Parte III:

CULTURA DE CLULAS
1.CULTURA DE CLULAS
a)Objectivo

_0

b)Tipo de Culturas Celulares

SC

c)Passagem das Clulas

IC

2.COLECO DE CLULAS

C
LN

a)ECACC

c)NIH
3.MEIOS DE CULTURA

4.Como escolher um meio

VI
RO
LG

IA

b)ATCC

II

5.Constituintes bsicos do meio de cultura

6.DESCONGELAO: COMO INICIAR UMA CULTURA
7.TRIPSINIZAO
8.CONTAGEM DE CLULAS
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

9
_0
SC
Q
A
IC
C
LN
IA
O
VI
RO
LG
C
A
M
II

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

CULTURA DE CLULAS

SC

_0

Objectivo:
Isolamento viral a partir de material biolgico adequado
Propagao in vitro de vrus j isolados

C
LN

IC

Condies:

II

VI
RO
LG

IA

Esterilidade
Frascos de cultura em plstico ou vidro tratados
Meios de cultura*
Estufa de CO2
Microscpio invertido
Hote de fluxo laminar vertical
*Meios de cultura: satisfao das exigncias nutricionais das
clulas
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

TIPOS DE CULTURAS CELULARES

SC

_0

Modo de propagao:
1.
Suspenso
2.
Monocamada

3.

C
LN
IA
O

2.

Primrias
Secundrias
Contnuas

2.
3.

Epiteliais
Fibroblsticas
Outras (clulas sanguneas, nervosas, musculares)

II

1.

Morfologia das clulas:

VI
RO
LG

1.

IC

Natureza das clulas:

TIPOS DE CULTURAS CELULARES

_0

Modo de propagao:

SC

Suspenso: as clulas crescem sem estarem

aderentes entre si ou ao suporte slido (paredes
interiores do frasco de cultura ou outro recipiente onde
estejam a ser cultivadas)

Monocamada: crescem aderindo ao suporte slido e

entre si. Estas clulas necessitam, para serem
transferidas para outro suporte slido, de serem
dissociadas entre si e do suporte slido onde se
fixaram (mtodos enzimticos e/fsicos).

II

2.

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

1.

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

TIPOS DE CULTURAS CELULARES

Natureza das clulas

C
LN

IC

SC

_0

Clulas primrias:
resultam directamente de um rgo ou tecido animal;
tm uma vida limitada.

VI
RO
LG

IA

Clulas secundrias:
Derivam de subculturas das clulas primrias;
Podem atingir as 50 passagens ou subculturas.

II

Clulas contnuas:
Derivam de tecidos cancerosos ou de clulas primrias
e secundrias que sofreram transformao;
Tm a capacidade de se multiplicarem ilimitadamente,
sem inibio de contacto e com grande rapidez.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

TIPOS DE CULTURAS CELULARES

SC

_0

Modo de propagao:
1.
Suspenso
2.
Monocamada

3.

C
LN
IA
O

2.

Primrias
Secundrias
Contnuas

2.
3.

Epiteliais
Fibroblsticas
Outras (clulas sanguneas, nervosas, musculares)

II

1.

Morfologia das clulas:

VI
RO
LG

1.

IC

Natureza das clulas:

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

COLECO DE CLULAS

SC

_0

Ser possvel introduzir, propagar, consolidar e disseminar erros durante a

manipulao numa linha celular?
Sim, repare-se que, muitos contaminantes so invisveis ao olho nu (micoplasma ou
vrus que no induzem efeito citoptico), ou seja existem contaminaes inaparentes!

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

Sistematizam as tcnicas de cultura

Crioconservao em Azoto Lquido
Tcnicos permanentes e especializados
Controlo de Qualidade para contaminaes microbianas, nomeadamente o
Micoplasma
Garantem a identidade e a pureza da linha celular
Recomendaes

II

caractersticas a linha celular

como manter a linha celular
como lidar com dificuldades
qual o meio de cultura apropriado
qual o material necessrio
quais as condies de incubao, etc.
formulrios de encomenda
quem pode depositar
como pode depositar
etc.

