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L'cotoxicologie

Bioindicateurs - Biomarqueurs
Daniela.Banaru@univmed.fr
&
Thierry.Perez@univmed.fr

L'cotoxicologie, rassemblant, comme son nom lindique,


toxicologie et cologie, a t dfinie en 1977 par Truhaut
comme "la branche de la toxicologie qui tudie les effets
toxiques provoqus par les substances naturelles ou les
polluants d'origine synthtique sur les constituants des
cosystmes animaux, y compris l'homme, vgtaux et microorganismes, dans un contexte intgr".
Les donnes d'ordre cotoxicologiques sont indispensables
pour l'valuation des risques et la gestion de l'environnement.

Effets biologiques des perturbations: fondements dcotoxicologie et


notions de bioindicateurs
1. Concept et utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu
1.1. Dfinitions
1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale
1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE
2. Accumulation de contaminants dans les organismes
2.1. Mthodes de dtection : avantages et inconvnients des mesures
dans leau (air), les sdiments (sols) et les organismes
2.2. Les bioaccumulateurs idaux
3. Mesures deffets biologiques
3.1. Les biomarqueurs
3.1.1. Df. : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non spcif.
3.1.2. Le systme de biotransformation
3.1.3. Gnotoxicit
3.1.4. Protines de stress
3.1.5. Mtallothionines
3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit
3.1.7. Les marqueurs physiol. : ex. de limposex chez les gastrop.
3.1.8. Les marqueurs morphologiques
3.2. Les tests de toxicit
3.3. Effets biologiques au niveau des populations
3.3.1. Les indicateurs cologiques

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

Effets biologiques des perturbations: fondements dcotoxicologie et


notions de bioindicateurs
1. Concept et utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu
1.1. Dfinitions
1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale
1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE
2. Accumulation de contaminants dans les organismes
2.1. Mthodes de dtection : avantages et inconvnients des mesures
dans leau (air), les sdiments (sols) et les organismes
2.2. Les bioaccumulateurs idaux
3. Mesures deffets biologiques
3.1. Les biomarqueurs
3.1.1. Df. : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non spcif.
3.1.2. Le systme de biotransformation
3.1.3. Gnotoxicit
3.1.4. Protines de stress
3.1.5. Mtallothionines
3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit
3.1.7. Les marqueurs physiol. : ex. de limposex chez les gastrop.
3.1.8. Les marqueurs morphologiques
3.2. Les tests de toxicit
3.3. Effets biologiques au niveau des populations
3.3.1. Les indicateurs cologiques

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

BIOEVALUATION

BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION
BIOINDICATEUR

BIOACCUMULATION
BIOMARQUEUR

BIOINDICATEUR

BIOMARQUEUR

Ensemble des procdures fondements biologiques


qui peuvent servir ltablissement de diagnostics
cologiques (Goldberg, 1976)

EVALUATION GLOBALE DE LA QUALITE


DU MILIEU MARIN

EVALUATION GLOBALE DE LA QUALITE DU


MILIEU MARIN

EVALUATION PHYSICO-CHIMIQUE

EVALUATION PHYSICO-CHIMIQUE

Paramtres physico-chimiques dans leau et les sdiments


(temprature, salinit, O2 etc.)

Paramtres physico-chimiques dans leau et les sdiments


(temprature, salinit O2 etc.)

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

BIOEVALUATION

BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION
BIOINDICATEUR

BIOACCUMULATION
BIOMARQUEUR

BIOINDICATEUR

BIOMARQUEUR

Organisme ou ensemble dorganismes qui, par rfrence


des variables biochimiques, cytologiques, physiologiques,
thologiques ou cologiques, permet, de faon pratique et
sre, de caractriser ltat dun cosystme ou dun
cocomplexe et de mettre en vidence aussi prcocement
que possible leurs modifications, naturelles ou provoques

Changement observable et / ou mesurable au niveau


molculaire, biochimique, cellulaire, physiologique ou
comportemental, qui rvle lexposition prsente ou passe
dun individu au moins un facteur de stress

EVALUATION GLOBALE DE LA QUALITE DU


MILIEU MARIN

EVALUATION GLOBALE DE LA QUALITE DU


MILIEU MARIN

EVALUATION PHYSICO-CHIMIQUE

EVALUATION PHYSICO-CHIMIQUE

Paramtres physico-chimiques dans leau et les sdiments


(temprature, salinit O2, etc.

Paramtres physico-chimiques dans leau et les sdiments


(temprature, salinit, O2 etc.)

