Identificao de protenas

atravs de espectrometria de
massa

Proteomica
Durante o curso vimos que possvel realizar medidas de presena e
abundancia de molculas de mRNA e deste modo realizar inferncias
sobre a presena de protenas que so os verdadeiros efetores da maioria
dos processos celulares.
Entretanto existem mecanismos ps-transcrionais que podem afetar o
nvel de protenas e que no so levados em conta quando medimos o
nvel de mRNAs
Os dados de mRNA do indicao de presena de uma protena, mas no
do nenhuma informao sobre a localizao da protena dentro da celula.

Proteomica
Existem metodologias utilizando espectrometria de massa que permitem
a identificao de seqncias proticas a partir da medida de sua massa
A conjuno desta metodologia com tcnicas de separao de protenas
permitem o estudo do contedo protico de um organismo, constituindo
assim a chamada proteomica
Tcnicas de fracionamento celular permitem que diferentes pores da
clula sejam separadas e que seu contedo seja determinado

Proteomica
A separao de protenas pode ser
realizada atravs de mtodos
eletroforeticos ou cromatogrficos
Tratamento com proteases permitem
com que peptdeos de pequeno
tamanho sejam formados
Analises com espectrometria de
massa permitem com que estes
peptdeos (e no a protena inteira)
sejam identificados

Eletroforese em duas dimenses

Protenas podem ser separadas pelo seu ponto isoeltrico atravs de um

procedimento inicial de isoeletrofocalizao e depois separados em uma segunda
dimenso pelo seu peso molecular atravs de SDS-PAGE

Eletroforese em duas dimenses

Exemplo de separao em eletroforese em duas dimenses.

Cada ponto representa uma diferente protena que possui PI e
peso molecular determinados

Analise de gis 2D

Programas de reconhecimento de imagem detectam os pontos presente

no gel e realizam analises densitomtricas, permitindo a comparao
entre diferentes amostras

Espectrometria de massa
Molculas dos peptdeos
so ionizadas utilizando
diferentes mtodos
Molculas ionizadas so
aceleradas e diferentes
mtodos
espectrometricos podem
ser utilizados para
medida da sua massa

Espectrometria de massa

Cada peptdeo gerar diversos picos devido a presena de istopos na

molcula. De modo geral, considera-se a massa monoisotopica como medida
da massa da molcula para analises posteriores

Espectrometria de massa

No entanto para molculas muito grandes muito difcil detectar molculas com a
massa isotopica e por isso a massa mdia passa a ser considerada

Analise de dados de MS
100
LASSLSVVVSLLLIPEDVCEK
80
IIGGNEVTPHSR
PYMVLLSLDR
60
TICAGALIAK
40
DWVLTAAHCNLNKR
20
ITTTYEEPTK
0
QIMLVK
EFPYPCYDPATR
EGDLKLL

100
80
%TIC

%TIC

MRNSYRFLASSL
SVVVSLLLIPED
VCEKIIGGNEVT
PHSRPYMVLLSL
DRKTICAGALIA
KDWVLTAAHCNL
NKRSQVILGAHS
ITYEEPTKQIML
VKKEFPYPCYDP
ATREGDLKLLQL

60
40
20

m/z

0
m/z

A partir dos dados experimentais das massas detectadas para os

peptdeos possvel realizar analises comparando o espectro obtido com
os espectros tericos de protenas depositadas em bancos de dados
Apesar deste tipo de analise se til na identificao de protenas ainda
podem existir casos muito ambiguos

Espectroscopia MS/MS

A espectrometria MS/MS permite a aquisio de maiores informaes sobre o

peptdeo pois inclui uma etapa adicional de coliso do fragmento que permite a
deteco de novos fragmentos formados a partir deste primeiro

Espectroscopia MS/MS

a fragmentao dos peptdeos tende a ocorrer na ligao peptdica

fazendo que se formem ons das series b e y.

Espectroscopia MS/MS

Realiza seleo de
fragmento de tamanho
desejado

Cmara de coliso

Deteco de fragmento
formados

Espectroscopia MS/MS
Espectro inicial de
massa passa a ter
espectros associados
ao resultado da
fragmentao do on
detectado

Espectro de fragmentao permite seqenciamento do peptdeo

Seqncia obtida muito curta para atribuio de funo- necessidade de
comparao com bases de protenas

Shotgun proteomics

Abordagem que realiza uma tripsinizao de todas as protenas de um

extrato protico e realiza posterior separao dos peptdeos gerados
atravs de tcnicas cromatogrficas
Tcnica muito mais simples que separao por eletroforese 2D, mas
fornece menos informaes sobre a protena

Busca em banco de dados

Uma analise em larga escala do proteoma de um organismo pode gerar
entre centenas e milhares de espectros de massa.
Deste modo so necessrias ferramentas que permitam a interpretao e
integrao destes dados
Programas do espectrmetro de massa j analisam o espectro e fornecem
uma lista de valores que correspondem a massa apurada para cada on
Programas adicionais iro utilizar estas listas para procurar padres
semelhantes em bancos de espectros tericos formados a partir de
bancos de dados de protenas

MASCOT
Programa de busca em bases de dados a partir de um
conjunto de espectros de massa(verso web somente em
bases de dados predefinidas, verso local (Paga) tem
possibilidade de utilizar bases prprias)
Fornece escores de modo que possvel realizar uma
avaliao da significncia do resultado
Permite a integrao de dados em casos de buscas em
experimento de shotgun proteomics

MASCOT
Banco de dados a ser
procurado

Modificaes existentes
nos aminocidos

Taxa de tolerncia de erro

MASCOT

Grfico de escore indica a probabilidade de

que as protenas identificadas no so um
evento randmico na seo hachurada

MASCOT

Resultado apresenta todos os espectros que podem ser associados a um

peptdeo da sequencia descrita

MASCOT

Seqncias em preto so aquelas que tem um rank maior que 1. Isto

existe um peptdeo diferente no banco de dados que possui um escore
melhor em relao a esse espectro do que o mostrado aqui. Deste modo,
improvvel que este predio esteja correta