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

AS MEGASTORES
European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC),
HLS Centre for Applied Microbiology and Research,
Porton Down, Salisbury SP4 OJG, UK.
Telephone (44) 980610391; fax (44) 980 611315.

SC

_0

Description of holdings: 1200 cell lines and hybridomas, 250 HLA-defined cell lines,
and approximately 7000 human genetic and chromosome abnormality cell lines (2000
stored as untransformed lymphocytes).

C
LN

IC

American Type Culture Collection (A TCC),

12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA.
Telephone (301) 991 2600; fax (301) 231 5826.

National Institute of Health (NIH)

About us.

VI
RO
LG

IA

The A TCC has a large and comprehensive stock of material built up over
a considerable period of time. A certain number of deposits carry 'certified
cell line' status and extensive testing programmes have been carried out
on this material. The whole of the collection comprises over 3200 cell lines
and hybridomas from approximately 75 different species.

II

The NIH AIDS Reagent Program evolved from a small bank of HIV research materials into a
unique worldwide resource of state-of-the art reagents for HIV and other pathogens.
Many of these reagents are not commercially available.
The first Catalog, published in 1988, listed 62 reagents from 20 contributors. Reagents are
shipped to scientists all over the world.
The value of the NIH AIDS Reagent Program is evident from the diversity of registered users;
as of June 2003, scientists from the US and 65 foreign countries registered to receive reagents.
During the past year over 14,000 reagents were provided.
US scientists obtaining AIDS reagents from the program work primarily in academ-ic settings.
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

COLECO DE CLULAS DE CULTURA CELULAR

II

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

SC

_0

EPITELIAL: 293T

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

_0

II

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

SC

EPITELIAL/FIBROBLSTICA: GHOST (derivadas

das Hos=osteosarcoma humano)

COLECO DE CLULAS DE CULTURA CELULAR

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

COLECO DE CLULAS DE CULTURA CELULAR

II

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

SC

_0

FIBROBLSTICA:Vero; Fibroblastos de Salmo, MRC-5

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

COLECO DE CLULAS DE CULTURA CELULAR

II

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

SC

_0

LINFOCTICA:Linfcitos humanos mortos

Quirina Santos-Costa
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COLECO DE CLULAS DE CULTURA CELULAR

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

SC

_0

SUSPENSO: J774

II

LINFOBLASTIDE PROMONOCTICA: U937

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

MEIOS DE CULTURA

C
LN

IC

SC

_0

De um modo geral as clulas requerem um ambiente estril,

componentes nutricionais, pH e temperatura estveis.
Hoje em dia j existem vrias formulaes de meios de cultura
disponveis, de acordo com o tipo de cultura com que se est a trabalhar.

II

VI
RO
LG

IA

Exemplos:
BME (basal medium Eagles)
EMEM (minimum essencial medium with Earls salts)
DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium, meio sinttico
complexo)
RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial Institute, meio
sinttico complexo)
CMRL (basal mdium designed for serum-free formulations)
D-22 (basal medium for insect cell culture)

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

COMO ESCOLHER UM MEIO?

C
LN

IC

SC

_0

a. Tipo de clulas
i.
Aderentes (Vero)
ii.
Suspenso (Ly Humanos)
iii.
Tipo de densidade celular
(baixa, para clonagens: 293T, meio com HEPES)
(elevada: bio-reactores com densidades na ordem do s108clulas/mL)

VI
RO
LG

IA

b. Sistemas estticos
So os sistemas clssicos de cultura em frasco deitado ou na vertical, em
laboratrio de baixa ou mdia produtividade.

II

c. Sistemas dinmicos ou perfuso contnua (sistema aberto)

O meio ter que ter partida todos os nutrientes necessrios para a durao
da cultura, nomeadamente em termos de fontes de energia, mas tendo em
conta que a degradao destes aumenta os nveis de toxicidade. Portanto
podem ser introduzidos controladamente no meio.

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

CONSTITUINTES BSICOS DO MEIO?