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

BIOEVALUATION

BIOEVALUATION

BIOACCUMULATION

BIOACCUMULATION

BIOINDICATEUR

BIOMARQUEUR

Accumulation par les organismes vivants de contaminants


directement depuis le milieu ambiant (bioconcentration) ou
depuis leur nourriture (biomagnification) jusqu des niveaux
suprieurs ceux de la contamination du milieu physique

BIOINDICATEUR
Indication des effets
moyen et long terme
sur les populations et
communauts

Indication des contaminants


biodisponibles, donc
potentiellement toxiques pour les
organismes

BIOMARQUEUR
Indication dune
exposition ou deffets
prcoces sur les
organismes

EVALUATION GLOBALE DE LA QUALITE DU


MILIEU MARIN

EVALUATION GLOBALE DE LA QUALITE DU


MILIEU MARIN

EVALUATION PHYSICO-CHIMIQUE

EVALUATION PHYSICO-CHIMIQUE

Paramtres physico-chimiques dans leau et les sdiments


(temprature, salinit, O2 etc.)

Paramtres physico-chimiques dans leau et les sdiments


(temprature, salinit, O2 etc.)

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

Le rle des bioindicateurs :


Dtecter les perturbations de lenvironnement marin
Mesurer les effets de cette perturbation
Apprcier les modifications des conditions environnementales rsultant
de la prise de dispositions remdiatrices

Une seule espce (approche) ne peut pas permettre datteindre ces


objectifs
Il faut abandonner ce concept au profit dune collection
dorganismes (d outils) situs diffrents niveaux trophiques et
couvrant tous les types dhabitats

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Dfinitions

Stress : ensemble de perturbations biologiques provoques par


une agression quelconque sur un organisme.
Facteurs de stress dun organismes

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

Face un stress, ltat physiologique dun organisme peut tre


caractris par trois niveaux majeurs de stress. Ces niveaux sont
dtermins en fonction des dommages causs par les facteurs de stress

Les bioindicateurs doivent tre utiliss pour :


mettre
des
signaux
prcoces
de
problmes
environnementaux ;
identifier les relations de cause effet entre les facteurs
daltration et les effets biologiques ;
valuer ltat de stress global de lenvironnement travers
diffrentes rponses dorganismes indicateurs ;
valuer lefficacit de mesures rparatrices sur la sant des
systmes biologiques.

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

Une sensibilit dpendante du niveau dorganisation


biologique o leffet est mesur
DES BIOINDICATEURS REPRESENTATIFS DE CHAQUE NIVEAU DE STRESS
NIVEAU 1

NIVEAU 2

NIVEAU 3

TRES SENSIBLE

MOYENNEMENT
SENSIBLE

PEU SENSIBLE

Enzymes de dtoxication

Histopathologies

Paramtres de la population

Dommages lADN

Immunologie

Paramtres de la communaut

Mtabolites dans la bile

Energie

Altration du sex-ratio

Enzymes anti-oxydantes

Indices de condition

Altration du rgime alimentaire

Paramtres sanguins

Croissance

Relations entre les niveaux

Protines de stress

Reproduction

trophiques

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

Une bonne spcificit pour certains bioindicateurs


(+++ les biomarqueurs)
Contaminants

Sources

Biomarqueurs potentiels

Hydrocarbures et ptroles Puits de ptrole, industrie CYP1A, Mtabolites des HAP


du ptrole, trafic maritime,
accidents
Mtaux lourds
Extraction de minerais,
MT, HSP, Marqueurs de stress
mtallurgie, agriculture
oxydants
Pesticides
Agriculture, industries,
CYP1A, AChE, HSP, GST,
zones de loisirs
Vitellogenine
Organochlors
Activit industrielle,
CYP1A, HSP, GST,
transformateurs, combustion,Vitellogenine, Stress oxydant
dchets toxiques, etc.
Hydrocarbures
Mtallurgie, combustion CYP1A, HSP, GST, Mtabolites
polyaromatiques
des HAP, dommages lADN
TBT
Peintures antifouling, ports, Imposex
etc.
Alkyl phnols
Dtergents industriels,
Vitellogenine
plastiques, etc.

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

Le cadre lgal : DIRECTIVE 2000/60/CE

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

Le cadre lgal : DIRECTIVE 2000/60/CE

tablissant un cadre pour une politique communautaire dans le domaine de l'eau

dfinir des principes communs pour .


amliorer la qualit des eaux
protger les cosystmes aquatiques
assurer l limination de substances dangereuses prioritaires
obtenir dans l'environnement marin des concentrations qui soient
proches des niveaux de fond pour les substances prsentes
naturellement
etc. etc. etc...

