Otimizao da Extrao de Compostos Fenlicos em uma

Biofarinha de Ma Enriquecida com Agaricus brasiliensis

Optimization of Phenolic Compounds Extraction in an
Apple Pomace Flour Enriched With Agaricus brasiliensis
Claudia Benetti
Departamento de Farmcia
Universidade Estadual do Centro-Oeste - UNICENTRO, Guarapuava, PR
claudia_benetti90@hotmail.com
Tbata Cristina Colussi
Departamento de Farmcia
Universidade Estadual do Centro-Oeste - UNICENTRO, Guarapuava, PR
tabata_colussi@yahoo.com.br
Fernanda Bovo
Universidade Federal do Paran - UFPR, Curitiba, PR
fernanda_bovo@yahoo.com.br
Herta Stutz Dalla Santa
Departamento de Engenharia de Alimentos
Universidade Estadual do Centro-Oeste - UNICENTRO, Guarapuava, PR
hdalsanta@yahoo.com.br
Elisa Perez
Departamento de Farmcia
Universidade Estadual do Centro-Oeste - UNICENTRO, Guarapuava, PR
eperez@unicentro.br
Resumo: Agaricus brasiliensis tem sido muito estudado por suas propriedades nutracuticas. Como essas propriedades podem estar relacionadas a componentes fenlicos, o objetivo deste trabalho foi otimizar o preparo de amostra, para a determinao
de compostos fenlicos totais em uma biofarinha de bagao de ma fermentada de
Recebido em 14/08/2013 - Aceito em 11/04/2014.

RECEN

15(2)

p. 255-273

jul/dez

2013

DOI: 10.5935/RECEN.2013.02.06

Revista Cincias Exatas e Naturais, Vol.15, n 2, Jul/Dez 2013

forma submersa com A. brasiliensis. Utilizou-se um planejamento fatorial fracionado

241 , com as variveis: composio do lquido extrator, concentrao do lcool no
lquido extrator, tempo e mtodo de extrao, utilizando-se o mtodo Folin-Denis.
Outras otimizaes foram realizadas com as variveis signicativas. O melhor mtodo de extrao utilizou etanol a 70%, em homogeneizador por 15 min. O teor de
fenlicos totais, em amostras de biofarinhas de bagao de ma fermentadas com A.
brasiliensis, foi menor (0,04852 0,001458) que o teor encontrado na biofarinha sem
fermentar (0,1098 0,001246) (p=3,331.1016 ). O sistema de planejamento fatorial

foi ecaz para otimizao dos resultados. A menor concentrao de fenlicos encontrados na biofarinha fermentada devido a, provavelmente, o fungo ter metabolizado
esses compostos.

Palavras-chave: Agaricus blazei; cogumelo; miclio; planejamento fatorial.

Abstract: Agaricus brasiliensis have been studied for their nutraceutical properties.
Given that these properties can be related to phenolic components, the aim of this
work was to optimize the sample preparation for determination of total phenolic
content in a our, obtained from apple pomace submerged fermented with A. brasiliensis. Fractional fatorial design 241 was used, with the variables: liquid extractor composition, alcohol concentration in liquid extractor, time of extraction and
method of extration, using Folin-Denis method. Other optimizations were performed with the signicant variables. The best method of extraction used 70% ethanol
in homogenizer for 15 min. The total phenolic content in ours of apple pomace fermented with A. brasiliensis was lower (0.04852 0.001458) that the content found in
unfermented our (0.1098 0.001246) (p=3,331.1016 ). The factorial design system

was effective to optimize results. The lowest concentration of phenolics in fermented

our is probably due to fungus has metabolized these compounds.
Key words: Agaricus blazei; factorial design; mycelium; mushroom.
256

BENETTI, C. et al.

