MANUAL DE TCNICAS DE DIAGNSTICO PARASITOLGICO

Disciplina Parasitologia clnica laboratorial

Profa. Gentilda K. F. Takeda

EXAME PARASITOLGICO DO SANGUE

Hemoscopia

Obteno do sangue
A- Da micro-circulao superficial.
Finalidade: Preparao de esfregaos em lminas ou outros processos que
usem pequenas quantidades de sangue.
Material: Lanceta
Algodo ou gaze
lcool 70% iodado
Local da puno: Ponta do dedo anelar esquerdo ou lbulo da orelha. Em
crianas pequenas, punciona-se a polpa do grande artelho.
Tcnica de puno: Limpar, massageando o local com lcool iodado, deixando
secar espontaneamente.
Puncionar firmemente com a agulha ou lanceta. Repetir
a operao caso no atinja a profundidade desejada (2 a 3 mm).
Desprezar a primeira gota de sangue, aproveitando as
seguintes para fazer o esfregao.

B- Do sangue venoso.
Finalidade: Colhem-se, quando for necessrio usar, volumes da ordem de
mililitros.
Material: Seringa descartvel com dimenso adequada quantidade de
sangue a ser colhido.
Agulha com calibre e comprimentos adequados.
Tubo estril (com anticoagulante: citrato, heparina ou EDTA).
Algodo ou gaze.
lcool iodado a 70%.
Para a pesquisa de tripanossomos e de microfilrias o exame a fresco
realizado em uma gota de sangue colocada em lmina e coberta com lamnula.
Pode-se utilizar, tambm, a tcnica do microhematcrito quando a
parasitemia baixa.

Tcnica do Microhematcrito
Esta tcnica, descrita por Woo para o diagnstico das formas sangneas de
Trypanosoma spp, consiste na centrifugao do sangue com anticoagulante
durante trs minutos, em tubos capilares. Os parasitas do sangue
(tripanossomas e microfilrias) podem ser visualizados, quando presentes, na
regio acima da camada leucocitria, em microscpio ptico.
Nestes exames podem-se observar os movimentos dos flagelados ou das
microfilrias. Porm, para observao da morfologia dos parasitas faz-se
necessria preparao de lminas fixadas e coradas.
Para isso quebra-se a parte superior do capilar e, com auxlio de uma seringa
de insulina aspira-se o contedo (constitudo de plasma e parasitas) que fica
logo acima do creme leucocitrio. Com o contedo aspirado faz-se esfregao
em lmina de vidro que deve ser fixado e corado com Giemsa.

Esfregaos de sangue e colorao de parasitas do sangue.

O esfregao de sangue pode ser realizado de duas maneiras: esfregao em
camada delgada ou gota espessa.
No esfregao de camada delgada a distoro do parasita mnima
(vantagem), mas h a desvantagem de ter que examinar muitos campos para
se encontrar parasitas, quando estes esto em pequeno nmero.
Na gota espessa apesar da distoro das formas parasitrias ser maior, a
probabilidade de deteco de parasitas aumenta porque a quantidade de
sangue a ser examinada cerca de trs ou quatro vezes maior do que o
esfregao e a rea examinada (1cm2) menor. Esfregaos de sangue ou gota
espessa, com sangue capilar, devem ser feitos com gota de fluxo espontneo
e no contaminado com lcool.
Estas tcnicas so utilizadas para a pesquisa e o diagnstico dos parasitas
da malria, tripanossomos, microfilrias, babsias, tripanossomas e
Leishmania chagasi.

CORANTES
Os derivados do Romanowsky so os mais utilizados; Destes os mais comuns
so o Giemsa e o Leishman.
Giemsa (soluo estoque)
Azur II eosina
Azur II
Glicerina P.A.
lcool metlico P.A.

0,30g
0,08g

12,50 ml
37,50 ml

Esta soluo pode ser preparada em laboratrio ou comprada pronta.

Ao us-la, esta deve ser diluda em gua da seguinte forma: trs gotas de
corante-estoque para cada 02 ml gua.

Leishman

O corante de Leishman uma mistura de azul de metileno e eosina, pode ser

adquirido no comrcio e um p.
Azul de metileno e eosina (p)
lcool metlico P. A

0,15g
100 ml.

Para preparar o corante, o p dissolvido em lcool metlico agitando-se

freqentemente, durante trs dias. Devem-se guardar ambos os corantes
(Giemsa e Leishman) em vidros mbar e em ambiente escuro.