_0

SC

Sais inorgnicos (oligoelementos)

Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, HCO3Mantm o potencial de membrana
So co-factores nas reaces ezimticas intracelulares
Factores de adeso (tripsinizao)

b.

a. gua

C
LN

IC

c. sistemas tampo
O meio de cultura necessita de sistemas tampo para compensar a evoluo do CO2, libertado pelas clulas e da
produo de cido lctico, resultante do metabolismo da glucose.

VI
RO
LG

IA

Explos (no txicos, com pKa=6,1):

Bicarbonato
Fosfato
A conjugao da concentrao de bicarbonato e a tenso de CO2 promove a osmolaridade e pH correctos.

II

d. hidratos de carbono
Glucose
Maltose
Sacarose
Frutose
Galactose
A glucose o hidrato de carbono mais usado como fonte de energia do meio.
e. Indicadores de pH
Vermelho de fenol (2mg/L)
Qualquer que seja o meio requer a presena de um indicador de pH, que nos chamar mais facilmente ateno
para as alteraes que possam ocorrer devidas ao metabolismo das clulas.

Quirina Santos-Costa
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CONSTITUINTES BSICOS DO MEIO?

h. lpidos (cidos gordos)

Colesterol
cido linolnico e linoleico
cido palmtico, etc.
um dos componentes fornecido pelo soro.

II

_0
SC
Q

IC

SUPLEMENTOS
i.
Hormonas
ii.
Soro
iii.
Protenas
e
pptidos para meios sem
soro (alfa-globulina,
fibronectina, albumina e
transferrina)
iv.
Antibiticos e
Antifngicos

Gentamicina (50ug/
mL)

Penicilina (100UI)/
mL / Estreptomicina (50ug/
mL)

Anfotericina B
(fungisona)
Mantm a esterilidade do meio, mas numa escala
industrial esto ausentes.
No podem ser citotxicos
Tm que ser de largo espectro, e induzir o mnimo de
resistncias
Ateno relao custo/benefcio.

IA

Aminocidos essenciais
Arginina
Cistena
Prolina
L-Glutamina, etc.

VI
RO
LG

g.

i.

C
LN

vitaminas
cido para-amino benzico
Biotina
cido flico
cido nicotnico
Riboflavina
Tiamina
Inositol
Vit. B12
Vit. E
Vit. A
So intervenientes em numerosos processos metablicos.

f.

Quirina Santos-Costa
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MEIOS COM SORO, PORQU?

II

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

SC

_0

Em 1950 o primeiro meio com soro teve um sucesso imenso, porque este aditivo fornecia elementos
essenciais, mas desconhecidos, ao meio, e de uma forma emprica:
Factores de Crescimento (estimulam e aceleram o crescimento e diferenciao celular;
previnem os processos de Apoptose)
o EGF, IL-6, PDGF, Insulina
Albumina
o liga-se aos ies txicos, funcionando como agente desintoxicante;
o um carrier de Vit. lipossolveis e esterides
o um factores de proteco contra os choques fsicos das pipetagens, etc.
Factores de Adeso celular
o Fibronectina
o Laminina
o Fetuna
Transportador do io Fe+++. O complexo Transf/Fe+++ fundamental nos receptores
celulares.
o Transferrina
Antiproteases (previne a degradao proteoltica das clulas e do prprio meio)
o Alfa1-antitripsina (tripsinizao)
Alfa2-macroglobulina
TIPOS DE SORO
FCS (soro bovino fetal)
NCS (soro de recm-nascido de vitela), com altos teores de biotina.
Vrias espcies animais e de animais de diferentes idades.
Os soros de animais adultos no so to eficientes, porque no so to ricos.
So obtidos no matadouro, por puno cardaca assptica, ou por animais dadores.
Quirina Santos-Costa
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MEIOS SEM SORO

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

SC

_0

Sempre que possvel seria desejvel que no se usasse soro nos

meios de cultura:
um componente emprico e com elementos no
quantificados (albumina);
No pode ser usado no fabrico de produtos biofarmacuticos;
No pode ser usado em tcnicas que requerem um meio
sinttico de composio bem definida e conhecida,
nomadamente em estudos de factores de crescimento,
citocinas, molculas de adeso, etc.;
Pode transportar vrus ou factores de inibio.

