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Gis de Entrada e Separao


ESCOLHA DO GEL
Depende do tamanho da protena que se quer detectar:
Tamanho da Protena

Gel

4 40 kDa
12 45 kDa

20%

10 70 kDa

12%

15 100 kDa
25 200 kDa

10%

15%

8%

PREPARO DO GEL

Monte a placa (gel caster+porcelana+espaador+vidro)

Encha o espao com gua, veja se h vazamento (espere 5 min);

Verta a gua, seque com papel filtro;

Pipete o gel de separao;

Pipete butanol sobre o gel;

Espere o gel polimerizar;

Verta o butanol;

Pipete o gel de entrada sobre o gel polimerizado e coloque o pente (15 poos);

Aguarde polimerizar;

Pronto para uso!

SOLUES

Tampo Gel de Separao (p/ 200 ml)

Tris 1,5M ....................... 36,33 g


SDS 0,4% ...................... 8,0 mL SDS 10% (adicionar aps o ajuste de pH)
H2O destilada q.s.p.
Obs.: ajustar o pH para 8.8 com HCl
Manter em geladeira (2-8C)

(2)

Tampo de Gel de Entrada (p/ 100 ml)

Tris 0,5M ....................... 6,05 g


SDS 0,4 % ..................... 4,0 mL SDS 10% (adicionar aps o ajuste de pH)
H2O destilada q.s.p.
Obs.: ajustar o pH para 6.8 com HCl
Manter em geladeira (2-8C)

Acrilamida 30% (100 ml)

Acrilamida ....................... 30 g
H2O destilada q.s.p.
Manter em geladeira (2-8C)

Bis-Acrilamida 1,6 % (100 ml)

Bis-Acrilamida ................ 1,6 g


H2O destilada q.s.p.
Manter em geladeira (2-8C)

SDS 10% (100 ml)

SDS ................................ 10,0 g


H2O destilada q.s.p.
Manter em temperatura ambiente

APS 10% (1 ml)

APS ..................................... . 0,1 g


H2O destilada ....................... 1 mL
Manter em geladeira (2-8C)
Estvel por uma semana!

(3)

GEL DE ENTRADA
1 gel

2 gis

4 gis

Tampo gel de entrada

470 l

940 l

1,88 ml

Acrilamida 30%
Bis-Acrilamida 1,6%

795 l
140 l

1,59 ml
280 l

3,18 ml
560 l

H2O destilada
APS 10%
TEMED

985 l
6,25 l
1,9 l

1,97 ml
12,5 l
3,75 l

3,94 ml
25 l
7,5 l

Obs.: Pipetar o APS e o Temed apenas na hora que for colocar o gel na placa, para que o gel
no polimerize antes do tempo.

SOLUES

TBS (2litros)

Tris 20mM .......................... 4,84 g


NaCl 0.5M ...........................58,44 g
Ajustar para pH 7.5 com HCl, Us-lo na capela.
H20 destilada q.s.p.
Manter em geladeira (2-8C)

T-TBS

Diluir:
TBS 1 litro
Tween 500l
Manter em geladeira (2-8C)

(4)

GEL DE SEPARAO
1 gel
6%

8%

10%

12%

15%

Tampo gel de separao

2,0 ml

2,0 ml

2,0 ml

2,0 ml

2,0 ml

Acrilamida 30%

1,60 ml

2,12 ml

2,65 ml

3,18 ml

3,98 ml

Bis-Acrilamida 1,6%

0,78 ml

1,06 ml

1,33 ml

1,59 ml

1,99 ml

H2O destilada

3,62 ml

2,82 ml

2,03 ml

1,23 ml

30 l

APS 10%

50 l

50 l

50 l

50 l

50 l

TEMED

5 l

5 l

5 l

5 l

5 l

2 gis
6%

8%

10%

12%

15%

Tampo gel de separao

4,0 ml

4,0 ml

4,0 ml

4,0 ml

4,0 ml

Acrilamida 30%

3,2 ml

4,24 ml

5,30 ml

6,36 ml

7,96 ml

Bis-Acrilamida 1,6%

1,56 ml

2,12 ml

2,66 ml

3,18 ml

3,98 ml

H2O destilada

7,24 ml

5,64 ml

4,06 ml

2,46 ml

60 l

APS 10%

100 l

100 l

100 l

100 l

100 l

TEMED

10 l

10 l

10 l

10 l

10 l

4 gis
6%

8%

10%

12%

15%

Tampo gel de separao

8,0 ml

8,0 ml

8,0 ml

8,0 ml

8,0 ml

Acrilamida 30%

6,4 ml

8,48 ml

10,6 ml

12,72 ml

15,92 ml

Bis-Acrilamida 1,6%

3,12 ml

4,24 ml

5,32 ml

6,36 ml

7,96 ml

H2O destilada

14,48 ml

11,28 ml

8,12 ml

4,92 ml

120 l

APS 10%

200 l

200 l

200 l

200 l

200 l

TEMED

20 l

20 l

20 l

20 l

20 l

(5)