Introduo
O cultivo e a explorao de cogumelos comestveis de grande interesse comer-

cial. O Agaricus brasiliensis (A. blazei Murrill [1]), ou cogumelo do sol [2], cultivado
e comercializado no Brasil, tem sido focado por apresentar propriedade imunomoduladora [1], anti-inamatria, anticancergena [3], no combate ao estresse fsico e
emocional, por evitar riscos de doenas como a osteoporose e lcera gstrica e pela
ao antioxidante [4].
Os cogumelos so considerados como alimentos nutracuticos, pois apresentam
eccia quando consumidos como suplementos alimentares [4]. O uso de A. brasiliensis como nutracutico porque sua ingesto aumenta as defesas imunolgicas do
organismo [3]. Essa espcie comercializada desidratada, em p ou fatiada, e indicada como suplemento alimentar e nutracutico, considerando suas propriedades
nutricionais (alimento funcional) [3]. H interesse, na indstria nacional, em comercializar essa espcie sob outras formas, como em farinhas fermentadas com esse fungo
(biofarinhas) para, por exemplo, enriquecer alimentos com compostos antioxidantes.
Tendo em vista que alguns antioxidantes sintticos, tais como BHA (butil hidroxianisol) e BHT (butil hidroxitolueno), possuem propriedades txicas e carcinognicas
[5], pesquisadores tm-se dirigido no sentido de encontrar antioxidantes naturais, que
so mais seguros e aceitos pelo consumidor. Alm de que, podem substituir os sintticos ou fazer associaes entre eles, diminuindo sua concentrao nos alimentos,
cosmticos, medicamentos e correlatos [4].
O organismo produz, normalmente, radicais livres que so tomos ou molculas produzidos de forma contnua e que apresentam um eltron desemparelhado. Em
virtude disso, so entidades qumicas extremamente reativas, apesar de, no organismo
humano, desempenharem importantes funes. Entretanto, em demasia podem causar danos s clulas, sendo, inclusive, esse excesso relacionado com o desenvolvimento
de vrias doenas [6]. Nessa situao, os antioxidantes podem controlar ou prevenir
as leses causadas pelos radicais livres. Os antioxidantes so encontrados em vrios
alimentos e podem neutralizar a ao dos radicais ou, ainda diretamente, reagir com
esses, extinguindo-os. Esses mecanismos de ao dos antioxidantes dividem-se em
257

Revista Cincias Exatas e Naturais, Vol.15, n 2, Jul/Dez 2013

dois grandes grupos: aqueles que inibem a formao de radicais livres que iniciam o
processo oxidativo (etapa de iniciao), ou ainda, aqueles que impedem a propagao
da sequncia oxidativa, por inibirem radicais chave (etapa de propagao) pela doao
de tomos de hidrognio, interrompendo a reao em cadeia [7].
Os cogumelos possuem grande quantidade de antioxidantes, dentre os quais, podemos destacar os compostos fenlicos, que agem como sequestradores de radicais
livres e bloqueadores de reaes em cadeia [8]. Esses parecem ser os principais responsveis pela atividade antioxidante do A. brasiliensis por sua alta concentrao [9]. O
A. brasiliensis fresco contm vitaminas B1 (Tiamina), B2 (Riboavina), B3 (Niacina),
D3 (Ergosterol), alm de compostos fenlicos. A alta concentrao de tocoferis no
A. brasiliensis tambm pode estar relacionada sua propriedade antioxidante [10].
Para a determinao de compostos fenlicos, necessrio otimizar o preparo da
amostra, que pode ser feito por mtodo univariado (uma varivel por vez), ou por
mtodo multivariado (relacionando todas as variveis). Este ltimo pode ser efetuado por meio de planejamento fatorial (PF), que permite a otimizao simultnea de
vrios fatores envolvidos no sistema com menor nmero de experimentos, rapidez,
ecincia e diminuio de custos [11], analisando a signicncia de variveis e indicando as condies timas para obteno dos melhores resultados [12]. Portanto, o
presente trabalho objetivou otimizar o preparo de amostra, para a determinao de
fenlicos totais em uma biofarinha de bagao de ma fermentada com A. brasiliensis.

2
2.1

Materiais e mtodos
Obteno da biofarinha do cultivo submerso
O material foi cedido pelo laboratrio de microbiologia do departamento de En-

genharia de Alimentos da Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO.