II

O meio sem soro:

reprodutvel;
No tem factores desconhecidos.

Quirina Santos-Costa
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TCNICA DE DESCONGELAO:
COMO INICIAR UMA CULTURA

SC

_0

Processo rpido
Libertar do DMSO que txico.
Lanar as clulas em cultura
(Controlo de qualidade do processo de CONGELAO: Descongelar uma ampola
criopreservada com 24h, para que se veja se a congelao foi eficiente e se as clulas tm
boa viabilidade).

C
LN

IC

I. A partir de Frascos de Cultura, transportados T. A.

VI
RO
LG

IA

O frasco de Cultura vem com o volume completo at ao mximo, de modo

a evitar entradas de ar o contaminaes. Assim que chega ao laboratrio,
as clulas devem ser passadas de imediato, para evitar o prolongamento
do sofrimento de ausncia de temperatura ideal e % de CO2.

II

1. Transferir a suspenso ou fazer uma desagregao por

enzimtica (tripsinizao), qumica (EDTA) ou mecnica
(cell-scrapper) para tubo(s) estril de 50mL
2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos a 4C
3. Rejeitar o sobrenadante por decantao.
4. Ressuspender as clulas na quantidade de volume de
Meio de Cultura adequado.
5. Transferir para frasco de cultura de cultura adequado
6. Examinar ao MO invertido
Incubar em estufa 37C, 5%CO2.
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TCNICA DE DESCONGELAO:
COMO INICIAR UMA CULTURA
A partir de Criotubos, transportados em Gelo Seco (-20-30C)

II.

SC

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Material:

II

VI
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IA

C
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IC

Material tcnico protector (luvas, bata, protector dos sapatos, culos ou viseira)
Cmara de fluxo estabilizada
Estufa CO2
Banho a 37C
Frasco de cultura T25 identificado com: Nome do tcnico; data;
n de passagem tipo de cultura
Marcador
Falcon50mL
Pipetas graduadas
Pipetador automtico
Suporte com gelo
1 Criotubo com clulas J774 Suspenso
40mL Meio RPMI 1640 N, pr-aquecido
1 Criotubo com clulas aderentes
40mL Meio DMEM N, pr-aquecido
Centruga JOUAN
lcool 70
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PASSAGEM DE CLULAS

IC

SC

Passagem das clulas ou subcultura:

II

VI
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LG

IA

C
LN

Consiste na dissociao, por aco

enzimtica (tripsina) ou fsica (raspadores),
de uma cultura celular e utilizao das
clulas da resultantes para estabelecer uma
nova cultura.

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TRIPSINIZAO

SC

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Objectivo:
Libertar as clulas do suporte slido (parede do frasco de
cultura) e dissociar as clulas entre si.

II

VI
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C
LN

IC

Material:
frascos de cultura
Tripsina-EDTA
PBS sem Ca2+ nem Mg2+
Meio Dulbeccos DMEM completo:
1mM L-Glutamina
1mM piruvato de sdio
1mM A.A. no essenciais
10% (v/v) soro bovino fetal
2,5 g/ml fungizona
50 g/ml gentamicina
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TRIPSINIZAO

II

VI
RO
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C
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SC

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Tcnica adaptada aula prtica de Virologia:

Quirina Santos-Costa
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CONTAGEM DE CLULAS
EM
HEMATMETRO DE NEUBAUER

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1m
SC

1m

N (1+2+3+4)
X

0,1 L
1000 L

II

VI
RO
LG

IA

C
LN

IC

Altura= 0,1 mm
rea= 1mm*1mm=1mm2
Volume= 0,1mm3

Diluio com Azul de Tripan

1/10 (90 L + 10 L)

N/4 * 105 clulas / ml

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL

BIBLIOGRAFIA

_0

http://www.aidsreagent.org/

SC

http://www.atcc.org/

C
LN

IC

http://www.cdc.gov/

IA

http://www.ecacc.org.uk/

VI
RO
LG

http://www.invitrogen.com/

http://www.nuncbrand.com/

II

http://www.sigmaaldrich.com/

Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL