Vous êtes sur la page 1sur 15

BREVE RESUMEN HISTRICO DE LA

RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR


Francisco Snchez Ferrando
Departament de Qumica, Universitat Autnoma de Barcelona
08193 Bellaterra, Barcelona

La resonancia magntica nuclear (RMN) es una tcnica transversal, cuyos


fundamentos y/o aplicaciones abarcan todo el mbito de las ciencias experimentales clsicas
(matemticas, fsica, qumica, biologia, geologia), las tecnologas (informtica, ciencia de
materiales) y las ciencias de la salud, en especial la medicina. Ahora bien, en este ltimo
mbito es frecuente que los facultativos se refieran a la resonancia magntica (denominacin
incompleta con que es conocida incluso por el gran pblico), sin el adjetivo nuclear,
conscientemente omitido por la profesin mdica (y en consecuencia por los medios de
comunicacin), posiblemente por temor a que el pblico desinformado pueda asociar esta
tcnica a eventuales radiaciones potencialmente peligrosas producidas por desconocidos
procesos radiactivos. Permtanme tranquilizarles inmediatamente: la estabilidad del protn,
ncleo mayoritariamente utilizado para la obtencin de las espectaculares imgenes mdicas
por RMN a que estamos habituados, es muy elevada. La vida media del protn es de unos
1031 aos, mucho mayor que la edad del Universo desde el Big Bang. nicamente gracias a su
gran abundancia se espera poder detectar en alguna ocasin la desintegracin espontnea de
un protn, y las probabilidades de que ello ocurra durante los pocos minutos que dura una
exploracin mdica por RMN son realmente muy, muy pequeas. Bromas aparte, la supresin
injustificada del adjetivo nuclear debe ser enrgicamente rechazada por toda la comunidad
cientfica.
Veamos someramente las interrelaciones entre las ciencias bsicas y la RMN. La
matemtica, por ejemplo, ha proporcionado herramientas como la transformacin de Fourier
en una o varias dimensiones, o la teora estocstica, que son imprescindibles para la obtencin
de espectros a partir de mediciones primarias de magnetizacin. La fsica, por supuesto, se
encuentra en la raz misma del fenmeno de la RMN, a partir de estudios del momento
angular intrnseco (o spin) de ciertos ncleos. La informtica ha permitido el control rpido,
fiable y reproducible de las muy diversas variables experimentales involucradas en la
obtencin de espectros RMN, tales como pulsos de radiofrecuencia de unos pocos
microsegundos, con fases predeterminadas hasta una precisin de menos de medio grado
sexagesimal, perodos de evolucin de micro- a milisegundos, potencias de irradiacin,

control de temperatura, etc. Tambin la informtica ha permitido la digitalizacin de la seal,


as como la transformacin de Fourier numrica. La qumica ha sido, desde hace ms de
cincuenta aos, la gran beneficiaria de las aplicaciones de esta tcnica, que permite descifrar
detalles muy sutiles de la estructura molecular de los compuestos, as como estudiar su
comportamiento dinmico y sus reacciones. La biologa, especialmente la fisiologa, la
bioqumica y la biologa molecular, ha podido investigar con gran detalle las biomolculas,
tanto en estudios estructurales de biopolmeros como en el seguimiento dinmico de rutas
metablicas y, ms recientemente, empleando la espectroscopa localizada in vivo. La
geologa, por su parte, ha podido aprovechar las tcnicas de RMN en fase slida en estudios
estructurales de minerales o de nuevos materiales, e incluso se han descrito aplicaciones de
antenas RMN para la determinacin del contenido en aceites minerales (petrleo) de las rocas.
Dado que los fundamentos de la RMN son sobradamente conocidos, no se repetirn
aqu. Bastar con enumerar los conceptos de spin nuclear I y el momento angular P asociado,
su cuantizacin (en magnitud y en orientacin respecto al campo magntico B0), su relacin
con el momento magntico (de la forma = P), que introduce la constante magnetogrica
como caracterstica de cada istopo, y la frecuencia de Larmor, 0, a la que precesionan los
spins, y que lleva a la bien conocida expresin

que para el protn, 1H, cuya constante magnetogrica vale H = 26.75 x 107 rad T-1 s-1 ,
operando con un campo magntico B0 = 2.35 T (23500 gauss), da una frecuencia de Larmor
de 100.00 MHz, dentro del rango de la radiofrecuencia. Como es bien sabido, la irradiacin
de la muestra, por medio de radiacin electromagntica polarizada circularmente en el plano
perpendicular a B0 y cuya frecuencia sea precisamente la de Larmor, lleva a la resonancia del
sistema, producindose transiciones entre los niveles energticos.
La deteccin de la absorcin de esta radiofrecuencia en un espectrmetro RMN no es
inmediata, ya que las cantidades de energa involucradas (h0) son muy pequeas, alrededor
de unas pocas milicaloras por mol. Ello impide el uso de tcnicas tradicionales en las
espectroscopas pticas (UV-vis, IR), en las que se comparan las intensidades de dos haces de
radiacin, uno de los cuales ha atravesado la muestra mientras que el otro constituye el haz de
referencia. As, a causa del pequeo valor de las energas involucradas, la RMN es una
tcnica espectroscpica de muy baja sensibilidad. En condiciones ptimas, en un
espectrmetro moderno de alto campo magntico, se requiere un mnimo de 1015 spins de una
determinada especie isotpica (de las "fciles" de medir) para poder detectar seales tiles en
un perodo de una hora.
Y, a pesar de estas limitaciones, la RMN es la tcnica ms ampliamente utilizada en
investigaciones estructurales o dinmicas de compuestos qumicos en fase condensada, tanto
desde el punto de vista de los fsicos como, en especial, del de los qumicos, y ms
recientemente de los bilogos o los mdicos. A diferencia de otras tcnicas de investigacin
estructural, la RMN no se limita al caso de pequeas molculas de bajo peso molecular y alta
simetra, sino que proporciona datos precisos y muy tiles incluso con biopolmeros de peso
molecular relativamente elevado (protenas), sin requerir la previa cristalizacin de la
muestra.