O inculo foi cultivado em erlenmeyers com meio Padro contendo (g.L1 ): glicose
(20), extrato de levedura (3,95), MgSO4 .7H2 O (0,3), e K2 HPO4 .3H2 O (0,5); com pH
ajustado a 6,0 (0,2) em potencimetro com NaOH 0,1N, esterilizados a 121o C por
15 min. Foram inoculados cinco pedaos (1cm2 ) de gar com miclio do cogumelo
em 50 mL de meio e incubados a 30o C a 120 rpm por 7 dias. O miclio foi separado
258

BENETTI, C. et al.

do caldo por ltrao em tela (malha de 0,5 mm2 ), dividido em duas partes. Uma
parte foi passada atravs da tela com auxlio de uma esptula com 50 mL de gua destilada esterilizada. Essa suspenso de miclio foi usada na concentrao de 5% (v/v)
para produo de miclio por cultivo submerso e inocular o substrato slido.
Foram utilizados 4,0 kg de mas da cultivar Gala, selecionadas, lavadas e sanitizadas (50 mg/L durante 20 minutos seguido de enxgue com gua potvel). As frutas
foram cominudas em processador de alimentos (METVISA-MPA). A massa triturada foi prensada a 3,0 kgf/cm2 durante 1 minuto (Prensa Hidrulica Eureka, 15 ton).
Aps a operao de prensagem, o material slido resultante, denominado de bagao
de ma, foi lavado em gua corrente e colocado para desidratao em estufa de circulao de ar (60o C/12h, MA-035 Marconi), em seguida triturado (METVISA-MP200)
e condicionado em embalagens plsticas.
O cultivo submerso foi conduzido em Erlenmeyers (volume de 250 mL) contendo
10% de bagao de ma em meio aquoso, com pH de 6,0, esterilizado a 121o C por
15 min e inoculado com 5% da suspenso de miclio do inculo, incubado a 30o C
por 7 dias a 120 rpm. Em seguida, o miclio foi ltrado em papel ltro Whatmann,
seco em estufa a 45-50o C e modo a p, armazenado em frascos fechados a -18 o C
para mensurao do contedo fenlico. Esse material foi denido como biofarinha
fermentada. Bagao de ma do mesmo lote foi submetido ao mesmo processo de
fermentao, porm sem o fungo e igualmente tratado, originando a biofarinha no
fermentada.

2.2

Moagem e determinao da granulometria do material vegetal

O mosto seco passou por processo de moagem em moinho do tipo copo. A bio-

farinha fermentada e no fermentada obtida foi peneirada em tamis com abertura de

malha de 0,25 mm, com o rendimento de cada granulometria calculado.

2.3

Determinao de umidade
O mtodo gravimtrico [13] utilizou cerca de 1,0 g da biofarinha fermentada e

no fermentada (n=3).
259

Revista Cincias Exatas e Naturais, Vol.15, n 2, Jul/Dez 2013

2.4

Curva analtica
Usou-se padronizao externa com o cido 4-hidroxicinmico (cido p-cumrico -

APC) e o mtodo de Folin-Denis para determinao de fenlicos totais [14]. Diferentes volumes de uma soluo de APC 0,214 mg.mL1 foram tratados com 0,5 mL de
reagente Folin-Denis e 1 mL de Na2 CO3 15% p/v, sendo o volume nal completado
com gua para 10 mL, originando concentraes nais de 0,428 a 5,136 g.mL1 .
Aps 30 min foram realizadas leituras em 720 nm, em triplicata, de cada concentrao. O branco constou dos mesmos reagentes e procedimento sem APC. Os resulR obtendo-se equao de reta, intervalo e
tados foram plotados no programa Origin

coeciente de correlao linear (R2 ).

2.5

Otimizao do preparo de amostra e doseamento das biofarinhas

Usou-se planejamento fatorial fracionrio 241 com ponto central (n=5). As va-

riveis testadas foram: composio do lquido extrator (metanol ou etanol); concentrao do lcool no lquido extrator (50% ou 70%); tempo de extrao (5 ou 15 min);
e mtodo de extrao (vrtex ou ultrassom), conforme a matriz de contrastes, exemplicada na tabela 1.
Tabela 1. Matriz de contrastes do planejamento fatorial fracionrio 241 com ponto central.
Ensaios
1
2
3
4
5
6
7
8
Ponto central
(n=5)

260

Composio Concentrao do
do lquido
lcool no lquido
extrator
extrator
-1 (metanol)
-1 (50%)
1 (etanol)
-1
-1
1 (70%)
1
1
-1
-1
1
-1
-1
1
1
1
mistura de metanol a 50% (0,75
mL) mais etanol a 70% (0,75 mL)

Tempo de
extrao

Mtodo de
extrao

-1 (5 min)
-1 (vrtex)
-1
1 (ultrassom)
-1
1
-1
-1
1 (15 min)
1
1
-1
1
-1
1
1
Extrao com ultrassom
(5 min) mais vrtex (5 min)

BENETTI, C. et al.

