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Extraction et dosage de lEugnol


dans le clou de girofle

Le clou de girofle provient du Giroflier (Syzygium aromaticum L.), arbre de la famille
des Myrtaces. Il sagit du bouton floral qui a t rcolt et sch jusqu lobtention de sa
couleur brun fonc caractristique. Il est beaucoup utilis en cuisine pour parfumer le pain
dpices, la choucroute et les currys par exemple.
Le clou de girofle contient de 15 20% dhuile essentielle. Celle-ci prsente de nombreuses
proprits pharmacologiques comprenant une action anti-inflammatoire, antiseptique,
analgsique, bactricide mais est galement trs utilise en parfumerie. Lhuile essentielle du
clou de girofle est compose majoritairement deugnol (85 90%), de caryophyllne, de
tanins et dacide olanolique.
Leugnol est un compos phnolique.
- Formule brute : C10H12O2
- Masse molaire : 168 g.mol-1
- Soluble dans lalcool (d = 0,78), le dichloromthane (d = 1,33)
- Trs peu soluble dans leau

Dans ces travaux pratiques, nous allons extraire de leugnol partir de clous de girofle, puis
doser la quantit de cet eugnol extrait laide de diffrentes techniques telles que la
spectrophotomtrie UV-Visible, lHPLC et la CPG. Dans notre compte-rendu ne seront
abords que lextraction, la spectrophotomtrie UV-Visible et la chromatographie en phase
gazeuse (CPG).

EXTRACTION
Extraction solide-liquide au Soxhlet
Le systme soxhlet est compos dun ballon, dun extracteur et dun rfrigrant.
Lextracteur comporte un tube permettant la vidange automatique du rservoir. Ce
systme est complt par une cartouche de cellulose contenant la matire premire
partir de laquelle nous voulons extraire le compos (ici le clou de girofle pour
leugnol). La cartouche est place dans le rservoir. Cette technique est relativement
longue et demande de chauffer le mlange solvant-compos, ce qui rend la technique
dlicate pour les composs sensibles la chaleur. Mais elle permet dutiliser peu de
solvant car il est rutilis en continu, ceci lui permet de rester pur et de rendre la
solubilisation du compos plus efficace.
Fig. 1 : extracteur Soxhlet

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Nous avons pes 12.8g de clou de girofle que nous avons broy grossirement. Le broyat a t
introduit dans la cartouche de cellulose qui est bouche avec du coton pour viter le reflux. La
cartouche a t introduite dans lextracteur Soxhlet. Un ballon contenant 300ml de
dichloromthane et quelques grains de pierre ponce est fix sur lextracteur Soxhlet et chauff
afin de permettre lvaporation du solvant. Le dichloromthane est un solvant apolaire non
miscible avec leau (leugnol y est soluble). Les pierres-ponce empchent lbullition du
solvant. Lextraction a dure 5h.
Evaporation rotative
La solution obtenue, contenant diffrentes molcules apolaires du clou de girofle, est
concentre laide dun vaporateur rotatif.

Lvaporateur permet dliminer rapidement


un solvant par vaporation.
La solution, place dans un ballon en rotation
(1), est chauffe au bain-marie (45C).
Une pompe cre un vide dans le ballon, ce
qui permet de diminuer la temprature
dvaporation du solvant. Ce dernier est alors
rcupr dans un ballon de rcupration.
Le volume de notre extrait concentr est alors
ramen 50mL environ afin de faciliter la
suite des manipulations.
Fig. 2 : vaporateur rotatif

Extraction liquide-liquide
Notre solution subit deux extractions liquide-liquide successives dans une ampoule dcanter
laide de 25ml de NaOH 1M.
Prparation de 50mL de soude 1M :
m = C*V*M = 1*0,05*39,3971 = 1,97g de NaOH peser
La soude est une base (pH 13-14). Lors du mlange, le NaOH alcalinise le milieu. LEugnol
devient alors un sel, lEugnolate (groupement alcool (OH) perd son proton). LEugnolate
est plus polaire et passe donc en phase aqueuse. Aprs la premire extraction, on rcupre la
phase organique qui subit la seconde extraction de la mme faon. Les phases aqueuses
contenant lEugnolate sont rcupres.
On ramne notre solution pH acide (pH 2-3) en ajoutant de lacide chlorhydrique (HCl).
LEugnolate (groupement (O-) rcupre son proton) redevient Eugnol. Cette fraction est
rintroduite dans une ampoule dcanter, et extraite avec 50mL de dichloromthane.
LEugnol repasse de la phase aqueuse la phase organique. Celle-ci est rcupre et
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vapore sec laide dun vaporateur rotatif. LEugnol est repris dans un volume prcis
de 50mL dthanol (car leugnol est soluble dans lalcool), puis filtre laide dun filtre
0,45m.

DOSAGE PAR SPECTROPHOTOMETRIE UV-VISIBLE


La spectromtrie dabsorption consiste mesurer lattnuation dun signal lumineux
traversant un milieu afin de dterminer les concentrations des substances absorbantes,
chromophores, prsentent dans le milieu.
Leugnol, de part ses proprits physiques (cycle aromatique), absorbe dans lUV.
Pour connatre la quantit dEugnol extraite de nos clous de girofle, on ralise un dosage par
spectrophotomtrie en utilisant la mthode dtalonnage externe laide de solutions de
rfrence de concentrations connues : 0,1-0,5-1-2,5-5g/mL.
Le spectrophotomtre UV-Visible comporte :
- une source lumineuse qui permet dclairer dans lUV (ex : lampe au deutrium) et
dans le visible (ex : lampe au Tungstne).
- Un monochromateur, qui permet de slectionner une longueur donde prcise du
spectre UV-Visible.
- Le compartiment o se trouvent lchantillon et le blanc. Ils sont placs dans des
cuves en quartz (car le quartz nabsorbe pas dans lUV contrairement aux cuves en
plastique) de 1 cm de longueur.
- Un dtecteur photodiode ou photomultiplicateur, qui rcupre les signaux lumineux
ayants travers lchantillon.
Une des solutions de rfrence est utilise pour dterminer le max (longueur donde du
maximum dabsorption de lEugnol).
max = 280nm
Grce aux valeurs des absorbances de nos solutions de rfrences, nous ralisons une courbe
talon (document1). Puis nous avons mesur labsorbance de notre solution obtenue la fin
de lextraction. Notre solution est dilu 5000 fois afin dentrer dans la zone de linarit de la
loi de Beer-Lambert.

Document 1: Courbe d'talonnage


Spectrophotomtrie UV 280nm
y = 0,0173x - 0,0028
R = 0,99795

0,1
0,08
0,06
Absorbance
0,04
0,02
0

Absorbance
0

Concentration en g/mL

Linaire
(Absorbance)

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Calcul de la concentration deugnol dans notre extrait dilu
Nous obtenons une absorbance A = 0,780. partir de lquation de la courbe talon, nous en
dduisons la concentration deugnol, soit :
y = 0 ,0173x 0,0028

avec

x = concentration en eugnol en g/mL


y = absorbance 280nm

x = 0,780 + 0,0028 / 0,0173


x = 4,63 g/mL
Calcul du coefficient dextinction molaire de leugnol :
= A / l.C

avec

l : longueur de la cuve (1 cm)


C : concentration en eugnol (mol .L-1)
A : absorbance 280nm

est gal la pente de la courbe talon


xa = 1 g/mL en utilisant la courbe talon : ya = 0,0173 * 1 0,0028 = 0,0145
xb = 2 g/mL yb = 0,0318
Rappel : Le coefficient dextinction molaire sexprimant en mol-1.cm-1.L., nous convertissons
les concentrations xa et xb grce la masse molaire de leugnol.
MM = 164,2 g.mol-1.
= (yb ya) / (xb xa)
= (0,0318 0,0145) / [((2.10-6 1.10-6)/164,2) * 103] = 2840,7 mol-1.cm-1.L
Calcul du rendement deugnol extrait
La concentration deugnol dans notre extrait est de 4,63g/mL. Cet extrait a t dilu 5000
fois. Nous avons donc 4,63*5000 = 23,15 mg.mL-1
Notre extrait avait t repris dans un volume prcis de 50mL dthanol. Nous avons donc
obtenu 0,02315*50 = 1,1575g deugnol.
Nous avons utilis 12,8g de clou de girofle pour lextraction. Nous avons donc un rendement
R = 1,1575 * 100 / 12,8 = 8,98 %.
Soit 89,8 mg deugnol par g de clou de girofle.

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CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG):


La CPG est une technique de sparation de molcules prsentent dans un mlange qui peut
tre complexe, avec des volatilits diffrentes. Elle sapplique principalement aux composs
gazeux ou susceptibles dtre vaporiss sans tre dgrads.
Les appareils chromatographie gazeuse sont principalement composs :
- dun four
- dun systme dinjection, permettant dintroduire et de vaporiser notre chantillon
- dune colonne de sparation
- dun systme de dtection
Les composs vont tre spars en fonction de leur volatilit et de leur polarit. Les composs
les plus volatiles (ayant une temprature dbullition plus faible) sortiront en premier. Mais si
deux composs ont une volatilit proche, le compos le moins polaire sortira en premier.
Laire des pics chromatographiques est proportionnelle la concentration ou la quantit de
produit analys. Cest cette proprit qui rend possible la quantification de notre compos.
Nous utilisons deux mthodes dtalonnage (externe et interne) pour dterminer la
concentration deugnol dans notre extrait.
Pour ltalonnage externe nous injectons des volumes constants de solutions de
concentrations en eugnol connues et mesurons laire des pics correspondants. Nous
construisons ensuite une courbe talon : Aire = f(concentration eugnol).
Pour ltalonnage interne nous introduisons dans le mlange doser un talon interne. Il
possde des proprits trs proches de leugnol, et son pic chromatographique doit tre bien
spar mais proche des autres composs prsents dans lchantillon.
La mthode dtalonnage interne est beaucoup plus prcise car elle est indpendante du
volume inject dans le chromatographe, qui est une des principales sources derreur des
rsultats (surtout pour les injections manuelles). Nanmoins il nest pas toujours ais de
trouver un bon talon interne (pur et commercialis).
Optimisation des conditions de sparation
Afin doptimiser les conditions de sparation des pics chromatographiques, nous disposons
dune solution contenant 4 composs majeurs de lhuile essentielle de clou de girofle que sont
leugnol, la carvone, lalpha-terpinol et laldhyde cinnamique.
Nous effectuons un premier essai en injectant 1L de mlange, une temprature de 219C.
Les pics taient mal rsolus. Un second essai une temprature de 190C permis une bonne
sparation des pics. (Document 2, voir fin). Cest donc cette temprature que nous avons
retenue pour nos analyses.
Identification des composs
Avant de raliser les chromatogrammes de chaque compos et ainsi dterminer lordre
dlution laide des temps de rtention, nous pouvons rflchir sur lordre de sortie de ces 4
composs grce leurs formules chimiques et leurs proprits.
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Carvone

Aldhyde cinnamique

Eugnol

-terpinol

Dans nos conditions de sparation (T = 190C), on peut dduire que :


-
-
-
-

lalpha terpinol sortirait en 1er car il est le plus volatile, il a la temprature


dbullition la plus basse de tous les composs
La carvone a une temprature de volatilisation un peu plus basse que les deux derniers
composs, mais surtout a une polarit infrieure leugnol et laldhyde
cinnamique. Il va donc tre moins retenu que les deux derniers.
Leugnol a peu prs la mme temprature de volatilisation que laldhyde
cinnamique mais est moins polaire que celui ci, il sortira donc avant.
Laldhyde cinnamique, le compos le plus polaire sortira en dernier

En comparant les temps de rtention des spectres individuels avec le chromatogramme du


mlange, on a pu confirmer lordre dlution des composs.
- terpinol
T
bullition 219
(C)
Tps de rtention 2,84
(min)

Carvone

Eugnol

230

252-253

Aldhyde
cinnamique
250-252

3,00

3,42

4,38

Dosage de leugnol par talonnage externe


Ltalonnage externe est effectu laide de solutions de rfrences deugnol commerciales
de concentrations connues : 0,2-0,4-0,6-0,8 et 1 mg.mL-1
Lanalyse des chromatogrammes de ces solutions nous a permis de construire une courbe
talon de laire sous courbe des pics deugnol en fonction de la concentration en eugnol
(document 3).
Nous avons chromatographi notre extrait que lon a pralablement dilu 20 fois afin que les
rsultats entrent dans les valeurs de la gamme talon (dilution dduite des rsultats obtenus
par dosage UV).
Laire obtenue pour notre chantillon est : 8901,51.
Lquation de la courbe talon est : y = 11104x + 604,22
Nous en avons dduit la concentration deugnol dans notre extrait dilu:
(8901,51 604,22) / 11104 = 0,75 mg.mL-1
Donc en tenant compte du facteur de dilution, nous obtenons une concentration de :
0,75*20 = 15 mg.mL-1
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Document 3: Etalonnage Externe


14000
y = 11104x + 604,22
R = 0,99698

12000
10000
Aire de l'Eugenol

8000
6000

Aire eugenol

4000

Linaire (Aire eugenol)

2000
0
0

0,5

1,5

Concentration d'Eugenol en g/L

Calcul du rendement deugnol extrait


Notre extrait avait t repris dans un volume prcis de 50mL dthanol. Nous avons donc
obtenu 0,015*50 = 0,75g deugnol.
Nous avons utilis 12,8g de clou de girofle pour lextraction. Nous avons donc un rendement
R = 0,75 * 100 / 12,8 = 5,86 %.
Soit 58,6 mg deugnol par g de clou de girofle
Dosage de leugnol par talonnage interne
Pour cela nous avons utilis une concentration constante de carvone (talon interne
0,5mg.mL-1) ajoute dans nos solutions de rfrences de concentrations 0,2-0,4-0,6-0,8 et 1
mg.mL-1 deugnol.
Une nouvelle courbe talon a pu tre construite, grce aux rapports des aires des pics de
leugnol sur la carvone en fonction du rapport des concentrations deugnol sur carvone
(document 4).

Document 4: Etalonnage Interne


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y = 0,9251x - 0,1003
R = 0,99092

1,5
Rapport des
Aires Eugnol/
Carvone

Rapport Aire E/C

0,5

Linaire (Rapport Aire E/C)

0
0

0,5

1,5

2,5

Rapport des concentrations Eugnol/Carvone

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Remarque : Plusieurs essais ont t raliss pour la concentrations de 0,8 mg.mL-1 deugnol
(4me point de la courbe talon) afin dobtenir de meilleurs rsultats. Mais nous navons pas
obtenus mieux.
Le rapport des aires obtenu pour notre chantillon est : 8901,51 / 7703,55
Lquation de la courbe talon est : y = 0,9251x 0,1003
Nous en avons dduit le rapport des concentrations deugnol sur carvone :
[eugnol]/[carvone] = (8901,51 / 7703,55) + 0,1003/ 0,9251 = 1,3575
La concentration de carvone tant de 0,5 mg.mL-1, nous pouvons en dduire la concentration
deugnol dans notre extrait dilu : 1,3575*0,5 = 0,6787 mg.mL-1
En tenant compte du facteur de dilution : 0,6787*20 = 13,57 mg.mL-1 deugnol.
Calcul du rendement deugnol extrait
Notre extrait avait t repris dans un volume prcis de 50mL dthanol. Nous avons donc
obtenu 0,01357*50 = 0,68g deugnol.
Nous avons utilis 12,8g de clou de girofle pour lextraction. Nous avons donc un rendement
R = 0,68* 100 / 12,8 = 5,31 %.
Soit 53,1mg deugnol par g de clou de girofle

CONCLUSION
Les rsultats des rendements obtenus en eugnol sont :
- 8,98% laide de la spectrophotomtrie UV-Visible
- 5,86% laide de la CPG talonnage externe
- 5,31% laide de la CPG talonnage interne
On observe une certaine diffrence entre la mthode de spectroscopie UV et celles de la CPG,
tout en restant dans un mme ordre de grandeur.
La spectromtrie UV est trs sensible, elle permet de dtecter de faible concentration (de
lordre du g/mL dans notre tude par exemple). Lors de notre exprimentation, labsorbance
obtenue (DO) ntait pas trs stable, ce qui nous a donn des rsultats approximatifs,
influenant sur lquation de la courbe talon, et donc sur les rsultats finaux (concentration,
rendement). Et ces faibles concentrations, chaque erreur de manipulations lors de
ltablissement de la gamme talon influence normment les rsultats finaux. Il est
ncessaire de bien connatre les proprits spectrales de la molcule tudier, et davoir
disposition un chantillon pur pour dterminer le max et raliser la courbe talon. Enfin, si
dautres molcules absorbant dans les UV sont prsentes dans le mlange, elles peuvent
recouvrir le pic dabsorption du compos tudi.
Cette mthode peut tre trs sensible, et dtecter de faibles concentrations de composs, mais
elle nest pas trs prcise pour le dosage.
Cest pourquoi nous avons utilis dautres techniques pour doser leugnol que nous avons
extrait, telle que le dosage par chromatographie en phase gazeuse.

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Comme dit prcdemment, la mthode dtalonnage interne est plus prcise que lexterne car
supprime les erreurs des volumes injects. Donc le rendement le plus pertinent obtenu serait
celui de la CPG talonnage interne : 5,31%.
Le clou de girofle est compos denviron 15% deugnol (cf. Monographie du clou de
girofle). Nous avons donc extrait environ 1/3 de leugnol total par la technique dextraction
Soxhlet.
Pour amliorer le rendement, nous aurions pu augmenter le temps dextraction (nous avons
extrait leugnol pendant 5h).
De plus, il est conseill au bout de 4 5 passages du solvant, de le renouveler car celui ci est
de plus en plus satur, et donc lefficacit dextraction est diminue chaque passage.

BIBLIOGRAPHIE
Monographie du clou de girofle
http://jardinsdumonde.org/index.php?option=com_content&view=article&id=87:eugeniacaryophyllata&catid=11:monographie-de-plantes&Itemid=16
Extraction soxhlet ; vaporateur rotatif
http://www.lachimie.fr
Dessins des molcules :
http://www.wikipedia.fr

M1 VRV : BREARD Dimitri ; DELECOLLE Julien ; MANDAVID Hugues