Esta gran utilidad de la RMN se puede describir usando las palabras de Richard R. Ernst,
Premio Nobel de Qumica 1991:
Los sistemas de spins nucleares presentan caractersticas singulares que los
predestinan para el estudio de las molculas:
1) Los ncleos atmicos empleados como sensores se encuentran
perfectamente localizados, con dimetros de unos pocos femtometros, y pueden
proporcionar informacin sobre la situacin de su entorno inmediato,
haciendo as posible una exploracin muy detallada de las molculas y de la
materia.
2) La energa de interaccin de los sensores con el entorno es pequesima,
inferior a 0.2 J mol-1, equivalente a la energa trmica a 30 mK. De este modo,
la observacin y la medicin de propiedades moleculares se puede realizar
prcticamente sin perturbaciones. No obstante, las interacciones presentan
una elevada sensibilidad respecto del entorno local.
3) La informacin sobre la estructura de las molculas puede obtenerse a
partir de las interacciones entre pares de ncleos. As, las interacciones
magnticas dipolo-dipolo proporcionan informacin sobre las distancias
internucleares. Por su parte, los acoplamientos escalares J permiten la
determinacin de ngulos de torsin.
Este conjunto de propiedades es el que ha hecho que la RMN sea hoy una herramienta
imprescindible en todos los laboratorios de qumica preparativa y de bioqumica estructural o
dinmica. En otro contexto, los instrumentos de imagen por RMN son tambin
imprescindibles en los hospitales. Pero para llegar a la situacin actual ha sido preciso superar
las dificultades asociadas a la baja sensibilidad caracterstica de la RMN. De hecho, la historia
de la RMN es una sucesin de brillantes avances experimentales que han permitido ir
aumentando con los aos la sensibilidad de la tcnica.

Un poco de prehistoria: la gestacin de la RMN


Un resumen de los acontecimientos que llevaron al descubrimiento de la RMN en fase
condensada sera incompleto sin la inclusin de su prehistoria, caracterizada por notables
esfuerzos experimentales destinados a demostrar primero y a detectar despus la existencia de
un momento angular de spin asociado a los ncleos, con su correspondiente momento
magntico.
Los conceptos de spin electrnico y del momento magntico del electrn fueron
experimentalmente confirmados al comienzo de los aos veinte por medio del famoso
experimento de Stern-Gerlach, en el cual se separaron haces de tomos en un campo
magntico inhomogneo de acuerdo con la orientacin del momento magntico de sus
electrones desapareados. Hacia finales de los aos veinte, Pauli demostr claramente que
muchas de las caractersticas de la estructura hiperfina de los espectros atmicos nicamente
se podan explicar si determinados ncleos atmicos presentaban tambin spin y su
correspondiente momento magntico. Posteriores refinamientos del experimento de Stern-

Gerlach lo confirmaron en el ao 1933, y proporcionaron unos primeros valores aproximados


del momento magntico del protn. Se haba formulado, as, la prediccin de la existencia de
un spin nuclear para ciertos tomos, incluyendo el hidrgeno, que era preciso medir con
exactitud.
En 1936 el fsico C.J. Gorter intent medir la resonancia magntica de ncleos de 7Li
en LiCl slido mediante tcnicas microcalorimtricas, pero sin resultado. Tampoco consigui
detectar la resonancia de 1H en cristales de alumbre potsico hidratado. Posteriormente lo
volvi a intentar con LiF slido, nuevamente sin xito. Hoy sabemos que una posible causa de
su fracaso es que el LiF cristalino de gran pureza presenta una relajacin longitudinal
anormalmente lenta, de modo que se requieren tiempos anormalmente elevados para que se
polarice la muestra una vez sumergida en el campo magntico y se pueda, as, medir su
resonancia magntica nuclear. Fu precisamente Gorter el primero en usar por escrito la
expresin Nuclear Magnetic Resonance en el ttulo de uno de sus artculos, publicado en
1942, pero siempre atribuy esta expresin a I.I. Rabi.
En 1937 B.G. Lasarew y L.W. Schubnikow demostraron que, a bajas temperaturas, los
momentos magnticos nucleares contribuyen apreciablemente a la susceptibilidad magntica
esttica observada en el hidrgeno slido.
El experimento crucial en la prehistoria de la RMN lleg en 1939, cuando I.I Rabi y
colaboradores disearon y probaron una importante mejora de las tcnicas de haces que
permiti, por primera vez, la observacin de resonancia magntica nuclear, aunque en haces
moleculares (carentes de spin electrnico), y que constituy la primera medicin del momento
magntico del protn. Adems de hacer pasar un haz de molculas por un campo magntico
inhomogneo (para deflectarlas) y por un segundo campo tambin inhomogneo pero de
signo opuesto (para reenfocarlas), Rabi intercal entre ambos campos inhomogneos un tercer
campo, variable pero homogneo. Al irradiar la regin central (campo homogneo) con
radiacin electromagntica de frecuencia constante, dentro del rango de la radiofrecuencia, y
realizar un barrido del campo magntico central homogneo, el haz result inalterado excepto
para un muy estrecho rango de valores del campo central homogneo. Para los valores de este
estrecho rango el haz diverga y ya no se produca el reenfoque sobre el detector. Haba
nacido la resonancia magntica nuclear, aunque Rabi la denomin espectroscopa de
radiofrecuencia. Por este importante descubrimiento se concedi a Rabi el Premio Nobel de
Fsica de 1944.
Poco despus de este brillante experimento, y usando el mismo tipo de instrumento,
lvarez i Bloch midieron el momento magntico del neutrn, pero la guerra mundial
introdujo un parntesis en estas investigaciones fundamentales sobre RMN. No fu sino en
1945, acabada la guerra, que dos grupos de Estados Unidos, trabajando independientemente,
intentaron nuevamente medir resonancia magntica nuclear en materia condensada, pese a la
falta de xito anterior de Gorter. Uno de estos dos grupos, dirigido por E.M. Purcell, trabajaba
en la Universidad de Harvard, Massachusetts. El otro, dirigido por Felix Bloch, lo haca en la
Universidad de Stanford, California. Ambos investigadores no se conocan personalmente,
pese a que F. Bloch haba pasado los aos de la guerra trabajando en proyectos militares
precisamente en Harvard. Segn el relato de W.G. Proctor, discpulo de Bloch que descubri
el fenmeno del desplazamiento qumico, fu justamente durante los aos de guerra pasados
en Harvard cuando Bloch desarroll tranquilamente (en casa, trabajando de noche) sus ideas

sobre RMN en fase condensada. Por este motivo fu posible efectuar con xito el experimento
a los pocos meses de su retorno a Stanford, acabada la guerra.