Exatamente 0,200 g das amostras de biofarinha (granulometria maior que 0,250

mm) tiveram a adio de 1,5 mL de lquido extrator com o mtodo de extrao e
tempo denidos pela matriz de contrastes. A mistura foi centrifugada a 4000 rpm /15
min e o sobrenadante recolhido. Alquotas (250 L) desse sobrenadante foram secas
em banho-maria (60 C) por 40 min e o material foi ressuspenso com trs lavagens
com gua destilada (1,0 mL cada). As lavagens foram recolhidas em balo volumtrico
(10 mL), tratadas pelo mtodo Folin-Denis, o volume completado com gua destilada
e o resultado expresso conforme a curva analtica. O branco constou de todos os
componentes da amostra original, exceto o extrato da biofarinha.
Denidas as variveis signicativas e o melhor mtodo obtido no PF, realizouse nova otimizao univariada somente para o mtodo de extrao, utilizando-se dois
mtodos: com vrtex ou homogeneizador por inverso (n=9 para cada grupo), sendo
que, em ambos, a extrao foi por 15 min, com etanol 70%. Com a metodologia
otimizada, realizou-se a determinao de fenlicos da biofarinha fermentada com A.
brasiliensis e no fermentada (n=10), usando-se, para a extrao da farinha fermentada,
3 mL de lquido extrator e para a no fermentada 3,5 mL, em funo de resultados
em relao curva analtica.

2.6

Tratamento dos dados

Os resultados da anlise de umidade e do PF foram tratados com o teste de rejei-

o Q a 95 % [15], alm de serem analisados pelas planilhas de quimiometria [16].

Avaliou-se o PF por meio do desvio do efeito (DE) Equao (1), onde
D E = t .d p

(1)

sendo t o valor da distribuio t de Student com =0,05, com quatro graus de liberdade, bem como dp o desvio padro dos valores do ponto central. O DE foi
contrastado com o efeito calculado (e f ) - Equao (2) - para cada varivel, onde
n/2
i =1

y i(+)

n/2

n/2

i =1

y i()

(2)
261

Revista Cincias Exatas e Naturais, Vol.15, n 2, Jul/Dez 2013

sendo e f o efeito calculado para as variveis e interaes usando a diferena entre

as mdias das observaes no nvel mais (y i(+) ) e as mdias das observaes no nvel
menos (y i() ), para n ensaios e yi observaes individuais [16]. Para a avaliao dos
resultados da otimizao univariada e comparaes, utilizaram-se os testes estatsticos
ANOVA, Bonferroni e Tukey com =0,05.

3
3.1

Resultados e discusses
Determinao da granulometria do material vegetal
O rendimento da biofarinha de ma fermentada com A. brasiliensis foi de 17,73%

para partculas com dimetro superior a 0,25 mm, e de 23,08% para biofarinha no
fermentada, em partculas com dimetro superior a 0,25 mm. A denio de uma
granulometria tem por objetivo uniformizar o teste, para que as repeties no apresentem variaes em funo de diferentes tamanhos de partculas.

3.2

Curva analtica
O APC foi empregado em sete concentraes diferentes, de 0,428 a 5,136 g.mL1 .

A equao obtida pode ser expressa como y = 108,0568. x + 0,07543, com R2 =

0,99128. A legislao brasileira recomenda que, para mtodos analticos, seja construda uma curva com, no mnimo, cinco concentraes diferentes e que a mesma
apresente um R2 superior a 0,99 no mnimo [17]. No presente estudo, a curva foi
elaborada com sete concentraes e o R2 superior a 0,99, de acordo com o exigido.