Preparao do esfregao
Para a confeco de esfregao (em camada delgada e gota espessa) devemse utilizar lminas de vidro limpas e desengorduradas
Esfregao em camada delgada
Uma pequena gota de sangue colocada prximo de uma extremidade da
lmina; com auxlio de outra lmina (segurar por cima com a mo direita), em
ngulo de 30, colocada adiante da gota, o sangue vai se espalhar pela
superfcie de contato das duas lminas. Com suavidade e rapidez deslizar
esta segunda lmina para frente de modo a espalhar o sangue at o fim da
lmina. Deixar secar ao ar. Fixar e corar.
Esfregao em gota espessa
Colher 2 a 3 gotas de sangue em uma lmina. Utilizando o canto de outra
lmina, espalhar o sangue numa camada circular com 15 mm de dimetro.
Deixar secar ao ar por uma noite. Colocar a lmina com a gota espessa num
recipiente com gua para a desemoglobinizao (lise) das hemcias. Com a
ruptura das hemcias a cor vermelha da hemoglobina desaparece da mancha
de sangue e d lugar a uma rea esbranquiada. Retirar a lmina com cuidado
e deixar secar. Fixar e corar.

Fixao do material e colorao

Existem vrios fixadores disponveis, porm o mais utilizado o lcool
metlico.
Para a fixao deve-se cobrir a lmina com lcool metlico (PA) e deixar
fixando por um minuto. Em seguida cobrir o esfregao com corante Giemsa
diludo, deixando-o agir por 30 minutos. Escorrer o corante e lavar em gua
corrente; deixar secar e examinar em microscpio.
Se o corante utilizado for o de Leishman proceder da seguinte maneira:
cobrir o esfregao com sete ou oito gotas de corante; deixar o corante agir
durante 15 segundos (no mximo), em seguida adicionar 15 gotas de gua;
com auxlio de uma pipeta homogeneizar (soprando o corante) a mistura.
Deixar corar por 20 minutos, escorrer o corante, lavar em gua corrente,
deixar secar e examinar em microscpio.
O esfregao corado pelo Leishman no necessita de fixao prvia pelo
lcool metlico, pois este j faz parte da frmula do corante. As lminas
coradas por este mtodo no so to boas e durveis quanto pelo mtodo de
Giemsa, no entanto, uma tcnica muito utilizada devido rapidez e
facilidade de execuo.

Tcnica de Knott (pesquisa de microfilrias).

1- Retirar 02 ml de sangue total por puno venosa e colocar imediatamente em
um tubo contendo 10 ml de formol a 2%.
2- Fechar o tubo e misture completamente, invertendo-o e agitando-o. O
formol hemolisa as hemcias; mata, fixa e distende as microfilrias
3- Centrifugar o sangue a 1500 rpm por 5 minutos.
4- Decantar o sobrenadante.
5- Retirar o sedimento com uma pipeta Pasteur e o espalhe numa gota espessa
sobre uma lmina.
6- Deixar secar bem e corar com Giemsa.
7- Examinar com objetiva de imerso.

Exame de fezes
1- Receber as fezes em recipiente adequado.
2- As amostras devem ser correta e completamente identificadas com: o nome
do paciente; idade, nmero de identificao do laboratrio; hora da colheita e
hora da chegada da amostra ao laboratrio.
As instrues, sobre a coleta de fezes devem ser claras e passadas ao
paciente. importante verificar se o paciente as entendeu, pois na coleta
adequada que se inicia a qualidade do exame parasitolgico.
3- Para um trabalho rotineiro em Parasitologia recomendvel que se realize
trs exames parasitolgicos.
4- Todos os parasitas observados devem ser relatados pelo nome cientfico,
incluindo gnero e espcie, quando possvel, e o estgio que esto.
Determinados elementos celulares (GV, GB ou outras clulas), fungos ou
cristais de Charcot-Leyden devem ser assinalados de modo semiquantitativo
como: poucos cristais, moderados ou muitos. Tambm, devero constar os
mtodos executados e a consistncia das fezes.
5- Fezes lquidas devem ser examinadas dentro de 30 minutos; semi-slidas
dentro de 1 hora e formadas dentro de 24 horas. Se o exame for realizado
depois de 24 horas a amostra deve ser mantida em conservadores tais como:
formol a 10%, lcool polivinlico (PVA); o MIF conservador muito difundido
composto de mertiolato ou mercurocromo, iodo e formol e o SAF que um
fixador usado para conservar cistos e trofozotos.
A proporo utilizada de trs partes de qualquer um dos conservadores para
uma parte de fezes. Essa mistura deve ser bem homogeneizada.
* O formol e o MIF preservam ovos, cistos e trofozoitos para exames a
fresco; PVA e o SAF preservam trofozoitos para colorao permanente.
Formol a 10%
Formol comercial

10ml.

Soluo salina a 0,85%

90ml.

Fixador lcool Polivinlico (PVA)

Utilizada para conservar e transportar fezes lquidas. A proporo adequada de 2 a 3ml. de
fezes para 8 a 10ml.de soluo de PVA.
*Bicloreto de mercrio,
Soluo aquosa saturada
lcool etlico a 95%
cido actico glacial
** PVA em p
Glicerina

312ml.
156ml.
25ml.
20g.
7,5ml.

