a leo mineral obtm-se subtraindo as duas fraces
determinadas anteriormente (Expresso 2).

O resultado obtido vem expresso em termos de mg.kg-1 (ppm).

III.3. Anlises efectuadas


O procedimento base utilizado para todas as determinaes efectuadas foi o mencionado
anteriormente, procedendo-se determinao dos seguintes parmetros:

III.3.1. Limiares analticos


Para a determinao dos limiares analticos foram efectuados dez replicados de um branco
contaminado com 15 mg.kg-1 de parafina lquida.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


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III.3.2. Curva de calibrao
Para determinar a curva de calibrao associada a esta medio foram utilizados brancos
contaminados com diferentes concentraes de parafina lquida: 22,5 mg.kg-1; 30 mg.kg-1;
37,5 mg.kg-1; 45 mg.kg-1; 52,5 mg.kg-1 e 60 mg.kg-1. Para cada concentrao analisada
foram efectuados trs replicados.

III.3.3. Repetibilidade
A repetibilidade determinada pela anlise no mesmo dia, utilizando o mesmo equipamento
e a mesma analista, dez replicados de uma amostra de leo de girassol refinado, sem
qualquer contaminao propositada.

III.3.4. Exactido
Nos estudos de exactido foram analisadas, em ensaios de recuperao, amostras de leo
de girassol bruto e refinado e de leo de soja bruto e refinado sendo as
determinaes efectuadas em duplicado para cada amostra. Nestes ensaios de recuperao
analisada a amostra sem contaminao propositada mas que poder naturalmente
possuir contaminao com leo mineral e ainda a amostra no estado natural
propositadamente contaminada com 50 mg.kg-1 de parafina.
Em termos de ensaios interlaboratoriais foram efectuados apenas dois ensaios deste tipo,
por motivos de custos. Um deles foi efectuado com uma amostra de leo de girassol
refinado, compreendendo cinco laboratrios, incluindo o LET e uma amostra de leo de soja
bruto, compreendendo apenas trs laboratrios, tambm incluindo o LET.

III.3.5. Robustez
Para avaliar a robustez do mtodo em estudo foram efectuados ensaios utilizando dois
mtodos de integrao diferentes - por motivos de avaria irreparvel no computador utilizado
para estas determinaes, foi necessrio utilizar dois mtodos de integrao diferentes, o
que possibilita este tipo de comparaes, que noutras circunstncias seria impossvel de
realizar por motivo dos custos associados. Neste ponto foi avaliado um ensaio efectuado
com um branco contaminado com 15 mg.kg-1 de parafina.
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Para avaliar a robustez foram ainda analisadas amostras de leo de girassol refinado e um
branco, tanto efectuando o procedimento experimental com n-hexano de pureza analtica,
como com n-hexano especfico para cromatografia.
Ainda foi efectuada uma anlise com uma amostra de leo de leo de girassol bruto
contendo impurezas suspensas, quer ao natural, quer recorrendo a filtrao da mesma, para
comparao de resultados.
Para a comparao entre mtodos foi utilizado o mtodo estabelecido pela Norma ISO para
a determinao de hidrocarbonetos alifticos em leos vegetais, que ainda apenas um
rascunho, estando em fase de discusso para posterior aprovao. Neste ponto foram
analisadas em triplicado duas amostras, uma delas de leo de girassol bruto e outra de leo
de girassol refinado e ainda, em duplicado, uma amostra de leo de soja bruto.

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
IV. Resultados e discusso
Para a validao do mtodo interno de ensaio para a determinao de hidrocarbonetos
alifticos saturados, por cromatografia gasosa em coluna capilar, com injeco on column e
detector FID foram analisados cinco parmetros principais de validao, que compreendem
a gama de trabalho/linearidade do mtodo, os limiares analticos do mesmo (limites de
deteco e de quantificao), a preciso e exactido do mtodo (incluindo a primeira, o
estudo da repetibilidade e preciso intermdia e a segunda, a execuo de ensaios de
recuperao e a realizao de um circuito interlaboratorial), e ainda a avaliao da robustez
do mtodo em causa, com comparao entre dois mtodos distintos de ensaio.
Convm primeiramente salientar que o mtodo usado no desenvolvimento deste trabalho
um mtodo interno - mtodo que no segue uma norma de ensaio nacional ou internacional
ou algum documento normativo equivalente - uma vez que, apesar de actualmente j existir
uma Norma ISO para a determinao de hidrocarbonetos alifticos em leos vegetais, esta
ainda no foi aprovada, encontrando-se em discusso. data de incio da elaborao deste
trabalho experimental, tal norma ainda no havia sido divulgada. No entanto, tendo em
conta que aps ser aprovada, a referida Norma ISO ser a referncia para a determinao
de hidrocarbonetos alifticos em leos vegetais, esta ser usada em algumas comparaes
neste trabalho.
O mtodo sobre o qual recai este estudo de validao especfico para a determinao da
contaminao por leo mineral, em leo de girassol. No entanto, existem tambm muitas
amostras de leo de soja a analisar para este parmetro de qualidade, pelo que, sempre
que possvel, este estudo ser feito tambm para o leo de soja. Convm, ainda assim,
salientar que o objectivo principal deste trabalho a validao do mtodo para leo de
girassol.
Para alm dos parmetros avaliados experimentalmente neste trabalho, a validao de um
mtodo de ensaio compreende ainda a apreciao da selectividade e especificidade do
mesmo. A selectividade a capacidade de um mtodo identificar e distinguir um analito em
particular numa mistura complexa, sem interferncia dos outros componentes, enquanto a
especificidade a caracterstica que um mtodo deve ter para permitir discriminar o analito
relativamente a outras substncias, eventualmente presentes na amostra a analisar, ou seja,
garantir que a grandeza medida provm apenas do analito. No entanto, tendo em conta a
natureza da determinao implicada neste trabalho, em que o objecto de interesse no um
composto, mas um conjunto de compostos que originam no um pico, mas uma banda larga
procedente da falta de capacidade da cromatografia gasosa para distinguir cada um dos
46

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
compostos que compem a mistura que se denomina leo mineral - a determinao destes
parmetros tem pouco significado. Ainda assim, atravs da realizao de um ensaio em
branco (Anexo A Figura A1) e outros aps fortificao com parafina lquida (Anexos A
Figura A2 A7) verifica-se que o sinal em forma de banda larga, que aparece num
cromatograma derivado de uma anlise de leo contaminado com hidrocarbonetos alifticos
de origem mineral corresponde a leo mineral, aparecendo esta banda apenas quando
existe fortificao do branco. O branco correspondente desta anlise no apresenta
qualquer sinal em termos de leo mineral.
Relativamente aos cinco parmetros de validao/implementao de um mtodo de ensaio
interno avaliados neste trabalho, sero analisados um a um ao longo deste captulo.

IV.1. Curva de calibrao e sensibilidade


Em anlises quantitativas a calibrao indica um processo pelo qual a resposta dum sistema
de medida se relaciona com a concentrao ou quantidade de substncia conhecida. Neste
trabalho experimental a concentrao conhecida dos padres de parafina lquida foi
correlacionada quer com reas normalizadas correspondentes a leo mineral - ou seja, a
razo entre a rea correspondente a leo mineral e a rea do padro interno - quer com o
sinal obtido em termos de rea de leo mineral, sem normalizao. A relao mais simples,
utilizaria como variveis a relacionar a concentrao conhecida dos padres de parafina
lquida e o sinal obtido em termos de rea correspondente a leo mineral, no entanto,
verificou-se (Figura 12) que esta correlao mais fraca, tendo o padro interno um papel
importante, que no seria contabilizado numa relao deste tipo. Assim, torna-se mais
realista a utilizao de valores de rea normalizada correspondentes a leo mineral (Figura
13), em que se entra em linha de conta com a rea correspondente ao padro interno. O
que se verifica que o padro interno tem um papel importante neste mtodo, visto que,
podem existir pequenas variaes no sinal obtido para leo mineral em duas anlises
cromatogrficas da mesma amostra, que sero acompanhadas por variao proporcional no
sinal obtido para o padro interno. Este funciona, assim, como uma referncia em termos de
resposta rea correspondente de leo mineral logo necessita de ser contabilizado nestes
clculos.

47

rea correspondente a leo mineral


(mV.s)

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

200
180
160
140
120
100
80
60

y = 3,0719x - 5,2108
R = 0,9937

40
20
0
0

10

20

30

40

50

60

70

Concentrao do padro (mg.kg-1)

rea normalizada correspondente a


leo mineral

Figura 12: Correlao entre concentrao de padres de parafina e sinal obtido em termos de rea
correspondente a leo mineral.

2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6

y = 0,0309x - 0,054
R = 0,9973

0,4
0,2
0,0
0

10

20

30

40

Concentrao do padro

50

60

70

(mg.kg-1)

Figura 13: Correlao entre concentrao de padres de parafina e rea normalizada


correspondente a leo mineral.

Considerando, assim, reas normalizadas correspondentes a leo mineral e analisando sete


diferentes concentraes de parafina lquida (Anexo A), obtm-se uma correlao linear
positiva entre as duas variveis, com um coeficiente de determinao de 0,9973, o que
significa que uma elevada percentagem da varincia (99,7 %) explicada pela regresso
efectuada. A equao que descreve a relao entre as duas variveis, obtida pelo mtodo
dos mnimos quadrados, :

48

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Esta relao vlida apenas para concentraes entre os 15 mg.kg-1 e os 60 mg.kg-1, visto
que foi para esta gama de trabalho que foi avaliada a linearidade do mtodo. Para alm
destas concentraes estaremos perante extrapolaes, pelo que, s se dever recorrer a
esta relao, quando o sinal obtido se encontrar dentro da gama, caso contrrio dever-se-
proceder a uma diluio da amostra.
A escolha da gama de trabalho foi feita tendo em conta que deveria conter o valor de 50
mg.kg-1, que o limite legal para este tipo de compostos no leo de girassol (Karasek et al,
2010), portanto, e por uma questo de gesto de recursos, no foram analisados padres
acima dos 60 mg.kg-1. Acima dos 50 mg.kg-1 considera-se que o leo em causa se encontra
fora dos requisitos impostos por lei, pelo que, a quantificao precisa se torna pouco
importante. Para alm disso, a maioria das amostras devero possuir valores de
contaminao abaixo dos 50 mg.kg-1, pelo que, se torna importante que, a maior densidade
de pontos da recta, se situe abaixo desse valor. Para a elaborao da recta de calibrao, o
primeiro padro considerado, para alm do branco, a menor concentrao passvel de
anlise em cromatografia gasosa com as condies utilizados no laboratrio, tendo em
conta

equipamento

usado

software

de

anlise

de

dados

disponvel.