RMN en fase condensada: el nacimiento de la RMN


La primera deteccin de resonancia magntica nuclear en materia condensada fu
conseguida por el equipo de Purcell, Torrey y Pound en Harvard, poco antes de las Navidades
de 1945 (su artculo se recibi en Phys. Rev. el da de Nochebuena). El experimento consisti
en situar un bloque de parafina slida, de 850 mL, en una cavidad resonante de
radiofrecuencia, alimentada a 29.8 MHz por medio de un circuito apropiado. Este conjunto se
hallaba dentro de un electroimn de campo magntico variable. La seal de salida del
resonador se equilibr con una parte de la seal procedente de la fuente de radiofrecuencia, y
al proceder a un barrido del campo magntico se observ una aguda absorcin por resonancia
para un valor del campo de 7100 gauss. Este experimento de deteccin directa de la absorcin
resulta equivalente a los intentos infructuosos de Gorter unos pocos aos antes. Es interesante
sealar que al planificar su experimento Purcell desconoca el fracaso anterior de Gorter.
Cuando Rabi supo lo que Purcell quera hacer, le hizo notar que Gorter no lo haba
conseguido, pero Purcell decidi que los preparativos estaban ya demasiado avanzados para
renunciar, y sigui adelante con lo que, en definitiva, acabara siendo la primera deteccin de
RMN en materia condensada.
De manera completamente independiente, el equipo de Felix Bloch en Stanford
consigui, a fines de diciembre de 1945, detectar tambin seales de RMN de protn,
utilizando un equipo experimental muy diferente y sobre una muestra de agua. En lugar de un
nico circuito de radiofrecuencia, en el experimento de Bloch se utilizaron dos bobinas,
mutuamente ortogonales, una para la excitacin y la otra como detector. Tambin en este
caso, las dos bobinas se hallaban dentro de un fuerte campo magntico variable, perpendicular
a ambas bobinas, y la elegante aproximacin de Bloch prevea detectar sobre la segunda
bobina la fuerza electromotriz inducida por la precesin de la magnetizacin nuclear de la
muestra, provocada por la primera bobina al producirse la absorcin. Por este motivo, en
Stanford el fenmeno se denomin inicialmente induccin nuclear. Resulta interesante seguir
el relato de uno de los investigadore participantes. Dice M.E. Packard:
Hacia el cuarto trimestre de 1945, en Stanford, bajo la direccin del Prof. Bloch, nos
habamos propuesto la tarea de detectar las seales de induccin nuclear (nombre
que en aquella poca dbamos a la RMN) de los protones en fase condensada. A este
fin Russell Varian, que tambin perteneca al Departamento, construy un
electroimn con una cavidad que, llena de agua, era nuestra muestra de protones en
fase condensada. La bobina de excitacin y la de deteccin eran mutuamente
ortogonales entre s, y tambin lo eran con el campo magntico. La fuente de
radiofrecuencia era muy parecida a uno de los radares utilizados durante la guerra.
Pero el campo magntico era demasiado inhomogneo. Pese a todos nuestros
esfuerzos, no conseguamos ver la seal de induccin nuclear en la pantalla del
osciloscopio, de modo que propuse un mtodo consistente en realizar un barrido
rpido de la corriente del imn con la esperanza de que, en algn instante, el campo
magntico y la radiofrecuencia tendran la relacin precisa para dar la seal
esperada. Tras diversos intentos, unos das despus de Navidad, hallndome solo en

el subterrneo del laboratorio, consegu ver la seal deseada al apagar la corriente


del electroimn (ciertamente, el ms rpido barrido imaginable).
Como es de suponer, la excitacin en Stanford fu mxima, y rpidamente se escribi
un artculo describiendo el nuevo fenmeno, sin tener conocimiento del artculo de Purcell
sobre el mismo tema. El artculo de F. Bloch, W. Hansen y M.E. Packard lleg a Phys .Rev. el
29 de enero de 1946, y ambos artculos se publicaron en el mismo nmero de la revista. Pocos
aos despus, en 1952, Purcell y Bloch recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Fsica
por su descubrimiento, ya definitivamente conocido como resonancia magntica nuclear
(RMN).
Resulta interesante indicar que, a diferencia de Purcell, Bloch conoca perfectamente
los trabajos infructuosos de Gorter, pero crea tener una explicacin para su fracaso. Bloch
supona que el experimento de Gorter haba fallado porque el tiempo de relajacin T1 era
mucho ms largo de lo que se imaginaba. Para superar esta dificultad, Bloch propuso a sus
colaboradores que pusieran su muestra de agua dentro del fuerte campo magntico del
electroimn durante unos cuantos das, antes de intentar las mediciones, para permitir que el
sistema de spins nucleares llegara al equilibrio trmico. As se hizo, y tras poner la muestra
Bloch se march a esquiar durante unos das. Al regresar al laboratorio, tras diversos intentos
infructuosos, finalmente se logr medir la seal de resonancia, pero tambin se pudo
determinar que el tiempo de relajacin era mucho ms corto de lo supuesto. En realidad, slo
eran precisos unos segundos, en lugar de das, para establecer el equilibrio!
La brillante concepcin de Bloch sobre la resonancia magntica nuclear, tanto desde el
punto de vista terico como desde el experimental, ha sido confirmada por sus numerosas
aportaciones durante el resto de la dcada de los aos cuarenta. Pero uno de los aspectos ms
importantes le pas por alto: la gran disminucin de la anchura natural de las seales RMN en
lquidos causada por sus movimientos trmicos, convincentemente demostrada por
Bloembergen, Purcell y Pound en Harvard, en su artculo publicado en 1948. Hasta conocer
en Stanford el contenido de este artculo, la gran anchura de banda de las seales RMN
observadas por el equipo de Bloch se atribuy, errneamente, a su anchura natural, causada
por las interacciones dipolo-dipolo descritas por Bloch en slidos. En realidad, para muestras
lquidas, esta gran anchura de banda era debida a la gran inhomogeneidad de campo
magntico de todos los imanes disponibles en Stanford durante aquellos aos iniciales.