* Preparar o bicloreto de mercrio dissolvendo 130 a 140 g. de sal em 1000 ml de gua

destilada. Aquea para dissolver, aps o resfriamento filtre e estoque em uma garrafa.
** Coloque o PVA em p no lcool agitando lentamente. Aquea a 75C (banho Maria) e agite
at que a soluo fique transparente. Acrescente os outros reagentes e deixe esfriar. Guarde
em um frasco fechado e use conforme a necessidade. Decante a soluo sem suspender o
sedimento.
MIF
gua destilada
Sol. mercuriocromo a 1:500
Formol
Glicerina

250ml.
250ml.
25ml.
5ml.

SAF
Acetato de sdio
cido actico
Formol 40%
gua destilada

1,5g
2,9ml.
4,0ml.
92,5ml.

5- Rejeitar fezes contendo meio de contraste para Raios X (sais de brio),

somente colher as fezes 5 a 10 dias aps a ingesto de sais de brio.
6- No administrar purgativos tais como: leo mineral, leo de castor ou
supositrios, porque impossvel pesquisar protozorios.

EXAME MACROSCPICO
Procedimentos
1- Observar a consistncia da amostra.
Fezes moles ou lquidas sugerem a possvel presena de trofozotos de
protozorios intestinais. Cistos de protozorios so encontrados com mais
freqncia em fezes formadas. Ovos e larvas de helmintos podem ser
encontrados tanto em fezes lquidas quanto em fezes formadas.
2- Examinar a superfcie da amostra para observar a presena de proglotes de
tnias, ancilostomdeos ou oxiros adultos, por exemplo.
3- Examinar a amostra fecal com auxlio de um palito (sorvete) para verificar a
presena de outros helmintos adultos.
4- Examinar as fezes quanto presena de sangue e/ou muco.
a) sangue fresco (vermelho vivo) indica hemorragia aguda no trato intestinal.
b) muco sanguinolento sugere ulceraes e uma poro desse material deve, de
preferncia, ser examinada, ao microscpio, para a procura de trofozoitos.
Os vermes adultos, quando encontrados, devem ser imediatamente examinados
e identificados.
As tnias so identificadas especificamente pelo exame das proglotes
grvidas. As proglotes devem ser fixadas em formol a 10% e depois
clarificadas por imerso em glicerina ou soluo de lactofenol (1:1).

EXAME MICROSCPICO
Permite a visualizao de trofozoitos, cistos e oocistos de protozorios e de
ovos e larvas de helmintos.
recomendvel, quando se trata de fezes diarricas ou disentricas, o
emprego dos seguintes procedimentos:
a) exame direto a fresco para observao dos movimentos dos trofozoitos,

b) seguido de feitura de esfregao de fezes com colorao permanente para

observao morfolgica dos trofozotos, especialmente, de amebas
O exame de fezes pode ser quantitativo ou qualitativo. Os mtodos
quantitativos so aqueles nos quais se faz contagem de ovos para avaliao da
carga parasitria. O mais conhecido o de Stoll, mas, o mais empregado
atualmente o de Kato-Katz.
Os mtodos qualitativos so os mais utilizados para a demonstrao da
presena das formas parasitrias. Freqentemente o nmero das formas
parasitrias pequeno, assim necessrio recorrer a processos de
enriquecimento dessas formas para concentr-las.

Os principais mtodos de enriquecimento ou de concentrao utilizados so:

Sedimentao espontnea: mtodo de Hoffmann, Pons e Janer ou mtodo de
Lutz. Este mtodo permite o encontro de ovos e larvas de helmintos, cistos e
oocistos de protozorios;
Sedimentao por centrifugao: Mtodo de Blagg, conhecido por MIFC;
Mtodo de Ritchie, e o Coprotest. Usados para a pesquisa de cistos de
protozorios e de ovos e larvas de helmintos.
Flutuao: Mtodo de Willis. Indicado para
(ancilostomdeos).

pesquisa

de ovos leves

Centrfugo-flutuao: Mtodo de Faust. Utilizado para pesquisa de cistos e

oocistos de protozorios e de ovos leves.
Concentrao de larvas de helmintos: Mtodo de Baermann-Moraes e o
mtodo de Rugai usados para pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.
As fezes enviadas ao laboratrio clnico devem ser submetidas a um desses
mtodos citados. Como no existe um mtodo muito sensvel capaz de
diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as formas parasitrias o que se faz de
rotina o emprego de um mtodo geral como o de Lutz ou de Hoffmann, Pons e
Janer (de fcil execuo e pouco dispendioso), um especfico para cistos de
protozorios e um para a pesquisa de larvas de helmintos.

Exame direto a fresco

1- Colocar duas a trs gotas de salina a 0,85% em uma lmina de vidro.
2- Tocar com a ponta de um palito em vrios pontos das fezes, transferindo
uma pequena poro para a lmina de microscopia.
3- Espalhar as fezes, fazendo um esfregao e examinar ao microscpio. A
espessura do esfregao no deve impedir a passagem de luz.
4- Este mtodo indicado principalmente para a pesquisa de trofozoitos de
protozorios em fezes diarricas recm emitidas; para a identificao de
cistos de protozorios e larvas de helmintos cora-se a preparao com Lugol. O
uso de lamnula facultativo.
Soluo de Lugol
Iodo
Iodeto de potssio
gua destilada

100ml

2g
4g

Mtodo de Lutz ou de Hoffmann, Pons e Janer (sedimentao espontnea).

1- Colocar aproximadamente 2g de fezes em um frasco de Borrel ou em um
copo plstico descartvel, com cerca de 5 ml de gua e dissolver bem com
auxlio de um palito de sorvete descartvel.
2- Acrescentar mais 20 ml de gua
3- Coar a suspenso (para isto, usa-se gaze cirrgica umedecida, dobrada em
quatro, e colocada em um coador de plstico pequeno) num clice cnico de 200
ml de capacidade. Os detritos retidos na gaze so lavados co mais 20 ml de
gua.
4- Completar o volume do clice com gua.
5- Deixar essa suspenso em repouso durante duas a 24 horas.
6- Desprezar o lquido sobrenadante cuidadosamente, homogeneizar o
sedimento e coletar uma poro do mesmo.
7- Colocar parte do sedimento numa lmina, corar com Lugol e cobrir com
lamnula (facultativo). Examinar no mnimo duas lminas de cada amostra.

Mtodo de MIFC ou de Blagg (sedimentao por centrifugao).

1- Coletar as fezes recm emitidas em lquido conservador de MIF.
2- Homogeneizar bem.
3- Coar a suspenso em gaze cirrgica dobrada em quatro num copo
descartvel.
4- Transferir 1 a 2 ml do filtrado para um tubo cnico com capacidade para
15ml.
5- Acrescentar 4 a 5 ml de ter sulfrico e agitar vigorosamente
(desengordura a amostra fecal).
6- Centrifugar por um minuto a 1.500 rpm.
7- Com auxlio de um basto, descolar a camada de detritos gordurosos da
parede do tubo.
8- Inverter o tubo para desprezar o lquido e limpar as paredes com um basto
contendo algodo na extremidade.
9- Acrescentar ao sedimento gotas de Lugol.
10- Coletar 2 a 3 gotas do sedimento, cobrir com lamnula e examinar com as
objetivas 10x e/ou 40x.
Mtodo de Ritchie modificado ou formol-acetato de etila.
1- 5 a 15g de fezes (uma colher de ch) de fezes recentes so homogeneizados
em 10 a 15 ml de formol a 10%, em um frasco Borrel, com auxlio de um basto
ou palito.
2- Coe a mistura com gaze umedecida e dobrada em quatro e a transfira para
um tubo cnico de centrfuga. (No coar amostra que contenha grande
quantidade de muco. Neste caso, centrifugar a mistura a 1500 rpm por 10
minutos, desprezar o sobrenadante e examinar o sedimento).
3- A suspenso centrifugada, vrias vezes, a 500g (1500 rpm.) 1 minuto, at
se obter um sobrenadante claro.
4- O sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspenso em 4 ml de
acetato de etila. Arrolhe o tubo e agite o tubo vigorosamente por 30 segundos.
Retire cuidadosamente a rolha do tubo, pois o vapor formado pode provocar um
jato de detritos fecais. Esta etapa remove as gorduras das fezes.
5-Centrifugar o tubo novamente. H formao de 4 camadas: a de acetato de
etila (a mais superficial); detritos fecais; formol e o sedimento contendo os
parasitas (no fundo do tubo).

6- Depois que a camada de detritos for retirada com um basto, todo

sobrenadante descartado, virando o tubo de centrfuga com movimento
suave, mas de uma s vez.
7- O sedimento homogeneizado, agitando o tubo entre os dedos. Uma gota de
sedimento fecal misturada com uma gota de Lugol e levada para exame ao
microscpio.
importante ressaltar que o acetato substitui o ter. mais seguro por no
ser inflamvel, porm, ele pode dissolver tubos de plstico. O acetato em
excesso aparece como bolhas quando se faz a lmina.
Coprotest
um processo simplificado e seguro de sedimentao por centrifugao.
O paciente adquire na farmcia o Coprotest que j vem com o conservador
(formol a 10%), coloca as fezes no coletor, fecha o frasco e agita por 2
minutos para homogeneizar e as envia para o laboratrio.
A amostra de fezes homogeneizada recolhida em um tubo de centrfuga,
acrescenta-se 3 ml de acetato de etila ou ter, agita-se e a mistura
centrifugada por 3 minutos. Desprezando-se os detritos e o lquido
sobrenadante e acrescenta-se uma gota de Lugol ao sedimento. Duas ou trs
gotas do sedimento so recolhidas numa lmina, cobertas com lamnula e
examinadas ao microscpio.
Mtodo de Faust (centrfugo-flutuao em sulfato de zinco)
1- Diluir 10g de fezes em 20 ml de gua
2- Homogeneizar bem.
3- Filtrar em gaze dobrada em quatro, num copo plstico, e transferir para um
tubo de Wasserman.
4- Centrifugar por um minuto a 2.500 rpm.
5- Desprezar o lquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em gua
6- Repetir as operaes 4 e 5 at que o sobrenadante fique claro.
7- Desprezar o sobrenadante claro e ressuspender o sedimento com uma
soluo de sulfato de zinco a 33%, densidade de 1,18 g/ml.
8- Centrifugar novamente por um minuto a 2.500 rpm.

9- Os cistos e os ovos leves presentes estaro na pelcula superficial; a mesma

recolhida com ala de platina, colocada numa lmina junto com uma gota de
Lugol e coberta com lamnula.
O material deve ser examinado imediatamente. O sulfato de zinco pode
deformar os cistos.

Mtodo de Willis
1- Colocar 10g de fezes num frasco de Borrel ou no prprio recipiente onde
esto as fezes
2- Homogeneza-las com um pouco de soluo saturada de sal (NaCl) ou de
acar
3- Completar o volume at a borda do frasco.
4- Colocar na boca do frasco uma lmina, que dever estar em contato com o
lquido.
5- Deixar em repouso por 5 minutos.
6- Findo esse tempo, retirar rapidamente a lmina, deixando a parte molhada
voltada para cima.
7- Cobrir com lamnula, corar com Lugol e examinar com objetiva 10x.

Mtodo de Baermann-Moraes
1- Colocar 8 a 10g de fezes numa gaze dobrada em quatro sobre um funil de
vidro, contendo um tubo de borracha conectado extremidade inferior de sua
haste.
2- Obliterar o tubo de borracha com um pina de Hoffman e adicionar, ao funil,
gua aquecida (45C) em quantidade suficiente para entrar em contacto com as
fezes.
3- Deixar uma hora em repouso.
4-Colher 5 a 7 ml da gua em um tubo de centrfuga, abrindo-se a pina.
5- Centrifugar um minuto a 1.000 rpm.
6- Coletar o sedimento, corar com Lugol e examinar ao microscpio com
objetiva 40x.

Mtodo de Rugai
1- Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolv-lo em ter
gazes, fazendo uma pequena trouxa.
2- Colocar o material assim preparado, com a abertura voltada para baixo, num
clice de sedimentao, contendo gua aquecida (45C), em quantidade
suficiente para entrar em contato com as fezes.
3- Deixar em repouso por uma hora
4- Coletar o sedimento no fundo do clice, com ajuda de uma pipeta.
5-Corar as larvas com Lugol e observ-las com o maior aumento para identificlas.
Fezes diarricas (as larvas morrem muito rapidamente) ou coletadas em
conservador no se prestam para esses mtodos.

Mtodo de Kato-Katz (Mtodo de Kato modificado por Katz e cols.).

1- Preparar uma soluo de verde de malaquita de acordo com a seguinte frmula:
Glicerina
100 ml
gua destilada
100 ml
Verde malaquita a 3%
1 ml

Essa soluo conserva as fezes e clarifica as formas parasitrias.

2- Cortar papel celofane semipermevel em pedaos de 24 mm por 30 mm e
deix-los mergulhados na soluo de verde-malaquita por pelo menos 24 horas.
3- Colocar, sobre um papel, uma pequena quantidade da amostra fecal.
4- Comprimir as fezes com um pedao de tela metlica (marca Ibras, n 120,
fios e trama: 0,09mm) ou similar de nilon.
5- Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-la,
com o auxlio de um palito, para o orifcio (6 mm de dimetro) de um carto
retangular de plstico, colocado sobre uma lmina de vidro.
6-Aps encher completamente o orifcio, retirar o carto cuidadosamente,
deixando as fezes (42 mg) sobre a lmina.
7- Cobrir as fezes com o papel celofane. Inverter a lmina sobre uma folha de
papel e comprimi-la.

8- Aps uma hora, examinar ao microscpio contando os ovos presentes na

preparao.
9- O nmero de ovos encontrados, na preparao fecal, multiplicado por 23,
corresponder ao n de ovos por grama de fezes.
Na rotina laboratorial usa-se, com maior freqncia, o mtodo qualitativo.
Assim, no h necessidade de se utilizar o carto retangular.
Este mtodo indicado para pesquisa de ovos de S. mansoni, A. lumbricoides,
T. trichiura e Ancylostomidae. Cistos de protozorios no so visualizados
nessa preparao.
No possvel a execuo deste mtodo em fezes diarricas.

Outros procedimentos de diagnstico .

Mtodo de Henriksen e Pohlenz (pesquisa de oocistos)
Nos ltimos anos, parasitas intestinais como: Cryptosporidium parvum,
Isospora belli, Cyclospora cayetanensis e os microspordeos vm causando
doenas diarricas graves em pacientes imunodeprimidos. Como esses parasitas
podem ser de difcil identificao pelos mtodos usuais de rotina, impe-se
utilizao do mtodo de colorao cido-resistente para a sua pesquisa.
Para execuo desse mtodo, as fezes (frescas, preservadas em formol a 10%
ou em SAF) devero ser previamente concentradas pelo mtodo de MIFC ou de
acetato de etila, aumentando-se o tempo de centrifugao para 10 minutos.
Fezes preservadas em PVA no apresentam bons resultados. Mtodos de
sedimentao pelo formol-ter ou centrfugo-flutuao com soluo saturada
de sacarose ou soluo de Sheather tambm so utilizados para concentrar os
oocistos.
1- Preparar um esfregao delgado com parte do sedimento obtido aps
centrifugao.
2- Deixar secar a temperatura ambiente.
3- Fixar com lcool metlico por 5 minutos.
4- Deixar secar a temperatura ambiente.
5- Corar com o corante de Kinyoun (a frio), durante uma hora.

6- Lavar em gua corrente.

7- Diferenciar com soluo aquosa de cido sulfrico a 2% (30 segundos a um
minuto) at que no saia mais corante da lmina.
8- Lavar em gua corrente.
9- Corar o fundo com soluo de verde malaquita a 5%, por 8 minutos.
10- Lavar em gua corrente e secar.
11- Examinar com objetiva de imerso.
Corante de Kinyon (soluo salina de fucsina fenicada)
Soluo A
Fucsina bsica
lcool etlico a 95% (v/v)

1,5g

Soluo B
Fenol (fundido a 44C)
gua destilada deionizada q.s.p.
Soluo corante
Soluo A
Soluo B

100ml

5g

100ml

10ml
90ml

Filtrar a soluo e armazenar a temperatura ambiente. Estvel por um ano.

Pesquisa de trofozotos de T, vaginalis

Trichomonas vaginalis encontra-se entre os mais prevalentes dos protozorios,

propagando-se pelo contato sexual. Geralmente, o diagnstico da vaginite por

T. vaginalis feito identificando o parasito na secreo vaginal. Os trofozotos
apresentam-se com movimentos de contoro com auxlio dos flagelos muito
ativos. So vistos em preparaes, fresco, de secrees vaginais em cerca de
60% das mulheres infectadas.
A tcnica empregada consiste na coleta de um pouco de secreo vaginal,
recolhida preferivelmente com pipeta grossa e aps colocao do especulo. A
secreo misturada com soro fisiolgico em uma lmina, cobrir com lamnula e
examinar ao microscpio.
Nos homens, uma preparao a fresco do material obtido por raspado com uma
ala de platina da uretra anterior revela o microorganismo em cerca de 60%

dos casos. A pesquisa tambm feita no sedimento urinrio. A massagem

prosttica antes da coleta da urina para a cultura da Trichomonas a
abordagem diagnstica mais sensvel.
Se os parasitos forem pouco abundantes e o exame a fresco negativo, deve-se
semear o material no meio de cultura. Como os flagelados sobrevivem pelo
menos 24 h na secreo vaginal diluda com soluo de Ringer, no necessrio
fazer a semeadura imediatamente. Inocular no tubo de cultura o sedimento
obtido por centrifugao. Aconselha-se suspender a aplicao local de
quaisquer desinfetantes ou de anticoncepcionais de natureza qumica alguns
dias antes da coleta. A cultura o mtodo mais sensvel de diagnstico e
existem, atualmente, kits comerciais.

Meio de Kupferberg

Empregado na cultura e isolamento de Trichomonas vaginalis.

Tripticase (BBL)
Cistena (cloridrato)
Maltose
gar
gua destilada

20,0 g
1,5 g
1,0 g
1,0 g
q.s.p. 950,0 ml.

1- Aquecer a mistura em banho-maria, at a dissoluo do gar, acertar o pH a

6.
2- Filtrar ( quente) em papel de filtro de porosidade adequada (Reeve-Angel
n 845, p. ex.) e juntar 0,6 ml de uma soluo de azul de metileno a 0,5% para
servir de indicador.
3- Depois de resfriar ligeiramente (em torno de 45 C), reajustar o volume
para 50 ml, com gua destilada, em pH 6.
4- Distribuir o meio em tubos de ensaio (colocando 9,5 ml em cada um) e
esteriliz-los em autoclave.
5- Depois de resfriarem naturalmente, adicionar a cada tubo 0,5 de soro
humano estril.

Pesquisa de Leishmania spp.