Complementarmente, procedeu-se escolha dos restantes padres de calibrao de forma


a permitir uma distribuio equitativa dos mesmos pela recta.
Tendo em conta que a recta de calibrao obtida uma funo polinomial do primeiro grau,
isto , uma recta, e como se utilizou o mtodo dos mnimos quadrados para a regresso
linear, assume-se o pressuposto de que os erros possuem uma distribuio normal e que
existe homogeneidade das varincias ao longo da recta obtida.
Convm ainda salientar que desejvel que a calibrao analtica seja efectuada aquando
da anlise, no entanto, quando no efectuada a recta de calibrao diria, para cada srie
de amostras analisadas, dever-se- proceder a um estudo mais pormenorizado da
linearidade do mtodo, atravs de uma anlise alargada, ao longo do tempo, de vrias
rectas de calibrao, com a finalidade de, perante um histrico das mesmas, demonstrar-se
a existncia de estabilidade. Esta anlise mais alargada no foi efectuada neste trabalho por
uma questo de tempo.
O facto deste mtodo fazer uso de um padro interno implica que no seria necessrio o
recurso a uma recta de calibrao, dado que este j funciona como uma referncia para
validao dos resultados obtidos em cada anlise, no entanto, para verificao da
linearidade e sensibilidade deste mtodo, tal anlise necessria.

49

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Para alm da avaliao da linearidade do mtodo utilizado, esta determinao serve ainda
para avaliar outro parmetro, a sensibilidade do mtodo. A sensibilidade pode ser definida
como o quociente entre o acrscimo do valor lido e a variao da concentrao
correspondente a esse acrscimo, ou seja, como a recta de calibrao definida por um
modelo linear, a sensibilidade ser constante ao longo de toda a gama de trabalho e igual
ao declive da recta de calibrao. Assim, a sensibilidade deste mtodo, nas condies
usadas neste trabalho, toma o valor de 0,0309 kg.mg-1. Esta caracterstica avalia a
capacidade do mtodo para distinguir pequenas diferenas de concentrao de um analito e
particularmente importante quando se pretende averiguar a evoluo desta grandeza ao
longo do tempo ou quando se compara a sensibilidade de vrios mtodos diferentes,
baseados em modelos lineares, para o mesmo analito ou ainda quando se compara a
sensibilidade para vrios analitos. Apesar de no existirem referncias na literatura
sensibilidade dos mtodos utilizados, esta grandeza poder vir a ser importante para
posteriores comparaes, ou mesmo para que o laboratrio tenha controlo deste parmetro
ao longo do tempo, atravs da elaborao de novas rectas de calibrao.
Ainda atravs da informao veiculada pela recta de calibrao obtida, possvel
determinar o desvio padro do mtodo (

, que uma caracterstica que permite ao

analista verificar a qualidade do seu trabalho experimental e ainda o coeficiente de variao


(

do mtodo utilizado. O desvio padro do mtodo (Relacre, 2000) dado por:

onde:

o desvio padro residual associado recta de regresso, que estima a preciso


de um resultado obtido recorrendo a essa recta de calibrao e dado por:

o declive da recta de regresso.

Assim, como o desvio padro residual associado recta de regresso toma um valor de
0,1307 e o declive da recta 0,0309 kg.mg-1, o desvio padro do mtodo de 4,23 mg.kg-1.

50

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Obtido este valor possvel calcular o coeficiente de variao do mtodo

, expresso

em percentagem (Relacre, 2000):

onde:

o desvio padro do mtodo;


a mdia das concentraes utilizadas nos padres de calibrao.

Assim, o coeficiente de variao do mtodo de aproximadamente 13 %. Tendo em conta


que se definiu internamente uma possvel variao de 10 %, este valor est um pouco acima
de tal critrio, no sendo no entanto, um valor demasiado elevado, tendo em conta a
natureza do mtodo.

Quadro VIII: Compilao dos resultados de avaliao de qualidade do mtodo usado.

Parmetros da recta de regresso


Ordenada na origem (a) = 0,054
Declive da recta (b) = 0,0309
Parmetros de avaliao de desempenho do mtodo
Desvio padro residual associado recta de regresso (
= 0,1307
-1
Desvio padro do mtodo (
= 4,23 mg.kg
Coeficiente de variao do mtodo (
= 13 %

Atendendo informao veiculada nas referncias bibliogrficas consultadas, no so


mencionados valores de desvio padro residual associado regresso ou do coeficiente de
variao dos mtodos utilizados. Estes valores seriam importantes para posteriores
comparaes aquando da anlise da evoluo da linearidade ao longo do tempo, com a
execuo de vrias rectas de calibrao.

IV.2. Limiares analticos


Existem vrias formas de determinar os limiares analticos de um mtodo de ensaio
(Eurachem, 1998; IPAC, 2005), sendo que, neste subcaptulo sero abordadas duas
maneiras distintas de efectuar esta determinao.
51

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Em relao aos limites de deteco e de quantificao, os resultados obtidos nos dez
replicados, analisados independentemente e em dia distintos (Anexo B), encontram-se
especificados no Quadro IX.

-1

Quadro IX: Resultados obtidos (em mg.kg ) nos dez replicados para determinao dos limiares
analticos.

Ensaio

Resultado (mg.kg-1)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

19,580
18,529
19,085
18,549
19,711
19,408
19,486
18,923
18,376
19,233

Mdia
Desvio padro

19,088
0,477

O clculo do limite de deteco (LD) feito atravs da expresso (IPAC, 2005; Relacre,
2000):

onde:

a mdia aritmtica do teor medido de uma srie de brancos ou padres vestgio


(entre 10 e 20 ensaios), preparados de forma independente e lidos ao longo de vrios
dias de trabalho, isto , reproduzindo de forma mais fiel possvel uma situao de
rotina;

o desvio padro associado a


Se a lei de probabilidade de

suficientemente conhecida e partindo do principio que

gausseana (distribuio normal dos erros) ento K toma o valor de aproximadamente


3,3 para um nvel de confiana de cerca de 97,5 %.

52

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Assim, o limite de deteco toma o valor de 20,7 mg.kg-1, ou seja, o teor mnimo a partir do
qual possvel detectar a presena de analito com uma certeza estatstica razovel
(aproximadamente 97,5 %), para este mtodo especfico, de aproximadamente 21 mg.kg-1.
Dado que foi elaborada uma recta de calibrao para este mtodo, o valor do limite de
deteco pode tambm ser determinado recorrendo a essa informao, utilizando a
expresso (IPAC, 2005; Relacre, 2000):

onde:

o desvio padro residual da recta de calibrao;

o declive dessa mesma recta.

Tendo em conta o valor do desvio padro residual associado recta de regresso,


calculado anteriormente (

), o limite de deteco, determinado por este mtodo,

de aproximadamente 14 mg.kg-1.

Relativamente ao limite de quantificao (LQ), este calculado de forma semelhante ao


limite de deteco (IPAC, 2005; Relacre, 2000):

onde:

a mdia aritmtica do teor medido de uma srie de brancos ou padres vestgio


(entre 10 e 20 ensaios), preparados de forma independente e lidos ao longo de vrios
dias de trabalho, isto , reproduzindo de forma mais fiel possvel uma situao de
rotina;

o desvio padro associado a

O limite de quantificao, ou seja, a menor concentrao a partir da qual possvel a


quantificao do analito, toma o valor de 23,9 mg.kg-1, aproximadamente 24 mg.kg-1.

53

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Tambm o valor do limite de quantificao pode ser estimado a partir dos parmetros
associados recta de regresso obtida, ou seja, atravs da expresso (IPAC, 2005;
Relacre, 2000):

onde:

o desvio padro residual da recta de calibrao;


o declive dessa mesma recta.

Utilizando o desvio padro residual associado recta de regresso calculado anteriormente


(

), o limite de quantificao, determinado por este mtodo, de

aproximadamente 42 mg.kg-1.

Quadro X: Smula dos valores obtidos para os limites de deteco e de quantificao pelos dois
mtodos de clculo.

Limite de Deteco
Limite de
Quantificao

Mtodo de clculo pela


anlise de dez replicados
independentes

Mtodo de clculo atravs dos


parmetros associados recta de
regresso

21 mg.kg-1

14 mg.kg-1

24 mg.kg-1

42 mg.kg-1

Analisando os resultados obtidos para cada um dos mtodos de clculo dos limiares
analticos verifica-se uma grande discrepncia entre eles. Enquanto para o clculo
efectuado com os dez replicados de um branco fortificado, os limites de deteco e de
quantificao possuem valores prximos, no caso do clculo pelos parmetros associados
regresso, os valores obtidos para os limiares distam bastante um do outro. Seria
espectvel e favorvel obter um valor de limite de quantificao o mais prximo possvel do
limite de deteco, o que no acontece num dos mtodos de clculo. Uma possvel
justificao para estes resultados deve-se ao facto de o clculo recorrendo recta de
calibrao introduzir mais erros no mesmo, visto que se trata de uma manipulao
experimental, qual se sucedem vrias manipulaes matemticas que vo introduzindo
erros sucessivos nos resultados. Para alm disto, o resultado dos limites de deteco e de
quantificao obtidos pela recta de regresso deveria ser confirmado pelo estudo da
estabilidade da mesma, que no foi efectuado neste trabalho. O Guia para Acreditao de
54

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Laboratrios Qumicos (IPAC, 2005) apresenta tambm algumas justificaes para o
aparecimento de valores irrealistas para os limiares analticos, quando determinados
recorrendo estatstica dos mnimos quadrados da recta de regresso, sendo as
justificaes apontadas, a possibilidade de no existncia de homogeneidade de varincias,
falha da linearidade at origem ou excluso do branco da recta de calibrao. Assim, ser
mais confivel, a utilizao dos valores de limiares analticos obtidos pelo mtodo da anlise
de dez brancos fortificados independentes, que de facto o modo mais comum de avaliar
estes dois parmetros de validao, especialmente porque a parte estatstica deve funcionar
apenas como uma orientao, visto que os limiares para um procedimento analtico podem
variar em funo do tipo de amostra e para tal no existe uma frmula estatstica.
Assim, a mais pequena concentrao de leo mineral que pode ser detectada numa
amostra, para este mtodo especificamente de 21 mg.kg-1, mas a quantificao da
concentrao deste composto nessa amostra, com um valor exacto, s poder ser
efectuada a partir de 24 mg.kg-1. Para alm disto, uma leitura inferior a 21 mg.kg-1 no
significa obviamente, a ausncia de leo mineral na amostra, apenas podendo afirmar-se
que - com uma probabilidade de 97,5 % - a concentrao deste na amostra ser inferior aos
21 mg.kg-1 determinados como limite de deteco. Relativamente ao limite de quantificao,
deveria ter sido efectuada uma confirmao da exactido e preciso conseguida com este
valor, com a finalidade de verificar se satisfatria, compreendendo esta anlise, a
realizao de ensaios, em condies de preciso intermdia, numa srie de padres
internos com concentrao igual ou prxima do limiar de quantificao, tendo em conta que
o coeficiente de variao (razo entre o desvio padro e a mdia dos valores observados)
para estes padres no deve exceder os 10 %.
Na literatura consultada (Biedermann et al, 2009; Bulder et al, 2008; Concin et al, 2008;
Fiorini et al, 2008; Fiorini et al, 2010; Karasek et al, 2010; Neukom et al, 2002; Tennant,
2004) no h referncia a limiares analticos obtidos noutros estudos utilizando o mesmo
mtodo que foi empregue na elaborao deste trabalho, no entanto, existem referncias a
limiares analticos para um mtodo que utiliza GC-FID com injeco splitless (Fiorini et al,
2010), com um limite de deteco de 5 mg.kg-1 e um limite de quantificao de 15 mg.kg-1 e
para um outro mtodo que acopla LC-SE-LC-GC-FID (Moret et al, 1997), com um limite de
deteco de 1 mg.kg-1. O que se verifica que o mtodo mais sofisticado em termos de
equipamentos e metodologia utilizada aquele que possui maior sensibilidade detectando
e quantificando menores quantidades de analito verificando-se tambm que a injeco
splitless, em vez da injeco on column, permite tambm um aumento da sensibilidade do
mtodo, no entanto, nunca alcanando os valores obtidos com um mtodo que acopla vrias
55