Descubrimientos de gran significacin qumica: la primera infancia de la RMN


El perodo 1945-1955 est marcado por el gran ritmo de los descubrimientos
efectuados por los fsicos dentro del campo de la RMN. Inicialmente, tras el descubrimiento
de Purcell y Bloch, tanto sus grupos como otros investigadores se dedicaron a medir los
momentos magnticos (o, ms precisamente, las constantes magnetogricas) de todos los
elementos (o istopos) todava no estudiados, con el objetivo de buscar relaciones entre la
magnitud medida y la estructura nuclear. Subyacente en este mtodo se encontraba la
hiptesis de que el momento magntico de un determinado ncleo (o istopo) presentara
siempre el mismo valor, independientemente de cul fuera el compuesto utilizado para la
determinacin. Al mejorar la calidad de los dispositivos experimentales fu posible aumentar
la resolucin de las seales. Esto condujo al descubrimiento del desplazamiento qumico, de
evidente trascendencia en qumica, y consistente en que las seales de una determinada

especie isotpica presentan frecuencias que dependen de la especie qumica sobre la cual se
efectan las determinaciones. Este descubrimiento fu efectuado en Stanford por Proctor y
Yu, dos jvenes estudiantes postdoctorales del grupo de Bloch. Sigamos el relato de
W.G. Proctor:
Tras haber diseado y construido un espectrmetro RMN de campo muy homogneo,
que constituy mi tesis doctoral en Stanford, el Prof. Bloch nos encarg a Yu (recin
graduado en Ohio State University) y a m la tarea de localizar las resonancias y
medir los momentos magnticos y los spins de cuantos istopos estables fuera posible,
con el objetivo de completar la tabla peridica en un ao, aproximadamente. En el
curso de estos trabajos, al tocarle el turno al nitrgeno como ncleo de referencia,
nos propusimos medir su momento magntico con gran precisin (creo recordar que
la resonancia de 14N haba sido medida el ao anterior por Pound en Harvard).
Recuerdo que fu al almacn de qumica y anduve rebuscando un compuesto que diera
la resonancia ms fuerte posible. Pronto eleg el frasco marcado NH4NO3, ya que
obviamente haba de ser muy soluble en agua y, adems, al tener dos nitrgenos haba
de dar una seal muy fuerte. Tras preparar una solucin concentrada e introducirla
en el imn, Yu y yo aguardbamos expectantes junto al imn, esperando que el
pequeo motor de reloj que cambiaba gradualmente la frecuencia del espectrmetro
hiciera aparecer la resonancia. As fu, y apareci una magnfica seal de resonancia
en la cinta que registraba el espectro. Pero mientras mirbamos, para nuestro
asombro, apareci una segunda seal de igual amplitud que la primera. Incrdulos,
repetimos el experimento diversas veces para descartar cualquier posible error
instrumental, siempre con igual resultado. Subimos los registros al despacho del Prof.
Bloch, que se mostr muy interesado, e inmediatamente nos pusimos a discutir
posibles causas para este fenmeno. Seleccionamos dos posibles explicaciones, una
mucho ms interesante que la otra. La ms interesante era la posible existencia de
ismeros nucleares estables, de la misma masa, con propiedades ligeramente
distintas. Creamos haber hecho un descubrimiento fsico trascendental. Pero era
preciso descartar la segunda posible causa, sin ningn inters para nosotros,
consistente en algn fenmeno qumico, tal como un apantallamiento diamagntico
del ncleo, dependiente de su entorno qumico, que pudiera afectar la densidad
electrnica del ncleo de nitrgeno.
Para descartar esta segunda y poco interesante hiptesis, Bloch pidi al Prof. Segra
una pequea muestra de 15N. Si las dos resonancias no aparecan en una muestra de
nitrato amnico preparada a partir de 15N, obviamente la explicacin haba de ser
nuclear, como nosotros desebamos, y no simplemente qumica. La conversin de la
muestra de 15N en nitrato amnico tard tres semanas, muy angustiosas para todos
nosotros. Finalmente la muestra lleg y, a las pocas horas, habamos vuelto a
observar las dos seales de igual intensidad, proporcionalmente con la misma
separacin entre ambas. Por tanto, nos vimos forzados a admitir que se trataba de un
enojoso efecto meramente qumico, que poda llegar a impedirnos progresar
rpidamente en nuestra carrera. Nuestro artculo se public en 1950 en forma de
carta, y por casualidad en el mismo nmero de Phys. Rev. que contena un artculo de
W.C. Dickinson, de MIT, que describa el mismo fenmeno para el ncleo de 19F.
De este modo se descubri el desplazamiento qumico, sin el cual la RMN no tendra hoy
gran utilidad analtica. Y fu precisamente durante sus estudios para clarificar las causas del

desplazamiento qumico cuando Gutowsky, a principios de 1950, descubri el acoplamiento


escalar spin-spin. Sigamos su relato:
A comienzos de 1950 nos interesaba investigar desplazamientos qumicos en lquidos,
y seleccionamos el ncleo de 19F. Inicialmente probbamos cualquier compuesto
fluorado que nos cayera en las manos, hasta que el 26 de abril de 1950 conseguimos
resolver las seales de un trifluorometilbenceno fluorado tambin en el ncleo
aromtico. Esto nos motiv mucho, y nos llev a pensar de qu modo podramos
correlacionar los desplazamientos qumicos con la estructura molecular. Influenciado
por el libro de Linus Pauling, The Nature of the Chemical Bond, pens que el
desplazamiento qumico, como fenmeno elctrico, debera estar relacionado de
algn modo con la naturaleza del enlace qumico. ste, a su vez, depende de la
naturaleza de los tomos que se enlazan, de modo que decid estudiar los fluoruros
binarios sencillos, eleccin que result ser muy afortunada.
El da 8 de septiembre de 1950, en nuestro laboratorio, C. Hoffmann observ por
primera vez una lnea doble en la resonancia de 19F de una pequea muestra de PF3
que l mismo haba sintetizado como parte de nuestro estudio de los desplazamientos
qumicos del flor. Como la sntesis se efectu por fluoracin de PCl3, decidimos que
la doble lnea era debida a la presencia de impurezas de PClF2 o PCl2F. Pero, tras
purificar la muestra, el par de seales permaneca inmutable. El mismo resultado se
obtuvo con una muestra de PF3 preparada por otra ruta. Tambin en una muestra de
PF5 se observaron dos bandas, y en este caso la explicacin que pareca ms
razonable era que se trataba de desplazamientos qumicos diferentes para los F
ecuatoriales y los apicales. Finalmente, en marzo de 1951, al examinar el espectro de
31
P de POCl2F, se observ un doblete 1:1 que me convenci de que habamos hallado
un nuevo tipo de interaccin internuclear relacionada con los estados de spin de
ambos ncleos. En efecto, el espectro de 31P de CH3OPF2 present un triplete 1:2:1,
tal como yo haba predicho.
As se descubri el segundo gran parmetro de la RMN, sin el cual carecera de la gran
utilidad analtica que ha alcanzado. Las mejoras instrumentales de aquellos primeros aos
permitieron muy pronto la observacin de diferentes desplazamientos qumicos de protn en
compuestos orgnicos (el primero fu el etanol), en forma de lo que por aquel entonces se
conoca como seales "bien resueltas", de intensidad proporcional al nmero de protones.
El procedimiento habitual para la observacin de lneas de RMN en aquellos tiempos
consista en variar la frecuencia (o, ms a menudo, el campo magntico) a travs de la
condicin de resonancia, recoger las seales de deflexin en un osciloscopio y registrarlas.
Este mtodo, denominado de onda continua (CW, continuous wave) ha sido el generalmente
utilizado durante muchos aos, porque permite la observacin secuencial de cada una de las
muchas lneas de absorcin de multipletes complejos, pero se requiere que el barrido sea muy
lento para permitir el registro sin distorsiones de las bandas, y ello ha exigido considerables
mejoras en la estabilidad de los instrumentos, ya que cada registro de un espectro suele
requerir unos diez minutos.
Bloch sugiri desde el inicio un procedimiento alternativo de excitacin mediante un
muy corto pulso de radiofrecuencia. En 1949 E. Hahn demostr que este procedimiento,
efectivamente, era capaz de inducir una seal (FID, free induction decay) correspondiente a la

libre precesin de la induccin nuclear. Adems demostr que empleando secuencias de


pulsos se generaban ecos de spin que contenan informacin adicional sobre el sistema. Los
mtodos de pulsos desarrollados por Hahn, que son la base de la RMN actual, se convirtieron
en los preferidos por los fsicos para el estudio del comportamiento dinmico de la relajacin
de sistemas sencillos, a menudo de una nica lnea en el espectro RMN, talos como, p.ej., las
muy anchas bandas de absorcin de muestras slidas. Por otra parte, en el estudio de la
relajacin, en 1953 se descubri el efecto nuclear Overhauser (NOE), si bien sus aplicaciones
qumicas tuvieron que esperar algunos aos.
De este modo, hacia principios de los aos cincuenta, toda la teora de la RMN haba
sido completamente desarrollada por los fsicos, que progresivamente fueron perdiendo
inters por un fenmeno ya tan bien conocido en sus principios fundamentales como la RMN.
Y, de modo casi natural, el inters por la RMN se desplaz de la fsica a la qumica, gracias a
sus numerosas aplicaciones. En palabras de M.E. Packard, "chemists got the point very
quickly, thanked the physicists, and took over".

Primeras aplicaciones qumicas: la preadolescencia de la RMN


El grupo de fsicos dirigido en Stanford por los profesores Bloch y Hansen estaba
constituido, entre otros, por personas como Russell Varian, Martin Packard, W.G. Proctor,
W.A. Anderson y otros que en 1948 fundaron una nueva empresa, denominada Varian
Associates, en Palo Alto, California, no muy lejos del campus de Stanford. Para fundarla se
vieron obligados a dejar la Universidad de Stanford, olvidar sus cmodos salarios e incluso
vender sus casas. La segunda lnea de productos comercializados por la nueva empresa era el
espectrmetro de RMN. Russell Varian estaba convencido de su gran valor, pero nadie en la
empresa saba demasiado bien para qu podra servir. Era el ao 1953, y Varian hizo insertar
anuncios del nuevo producto en revistas de qumica, como por ejemplo JACS, con el ttulo
"NMR at work". Es interesante resear que en 1955 Varian ya haba vendido tres
espectrmetros RMN de alta resolucin, a 40 MHz para protn, precisamente a tres empresas
del ramo de la qumica (Humble Oil, Texas; DuPont, Delaware; y Shell Development,
California). Investigadores de la talla de M.E. Packard, J.N. Shoolery o H.E. Weaver, aparte
de sus funciones como directivos de Varian Associates, proporcionaban nuevas aplicaciones
en un nmero creciente de campos de la qumica, entre los que no tard en aparecer la
qumica orgnica. En contraste con el casi medio siglo transcurrido desde el descubrimiento
de la espectroscopa infrarroja (1900) hasta la introduccin del primer espectrmetro IR
comercial (1946), la rapidez del desarrollo de la RMN es muy chocante. Sin duda, uno de los
motivos es el clima de base tecnolgica y la aceptacin de innovaciones que haba en aquellos
aos postblicos. Pero tambin tuvo gran importancia la fuerte interaccin entre una industria
electrnica de gran base tecnolgica (Varian) y el grupo puntero de investigadores de la RMN
comandado por Bloch en la Universidad de Stanford.
Aquellos primeros espectrmetros RMN a 40 MHz para protn eran aparatos muy
primitivos. Era preciso registrar el espectro protnico entre 0 y 10 ppm durante unos 5-10
minutos, pero no era posible efectuar registros ms lentos a causa de la deriva aleatoria del
campo magntico, que podia llegar a ser dominante incluso bajo el control de los
denominados superestabilizadores de campo. Especialmente crtico era el proceso de ajuste de
la homogeneidad del campo magntico (field shimming), que era preciso efectuar para cada
muestra al objeto de obtener la mxima resolucin. Entre unas cosa y otras, la obtencin de