Nas Leishmanioses Tegumentares devem ser pesquisados os parasitos

mediante bipsia ou raspagem das leses cutneas ulceradas, especialmente na
borda da lcera, junto base, aps a completa limpeza da leso. Melhor ainda e
mais cmoda a puno da borda inflamada, bem como das leses no
ulceradas, mediante aspirao com agulha fina. Tambm se pode injetar um
pouco de soro fisiolgico no tecido lesado e aspir-lo, em seguida, para
preparar uma lmina fixada e corada.
As lceras novas so ricas de parasitos que, depois, vo se tornando raros. Os
amastigotas sero vistos no interior dos macrfagos ou espalhados na lmina,
quando estes se rompem.
Com o material de bipsia faz-se impresso ou imprint (por aposio) sobre
lminas de microscopia e cor-la com Giemsa, para exame ao microscpio ou se
utiliza para a preparao de cortes histolgicos.
Na Leishmaniose visceral o encontro do parasito constitui requisito bsico para
o diagnstico. A sorologia til para uma triagem de casos, quando for difcil
demonstrar a presena de leishmnias, geralmente, no incio da infeco ou em
formas benignas e autolimitantes.
O material para exame pode ser coletado de vrios rgos como:
1- Puno das vsceras. Os parasitos podem ser encontrados no material
aspirado do bao (98% dos casos do resultados positivos), da medula ssea
(54 a 86% de positivos) ou de linfonodos aumentados de volume (64% dos
casos).
Alguns autores recomendam a puno do bao como mtodo de escolha, porm
a maioria prefere a puno do esterno (em adultos) ou da crista ilaca (em
crianas), para evitar os riscos de ruptura do bao e hemorragia interna.
Com o material aspirado, preparar esfregao em camada delgada na lmina de
vidro, fixar e corar com Giemsa ou por mtodo equivalente.
2- Sangue. Elas podem ser encontradas, eventualmente, no interior de
moncitos, devendo a pesquisa ser feita no creme leucocitrio, obtido por
centrifugao de amostras de sangue em tubo capilar. Fixar e corar com
Giemsa.
3- Pele. Esta pesquisa no faz parte da rotina diagnstica, devido escassez
de parasitos na pele, exceto nos casos de leishmaniose drmica ps calazar
(difusa). Com o material obtido faz-se um esfregao ou, no caso de bipsia,

uma impresso sobre lmina de microscopia. O material fixado com lcool

metlico e corado com Giemsa.
Cultura em meio NNN.
A escassez de parasitos sempre dificulta a sua busca ao microscpio assim, o
material suspeito como raspado de leso, sangue ou aspirado de puno (nos
casos de Leishmaniose Tegumentar e Visceral) deve ser semeado no meio NNN.
Os meios de cultura (incubados a 24 - 26C) devero ser examinados 5, 7, ou
10 dias depois; mas, caso sigam negativos, repicar para novo meio aps 15 dias.
A inoculao em animal de laboratrio (hamster) bastante sensvel, porm no
prtica porque requer meses para positivar.

Meio de NNN (Novy, McNeal e Nicolle) para leishmnias.

um meio difsico, compreendendo uma base nutritiva slida e inclinada de
gar-sangue de coelho e uma poro lquida, resultante da gua de condensao
que se acumula durante o resfriamento do meio, onde crescem os flagelados.
Em um balo de vidro, misturar:
Cloreto de sdio
6g
Agar
14 g
gua destilada
900 ml.
Aquecer at dissolver o gar. Distribuir a mistura em frascos de cultura e
esteriliz-los. Assim podem ser mantidos temperatura ambiente at a ocasio
de usar, quando cada recipiente ser colocado em banho-maria para que a
gelose se funda. Deixar que a temperatura do meio de cultura atinja cerca de
50C e adicionar sangue de coelho desfibrinado na proporo de 15%, agitando
suavemente para assegurar mistura completa. Deixar solidificar, mantendo os
tubos inclinados. Ao lquido de condensao deve-se adicionar antibitico
(gentamicina p.ex.) para prevenir contaminao bacteriana.

Meio LIT
Este meio, que serve para tripanossomos e leishmnias, designado pelas
iniciais de Liver Infusion Tryptose. Quando usado para cultura de leishmnias,
ele deve constituir a fase lquida do meio, sobre uma base slida do meio NNN.
Em um balo de vidro de 1.000 ml, colocar
NaCl
4,0 g
KCl
0,4 g
Na2 PO4
8,0 g
Glicose
2,0 g
Triptose
5,0 g
Infuso de fgado
5,0 g
gua destilada
800,0 ml.
A infuso de fgado (Liver infusion da Difco ou Oxford) dissolvida em banhomaria, durante 10 minutos em ebulio. Filtrar em papel de filtro. Acertar o pH
para 7,2 com soluo de HCl 2N. Ao filtrado, juntar 100 ml de soro bovino e
colocar em banho-maria a 68C durante uma hora. Deixar esfriar e adicionar
20 ml de hemoglobina de boi.
Para conserv-lo, conveniente distribuir o meio em frascos de Erlenmeyer de
125 ml (30 ml por frasco) e guard-lo em freezer. Antes de us-lo, descongelar
temperatura ambiente e fazer o teste de esterilidade em estufa a 28C.

Mtodo de Graham ou da fita gomada (swab anal)

Este mtodo utilizado para pesquisa de ovos de Taenia solium, T. saginata e
de Enterobius vermicularis. Esta tcnica deve ser feita pela manh, antes que o
paciente defeque ou tome banho, e repetida, em dias sucessivos, caso d
negativo.
1- Fixar, em uma lmina, uma tira de 5 a 6 cm de fita durex transparente,
colocando, nas duas extremidades, tiras de papel de aproximadamente 4cm. (as
quais serviro de suporte para segurar e para identificao do material).
2- Destacar a fita da lmina e colocar sobre o fundo de um tubo de ensaio ou
ao redor de um abaixador de lngua com o lado aderente voltado para fora.
3- Afastar as ndegas e aplicar a superfcie aderente da fita na regio
perianal, fazendo movimento de vaivm para tocar o mximo possvel na mucosa
perianal.

4- Remover a fita e distend-la sobre uma lmina de microscopia, com o lado

aderente voltado para baixo. Pressionar firmemente para evitar que fiquem
bolhas de ar.
4- Examinar ao microscpio com objetivas 10x e 40x.

Colorao de trofozotos intestinais pela hematoxilina frrica (Tcnica

modificada por Corra e cols. 1994)
Reagentes
1- Lquido de Schaudinn (fixador)
Soluo saturada de bicloreto de mercrio
lcool a 95%

200 ml
100 ml

No momento de uso adicionar 2,5 ml de cido actico para cada 50 ml.

2- Almen de ferro a 2,5%
Triturar os cristais de almen de ferro em Graal e diluir aos poucos com
gua destilada. Completar o volume.
3- Hematoxilina a 0,5%
Hematoxilina
lcool a 95%
gua destilada

0,5 g
10 ml
90 ml

Diluir a hematoxilina no lcool e acrescentar a gua destilada. Aps 72

horas de maturao, o tempo de exposio do material a ser corado, dever
ser de trs minutos.
4- lcool-salicilato
lcool absoluto p.a.
Salicilato de metila

100 ml
100 ml

Tcnica
1) Filtrar as fezes, conservadas em Schaudinn ou SAF, em gaze dobrada
quatro vezes.
2) Transferir cerca de 2 ml para um tubo e centrifugar por um minuto a
1.500 rpm.
3) Desprezar o sobrenadante, acrescentar soluo salina a 0,85%,
homogeneizar e centrifugar novamente.
4) Repetir a operao at obter um sobrenadante lmpido
5) Desprezar o sobrenadante e acrescentar, ao sedimento, duas gotas de
soro humano inativado.
6) Misturar bem e fazer esfregaos finos sobre lamnulas. A lamnula deve
ser presa a um suporte de borracha pequeno (pode ser utilizada a
borracha que serve de rolha em vidro de penicilina) por meio de um
entalhe, para facilitar o manuseio e a identificao do material. Desta
forma, possvel a colorao de vrias amostras ao mesmo tempo.
7) Sem deixar secar o esfregao, colocar a lamnula com o esfregao
voltado para baixo, em uma placa de Petri contendo o fixador de
Schaudinn com 5% de cido actico por 10 minutos.
8) Passar a lamnula com o esfregao voltado para cima para as placas de
Petri subseqentes, contendo os seguintes reagentes:
a) lcool 70% (para retirar o excesso de fixador) 2 minutos
b) lcool 70% iodado, isto , contento alguma gotas de tintura de iodo
at atingir a cor de vinho do porto (para reagir com o mercrio)
5
minutos
c) lcool 70% (para precipitar o mercrio) 2 minutos
d) lavar em gua destilada (para retirar o excesso de mercrio) 1 minuto
e) almen de ferro 2,5% (mordente que fixa o corante) 10 minutos
f) lavar em gua destilada (para retirar o excesso de ferro)
1 minuto
g) hematoxilina 0,5% (corante) 5 minutos
h) lavar em gua destilada (para retirar o excesso do corante) 5
minutos
i) almen de ferro 2,5% (diferenciador). Obs: O esfregao deve
permanecer nessa soluo at atingir uma colorao lils clara azulada.
j) lavar em gua destilada
1 minuto
k) lcool 70% (desidratar)
2 minutos
l) lcool 80% (desidratar)
2 minutos

m) lcool 95% (desidratar)

2 minutos
n) lcool absoluto (desidratar) 2 minutos
o) lcool-salicilato (para preparar o material para diafanizar)
minutos
p) salicilato de metila
2 minutos

9) Montar em lmina de vidro com blsamo-do-canad ou em resina

sinttica com o esfregao voltado para baixo.
10) Deixar secar e examinar com objetiva de imerso.

Referncias bibliogrficas
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laboratrio para o diagnstico das parasitoses humanas. 2 ed. So
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