SOLUES

Tampo de Eletrotransferncia Bio-Rad (2 litros)

Tris 25 mM ............................ 6,06 g


Glicina 192 mM ...................... 28,7 g
Metanol 10% ........................... 400 mL (40 mL Metanol PA + 360 mL H20 destilada)
H20 q.s.p.

Obs: possvel reutilizar uma vez o tampo!


Manter em geladeira (2-8C)

Tampo de Corrida 10X (500 mL) (Soluo Estoque)

Tris 0,125M ....................... 7,57 g


Glicina 1,92M ................... 72,1 g
SDS 1% ................................ 50 mL de SDS 10%
Ajustar para pH 8.5 antes do SDS.
H2O q.s.p.
Manter em geladeira (2-8C)

Tampo de Corrida 1X (250 mL) (Soluo USO)

Tampo 10X ....................... 25,0 mL


H2O destilada ..................... 225,0 mL
O volume de 250-300 mL suficiente para 1 cuba de eletroforese

(6)

Corrida e Transferncia

CORRIDA

- Monte o(s) gel(s) na cuba de corrida; Depois de polimerizar retire o pente;


- Acrescente o tampo de corrida nos poos do gel at o limite da porcelana;
- Acrescente tampo atrs da placa e na base, at o limite inferior do gel;
- Pipete o padro de peso molecular (3,5 uL) e as amostras (h 15 poos no total);
- Ajuste os parmetros da corrida:
Para uma mesma fonte:
1 gel: 150V, 25 mA, ~1h

2 gis: 150 V, 50 mA, ~1h

Obs.: Preste ateno na faixa azul da corrida. Quando ela chegar prxima base do gel, pare a
corrida!

TRANSFERNCIA

Membrana:

Corte a membrana nas dimenses

Gel:

Aps a corrida, corte as bordas em

8,5 cm x 6 cm;

excesso do gel e o canto inferior

Corte o canto inferior direito;

direito;

Lave 1 minuto em metanol;

Deixe em gua destilada at o final

Monte o sanduche.

da corrida.

Montagem do Sanduche:

Molhe a cmara de transferncia com tampo de transferncia;

Monte o sanduche:

Esponja - Blot paper (novo) gel membrana Blot paper (velho) - Esponja
Obs.: Ao mesmo tempo, pode ser feito a transferncia de protenas de 2 gis (1 de cada lado).
Ajuste os parmetros da transferncia:
2 gis: 75V 200 mA - 2 horas

(7)

Bloqueio e Anticorpo
ETAPAS

Aps a Transferncia .......................................1 x 5 min T-TBS

Leite Desnatado ...............................................1h (2,5 g leite em p + 50 mL T-TBS)

Obs.: Para o fgado, usar 3 g em 50 mL QUANTIDADE PARA DUAS MEMBRANAS

T-TBS .............................................................. 1 x 5 min

Anticorpo Primrio .......................................... 2 horas (pelo menos/ temp. ambiente)

Anticorpo Primrio ........................................... overnight 4C no shake!

Dia seguinte

Ambientalizar .................................................... 30 min

T-TBS ................................................................ 5 x 5 min

Anticorpo secundrio acoplado peroxidase..... 1h

T-TBS ................................................................ 5 x 5 min

Obs.: 10 - 15 mL de T-TBS suficiente para as lavagens.

(8)

Revelao com ECL


ETAPAS

Prepare o ECL ...................................................... 300l sol A + 300l sol B

Escorra o excesso de T-TBS da membrana

Pipete o ECL sobre a membrana ........................... 3 min;

No seque a membrana!

Coloque no Chemidoc ligar 1 hora antes!

Obs: Logo aps a revelao, a membrana pode ser estripada com kit para stripping com
sucesso para incubao com novo anticorpo.

Stripping
Assim que terminar a revelao:

T-TBS ................................................... 5 min (p/ reidratar a membrana)

Soluo Stripping 1mL + 9mL (T-TBS) Strong - 10 min ou Mild 15 min

T-TBS ................................................... 3 x 5 min

Obs.: Aps o stripping, reiniciar o WB a partir do bloqueio com leite. Ou, guardar a
membrana em T-TBS na geladeira at o prximo dia.