espectros RMN era una tarea larga y delicada, reservada a buenos especialistas
instrumentales. Pero la recompensa por la obtencin de buenos espectros era muy importante.
Los qumicos orgnicos pronto comprobaron que la espectroscopa RMN era la tcnica ideal
para la elucidacin o comprobacin estructural de molculas de peso molecular moderado.
Casi todos los compuestos de la poyata daban nuevos e interesantes datos espectrales de
utilidad general. En 1958 apareci el clsico artculo de Shoolery y Rogers sobre el estudio de
esteroides por RMN, en el que se demostraba que incluso a 40 MHz los desplazamientos
qumicos de los metilos angulares eran de gran valor diagnstico. Tambin en aquellos aos
se publicaron numerosos datos de biomolculas, tales como alcaloides, azcares, porfirinas y
otros compuestos. Pronto Karplus demostr que las constantes de acoplamiento vicinales a
tres enlaces se podan correlacionar con los ngulos de torsin, y esto di origen a numerosos
estudios conformacionales, especialmente en el campo de los azcares. Hacia finales de la
dcada, en 1959, aparecieron el clsico libro de Jackman, en el que se correlacionaban los
datos de RMN con la estructura molecular, y el pequeo opsculo de Roberts, en el que se
efectuaba una breve introduccin de los principios tericos bsicos con argumentos sencillos,
al alcance de los qumicos orgnicos. Aparecieron en el mercado instrumentos comerciales de
imn permanente, a 60 MHz para protn, con mucha ms estabilidad y resolucin que los
primeros aparatos comerciales, y con los cuales los espectros eran mucho ms reproducibles.
En 1961-1962 se instalaron en Espaa los dos primeros espectrmetros RMN. El
primero de ellos se instal en Madrid, bajo la supervisin del Prof. Manuel Rico, de cuyo
magisterio nos hemos venido beneficiando todos cuantos nos hemos dedicado a la RMN en
Espaa. El segundo se instal muy poco despus en Barcelona, bajo la supervisin del Prof.
Josep Castells, introductor de la RMN en Catalunya y que fu mi director de tesis. Recuerdo
bien que durante mi tesis utilic intensivamente este segundo instrumento, un Perkin-Elmer
R-10, a 60 MHz, que requera un mnimo de 60-100 mg de muestra slida, disuelta en CCl4,
para compuestos de peso molecular inferior a 300, a menos que la muestra fuera lquida, en
cuyo caso se usaba el lquido puro para maximizar las seales. O tempora, o mores!

Tcnicas de pulsos y transformacin de Fourier: la adolescencia de la RMN


La estabilidad y la fiabilidad de la electrnica fueron mejorando la calidad de los
espectrmetros RMN durante toda la dcada 1955-1965. Especialmente importante fu el
establecimiento de campos estables (con electroimn) de 23.5 kG, que permitieron medir
protn a 100 MHz empleando cantidades de muestra inferiores a los 100 mg. La tecnologa de
los imanes superconductivos, refrigerados por helio lquido, hizo posible finalmente la
construccin de imanes permanentes de solenoide superconductor con campos estables mucho
ms elevados (primeros espectrmetros de protn a 220 MHz, Varian HR-220, en 1966). Con
estos espectrmetros de campo alto fu posible culminar (el Prof. Manuel Rico, en Madrid, ya
haba iniciado sus trabajos con la ribonucleasa a 90 MHz!) el estudio de biopolmeros tales
como polipptidos, protenas, etc. Pero todava era preciso obtener todos los espectros
mediante el lento barrido de campo (o de frecuencia) caracterstico del mtodo de la onda
continua. De todos modos, la gran dispersin de frecuencias protnicas alcanzable con imanes
superconductores permiti la aparicin, en 1967, de un primer estudio detallado de protenas
por RMN.
En 1966 lleg tambin la primera gran revolucin metodolgica instrumental de la
RMN, veinte aos despus de su descubrimiento, por parte de uno de sus primeros

investigadores (Weston A. Anderson) y de un joven suizo (Richard R. Ernst) todava poco


conocido, que por aquel entonces trabajaba en Varian, Palo Alto. Se trata del mtodo de
pulsos y transformacin de Fourier, hoy universalmente utilizado por todos los
espectrmetros, que ya haba sido investigado por Hahn en 1950. La gran ventaja de este
mtodo es que permite excitar simultneamente, con un nico pulso de radiofrecuencia de
gran intensidad y de muy corta duracin (tpicamente inferior a 10 s), todos los protones de
la muestra, independientemente de su desplazamiento qumico, sin necesidad de efectuar un
barrido de frecuencia. La respuesta transitoria del sistema (FID) consiste en la aparicin de
una induccin nuclear, en forma de magnetizacin macroscpica transversa, que precesiona
perpendicularmente al campo fijo del imn, mientras se va amortiguando por la accin de los
mecanismos de relajacin. Como en los experimentos de Bloch, esta induccin nuclear se
puede medir gracias a la fuerza electromotriz que induce en la bobina del detector, y suele
tener una duracin del orden de un segundo. Adems, se puede almacenar digitalmente en la
memoria de un ordenador y, tan pronto como se anula, inmediatamente se puede volver a
enviar un pulso a la muestra, sumndose coherentemente las sucesivas FIDs en la memoria
del ordenador. Esto permite mejorar en dos o tres rdenes de magnitud la relacin seal-ruido
y ampliar as los mbitos de aplicacin de la RMN. La transformacin de Fourier de esta FID,
operacin matemtica que tambin realiza digitalmente el ordenador, proporciona un espectro
con el mismo formato y la misma informacin que si se hubiera obtenido por onda continua,
pero en mucho menos tiempo. As, durante los diez minutos habitualmente necesarios para el
registro de un nico espectro por onda continua, el mtodo de pulsos puede sumar un total de
ca. 600 FIDs. Pero es que, adems, la seal de cada una de estas FIDs es mucho ms intensa
que la de un espectro convencional de onda continua para la misma concentracin de muestra.
Hasta esta revolucin, las aplicaciones prcticas de la RMN se haban limitado a los
muy pocos istopos de elevada abundancia natural y de spin 1/2, principalmente 1H, 19F, 31P y
195
Pt. Desgraciadamente, esto excluye ncleos tan abundantes e importantes como el carbono
12
( C, 98.9%) o el oxgeno (16O, 99.8%), ya que carecen de spin (I = 0). Pero la aparicin de
este artculo de Ernst y Anderson abri el campo de la RMN multinuclear, al posibilitar la
suma coherente, en poco tiempo, de centenares o miles de FIDs correspondientes a ncleos de
baja abundancia natural, hasta entonces slo accesibles para molculas isotpicamente
enriquecidas. Entre los ncleos de mayor inters que la tcnica de pulsos y transformacin de
Fourier puso al alcance, hay que mencionar en primer lugar al 13C (1.1% de abundancia
natural), el 15N (0.37%), el 2H o deuterio (0.015%) y, en general, todos los elementos de la
tabla peridica. Naturalmente, tambin permiti la obtencin en poco tiempo de excelentes
espectros de protn de compuestos de estructura complicada utilizando muestras de 1 mg o
menos. Los primeros espectrmetros comerciales que incorporaron la nueva tcnica fueron
comercializados por la firma alemana Bruker, y estaban en el mercado hacia 1970.
La combinacin de imanes superconductivos de campo permanente cada vez ms alto
y el mtodo de pulsos y transformacin de Fourier, con su ya inseparable ordenador
integrado, caracteriz el incremento constante de la sensibilidad de la RMN durante los
primeros aos setenta. Tambin permiti convertir la RMN multinuclear en una herramienta
prctica de investigacin estructural. As, los espectros de 13C a abundancia natural pronto se
convirtieron en completamente rutinarios. Con grados de dificultad variables, tambin
muchos ncleos metlicos fueron accesibles en la prctica por primera vez.
Otra caracterstica de los avances producidos durante los aos setenta fu el diseo y
la utilizacin de secuencias multipulso, con el objetivo de aumentar an ms la relacin

seal/ruido (p.ej., mediante transferencia de polarizacin) o de singularizar el tipo de


informacin espectral producida (p.ej., espectroscopa diferencial, determinacin de NOEs,
excitacin selectiva, etc). Si para la obtencin de un espectro convencional por onda continua
se requiere simplemente un barrido de frecuencias, registrando la intensidad absorbida a cada
frecuencia, con el mtodo de pulsos basta excitar la muestra con un nico pulso de corta
duracin, y acto seguido recoger y almacenar la FID que, por transformacin de Fourier,
proporcionar un espectro idntico al anterior. Pero nada impide librar ms de un pulso
durante la excitacin, como ya lo haba efectuado Hahn al estudiar los ecos de spin. As,
variando el nmero de pulsos, su duracin, su fase, los perodos entre ellos, los ncleos a los
que excitan, su selectividad (duros o blandos), etc, se abri paso una gran variedad de
secuencias multipulso tiles para la obtencin de informaciones estructurales especficas, hoy
da ya totalmente rutinarias, y que se desarrollaron durante los aos setenta.
Tambin en esos aos se perfeccionaron los estudios de muestras slidas mediante
RMN de alta resolucin, con la introduccin de mtodos de desacoplamiento de alta potencia
y especialmente la rotacin de ngulo mgico. Finalmente, tambin en los setenta, Lauterbur
inici un ambicioso programa de localizacin espacial de seales RMN, que l denomin
zeugmatografa, que acabara siendo la base de la actual tcnica de obtencin de imgenes
mdicas por RMN.

RMN multidimensional: la primera juventud de la RMN


Vemos, pues, que desde el descubrimiento (1946) de la RMN hasta la primera
revolucin metodolgica (pulsos y transformacin de Fourier, 1966) haban transcurrido
veinte aos. La segunda gran revolucin metodolgica, la RMN bidimensional (2D NMR)
tard mucho menos en llegar: conceptualmente fu formulada como posibilidad terica por
J. Jeener, en uno de los unpublished papers ms citados del mundo, durante el congreso
Ampre celebrado en 1971 en Basko Polje, en un pas todava llamado Yugoslavia. Cinco
aos ms tarde, el equipo de Ernst, ya definitivamente instalado en la ETH de Zrich, haba
completado la teora de la 2D NMR, haba incorporado a los espectrmetros las
modificaciones necesarias y haba aplicado los mtodos experimentales bidimensionales, con
ejemplos concretos y aplicaciones prcticas, todo ello publicado entre 1973 y 1976. Con la
llegada de la segunda dimensin, nuevamente la RMN revelaba la existencia de un nuevo
territorio inexplorado para investigar: correlaciones homo- y heteronucleares, espectroscopa
J, procesos de intercambio qumico o topolgico, transferencias de polarizacin, secuencias
multipulso, excitaciones selectivas y un largo etctera. Significativamente, uno de los nuevos
campos ahora abiertos, gracias a la gran simplicidad de los espectros bidimensionales, fu el
estudio de transiciones prohibidas, en particular las bicunticas. En palabras del propio Ernst:
"Chemists will find great excitement in the forbidden fruits of spectroscopy".
El principio en que se basa la RMN bidimensional es sobradamente conocido por esta
audiencia, y es conceptualmente muy sencillo. En RMN monodimensional se excita el
sistema de spins y se mide la magnetizacin o seal S en funcin de la variable tiempo. Se
obtiene as la funcin temporal S(t), o FID, que se debe monitorizar a intervalos constantes, y
cuya transformacin de Fourier proporciona el espectro F(), en funcin de la frecuencia.
Pero si se somete el sistema de spins a dos perturbaciones, separadas en el tiempo por un
periodo incrementable t1, tras medir la magnetizacin a lo largo del tiempo (que ahora se
denomina t2) se obtiene una seal S(t1,t2) que es funcin de ambas variables temporales. Por

doble transformacin de Fourier se obtiene un espectro bidimensional, F(1,2), en el cual la


intensidad de la seal ser funcin simultneamente de dos variables frecuencia. Cada una de
estas dos variables frecuencia est relacionada con el comportamiento del sistema durante el
correspondiente tiempo (1 con el tiempo t1, 2 con el tiempo t2), as como con la naturaleza
de las dos perturbaciones introducidas. Surgen de este modo espectros de correlacin, tanto
homonucleares (COSY) como heteronucleares (HETCOR, HMQC, HSQC, HMBC), pero
tambin espectros J-resueltos, de doble cuanto, de intercambio (EXSY) o de relajacin
(NOESY, HOESY), y un largo etctera. Todos ellos constituyen poderosos mtodos que
ayudan a la asignacin estructural o a la investigacin de procesos de escala de tiempo
adecuada.
Desde la introduccin de estas tcnicas bidimensionales el concepto se ha extendido a
tres y hasta cuatro dimensiones. Con la ayuda del marcaje isotpico (13C y 15N,
principalmente) y por medio del uso de tcnicas de ingeniera gentica (DNA recombinante)
se puede disponer de protenas cmodamente biosintetizadas a partir de aminocidos
doblemente marcados con ambos istopos. Los resultados son totalmente espectaculares,
especialmente gracias a la aceleracin en la obtencin de los resultados posibilitada por la
seleccin de coherencias por medio de gradientes. La RMN da hoy una informacin tan
precisa y fiable como la difraccin de rayos X para protenas de peso molecular inferior a
50000, con la ventaja de que, al trabajar en solucin, puede suministrar tambin informacin
sobre procesos dinmicos, de gran inters para entender la funcin biolgica de estas
macromolculas.
Las mejoras instrumentales, aparecidas desde que en 1975 se inici la prctica
generalizada de la RMN bidimensional, han facilitado en gran medida la aplicacin de estos
mtodos. Veamos algunos ejemplos.
El campo magntico estable y homogneo de los imanes superconductivos disponibles
comercialmente ha ido aumentando desde los 5.17 T del viejo Varian HR-220, de 1966, hasta
los 21.1 T (900 MHz para protn) de los espectrmetros comerciales actuales de mayor
campo. De hecho se habla ya de la espectroscopa de GHz, sin duda reservada para las
aplicaciones (todava lejanas, lamentablemente) de los nuevos materiales superconductores de
alta temperatura. En cualquier caso, a mayor campo magntico se tiene mayor sensibilidad,
mayor dispersin y la posibilidad de extender las aplicaciones a casos ms difciles. El coste
de estos futuros espectrmetros de GHz, sin embargo, deber resultar astronmico.
El desarrollo de la informtica ha permitido la incorporacin a los espectrmetros
RMN de ordenadores de gran capacidad y velocidad. Adems, el software se ha diseado
pensando en facilitar al usuario no especialista un control fcil sobre las variables
instrumentales. Por otra parte, las redes informticas permiten el procesamiento off-line de los
espectros en cualquier ordenador personal o estacin de trabajo.
Los avances en electrnica aplicada han permitido disponer de espectrmetros
multicanal, con los cuales se pueden perturbar simultneamente diversos istopos, usando
excitaciones de radiofrecuencia precisables desde unos pocos mHz a varios kHz de amplitud
de excitacin, con un control de fases de excitacin, desacoplamiento y deteccin mejor que
medio grado sexagesimal.

Los hoy ya rutinarios mtodos de deteccin inversa y de seleccin de coherencias por


medio de gradientes pulsantes de campo magntico han facilitado el diseo y la realizacin de
todo tipo de experimentos estructurales y dinmicos, en una o varias dimensiones, para
dilucidar cualquier detalle de molculas orgnicas, inorgnicas o bioqumicas.
Por otra parte, la RMN en estado slido ha experimentado grandes progresos con el
desarrollo de mtodos que van ms all de la rotacin de ngulo mgico, tales como los
mtodos de doble rotacin puestos a punto por Pines. De este modo se han podido abordar por
RMN los materiales slidos, cermicos, polimricos, etc.
Pero, sin duda, es en las biociencias donde la moderna RMN tiene un futuro ms
prometedor. Aparte de las ya clsicas determinaciones estructurales y dinmicas de
biopolmeros (como las protenas), que todava hoy constituyen un reto importante en el caso
de oligonucletidos de varias docenas de pares de bases, la RMN se ha usado ya con xito en
estudios de metabolismo, tanto in vitro como in vivo, gracias a su carcter de tcnica no
invasiva. Hace ya treinta aos de la observacin de seales de RMN de 31P correspondientes a
diversos metabolitos fosforilados de gran importancia, como ATP, ADP, fosfocreatina, etc.
Tambin son ya clsicos los estudios de pH intracelular monitorizados por medio del
desplazamiento qumico de ciertas seales. Se han desarrollado mtodos de perfusin para el
estudio de rganos en fluidos nutrientes apropiados, antenas para el estudio de elementos de
volumen cercanos a la piel en seres vivos, pulsos de profundidad predeterminada para el
estudio de zonas ms internas, etc. Finalmente, la RMN mdica, en la cual se mide casi
siempre la seal del agua, es hoy una tcnica rutinaria en los hospitales para fines
diagnsticos. Tambin es muy activo el campo de la espectroscopa localizada in vivo.
Medio en broma, Bloch deca que el primer experimento de RMN in vivo lo haba
efectuado l mismo, en 1946, poniendo su dedo en la sonda de su espectrmetro RMN, con lo
que observ una seal de agua. Y entre los qumicos orgnicos veteranos es muy conocido un
artculo de J. Org. Chem., de los aos sesenta, en que se describe el espectro de RMN de un
ratn entero y vivo. Hoy, las aplicaciones de la RMN a las biociencias son de alcance cada
vez mayor, pero tambin lo son en ciencia de materiales, en geologa (magnetmetros, sondas
RMN para los pozos de petrleo), en la industria alimentaria (que usa la RMN protnica para
medir el contenido en agua) e incluso en estudios agrcolas, en los que se puede usar la RMN
como tcnica no invasiva para determinar el contenido de semillas y plntulas.

Conclusin: se acerca la RMN a la madurez?


No es muy frecuente que una tcnica instrumental siga siendo objeto de tanta
investigacin fundamental a los sesenta aos de su nacimiento. En el caso de la RMN, tras su
infancia claramente marcada por la fsica, con Premios Nobel a Rabi (1944) y a Purcell y
Bloch (1952), su adolescencia y juventud han estado claramente ligadas a la qumica, con
Premios Nobel a Ernst (1991) y a Wthrich (2002).
Dicen que la juventud es el perodo ms feliz de la vida. Si en su futura madurez la
RMN cae finalmente en manos de los mdicos, que sin duda le amputarn su segundo
adjetivo, siempre recordar con aoranza los agradables perodos en que se mantuvo unida a
la qumica.

Este libro fue distribuido por cortesa de:

Para obtener tu propio acceso a lecturas y libros electrnicos ilimitados GRATIS


hoy mismo, visita:
http://espanol.Free-eBooks.net

Comparte este libro con todos y cada uno de tus amigos de forma automtica,
mediante la seleccin de cualquiera de las opciones de abajo:

Para mostrar tu agradecimiento al autor y ayudar a otros para tener


agradables experiencias de lectura y encontrar informacin valiosa,
estaremos muy agradecidos si
"publicas un comentario para este libro aqu".

INFORMACIN DE LOS DERECHOS DEL AUTOR


Free-eBooks.net respeta la propiedad intelectual de otros. Cuando los propietarios de los derechos de un libro envan su trabajo a Free-eBooks.net, nos estn dando permiso para distribuir dicho
material. A menos que se indique lo contrario en este libro, este permiso no se transmite a los dems. Por lo tanto, la redistribucin de este libro sn el permiso del propietario de los derechos, puede
constituir una infraccin a las leyes de propiedad intelectual. Si usted cree que su trabajo se ha utilizado de una manera que constituya una violacin a los derechos de autor, por favor, siga nuestras
Recomendaciones y Procedimiento de Reclamos de Violacin a Derechos de Autor como se ve en nuestras Condiciones de Servicio aqu:

http://espanol.free-ebooks.net/tos.html