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
tcnicas, que permite uma melhor separao dos compostos de interesse e portanto a
deteco de menores quantidades de analito. Ainda assim, apesar de o mtodo utilizado
neste trabalho ser aquele que possui menor sensibilidade permite detectar e quantificar a
concentraes mais elevadas o que se verifica que os limiares analticos obtidos so
satisfatrios para o tipo de anlise que se pretende, que a verificao da conformidade do
leo em questo com os limites legais impostos em termos de leo mineral, uma vez que,
permite detectar e quantificar o analito abaixo dos 50 mg.kg-1.
Convm ainda salientar que a estimativa quer do limite de deteco, quer do limite de
quantificao no foi executada recorrendo a brancos, visto que o branco associado a este
mtodo, no possui sinal em termos de leo mineral. Assim, tendo em conta que este no
possui sinal, seria impossvel usar esses dados para efectuar os clculos mencionados
acima. A fortificao efectuada a mais baixa concentrao de parafina lquida que o
mtodo permite analisar tendo em conta as condies no laboratrio - equipamento usado e
software de integrao disponvel. Foram ainda testadas outras concentraes para a
execuo da fortificao do branco, mas no caso da concentrao de 7,5 mg.kg-1 no foi
detectado sinal em termos de leo mineral e para a concentrao de 11,25 mg.kg-1 o sinal
gerado de tal forma pequeno, que a integrao se torna extremamente difcil, pelo que, se
utilizou uma concentrao de 15 mg.kg-1 para a contaminao do branco usado nesta
anlise.
A actualizao dos valores dos limiares analticos dever ser efectuada sempre que ocorram
alteraes de factores de influncia, tal como, o analista, os reagentes, o equipamento,
entre outros ou sempre que se faa uma nova recta de calibrao e se utilize os parmetros
relativos mesma para o clculo dos limiares, sendo que, mais uma vez se poder efectuar
um estudo de estabilidade e adoptar como limiares analticos a mdia aritmtica dos limites
de deteco e quantificao relativos a uma srie significativa de rectas de calibrao.

IV.3. Preciso
A avaliao da preciso tem como intuito averiguar a disperso de resultados entre ensaios
independentes, executados sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, em
condies definidas, consoante a forma de expressar tal avaliao:

Repetibilidade que exprime a preciso de um mtodo efectuado em condies


idnticas, ou seja, em que os ensaios so efectuados sobre a mesma amostra em

56

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
condies to estveis quanto possvel - mesmo laboratrio, equipamento, analista,
reagentes e em curtos intervalos de tempo;

Reprodutibilidade que se refere preciso de um mtodo executado em diferentes


condies de ensaio, isto , utilizando o mesmo mtodo de ensaio, sobre a mesma
amostra, mas fazendo variar as condies de medio, tais como, diferentes
laboratrios, diferentes analistas, diferentes equipamentos e/ou diferentes tempos;

Preciso Intermdia ou variabilidade intralaboratorial que um processo de avaliao


da preciso intermdio entre a repetibilidade e a reprodutibilidade, isto , um estudo que
se realiza sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando o mesmo
mtodo, no mesmo laboratrio ou em laboratrios diferentes, mas definindo exactamente
quais as condies a variar.

IV.3.1. Repetibilidade
Na avaliao da preciso do mtodo atravs da repetibilidade foram analisados dez
replicados de uma amostra de leo de girassol refinado (Quadro XI; Anexo C). Os clculos
necessrios determinao deste parmetro sero efectuados quer recorrendo recta de
calibrao, quer atravs da expresso geral que o prprio mtodo apresenta, possibilitando
a comparao dos dois modos de clculo.

-1

Quadro XI: Resultados obtidos (em mg.kg ) na determinao da repetibilidade.

Ensaio

Resultado obtido atravs da


expresso do mtodo (mg.kg-1)

Resultado calculado a partir da


recta de calibrao (mg.kg-1)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

102,383
102,969
102,582
103,980
106,087
104,598
106,103
107,561
107,268
103,796

68,061
68,434
68,197
69,076
70,412
69,462
70,464
71,408
71,212
68,976

Mdia
Desvio Padro

104,733
1,911

69,570
1,231

57

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
O que se verifica pela informao veiculada no Quadro XI, que os resultados obtidos para
a mesma amostra, mas usando dois mtodos de clculo distintos so diferentes. O mtodo
de clculo recorrendo recta de calibrao conduz a resultados substancialmente mais
baixos do que os obtidos aquando da utilizao da expresso mencionada no mtodo. Um
factor a ter em conta o facto de os resultados obtidos, atravs da recta de calibrao,
resultarem de extrapolao, uma vez que, os valores obtidos experimentalmente de rea
normalizada se encontram fora da gama analisada para a construo da recta de calibrao.
Deste modo, dever-se-ia ter procedido diluio da amostra e posterior anlise. No entanto,
visto que, esta amostra foi tambm analisada num ensaio interlaboratorial, possvel
constatar que o mtodo de clculo recorrendo expresso mencionada no mtodo o que
proporciona valores de maior concordncia com este ensaio (Captulo IV.4.2.).
Nota: Dado que os resultados calculados com base na recta de calibrao so incoerentes de acordo com o referido acima - no ser utilizado a partir deste momento, o modo de
clculo de concentrao final a partir da recta de calibrao, devendo-se posteriormente
proceder confirmao experimental dos resultados obtidos para a construo da mesma.
Apesar da constatao mencionada anteriormente, os clculos que se efectuaro de
seguida contemplaro os dois modos de clculo, por uma questo de comparao dos
mesmos.
A partir do desvio padro dos resultados dos ensaios efectuados sob condies de
repetibilidade pode-se calcular o limite de repetibilidade

, que capacita o analista para

decidir se a diferena entre anlises efectuadas em condies de repetibilidade


significante (Relacre, 2000):

onde:

o desvio padro amostral associado aos resultados considerados para cada nvel de
concentrao;

para um nvel de confiana de 97,5 % e 10 observaes toma o valor de 2,26.

Assim, para os resultados calculados com base na recta de calibrao o limite de


repetibilidade de 3,93 mg.kg-1 e para os resultados obtidos pela expresso veiculada no
mtodo, este parmetro de 6,11 mg.kg-1. Isto , a diferena absoluta entre dois resultados
de ensaio, para a determinao de leo mineral por este mtodo cromatogrfico e obtidos
58

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


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em condies de repetibilidade, no deve exceder os valores de 3,93 mg.kg-1 e 6,11 mg.kg-1
dependendo do mtodo usado para efectuar o clculo da concentrao de leo mineral na
amostra. Esta diferena entre o limite de repetibilidade associado a cada um dos mtodos
de clculo da concentrao justificada pelo valor do desvio padro dos resultados, que
maior no caso do clculo efectuado recorrendo expresso mencionada no mtodo, tendo
em conta que, o limite de repetibilidade proporcional ao desvio padro associado ao
estudo efectuado em condies de repetibilidade.
Uma outra forma de expressar a preciso baseada em dados de repetibilidade atravs do
coeficiente de variao de repetibilidade

expresso em termos de percentagem

(Relacre, 2000):

onde:

o desvio padro de repetibilidade;

a mdia dos valores observados no ensaio de repetibilidade.

Ento, o coeficiente de variao de repetibilidade para o mtodo de clculo usando a recta


de calibrao de 1,77 % e usando a expresso do mtodo de 1,82 %. Estes dados
corroboram os obtidos para o limite de repetibilidade, uma vez que, para o coeficiente de
variao de repetibilidade tambm o modo de clculo pela expresso baseada no mtodo
possui uma maior percentagem do que para o mtodo de clculo recorrendo recta.
Na prtica aceitam-se resultados de duas determinaes efectuadas em condies de
repetibilidade se o mdulo da diferena entre esses dois resultados no exceder o limite de
repetibilidade, que neste caso assumir o valor de 6,11 mg.kg-1 - limite de repetibilidade
associado ao modo de clculo da concentrao de leo mineral atravs da expresso
mencionada no mtodo - pelo facto de existir um ensaio interlaboratorial que favorece este
mtodo de clculo, em detrimento da recta de calibrao. Caso a amplitude de dois ensaios
seja superior ao limite, dever-se- numa primeira fase, fazer uma anlise crtica e, caso seja
necessrio, recorrer repetio de ensaios segundo um plano assente em dados
bibliogrficos ou normas.
Para validao mais pormenorizada deste parmetro - repetibilidade - poder-se-ia ter
recorrido anlise de uma outra amostra, tambm em condies de repetibilidade, mas com
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um teor mais reduzido em leo mineral, ou seja, efectuar a determinao da repetibilidade
em dois nveis de concentrao de leo mineral distintos. Tal no foi possvel por falta de
uma amostra deste tipo.

IV.3.2. Reprodutibilidade
A anlise da preciso atravs da reprodutibilidade no foi efectuada neste trabalho, uma vez
que, apesar de ter sido realizado um ensaio interlaboratorial (Captulo IV.4.2.), este no foi
efectuado a nvel oficial, tratando-se de uma anlise comummente pedida a outros
laboratrios. Os resultados facultados mencionam apenas o valor correspondente ao teor de
leo mineral da amostra, no facultando dados relativos ao nmero de replicados
efectuados para obter tal resultado, o mtodo utilizado por cada laboratrio ou mesmo o
desvio padro associado ao resultado fornecido. Assim, estes dados no permitem a
determinao deste parmetro de validao, servindo apenas como uma referncia em
termos de concentrao de leo mineral na amostra analisada por laboratrios, em que a
implementao deste mtodo j foi efectuada.
Caso este parmetro tivesse sido determinado seria possvel, tal como para a repetibilidade,
encontrar um limite de reprodutibilidade para validar ensaios desta natureza. No entanto,
este clculo implica o conhecimento do desvio padro associado aos resultados de cada
laboratrio, dados que no foram facultados, como j foi referido.
Embora a reprodutibilidade no seja um componente de validao do mtodo executado por
um nico laboratrio, um parmetro de validao importante quando o laboratrio procura
a verificao do desempenho do seu mtodo em relao aos dados de validao obtidos por
meio de comparaes interlaboratoriais.

As duas medidas de disperso referidas repetibilidade e reprodutibilidade representam


os extremos de variabilidade de um mtodo de ensaio, sendo a repetibilidade uma medida
da variabilidade mnima e a reprodutibilidade, uma medida da variabilidade mxima dos
resultados. Assim, e visto que, foi determinada a repetibilidade deste mtodo, h que
cumprir estes critrios de variabilidade mnima, uma vez que, no foi possvel a anlise e
determinao dos critrios de variabilidade mxima.

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IV.3.3. Preciso intermdia
A avaliao da preciso intermdia de um mtodo implica um estudo sobre uma amostra,
amostras idnticas ou padres, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio ou em
laboratrios diferentes, mas definindo exactamente quais as condies a usar, de entre
diferentes analistas, diferentes equipamentos, diferentes pocas, com ou sem verificao da
calibrao. Dado no ser possvel a realizao deste ensaio noutro laboratrio, nem a
utilizao de outro equipamento ou outro analista, resta efectuar esta anlise em tempos
diferentes, ou seja, em dias distintos.
Este estudo compreendeu, assim, a anlise de um branco fortificado com 15 mg.kg-1 de
parafina lquida, em dias de anlise diferentes (Quadro XII), mas utilizando os mesmos
reagentes, equipamento e analista. Devido complexidade e necessidade de recursos, a
verificao da calibrao no foi efectuada neste estudo especfico.
Esta medida de preciso reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos
resultados num laboratrio e como tal, a mais aconselhvel de usar.

Quadro XII: Resultados obtidos nos dez ensaios para a avaliao da preciso intermdia.

Ensaio

Resultado (mg.kg-1)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

19,580
18,529
19,085
18,549
19,711
19,408
19,486
18,923
18,376
19,233

Mdia
Desvio padro

19,088
0,477

No estudo da preciso intermdia efectuado neste trabalho foi usado um mtodo


simplificado para estimar este parmetro, efectuando n medies sobre um padro de
concentrao 15 mg.kg-1 variando apenas o dia em que a medio efectuada.

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Neste caso, o clculo da preciso intermdia baseia-se na expresso (Relacre, 2000):

onde:

o desvio padro de preciso intermdia relativo s condies de preciso


intermdia que aparecem entre parntesis, ou seja, fazendo variar o tempo de
anlise;

n o nmero de repeties;
o resultado individual obtido;
a mdia aritmtica dos resultados individuais obtidos.

Assim, o desvio padro de preciso intermdia baseado no estudo de dez anlises


independentes da mesma amostra, em dias distintos, de 0,48 mg.kg-1 - sendo este
considerado o valor de variabilidade dos resultados usando este mtodo especificamente.
Uma crtica necessria a esta determinao o facto ser necessrio a realizao do maior
nmero de repeties tcnica e economicamente viveis, sendo recomendado para o
clculo da preciso intermdia, um mnimo de quinze repeties, o que no foi atingido na
anlise efectuada neste trabalho.
Ainda a salientar, dentro da determinao da preciso do mtodo, que este estudo poderia
contemplar a comparao da preciso entre mtodos, que consiste no confronto dos
resultados obtidos pelo mtodo a ser validado com os resultados obtidos recorrendo a um
mtodo de referncia. Este estudo visa a comparao da preciso de um mtodo em
processo de implementao com uma referncia. No caso especifico da determinao de
leo mineral, existe uma Norma ISO - que ainda se encontra em processo de estudo para
posterior aceitao, podendo ainda sofrer algumas alteraes no seu contedo - que
poderia ser usada para efectuar esta comparao. No entanto, esta avaliao implica a
realizao de anlises em replicado, utilizando os dois mtodos em separado, sobre as
mesmas amostras, em toda a gama de concentraes em que se pretende validar o
mtodo, o que se torna economicamente pouco vivel. Assim, este estudo comparativo no
foi efectuado para a validao do mtodo em implementao.

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
IV.4. Exactido
O estudo da exactido de um mtodo visa avaliar a concordncia entre o resultado de um
ensaio e o valor de referncia aceite como convencionalmente verdadeiro e implica uma
combinao de erros aleatrios e sistemticos.
Os processos normalmente usados para a avaliao da exactido de um mtodo
compreendem entre outros (Relacre, 2000) o uso de materiais de referncia, a participao
em comparaes interlaboratoriais e a realizao de ensaios de recuperao.

IV.4.1. Materiais de Referncia Certificados (MRC)


Relativamente aos Materiais de Referncia Certificados (MRC), foram consultadas as duas
bases de dados mais importantes, de entidades que comercializam MRC, IRMM Institute
for Reference Materials and Measurements e NIST National Institute of Standards and
Technology, tendo-se verificado que no existem materiais de referncia certificados para a
determinao de hidrocarbonetos alifticos saturados com origem mineral.

IV.4.2. Comparaes interlaboratoriais


Em relao a comparaes interlaboratoriais, como j foi referido anteriormente, procedeuse ao envio de uma amostra de leo de girassol refinado (Anexo D Figura D1) para quatro
laboratrios, que efectuaram a anlise para determinao de hidrocarbonetos alifticos
saturados de origem mineral, de acordo com os mtodos que possuem implementados, mas
que no foram mencionados nos resultados facultados. Para alm desta amostra foi ainda
enviada uma outra de leo de soja bruto para dois dos laboratrios - no foi enviada para os
outros dois, por uma questo de falta de disponibilidade dos mesmos para a realizao
destas anlises. Os resultados obtidos, incluindo os do Laboratrio de Estudos Tcnicos,
encontram-se sumarizados no Quadro XIII.

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-1

Quadro XIII: Resultados obtidos (mg.kg ) nos ensaios interlaboratoriais, para as amostras de leo de
girassol refinado e leo de soja bruto.

Amostra

leo de Girassol Refinado


(mg.kg-1)

leo de Soja Bruto


(mg.kg-1)

LET
Laboratrio B
Laboratrio C
Laboratrio D
Laboratrio E

105
105
98
108
73

224
140
299
-

Mdia
Desvio Padro

98
14

221
80

Laboratrio

O ensaio efectuado do tipo de aptido, em que, o objectivo avaliar o desempenho dos


laboratrios participantes, mais especificamente, avaliar a exactido dos resultados obtidos
neste trabalho experimental.
A avaliao de desempenho de um laboratrio que participa num ensaio deste tipo feita
com base no Z-score (Relacre, 2000):

onde:

o valor obtido pelo laboratrio;


o valor aceite como verdadeiro, isto , a mdia dos valores obtidos no ensaio
interlaboratorial;

a unidade de desvio, que pode ser o desvio padro da mdia dos laboratrios no
ensaio interlaboratorial, a incerteza de

ou outro desvio que assente em critrios

de exigncia por parte de quem organiza tal ensaio.

Dado que os participantes neste circuito interlaboratorial no facultaram informao acerca


do desvio padro associado aos resultados obtidos, para o clculo do Z-score ser
considerado o desvio padro da mdia das observaes dos vrios laboratrios.

Ao longo deste trabalho no sero referidos nomes de laboratrios que contriburam para o estudo, nos
ensaios interlaboratoriais, por questes de confidencialidade.

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Assim, o Z-score obtido neste estudo, para o Laboratrio de Azeites, relativamente
amostra de leo de girassol de 0,5 e em relao amostra de leo de soja bruto de
aproximadamente 0,04.
A escala de valores que permite a avaliao do Z-score obtido a seguinte (Relacre, 2000):

Z 2: Satisfatrio;

2 < Z 3: Questionvel;

Z > 3: Incorrecto.

Tendo em conta a escala mencionada, pode-se constatar que os valores de Z-score obtidos
para ambas as amostras se encontram no patamar satisfatrio, pelo que, se pode
comprovar que a exactido do mtodo usado tambm satisfatria.
Um outro parmetro importante na verificao da exactido do mtodo o erro normalizado,
em que, caso o laboratrio calcule a incerteza do seu resultado (
verdadeiro no ensaio (
laboratrio (

), o valor aceite como

) deve estar contido no intervalo de incerteza do valor obtido pelo

). Quando tal no acontece, o intervalo pode estar subestimado, devendo,

ser empregue o conceito de erro normalizado (

) para efectuar a avaliao do desempenho

(Relacre, 2000):

onde:

Se

a incerteza associada ao valor aceite como verdadeiro.


1, ento

est bem estimada.

Os resultados obtidos e a respectiva incerteza, calculada com base na incerteza padro que

corresponde

ao

desvio

padro

associado

mdia

dos

valores

obtidos

experimentalmente nos diversos ensaios - apresentam-se no Quadro XIV. O fornecimento


do valor de concentrao de leo mineral presente na amostra, associado a uma incerteza
importante neste tipo de avaliao, pois permite determinar se os valores apesar de
discrepantes numa viso mais grosseira, podem ser considerados semelhantes, por
exemplo, devido a elevadas incertezas.
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


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-1

Quadro XIV: Resultados obtidos (mg.kg ), pelo LET, na anlise de amostras de leo de girassol
refinado e leo de soja bruto, englobadas no ensaio interlaboratorial.

Amostra
leo de Girassol
Refinado
leo de Soja Bruto

Nmero de
replicados

Mdia (mg.kg-1)

Desvio padro
(mg.kg-1)

10

104,7

1,9

223,5

13,4

Antes de avanar na avaliao do desempenho, convm assinalar que o nmero de


replicados em cada amostra no o mesmo, uma vez que, a amostra de leo de girassol foi
tambm analisada para o estudo da repetibilidade, tendo esses resultados sido
considerados nesta anlise, enquanto a amostra de leo de soja bruto possui um nmero de
replicados de acordo com o que ser rotina no laboratrio, uma vez que, foi analisada
exclusivamente para este parmetro.
Fazendo uso do conceito de erro normalizado e comparando os valores obtido no
Laboratrio de Estudos Tcnicos (105 2 mg.kg-1 para a amostra de leo de girassol
refinado e 224 13 mg.kg-1 para a amostra de leo de soja bruto) com os valores de
referncia obtidos nas comparaes interlaboratoriais (98 14 mg.kg-1 para a amostra de
leo de girassol refinado e 221 80 mg.kg-1 para a amostra de leo de soja bruto) verificase que o valor aceite como verdadeiro (obtido no ensaio interlaboratorial) no se situa dentro
do intervalo de incerteza do valor obtido no laboratrio para o caso da amostra de girassol,
mas encontra-se nesse intervalo para o caso do leo de soja. Assim, utilizando a expresso
do erro normalizado para a amostra de leo de girassol refinado, obtm-se um valor de 0,5,
ou seja, menor do que 1, pelo que se pode concluir que a incerteza associada ao valor
obtido no laboratrio est bem estimada.
Analisando quer os dados do Quadro XIII, quer do Quadro XIV, o que se verifica uma
disperso relativamente grande dos resultados obtidos. Relativamente amostra de leo de
girassol, o que se verifica o aparecimento de um resultado (Laboratrio E) completamente
discordante dos restantes. Esta discordncia pode ser justificada pelo modo de integrao
do cromatograma obtido, uma vez que, experimentalmente se verificou que a etapa de
integrao manual a que introduz maiores erros no resultado final (este assunto ser
abordado de forma mais alongada no subcaptulo correspondente robustez do mtodo).
No entanto, para poder comentar mais correctamente estes valores seria necessrio o
acesso incerteza padro associada aos mesmos, o que no foi facultado pelos vrios
laboratrios. Tendo como referncia o valor obtido na anlise efectuada no Laboratrio de
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Estudos Tcnicos (105 2 mg.kg-1 para o leo de girassol e 224 13 mg.kg-1 para o leo de
soja), o que se verifica que para a amostra de leo de girassol apenas o Laboratrio B
possui um valor concordante, no entanto, tanto o Laboratrio C, como o Laboratrio D
podem tambm ser concordantes com este valor, dependendo da incerteza associada.
Relativamente ao leo de soja, para alm de existirem poucos resultados, muito difcil
efectuar comparaes sem o respectivo valor da incerteza, uma vez que, quanto maior a
concentrao de leo mineral observada, maior vai ser a incerteza associada,
especialmente tendo em conta que este mtodo concebido para avaliar concentraes
relativamente baixas, dado que, o limite legal so 50 mg.kg-1.

IV.4.3. Ensaios de Recuperao


Ainda focando a ateno na exactido do mtodo, foram efectuados ensaios de
recuperao contemplando os vrios tipos de leo - quer de girassol (Anexo D Figuras D2
e D3), quer de soja (Anexo D Figuras D4 e D5), brutos e refinados - numa tentativa de
abranger o mximo de tipos possveis de amostras que podero ser futuramente analisadas.
Os ensaios de recuperao basearam-se na anlise da amostra ao natural - que
designada controlo - e posterior anlise da mesma aps fortificao com 50 mg.kg-1 de
parafina lquida. A escolha da fortificao com 50 mg.kg-1 de parafina deve-se ao facto de
este ser o limite mximo de leo mineral permitido em leo de girassol. No entanto, para um
estudo mais pormenorizado deveriam ter sido analisadas amostras em que a fortificao
deveria contemplar os limites mnimo e mximo da gama de trabalho escolhida. Os
resultados dos ensaios de recuperao encontram-se resumidos no Quadro XV.
Na anlise da exactido atravs de ensaios de recuperao, a taxa de recuperao
calculada segundo a expresso (Relacre, 2000):

onde:

a concentrao do analito na amostra fortificada;

a concentrao do analito na amostra no fortificada;

a concentrao do analito adicionada amostra fortificada.

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Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Quadro XV: Resultados obtidos nos ensaios de recuperao, para o estudo da exactido do mtodo.

Tipo de leo

Resultado (mg.kg-1)

Taxa de
Recuperao

leo de Girassol Bruto

Controlo
Fortificao

21,564
70,919

99 %

leo de Girassol
Refinado

Controlo
Fortificao

18,118
64,573

93 %

leo de Soja Bruto

Controlo
Fortificao

121,799
174,207

105 %

leo de Soja Refinado

Controlo
Fortificao

24,419
71,545

94 %

Os critrios de aceitao das taxas de recuperao, para este mtodo e especificamente


para o Laboratrio de Estudos Tcnicos, foram definidos internamente como sendo uma
variao de 10% em relao recuperao ideal, os 100 %. Assim, as taxas de
recuperao sero aceites como satisfatrias num intervalo de 90 % a 110 %. Observando
os valores obtidos para a taxa de recuperao em amostras de leo de girassol bruto e
refinado e em outras de leo de soja bruto e refinado verifica-se que estas se encontram
dentro dos critrios estabelecidos. Confirma-se, assim, que a exactido do mtodo
satisfatria, tal como j havia sido referido aquando da anlise dos resultados dos ensaios
interlaboratoriais.
H ainda que referir que este procedimento possui como limitao o facto de a parafina
lquida adicionada no estar necessariamente na mesma forma que o leo mineral se
apresentaria, numa amostra real sem contaminao propositada. Este factor importante
porque a presena de analitos mais facilmente detectveis pode ocasionar avaliaes
excessivamente optimistas da recuperao.

IV.5. Robustez
A robustez de um mtodo de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta face a
pequenas variaes, sendo um mtodo considerado robusto se se revelar praticamente
insensvel a pequenas variaes que possam ocorrer aquando da sua execuo.
A anlise da robustez do mtodo foi efectuada de um modo intuitivo e pouco estruturado,
no utilizando um modo comum de anlise deste parmetro de validao que o teste de
Youden, visto que, para que este seja correctamente elaborado necessrio efectuar uma
grande quantidade de anlises, o que requereria muito tempo e economicamente pouco
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
vivel. Os aspectos que sero seguidamente abordados com o intuito de averiguar a
robustez resultam de situaes inesperadas que foram surgindo ao longo do trabalho prtico
ou de experincias efectuadas para resolver alguns problemas que foram aparecendo.
Este trabalho prtico foi inicialmente efectuado utilizando n-hexano de pureza analtica (com
99,0 % de pureza), tendo-se verificado que efectuando um branco com este reagente
apareceria uma banda larga - tpica de leo mineral - no cromatograma obtido (Anexo E
Figura E1). Para comparao foi efectuada a mesma anlise do branco, mas utilizando
como eluente da cromatografia lquida n-hexano para cromatografia (tambm com 99,0 %
de pureza) e verificou-se a inexistncia de qualquer banda, sendo este cromatograma
composto apenas pelo pico correspondente ao padro interno (Anexo E Figura E2). Este
estudo de comparao foi ainda efectuado para uma amostra de leo de girassol refinado,
sem contaminao de leo mineral, que mais uma vez confirmou os resultados obtidos da
anlise do branco - com o aparecimento de uma banda tpica de leo mineral aquando da
anlise com n-hexano de pureza analtica e o desaparecimento dessa banda na anlise com
n-hexano prprio para cromatografia. Isto significa que apesar do grau de pureza do
reagente ser o mesmo, o n-hexano especfico para cromatografia possui menor quantidade
de contaminantes do que o n-hexano de pureza analtica, o que se justifica atravs do facto
de os solventes para cromatografia necessitarem de ser mais puros do que os restantes,
uma vez que, entram em contacto com a coluna cromatogrfica, que pode ligar compostos
sua estrutura qumica e caso o solvente seja impuro pode levar a contaminaes da coluna
que a danifiquem irreversivelmente, pelo que imprescindvel que possuam um grau de
pureza elevado e poucos contaminantes na sua composio. Neste caso, apesar do nhexano no entrar em contacto com a coluna cromatogrfica em GC, pode e de facto
introduz uma contaminao de leo mineral na amostra, quando no de grau prprio para
utilizao cromatogrfica.
Para alm disto, ainda relativamente aos reagentes usados nesta determinao, o gel de
slica aps ser prateado, com recurso a uma soluo de nitrato de prata, necessita de ser
correctamente armazenado, num frasco de vidro opaco, envolto em papel de prata e
colocado num local escuro, sem humidade. Caso o armazenamento da mesma no seja o
correcto verifica-se que passados dois dias da preparao, a slica se encontra imprpria
para utilizao, originando um pico cromatogrfico grande, junto ao padro interno, que no
mtodo apresentado como kaureno. Segundo o mtodo usado neste trabalho, este pico
pode ainda aparecer derivado de um gotejamento rpido de mais ou pouca compactao da
slica na cromatografia em coluna.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
No mtodo usado como base para este trabalho prtico no mencionada a necessidade
de filtrao da amostra, quando esta possui impurezas em suspenso, no entanto, na
Norma ISO relativa determinao de hidrocarbonetos alifticos saturados de origem
mineral em leos vegetais, mencionada a necessidade de filtrao de amostras com esta
caracterstica. Para avaliar estes dados foi utilizada uma amostra de leo de girassol bruto
com impurezas suspensas, usando o mtodo em estudo com e sem filtrao da amostra
(Anexo E Figura E3). Os ensaios para cada uma das situaes experimentais foram
efectuados em triplicado e os resultados obtidos encontram-se sumarizados no Quadro XVI.

Quadro XVI: Resultados dos ensaios para testar a necessidade de filtrao de amostras com
impurezas.

Condies

Mdia Desvio Padro (mg.kg-1)

Sem filtrao

23,826
23,262
25,419

24,2 1,1

Com filtrao

23,673
23,077
23,412

23,4 0,3

O que se verifica neste estudo que a filtrao no altera o valor da concentrao de leo
mineral obtido e pelo facto de ser uma operao que demora algum tempo, poder-se-
prescindir deste passo. No entanto, seria aconselhvel efectuar este estudo noutras
amostras, possivelmente noutras gamas de concentrao, uma vez que, a amostra
analisada possui uma concentrao baixa tendo em conta a gama analisada neste trabalho
e uma concentrao alta pode levar a concluses diferentes. Este estudo mais aprofundado
no foi efectuado porque durante o trabalho prtico, a amostra analisada foi a nica que
apresentou impurezas em suspenso.
Ainda referente manipulao do mtodo foi analisada uma amostra de leo de soja bruto,
cuja contaminao de hidrocarbonetos alifticos saturados de origem mineral, de cadeia
curta. Tal no de estranhar visto se tratar de um leo bruto, que, portanto, ainda no foi
sujeito a refinao, uma vez que, num passo de refinao a contaminao com cadeias
mais curtas deveria desaparecer, tendo em conta que, a desodorizao permite a remoo
de massas moleculares abaixo dos C20 (Grundbck et al, 2010). A anlise desta amostra foi
efectuada em quadruplicado tendo-se verificado na primeira anlise que a banda larga
correspondente a leo mineral tinha inicio logo no comeo do cromatograma (Anexo E
Figura E4). Aquando das restantes anlises verificou-se o desaparecimento de um pouco do

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
inicio desta banda, iniciando-se esta mais frente no cromatograma (Anexo E Figura E5).
Este trata-se de um aspecto importante, visto que, uma explicao para o desaparecimento
da zona inicial da banda de leo mineral a evaporao das cadeias mais curtas dos
hidrocarbonetos contaminantes, aquando da evaporao do solvente no evaporador
rotativo, o que poder levar a leituras enganosas por defeito. Mais uma vez para avaliao
mais estruturada, este aspecto deveria ter sido estudado noutras amostras (durante a
elaborao experimental deste trabalho no existiram mais amostras com tal caracterstica,
uma vez que, mais comum o aparecimento de amostras com contaminaes de
hidrocarbonetos alifticos saturados de origem mineral de cadeias mais longas).
Devido a um aspecto inesperado durante o trabalho experimental - a avaria irreparvel do
computador de suporte ao software de integrao - houve necessidade de alterao do
software usado para integrao dos cromatogramas obtidos, permitindo assim, efectuar
algumas comparaes em termos do modo de integrao, que o ponto mais fraco e que
permite maior introduo de erros nos resultados obtidos ao nvel deste mtodo.
Inicialmente era usado o software de integrao Turbochrom Navigator, que um tipo de
software mais permissivo que o actual software utilizado - Clarity. O primeiro permitia
efectuar qualquer tipo de integrao manual, sem restries e possua algumas funes de
correco de picos, que por exemplo, permitiam corrigir picos com arrastamento, eliminando
a parte correspondente ao arrastamento, ou seja, desenhando um pico perfeito - pico
alongado, que se inicia e termina na linha de base, sem arrastamento. O actual software
mais autnomo, com funes de integrao pr-definidas e determinadas situaes de
integrao no so permitidas pelo mesmo, como o exemplo da correco do
arrastamento de um pico, uma vez que, este software no permite a obteno de um pico
perfeito a partir de um com arrastamento. Dado que a forma de integrar um cromatograma
se altera consoante o software utilizado, o que se pode verificar o aparecimento de
resultados diferentes consoante o tipo de integrao. Com o antigo software haviam j sido
analisados alguns dos dez replicados relativos ao estudo dos limiares analticos (Anexo E
Figura E6), que por uma questo de coerncia foram novamente analisados no novo
software (Anexo B), permitindo assim a comparao dos resultados obtidos com cada modo
de integrao (Quadro XVII).
Analisando os dados destas duas formas de integrao, o que se observa que os valores
no so significativamente diferentes, visto que a integrao recorrendo ao software
Turbochrom Navigator fornece um resultado de 20,9 0,7 mg.kg-1 e recorrendo ao software
Clarity o valor obtido de 19,1 0,5 mg.kg-1 na anlise de um branco fortificado com 15
mg.kg-1 de parafina lquida. No entanto, o software Turbochrom Navigator fornece sempre
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
valores de concentrao superior aos obtidos com o software Clarity, sendo esta pequena
diferena justificada pela forma diferenciada de integrao de cada um dos softwares, para
alm do facto de este mtodo ser extremamente sensvel forma de integrao do
cromatograma obtido.

Quadro XVII: Comparao de sistemas de integrao atravs da inspeco de resultados obtidos


para a anlise dos limiares analticos.

Software de Integrao Turbochrom


Navigator

Software de Integrao
Clarity

Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Ensaio 10

21,003
20,324
21,682
20,421
22,199
20,064
21,000
20,335
-

19,580
18,529
19,085
18,549
19,711
19,408
19,486
18,923
18,376
19,233

Mdia
Desvio Padro

20,879
0,746

19,088
0,477

Esta sensibilidade forma de integrao foi experimentada e confirmada atravs da


comparao de vrios modos de integrao, inclusivamente comparando os resultados
obtidos com diversas formas de integrao, com laboratrios que j possuem este mtodo
correctamente implementado. O que se verifica que para a obteno de resultados
comparveis entre os vrios laboratrios que efectuam este tipo de anlise, necessrio
que a integrao do cromatograma seja efectuada de forma semelhante, visto que,
pequenas variaes na forma de integrar alteram completamente o resultado final obtido.
Neste trabalho foi adoptada a forma de integrao em que apenas interessa, num
cromatograma contaminado com leo mineral, o pico do padro interno e a banda larga
resultante da contaminao. Assim, inicialmente, ser integrado o pico do padro interno desde o seu inicio at ao seu final, mesmo que este apresente arrastamento - e depois
procura-se a zona em que aparece a banda larga e procede-se integrao da mesma
desde o incio at ao final dessa banda (Figura 14). Posteriormente procede-se, ento,
integrao de todos os picos que se encontram sobre a banda larga correspondente a leo
mineral, tendo em ateno que esta integrao dos picos de hidrocarbonetos normais num
leo mineral deve ser efectuada vale a vale (Figura 15), com a finalidade de no roubar rea
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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
banda da contaminao. Outra situao importante tambm neste tipo de anlise o facto
de a banda de leo mineral poder aparecer em zonas distintas do cromatograma, consoante
o tipo de contaminao a que o leo foi sujeito. Se esta contaminao for de cadeias
carbonadas mais curtas, o que se verifica o aparecimento da banda larga logo no incio do
cromatograma, sendo esta contaminao facilmente eliminada por refinao do respectivo
leo; poder tambm aparecer uma banda larga no final do cromatograma correspondente a
contaminao com cadeias carbonadas mais longas, sendo esta contaminao mais
preocupante do que a anterior, uma vez que, estes compostos no so volteis e portanto
no podem ser eliminados por refinao (mas este um caso de contaminao menos
frequente); e ainda, no caso mais recorrente, aparece uma banda larga no meio do
cromatograma, sendo esta derivada de contaminao com cadeias mdias, que podem ser
parcialmente removidas na refinao, mas que no desaparecem completamente, ou seja,
em que a refinao s diminui a concentrao dessa contaminao. Situaes mais
complexas podem ainda levar ao aparecimento de duas bandas distintas, correspondendo
ambas a contaminao com leo mineral, mas de dois tipos distintos.

Figura 14: Exemplificao da integrao da banda larga correspondente a leo mineral num
cromatograma referente a leo de girassol refinado.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

Figura 15: Exemplificao da integrao pico a pico dos hidrocarbonetos alifticos normais num leo,
para o mesmo leo de girassol refinado apresentado na Figura 13.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
Uma crtica a efectuar a este mtodo o facto de por vezes, o pico do padro interno
aparecer sobre a banda larga correspondente a contaminao com leo mineral (Anexo E
Figuras E7 e E8), o que numa situao ideal no deveria acontecer, visto que, este actua
como uma referncia, que no ser correctamente contabilizada quando aparece na mesma
zona do cromatograma que a contaminao. No entanto, difcil alterar esta situao, uma
vez que, esta banda larga pode aparecer em vrias zonas do cromatograma - como foi
referido anteriormente - consoante o tipo de contaminao e, portanto, difcil encontrar um
padro interno que, em nenhuma situao, possa ser detectado na mesma zona da
contaminao.
Ainda relativamente ao estudo da robustez do mtodo, foi utilizada a Norma ISO para a
determinao de hidrocarbonetos alifticos saturados em leos vegetais - que ainda se
encontra em fase de aprovao - para comparao com o mtodo em estudo neste trabalho,
dado que, depois de aprovada esta Norma ISO ser a referncia para o estudo deste tipo de
contaminao. Para tal, foram analisadas em triplicado, por cada mtodo em anlise, duas
amostras distintas, uma de leo de girassol bruto (Anexo E Figuras E9 e E10) e outra de
leo de girassol refinado. Foi ainda analisada uma amostra de leo de soja bruto, mas em
duplicado, por cada um dos mtodos (Quadro XVIII).

Quadro XVIII: Resultados da comparao entre mtodos.

Tipo de leo

Mtodo

Mdia Desvio Padro (mg.kg-1)

leo de Girassol Bruto

Mtodo Interno
Mtodo ISO

20,8 0,2
21,5 0,1

leo de Girassol Refinado

Mtodo Interno
Mtodo ISO

114,6 0,7
116,4 0,5

leo de Soja Bruto

Mtodo Interno
Mtodo ISO

223,5 12,8
198,0 9,2

Atravs dos dados obtidos neste estudo, o que se verifica que para as amostras de leo
de girassol - quer bruto, quer refinado - no existem diferenas no valor de concentrao
obtido, por cada um dos mtodos, ou seja, verifica-se que a execuo do mtodo ISO ou do
mtodo interno conduz a resultados semelhantes. Esta constatao facilmente
compreendida pelo facto de os dois mtodos apenas diferirem em pequenos aspectos, tais
como a recolha do volume da amostra - que no mtodo interno no se faz, assim como o
desprezo do volume correspondente aos dois mililitros de lavagem do copo de pesagem,
enquanto no mtodo ISO estes volumes so todos recolhidos para posterior anlise em

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
cromatografia gasosa - e tambm o volume de eluio - que no mtodo ISO 70 mL e no
mtodo interno de apenas 55 mL.
Em relao amostra de leo de soja bruto verifica-se uma ligeira diferena entre os
resultados obtidos para cada um dos mtodos, o que explicado pelo facto de, numa das
anlises efectuadas com o mtodo interno, aparecer uma banda mais larga do que nas
restantes anlises. Deveria ter sido averiguada a provenincia de tal contaminao extra,
mas por falta de quantidade de amostra para anlise, tal no foi possvel. Assim, neste caso,
deveriam ser efectuados mais estudos noutras amostras de leo de soja, para confirmao
dos resultados obtidos.
Tendo em conta os aspectos observados neste estudo de robustez pode-se concluir que se
correctamente executado e atendendo aos pormenores na execuo experimental do
mesmo (como por exemplo, o correcto armazenamento da slica prateada), este um
mtodo robusto, cujo ponto fraco o modo de integrao, que deve ser cuidadosamente
estabelecido e cumprido, com o objectivo de obter resultados coerentes.
Aps o episdio de leo de girassol contaminado proveniente da Ucrnia foi efectuado um
teste de proficincia em 2010 (Karasek et al, 2010) com o intuito de verificar a concordncia
dos resultados obtidos por cinquenta e cinco laboratrios diferentes, usando os mtodos que
j possuam implementados, tendo-se verificado a necessidade de estandardizao dos
mtodos de anlise para a obteno de resultados concordantes entre si. Este teste
corrobora o que foi avaliado neste trabalho na etapa de robustez, em que se verificou que,
por exemplo, o modo de integrao dos cromatogramas e o software utilizado possuem
importncia para os resultados obtidos. Esta estandardizao poder ser alcanada pela
implementao da Norma ISO, pela qual um laboratrio se dever reger para efectuar este
tipo de determinao.
Aps as vrias etapas de validao do mtodo, para alm da correcta documentao da
validao, devem ser claramente estipulados os procedimentos experimentais a cumprir,
para que o mtodo possa ser implementado sem ambiguidades e de acordo com o previsto
pelos dados de validao. Caso tal no seja efectuado, o desempenho real do mtodo no
corresponder ao previsto pela validao.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
V. Propostas para trabalho futuro
Tendo em conta que a validao um processo demorado e com muitas etapas a avaliar,
no foi possvel efectuar todo o trabalho experimental pretendido ao longo do tempo
disponvel para o mesmo. Assim, existem algumas anlises importantes que seriam
necessrias efectuar, tendo algumas delas sido referidas ao longo da discusso dos
resultados obtidos no processo de validao. Entre estas anlises destacam-se:
A anlise ao longo do tempo da estabilidade da recta de calibrao, que dados os
resultados obtidos, apesar de mostrar a linearidade do mtodo, fornece resultados
no coerentes com o modo alternativo de clculo dos resultados em termos de
concentrao;
A participao em ensaios interlaboratoriais oficiais, quando estes existirem, com a
finalidade de obter a reprodutibilidade do mtodo e confirmar a exactido do mesmo
num circuito oficial;
A anlise de parmetros de validao para leo de soja, tais como, recta de
calibrao, repetibilidade e estudos de robustez mais aprofundados. O estudo mais
alargado destes parmetros necessrio para se proceder validao do mtodo
para a determinao de hidrocarbonetos alifticos saturados em leo de soja, uma
vez que, o mtodo em causa neste trabalho especfico para leo de girassol, mas
poder demonstrar-se til para a anlise de outros tipos de leos vegetais;
Se se verificar necessrio proceder validao deste mtodo para outros tipos de
leos vegetais cujo volume de anlises assim o justifique, tendo em conta que, este
mtodo pode ser mais abrangente do que apenas para a anlise de leo de girassol.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
VI. Concluses
Concluindo, verifica-se que a elaborao deste trabalho acerca da validao/implementao
de um mtodo para a determinao de hidrocarbonetos alifticos saturados em leo de
girassol por cromatografia gasosa de extrema importncia em termos de controlo de
qualidade alimentar, dada a diversidade de aplicaes que o leo mineral pode ter em
termos alimentares, incluindo o facto de poder ser usado como aditivo, e tendo em conta
que dados actuais mostram que este um dos contaminantes alimentares mais
encontrados, devendo esta anlise ser expandida para outros tipos de alimentos onde a
contaminao por este tipo de substncias significativa, como se referiu no incio desta
exposio.
Relativamente ao mtodo implementado verificou-se que:

A concentrao de padres conhecidos correlaciona-se linearmente com a resposta em


termos de rea normalizada correspondente a leo mineral, sendo no entanto,
necessria a realizao de ensaios de verificao da estabilidade desta correlao,
especialmente tendo em conta que os clculos efectuados com recurso recta de
calibrao no so coerentes com o outro modo de clculo, recorrendo expresso
veiculada no mtodo. Uma vez que, este mtodo faz uso de um padro interno, no
seria necessrio este tipo de anlise, dado que este j funciona como uma referncia
para verificao da validade das medies efectuadas.

A linearidade do mtodo foi verificada entre as concentraes de 15 mg.kg-1 e 60 mg.kg-1


sendo que, qualquer valor que surja fora desta gama trata-se de extrapolao, o que em
termos de incerteza associada medio no deve acontecer, devendo-se, nestes
casos, proceder diluio da amostra.

O mtodo em causa permite uma sensibilidade de 0,0309 kg.mg-1, valor que poder ser
usado para comparao com a sensibilidade de outros mtodos ou outros analitos com o
mesmo mtodo.

O mtodo possui um limite de deteco de 21 mg.kg-1 e um limite de quantificao de 24


mg.kg-1, que so valores satisfatrios dado estarem de acordo com o objectivo da
implementao deste mtodo, ou seja, o controlo da qualidade de leos de girassol
tendo em conta o limite imposto para a contaminao dos mesmos com leo mineral
50 mg.kg-1.

Tendo em conta o estudo de repetibilidade efectuado, o limite de repetibilidade deste


mtodo toma um valor de 6,11 mg.kg-1, ou seja, a diferena entre dois replicados

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
efectuados em condies de repetibilidade no deve exceder 6,11 mg.kg-1, para que o
ensaio possa ser considerado vlido.

Numa anlise de preciso intermdia, fazendo variar apenas os dias em que se


efectuam as anlises, verifica-se um desvio padro de preciso intermdia de 0,48
mg.kg-1, sendo este um valor razovel para a variabilidade dos resultados associados a
este mtodo especfico.

Para a avaliao da exactido do mtodo, recorrendo a ensaios interlaboratorais,


obtiveram-se valores de Z-score de 0,5 e 0,04, para uma amostra de leo de girassol e
outra de leo de soja bruto, respectivamente, sendo estes valores satisfatrios. No
entanto, os resultados obtidos por cada laboratrio no ensaio interlaboratorial so
dispersos (no tendo em conta as incertezas associadas a tais resultados, dado no
terem sido facultadas), o que pode ser justificado pela integrao efectuada em
determinada anlise, dado que, este mtodo muito sensvel ao modo de integrao.
Confirmando a exactido do mtodo verificou-se tambm atravs de ensaios de
recuperao, que este permite a obteno de recuperaes entre os 90 % e os 110 %
(critrio de aceitao estabelecido internamente) em amostras de leo de girassol e de
soja, quer bruto, quer refinado.

A avaliao da robustez baseada numa anlise qualitativa revelou que este um mtodo
robusto,

em

que

necessria

ateno aos

pormenores,

como

correcto

armazenamento da slica prateada e uma integrao coerente com os critrios


determinados, visto este ser um dos pontos-chave para a obteno de resultados
concordantes entre os vrios ensaios efectuados ou mesmo em ensaios entre
laboratrios, dado que, pequenas alteraes na forma de integrao da banda larga e
posteriormente dos picos sobre essa banda podem originar diferenas significativas
entre os vrios resultados. Entre os vrios estudos efectuados para averiguar a robustez
do mtodo verifica-se a necessidade de utilizao de n-hexano prprio para
cromatografia como eluente da cromatografia em coluna, uma vez que, o n-hexano de
pureza analtica introduz impurezas na amostra analisada originando resultados
distorcidos. Foi ainda testada a filtrao de uma amostra contendo impurezas suspensas
tendo-se verificado que indiferente, em termos de sinal obtido, a filtrao da amostra.
Ainda neste mbito dever futuramente ser estudado o papel da evaporao do solvente
recorrendo ao evaporador rotativo, visto haver indcios que corroboram a possibilidade
de evaporao das cadeias mais curtas dos hidrocarbonetos de origem mineral durante
esta operao. Para alm disto, o software de integrao utilizado revelou-se relevante
para a obteno de resultados coerentes, sendo especialmente importante o

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
estabelecimento de critrios objectivos de integrao com o software em uso no
momento.

A comparao do mtodo usado neste trabalho com a Norma ISO que futuramente
reger esta determinao permitiu verificar que em termos de robustez, no existem
diferenas significativas entre ambas.

H necessidade de estandardizao dos mtodos usados para efectuar esta


determinao, dado que vrios factores, como foi determinado na anlise da robustez,
podem alterar de forma significativa o resultado obtido - isto para que, os resultados
facultados por vrios laboratrios, para uma mesma anlise sejam concordantes entre si.
Esta estandardizao poder ser alcanada pela Norma ISO ainda em fase de
aprovao, que ser o documento normativo no qual um laboratrio se dever basear
para efectuar esta determinao.

Existe a possibilidade de expanso deste mtodo para outros leos vegetais, como se
verificou atravs de ensaios de recuperao e num circuito interlaboratorial para o leo
de soja, que no o objecto de estudo explcito para o mtodo em causa, que
especfico para leo de girassol.

Conclui-se, assim, que fundamental que os laboratrios disponham de meios e critrios


objectivos para demonstrar, por meio de validao, que os mtodos de ensaio que
executam conduzem a resultados confiveis e adequados qualidade pretendida. Neste
caso especifico, verifica-se que este mtodo permite a obteno de resultados confiveis
para a determinao de hidrocarbonetos alifticos saturados de origem mineral em leo de
girassol, tendo em conta os resultados da validao. Ou seja, este mtodo permite
determinar se uma amostra especfica est dentro dos limites legais em termos de qualidade
alimentar neste parmetro especfico, permitindo assim, a sua comercializao.

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
VII. Referncias bibliogrficas

Baldwin, M.K., Berry, P.H., Esdaile, D.J., Linnett, S.L., Martin, J.G., Peristianis, G.C.,
Priston, R.A.J., Simpson, B.J.E., Smith, J.D. (1992), Feeding Studies in Rats with Mineral
Hydrocarbon Food Grade White Oils, Toxicologic Pathology, Vol. 20, n 3, p. 426 435.

Biedermann, M., Fiselier, K., Grob, K. (2009), Aromatic Hydrocarbons of Mineral Oil
Origin in Foods: Method for Determining the Total Concentration and First Results, J.
Agric. Food Chem., Vol. 57, p. 8711 8721.

Biedermann, M., Grob, K. (2009), Comprehensive two dimensional GC after HPLC


preseparation for the characterization of aromatic hydrocarbons of mineral oil origin in
contaminated sunflower oil, J. Sep. Sci., Vol. 32, p. 3726 3737.

Biedermann, M., Grob, K. (2009), How white was the mineral oil in the contaminated
Ukrainian sunflower oils?, Eur. J. Lipid Sci. Technol., Vol. 111, p. 313 319.

Brito, N.M., Junior, O.P., Polese, L., Ribeiro, M.L. (2003), Validao de Mtodos
Analticos: Estratgia e Discusso, R. Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Vol. 13, p. 129-146.

Bulder, A.S., Hoogenboom, L.A.P., Kan, C.A., Raamsdonk, L.W.D., Traag, W.A.,
Bouwmeester, H. (2008), Risk assessment of Nickel, Mineral Oils, Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons and Volatile Organic Compounds in animal feed materials, Rikilt Institute
of Food Safety, p. 22 34.

Cames, M.F.G.F.C. (2001), Quantificao da Incerteza nas Medies Analticas,


Verso em Portugus do Guia Eurachem/CITAC Traduo e adaptao da 2 edio,
Outubro.

Carvalho, M.A. (2010), Girassol, Conab Companhia Nacional de Abastecimento


Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento, Braslia, Junho.

Concin, N., Hofstetter, G., Plattner, B., Tomovski, C., Fiselier, K., Gerritzen, K., Fessler,
S., Windbichler, G., Zeimet, A., Ulmer, H., Siegl, H., Rieger, K., Concin, H., Grob, K.
(2008), Mineral oil paraffins in human body fat and milk, Food and Chemical Toxicology,
Vol. 46, p. 544 552.

Coordenao Geral de Acreditao (2010), Orientao sobre Validao de Mtodos


Analticos DOQ-CGCRE-008, Reviso 03, Fevereiro.
81

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

Dias, J.M.S. (2009), Quantificao de Furanos por Cromatografia Gasosa, Faculdade de


Medicina Veterinria, Lisboa.

Droz, C., Grob, K. (1997), Determination of food contamination by mineral oil material
from printed cardboard using on-line coupled LC-GC-FID, Z Lebensm Unters Forsch A,
Vol. 205, p. 239 241.

EFSA European Food Safety Authority (2004), Opinion of the Scientific Panel on Food
Additives, Flavourings, Processing Aids and Materials in Contact with Food (AFC) on
request from the Commission related the use of mineral oils in jute and sisal bags, EFSA
Journal, Vol. 162, p. 1 6.

EFSA - European Food Safety Authority (2008), EFSA statement on the contamination of
sunflower oil with mineral oil exported from Ukraine, EFSA.

EFSA - European Food Safety Authority (2008), Initial considerations for toxicological
risks related to sunflower oil contamination with mineral oil, consultado em
http://www.efsa.europa.eu/it/news/documents/sunfloweroil_mineraloil.pdf, acedido a 3 de
Maio de 2011.

EFSA European Food Safety Authority (2009), Scientific Opinion on the use of high
viscosity white mineral oils as food additive, EFSA Journal, 7 (11):1387, p. 1 39.

EFSA, Contamination of mineral oil in sunflower oil from Ukraine, consultado em


http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_normativa_1670_ulterioriallegati_ulterioreallegato_0_
alleg.pdf, acedido a 3 de Maio de 2011.

Eurachem (1998), The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to
Method Validation and Related Topics.

Faleiro, H.T., Jnior, R.P.S., Silva, L.F. (2001), Caracterizao de gros de girassol
(Hellianthus annuus L.) ao longo do perodo de colheita em dois municpios do estado de
Gois, Pesquisa Agropecuria Tropical, Vol. 31(2), p. 163 168.

FAO Investment Centre/EBRD Cooperation Programme (2002), Ukraine - Review of the


Sunflower Oil Sector, Food and Agriculture Organization of the United Nations, N 2,
Novembro.

82

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

Fiorini, D., Fiselier, K., Biedermann, M., Ballini, R., Coni, E., Grob, K. (2008),
Contamination of Grape Seed Oil with Mineral Oil Paraffins, J. Agric. Food Chem., Vol.
56, p. 11245 11250.

Fiorini, D., Paciaroni, A., Gigli, F., Ballini, R. (2010), A versatile splitless injection GC-FID
method for the determination of mineral oil paraffins in vegetable oils and dried fruit, Food
Control, Vol. 21, p. 1155-1160.

Fiselier, K., Grob, K. (2009), Determination of mineral oil paraffins in foods by on-line
HPLC-GC-FID: lowered detection limit; contamination of sunflower seeds and oils, Eur
Food Res Technol, Vol. 229, p. 679 688.

Freire, D.B.P. (2002), Controlo de Qualidade de leos Vegetais Comercializados na


Regio do Grande Porto, Faculdade de Cincias da Nutrio e Alimentao da
Universidade do Porto, Porto.

Grompone,

M.A.

(2005),

Sunflower

Oil,

consultado

em

http://uqu.edu.sa/files2/tiny_mce/plugins/filemanager/files/4281709/84607_29.pdf,
acedido a 15 de Maro de 2011.

Grosvenor, M.B., Smolin, L.A. (2002), Nutrition: From Science to Life, Harcourt College
Publishers, Estados Unidos da Amrica, p. 137 171.

Grundbck, F., Fiselier, K., Schmid, F., Grob, K. (2010), Mineral oil in sunflower seeds:
the sources, Eur Food Res Technol, Vol. 231, p. 209 -213.

Guin, R.P.F., Henriques, F. (2011), O Papel dos cidos Gordos na Nutrio Humana e
Desenvolvimentos Sobre o Modo Como Influenciam a Sade, Millenium, 40, p. 7 21.

Heimbach, J.T., Bodor, A.R., Douglass, J.S., Barraj, L.M.,Cohen, S.C., Biles, R.W.,
Faust, H.R. (2002), Dietary exposures to mineral hydrocarbons from food-use
applications in the United States, Food and Chemical Toxicology, Vol. 40, p. 555 571.

Instituto de La Grasa (2008), Determinacin de Hidrocarburos Alifticos Saturados en


Aceites de Girasol mediante Cromatografa de Gases en Columna Capilar con Inyeccin
on column y detector FID, Sevilha, Julho.

Instituto Nacional de Estatsticas (2011), Estatsticas Agrcolas 2010.

83

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

IPAC Instituto Portugus de Acreditao (2005), Guia para a Acreditao de


Laboratrios Qumicos, OGC002.

IPAC Instituto Portugus de Acreditao (2007), Guia para a Quantificao de


Incerteza em Ensaios Qumicos, OGC007.

Karasek, L., Wenzl, T., Ulberth, F. (2010), Proficiency test on the determination of
mineral oil in sunflower oil, Eur. J. Lipid Sci. Technol., Vol. 112, p. 321-332.

Karleskind, A. (1996), Oils and Fats Manual: A Comprehensive Treatise Properties,


Production and Applications, Volume 1, Intercept Limited, Londres, p. 118 124 e p. 134
- 139.

Kvasnicov, V., Balnov, P.(2006), Practical Trainings from Medical Chemistry and
Biochemistry, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Reino Unido,
consultado

em

http://old.lf3.cuni.cz/chemie/english/practical_trainings/task_B2.htm,

acedido a 10 de Setembro de 2010.

Lopes, I.M.G. (2000), Extraco e Caracterizao do leo de Bolota, Dissertao


apresentada para a obteno do grau de mestre em Cincia e Tecnologia dos Alimentos,
Universidade Tcnica de Lisboa, Lisboa.

Moraes, F. P., Colla, L. M. (2006), Alimentos Funcionais e Nutracuticos: Definies,


Legislao e Benefcios Sade, Revista Electrnica de Farmcia, Vol. 3 (2), p. 109
122.

Moret, S., Grob, K., Conte, L.S. (1996), On-line high-performance liquid chromatography
solvent evaporation high performance liquid chromatography capillary gas
chromatography flame ionization detection for the analysis of mineral oil polyaromatic
hydrocarbons in fatty foods, Journal of Chromatography A., Vol. 750, p. 361 368.

Moret, S., Grob, K., Conte, L.S. (1997), Mineral oil polyaromatic hydrocarbons in foods,
e.g. from jute bags, by on-line LC-solvent evaporation (SE)-LC-GC-FID, Z Lebensm
Unters Forsch A, Vol. 204, p.241 246.

Nash, J.F., Gettings, S.D., Diembeck, W., Chudowski, M., Kraus, A.L. (1996), A
Toxicological Review of Topical Exposure to White Mineral Oils, Fd Chem. Toxic., Vol.
34, n 2, p. 213-225.

84

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

National Sunflower Association, Sunflower sustainability: the substance behind the seed,
consultado

em

http://www.sunflowernsa.com/uploads/resources/540/sustainability-

use_layout-1.pdf, acedido a 14 de Maro de 2011.

Neukom, H-P., Grob, K., Biedermann, M., Noti, A. (2002), Food contamination by C20
C50 mineral paraffins from the atmosphere, Atmospheric Environment, Vol. 36, p. 4839
4847.

Nicholas, D., The Analysis of Mineral Oil in Sunflower Oil, GL Sciences Company,
consultado

em

http://www.atasgl.com/ap-note/070_DMI%20Sunflower%20Oil.pdf,

acedido a 5 de Junho de 2011.

Norma ISO/TC 34/SC 11/WG Animal and Vegetable fats and oils: Determination of
aliphatic hydrocarbons in vegetable oils (2011).

Office Luxembourgeois DAccreditation et de Surveillance (2008), A011 Guidelines for


checking and validating test and calibration methods according to ISO/IEC 17025,
version 04.

RaB, M., Schein, C., Matthus, B. (2008), Virgin sunflower oil, Wiley InterScience,
Alemanha.

Reda, S.Y., Carneiro, P.I.B. (2007), leos e Gorduras: Aplicaes e Implicaes, Revista
Analytica, n 27, p. 60 67.

Relacre Associao de Laboratrios Acreditados de Portugal (1996), Guia Relacre 3:


Validao de Resultados em Laboratrios Qumicos, Relacre.

Relacre Associao de Laboratrios Acreditados de Portugal (2000), Guia Relacre 13:


Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise Qumica, Relacre.

Ribeiro, E.P., Seravalli, E.A.G. (2007), Qumica de Alimentos, 2 Edio Revista, Instituto
Mau de Tecnologia, Editora Edgard Blcher, So Paulo.

Rosillo-Calle, F., Pelkmans, L., Walter, A. (2009), A Global Overview of Vegetable Oils,
with Reference to Biodiesel A Report for the IEA Bioenergy Task 40, IEA Bioenergy, p.
8 30.

85

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos


Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

Silva, S.R.G.P. (2001), Estudo da Formao dos Ismeros Trans durante o Processo de
Refinao do leo de Soja, Relatrio do trabalho de Fim de Curso de Engenharia Agro Industrial, Universidade Tcnica de Lisboa - Instituto Superior de Agronomia, Lisboa.

Skoog, Holler, Nieman (1998), Principles of Instrumental Analysis - Fifth Edition, Harcourt
College Publishers, p. 701-721.

Tennant, D.R. (2004), The usage, occurrence and dietary intakes of white mineral oils
and waxes in Europe, Food and Chemical Toxicology, Vol. 42, p. 481 492.

The AOCS Lipid Library (2011), Oils and Fats in the Market Place: Commodity Oils and
Fats Soybean Oil, consultado em http://lipidlibrary.aocs.org/market/soybean.htm,
acedido a 25 de Agosto de 2011.

Ventura, G.T., Kenig, F., Reddy, C.M., Frysinger, G.S., Nelson, R.K., Mooy, B.V., Gaines,
R.B. (2008), Analysis of unresolved complex mixtures of hydrocarbons extracted from
Late Archean sediments by comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC
GC), Organic Geochemistry, Vol. 39, p. 846-867.

Viola, P. (1970), Fats in the Human Diet: Olive Oil, International Olive Oil Council,
Industrias Asenga, Madrid.

Vollmer, A., Biedermann, M., Grundbck, F., Ingenhoff, J-E., Biedermann-Brem, S.,
Altkofer, W., Grob, K. (2011), Migration of mineral oil from printed paperboard into dry
foods: survey of the German market, Eur Food Res Technol, Vol. 232, p. 175-182.

Wolf, W.J., Cowan, J.C. (1975), Soybeans as a Food Source, CRC Press, Florida.

86

Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa
ANEXO A: Cromatogramas referentes ao estudo da linearidade do mtodo.

Figura A1: Cromatograma referente ao branco deste estudo.

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-1

Figura A2: Cromatograma referente ao padro de 22,5 mg.kg .

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

-1

Figura A3: Cromatograma referente ao padro de 30 mg.kg .

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

-1

Figura A4: Cromatograma referente ao padro de 37,5 mg.kg .

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

-1

Figura A5: Cromatograma referente ao padro de 45 mg.kg .

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Implementao de um Mtodo para a Determinao de Hidrocarbonetos Alifticos Saturados em leo de Girassol por Cromatografia Gasosa

-1

Figura A6: Cromatograma referente ao padro de 52,5 mg.kg .

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-1

Figura A7: Cromatograma referente ao padro de 60 mg.kg .

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ANEXO B: Cromatograma referente determinao dos limiares analticos.

-1

Figura B: Cromatograma referente a um padro de 15 mg.kg .

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ANEXO C: Cromatograma referente ao estudo da repetibilidade do mtodo.

Figura C: Cromatograma referente a uma amostra de leo de girassol refinado.

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ANEXO D: Cromatogramas referentes ao estudo da exactido do mtodo.

Figura D1: Cromatograma referente amostra de leo de girassol refinado analisada no ensaio interlaboratorial.

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Figura D2: Cromatograma referente amostra de leo de girassol bruto de controlo, analisada no teste de recuperao.

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-1

Figura D3: Cromatograma referente amostra de leo de girassol refinado fortificado com 50 mg.kg , analisada no teste de recuperao.

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Figura D4: Cromatograma referente amostra de leo de soja bruto de controlo, analisada no teste de recuperao.

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-1

Figura D5: Cromatograma referente amostra de leo de soja refinado fortificado com 50 mg.kg , analisada no teste de recuperao.

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ANEXO E: Cromatogramas referentes ao estudo da robustez do mtodo.

E1: Cromatograma referente anlise do branco utilizando n-hexano de pureza analtica.

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E2: Cromatograma referente anlise do branco utilizando n-hexano prprio para cromatografia.

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Figura E3: Cromatogramas referentes ao estudo da necessidade de filtrao de amostras contendo impurezas, na anlise de uma amostra de leo de
girassol bruto sem filtrao ( esquerda) e com filtrao ( direita).

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Figura E4: Cromatograma de um leo de soja bruto contaminado com hidrocarbonetos alifticos saturados de origem mineral, com cadeias
curtas.
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Figura E5: Cromatograma referente ao duplicado da anlise mencionada na Figura E4, em que se verifica o desaparecimento da zona inicial
da banda larga correspondente a leo mineral.
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Figura E6: Cromatograma de um padro de 15 mg.kg-1 obtido recorrendo ao software Turbochrom Navigator.
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Figura E7: Cromatograma obtido para uma amostra de leo de soja bruto, onde o padro interno aparece na mesma zona da banda larga
correspondente a leo mineral integrao para a obteno de hidrocarbonetos alifticos saturados totais.
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Figura E8: Cromatograma obtido para uma amostra de leo de soja bruto, onde o padro interno aparece na mesma zona da banda larga
correspondente a leo mineral integrao pico a pico para a obteno dos hidrocarbonetos alifticos saturados normais num leo.
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Figura E9: Cromatograma referente a uma amostra de leo de girassol bruto, analisada pelo mtodo interno validado neste trabalho.

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Figura E10: Cromatograma referente amostra mencionada na Figura E9, analisada pelo mtodo apresentado na Norma ISO.

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