3.3

Otimizao do preparo de amostra e doseamento das biofarinhas

No PF 241 , o DE obtido foi de 0,052245, com efeito de 1a ordem para o mtodo

de extrao. Quando o mtodo de extrao alterado de vrtex para ultrassom, h

uma diminuio no teor extrado de compostos fenlicos. Entretanto, foram percebidos efeitos de 2a ordem entre composio do lquido extrator + concentrao do
lcool no lquido extrator, composio do lquido extrator + mtodo de extrao,
concentrao do lcool no lquido extrator + tempo de extrao e tempo de extrao + mtodo de extrao (Tabela 2). Os melhores resultados foram obtidos com o
262

BENETTI, C. et al.

uso de etanol a 70%, em extrao por 15 min em vrtex no caso dessa ltima varivel, como o e f de 1a ordem do mtodo de extrao foi maior que o e f de 2a ordem
(0,08245 > 0,06861, pois os valores so analisados em mdulo), optou-se pelo vrtex.
Tabela 2. Resultado da signicncia das variveis do planejamento fatorial fracionrio
241 para determinao de compostos fenlicos (DE = 0,052245).
Varivel
Composio do lquido extrator
Concentrao do lcool no
lquido extrator
Tempo de extrao
Mtodo de extrao
Composio do lquido extrator
+ concentrao do lcool no
lquido extrator
Composio do lquido extrator
+ tempo de extrao
Composio do lquido extrator
+ mtodo de extrao
Concentrao do lcool no
lquido extrator + tempo de
extrao
Concentrao do lcool no
lquido extrator + mtodo de
extrao
Tempo de extrao + mtodo de
extrao

Resultado

Ef
-0,04816

VNS

-0,01818

VNS

-0,03159
-0,08245

VNS
VS, melhores valores com vrtex
VS, melhores resultados com
etanol a 70%

0,06861

0,01595
0,06991
0,06991

VNS
VS, melhores resultados para
etanol em ultrassom
VS, melhores resultados com
lcool em 70% e 15 min de
extrao

0,01595

VNS

0,06861

VS, melhores resultados para 15

min de extrao em ultrassom

Legenda: DE: desvio do efeito; ef: efeito calculado para cada varivel, VS: varivel signicativa; VNS:
varivel no signicativa.

Mediante esses resultados, deniu-se a extrao por 15 min, com etanol 70% como
a mais ecaz. Como a extrao com vrtex apresentou melhores resultados do que
com o ultrassom, a prxima etapa de otimizao foi univariada, em dois grupos (n=9),
sendo eles vrtex e homogeneizador por inverso. O mtodo de extrao mais eciente foi o que usou o homogeneizador, apresentando diferena signicativa por
ANOVA (p= 9,41.104 ) com a extrao por vrtex. O mtodo de extrao otimizado ento foi denido com etanol a 70%, em homogeneizador por 15 min.
O PF uma importante e simples ferramenta estatstica, que permite a anlise dos
263

Revista Cincias Exatas e Naturais, Vol.15, n 2, Jul/Dez 2013

resultados considerando todos os parmetros experimentais envolvidos, bem como

fornece o efeito das possveis interaes entre as variveis analisadas [18]. Essa ferramenta ajuda a denir as melhores condies operacionais de um sistema, ou seja,
faixas que maximizem os resultados, realizando-se um nmero reduzido de ensaios experimentais e, tambm, avalia quando as associaes de variveis possuem um efeito
sinrgico ou antagnico. Sem o uso de PFs, importantes interaes entre as variveis no so detectadas, levando-se mais tempo para se determinarem as condies
timas, alm de gerar mais gastos por aumentar o nmero de ensaios [19]. Para a
realizao do planejamento, so selecionadas variveis que, provavelmente inuenciaram no sistema, e so executados experimentos variando-se os nveis, que podem ser
quantitativos (por exemplo: concentraes de uma substncia, valores de pH etc.) ou
qualitativos (tipos de cidos, tipos de agitao, etc.). Estes so nomeados pelos sinais
(menos) ou + (mais), no sendo um critrio denido a nomeao dos sinais, sendo
importante apenas a relao inicial entre o sinal dado e o efeito obtido [16].
Considerando que os efeitos de altas ordens so quase sempre no signicativos,
a utilizao de PFs fracionrios apresenta a vantagem de um nmero reduzido de experimentos, de forma mais rpida (nv-x , onde x a reduo, sendo o valor 1 para
metade dos experimentos, por exemplo), fornecendo as informaes com os efeitos
mais importantes (primeira e segunda ordem). Retira, na maioria das vezes, as mesmas concluses caso fosse realizado um planejamento completo [16].
A extrao de compostos fenlicos em produtos naturais sofre inuncia da natureza qumica da matriz, solventes extratores, condies de extrao, bem como mtodo, tempo e temperatura de extrao [5] o que justica a grande variedade de resultados obtidos por diferentes pesquisadores. Para quanticao de compostos antioxidantes de fontes naturais, essencial a realizao da extrao com solventes de polaridades diferentes [4]. Os compostos fenlicos so substncias de elevada polaridade,
que podem ser extrados por meio de solventes como metanol, etanol, acetona, gua,
acetato de etila, propanol, dimetilformaldedo e suas combinaes [20]. Quando se
trata de solventes orgnicos, o metanol, por conseguir extrair maiores quantidades
de metablitos, tem sido indicado como o mais efetivo [21]. Por isso, a escolha foi
entre dois lcoois de fcil acesso, o metanol e etanol, em propores diferentes, com
264

BENETTI, C. et al.

gua. A gua considerada o solvente universal que, quando combinada com outros
solventes orgnicos, ajuda a tornar o meio um pouco mais polar, o que favorece a
extrao de compostos fenlicos [22].
Estudos anteriores apontam que extratos metanlicos de Lentinus edodes e A.
brasiliensis, independente do tipo de extrao, apresentaram maior atividade antioxidante do que os extratos etanlicos [4]. Como os compostos fenlicos so substncias
antioxidantes, esperava-se a mesma resposta; entretanto, em nossa anlise, percebeuse que, ao diminuir a polaridade - ao acrescentar etanol e diminuir o percentual de
gua -, a quantidade extrada de substncias fenlicas aumenta.
Em outro trabalho, o corpo de fruticao de A. blazei Murill foi extrado sob
a forma de decoco e de macerao, com gua. Vericou-se, in vitro, a resistncia
oxidao por meio de trs mecanismos: inibio do processo oxidativo enzimtico
(por inibio de 100% das enzimas horseradish peroxidase e mieloperoxidase); inibio do estresse oxidativo celular (por meio da inibio de 80% da ruptura oxidativa
de neutrlos polimorfonucleares); e ao direta em espcies reativas (pela supresso
) [23].
de 62% de HOCl e 87% do radical nion superxido O
2

Porm, ainda no foi desenvolvido um sistema satisfatrio de extrao com sol-

ventes para a quanticao de todos os antioxidantes ou uma classe especca desses

compostos por vrios fatores. Os resultados obtidos podem ser justicados devido
grande variedade e quantidade de compostos presentes nos cogumelos (compostos
fenlicos como cidos fenlicos, avonoides e tocoferis), possibilidade de interao
com carboidratos, protenas e outros componentes dos alimentos, alm do fato de
esses compostos variarem do simples ao altamente polarizado [24].
O efeito da varivel tempo no rendimento da extrao no um fator amplamente
analisado [4]. Quando se trata de tempo de extrao, vrias metodologias utilizadas
consideram um fator importante o perodo de macerao melhorando a ecincia
da extrao [22]. Outros estudos armam que o tempo de extrao tem pouca inuncia quando comparado ao tipo de solvente utilizado [4]. Por exemplo, para o
extrato aquoso de uva, ocorre um pequeno aumento no rendimento com o aumento
do tempo de extrao, enquanto que, para o extrato etanlico, o rendimento aumentou signicativamente com o tempo. Em outra anlise, extratos de frutas vermelhas
265

Revista Cincias Exatas e Naturais, Vol.15, n 2, Jul/Dez 2013

foram preparados com etanol, metanol e gua e tempos de extrao de 1, 12 e 24 h.

Analisando-se os resultados, o contedo de polifenis diminuiu no extrato aquoso
com maior tempo de extrao, mas, nos extratos metanlicos e etanlicos, houve
aumento do contedo desses compostos com o aumento do tempo [25].
Neste caso, uma hiptese seria que a alterao do rendimento em funo do tempo
de extrao depende de todas as variveis envolvidas no processo, no podendo ser
analisado mediante cada varivel isoladamente, pois pode ter alterao em funo da
matriz de extrao, bem como na classe de substncia fenlica envolvida (cidos orgnicos, avonoides, alcaloides etc). Nesse sentido, o PF a ferramenta que mais se
adequa a esse tipo de investigao.
Substncias fenlicas so passveis de oxidao [26], ou seja, sistemas que propiciem maior contato com o oxignio podem desencadear reaes de oxidao nesses
compostos. Dessa forma, tal fator pode ter inuenciado na otimizao do mtodo
de extrao (ultrassom, vrtex, homogeneizador). O ultrassom propicia a imploso
de bolhas de cavitao, gerando grande quantidade de energia, oxidando os compostos, explicando a menor quantidade de fenlicos obtida. O vrtex provoca agitao
com bastante aerao, ou seja, incorporando oxignio no sistema [27]. J a agitao
por inverso promove o choque das partculas com o lquido em funo da gravidade,
podendo ser entendida como um sistema que, possivelmente, desencadeie menor oxidao que os anteriores, explicando, assim, os resultados obtidos.
A partir da extrao otimizada (etanol a 70%, em homogeneizador por 15 min),
mensurou-se o teor de fenlicos totais nas biofarinhas de bagao de ma,. A amostra
de biofarinha fermentada apresentou teores de fenlicos totais menores (0,04852

1,458.103 % em APC, n=7 aps o teste Q, Desvio Padro Relativo - DPR=4,34%)

que o teor encontrado na biofarinha sem fermentar (0,1098 1,246.103 % , n=7

aps o teste Q, DPR=1,53%) (ANOVA p=3,331.1016 ; Bonferroni p=2,910.1016 ;

Tukey p=1,252.107 ) apresentado na gura 1.

Compostos fenlicos apresentam excelentes propriedades antioxidantes. Antioxidantes so compostos que previnem ou reduzem os efeitos nocivos dos processos ou
das reaes que levam oxidao de estruturas celulares, protegendo os sistemas biolgicos [5]. Agem atravs de diferentes mecanismos, tais como quelantes de metais,
266

BENETTI, C. et al.

sequestradores de radicais livres, decomposio de perxidos, inibio de enzimas responsveis pela gerao de espcies reativas de oxignio e nitrognio entre outros [21],
sendo que os produtos intermedirios formados pela ao desses compostos so relativamente estveis, pois o anel aromtico dessas estruturas apresentam ressonncia
[5].
A quanticao de compostos fenlicos realizada por vrios mtodos, todavia,
o reagente de Folin-Denis simples e comumente mais utilizado [28]. Este baseia-se
na reduo dos cidos fosfomolbdico e fosfotngstico pelas hidroxilas fenlicas em
meio alcalino, produzindo um complexo de colorao azul, medindo espectrofotometricamente entre 620 e 740 nm. Porm este mtodo no especco, pois determina
todos os fenlicos presentes, mais substncias redutoras adicionadas aos alimentos ou
presentes naturalmente, interferindo nos resultados [20].

Figura 1. Teores de fenlicos totais em amostras de biofarinha fermentada com A. brasiliensis e no fermentada.
Para doseamentos, a legislao brasileira preconiza um mximo de 5% para o DPR
[17]; portanto, os valores obtidos nos doseamentos esto dentro do exigido.
No processamento da ma para obteno de suco, ocorre a formao de uma
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quantidade razovel de resduo industrial, composto pela mistura heterognea de

polpa, casca, semente, haste e clice, chamado de bagao. O bagao permanece com
seus componentes bioativos em sua biomassa fresca, mesmo aps o processo de produo do suco. A ma apresenta elevado teor de metablitos, tais como avonides,
polifenis e cidos fenlicos, encontrados na polpa e, principalmente, em sua casca,
que fornece as propriedades antioxidantes dessa fruta [29].
O contedo de fenlicos totais que permanece no bagao de ma elevado (134,45
a 522,74 mg em cido glico.100 g1 ), o que indica o potencial antioxidante desse
subproduto. Com isso, so importantes estudos que avaliem os descartes da indstria alimentcia [29]. Alm de que, a incorporao de A. brasiliensis, ao bagao, pode
ser til para potencializar, ainda mais, a atividade antioxidante, pois esse cogumelo
tambm apresenta metablitos com tais propriedades. Pesquisa anterior realizou o
doseamento de fenlicos totais em basidiomas jovens (corpo de fruticao) de A. brasiliensis com etanol a 70%, sob agitao por 3 h. A concentrao de fenlicos totais, de
acordo com o mtodo de Folin-Ciocalteu, foi de 1,94 0,39 mg de catequina.mL1

de extrato ou 1,94% em catequina [5], ou seja, h fenlicos presentes no corpo de

fruticao. Em outro trabalho, foi mensurado o teor de fenlicos totais em extratos
de basidiomas de A. brasiliensis, obtidos por extraes de forma rpida (em liquidicador por 30 min) ou de forma lenta (em shaker, por 3 h) em diferentes solventes:
gua, metanol:gua, etanol:gua, metanol e etanol. O experimento utilizou esquema
fatorial no delineamento inteiramente casualizado. Nesse, o melhor solvente de extrao foi a gua, sem diferena estatstica entre a extrao rpida e lenta (em torno de
130 mg de cido glico.g1 ) [4]. J outros estudos em extratos etanlicos de gros de

trigo fermentados com miclio de A. brasiliensis (2% p/v), apresentaram 0,576 mmol
de cido glico 100 g1 (98,03 mg.100 g1 ) no resduo seco (os gros de trigo sem
fermentar tiveram concentrao signicativamente inferior) [30]. Com base nisso,
o resultado obtido neste experimento no foi o esperado, pois o ideal seria que a biofarinha fermentada com A. brasiliensis tivesse fornecido um maior rendimento de
fenlicos totais em relao biofarinha no fermentada. Porm, o fungo pode ter
utilizado essas substncias fenlicas, tanto da ma quanto as prprias que ele produz, para seu crescimento e desenvolvimento. Deve-se levar em considerao o fato
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BENETTI, C. et al.

de que fungos secretam enzimas durante seu desenvolvimento e degradam compostos

orgnicos e outros nutrientes para o seu crescimento [31], podendo ter desencadeado um processo de degradao e/ou alterao das estruturas fenlicas (por exemplo,
a estrutura molecular do composto passou a ter uma metoxila no lugar de uma hidroxila, ocasionando uma falsa diminuio na concentrao de compostos fenlicos,
pois o mtodo utilizado para o doseamento usa as hidroxilas fenlicas). Pode-se garantir que ocorreram as mesmas perdas desses compostos durante o processo, pois a
biofarinha fermentada e no fermentada foram submetidas s mesmas condies de
fermentao.
importante salientar que, em nosso grupo de trabalho, resultados anteriores de
avaliao antioxidante com a mesma biofarinha fermentada indicou uma capacidade
antioxidante expressa como 74,581 0,0225 mmol de cido ascrbico.100 g1 , me-

diante a extrao com metanol a 70% em vrtex por 15 min, na proporo de 50 mg

de farinha para 1,5 mL de lquido extrator. Inclusive, ocorreu diferena signicativa
(p = 0,0132) entre a biofarinha fermentada versus a no fermentada (69,152 0,0314
mmol de cido ascrbico.100 g1 ) [32].

Concluses
O sistema de planejamento fatorial destaca-se como um instrumento ecaz para

otimizao de resultados. A melhor metodologia de extrao para compostos fenlicos da biofarinha com granulometria superior a 0,25 mm utilizou como solvente
extrator o etanol a 70% em homogeneizador por 15 min. Com isso, obteve-se, para a
amostra de biofarinha no fermentada com A. brasiliensis, 0,1098 1,246.103 % de

fenlicos totais expressos em APC, e na fermentada 0,04852 1,458.103 %, sendo

que este valor foi inferior ao da biofarinha no fermentada, provavelmente em funo de o fungo ter utilizado esses compostos para o seu crescimento. Com base nos
resultados obtidos, trabalhos futuros, com cromatograa acoplada espectrometria
de massas, podem auxiliar no real doseamento de substncias fenlicas de forma individualizada.
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Agradecimentos
UNICENTRO.

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