Objectif 2015 !.
Bon tat cologique
Non dtrioration des milieux
Un effort sur les substances dites prioritaires
Mise en place de zones protges

1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu - Concept dune stratgie idale

Le cadre lgal : DIRECTIVE 2000/60/CE


Les paramtres slectionns
1) Paramtres physico-chimiques
(transparence, temprature, bilan oxygne, salinit, nutriments, polluants fixs par dautres textes)

2) Paramtres hydromorphologiques
(profondeur, zone inter-tidale, structure sdiment, dbit, exposition aux vagues, etc.)

3) Paramtres biologiques

ou plutt . cologique

Phytoplancton : composition, biomasse


Macrophytes benthiques : Phanrogames et macroalgues,
composition et abondance
Macrofaune benthique : composition et abondance
Ichtyofaune : composition et abondance, ge (eaux douces et
transition uniquement)

2. Accumulation de contaminants dans les organismes

Notion de Bon tat

tat cologique
5 niveaux
Tr
Trs bon
Bon
Moyen
Mdiocre
Mauvais

tat physico-chimique
2 niveaux
Bon
Mauvais

Dcoupage, typologie des masses d eau

Dfinition dindicateurs
Sites de rfrences
Dfinir le TRES BON

Sites perturbs

Effets biologiques des perturbations: fondements dcotoxicologie et


notions de bioindicateurs
1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu
1.1. Dfinitions
1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale
1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE
2. Accumulation de contaminants dans les organismes
2.1. Mthodes de dtection : avantages et inconvnients des mesures
dans leau (air), les sdiments (sols) et les organismes
2.2. Les bioaccumulateurs idaux
3. Mesures deffets biologiques
3.1. Les biomarqueurs
3.1.1. Df/ : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non spcif.
3.1.2. Le systme de biotransformation
3.1.3. Gnotoxicit
3.1.4. Protines de stress
3.1.5. Mtallothionines
3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit
3.1.7. Les marqueurs physiol. : ex. de limposex chez les gastrop.
3.1.8. Les marqueurs morphologiques
3.2. Les tests de toxicit
3.3. Effets biologiques au niveau des populations
3.3.1. Les indicateurs cologiques

2. Accumulation de contaminants dans les organismes

Les bioaccumulateurs idaux


Trois types de mesures pour trois informations complmentaires
Dans leau : image instantane de la quantit totale de
polluants prsents dans le milieu (RNO)
Dans les sols, les sdiments : accumulation travers le temps,
intgration des sources de variations (problme de
granulomtrie)
Dans les organismes (biomoniteurs) : image de la fraction
biodisponible, potentiellement toxique (en fonction de la
biologie de lespce et du comportement trophique)
Limites de dtection des appareillages utiliss!...

 des espces opportunistes, tolrantes faces aux


perturbations de l'environnement.
 sdentaires et abondants sur les sites tudier.
 faciles rcolter et identifier.
 Accumule et non pas rgule les contaminants ;
reflte les variations de la qualit chimique du milieu
Les vgtaux : algues et phanrogames marines
sources dissoutes de contaminants
Les invertbrs filtreurs : bivalves et spongiaires
sources particulaires et dissoutes de contaminants
Les dtritivores : vers polychtes et crustacs
contaminants accumuls dans les sdiments

Ex. : Mussel watch

Effets biologiques des perturbations: fondements dcotoxicologie et


notions de bioindicateurs
1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu
1.1. Dfinitions
1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale
1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE
2. Accumulation de contaminants dans les organismes
2.1. Mthodes de dtection : avantages et inconvnients des mesures
dans leau (air), les sdiments (sols) et les organismes
2.2. Les bioaccumulateurs idaux
3. Mesures deffets biologiques
3.1. Les biomarqueurs
3.1.1. Df. : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non spcif.
3.1.2. Le systme de biotransformation
3.1.3. Gnotoxicit
3.1.4. Protines de stress
3.1.5. Mtallothionines
3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit
3.1.7. Les marqueurs physiol. : ex. de limposex chez les gastrop.
3.1.8. Les marqueurs morphologiques
3.2. Les tests de toxicit
3.3. Effets biologiques au niveau des populations
3.3.1. Les indicateurs cologiques

3. Mesures d effets biologiques

3. Mesures d effets biologiques

Bioindicateurs de quoi?
 est-ce que les bioindicateurs peuvent attirer notre
attention sur la qualit de lenvironnement ?
 est-ce quun bioindicateur peut suggrer une
cause responsable dune altration, et nous
permettre den dduire des consquences et
ventuellement des mesures de remdiation ?
 est-ce quun organisme donn, prslectionn,
peut servir caractriser brivement ou exprimer
une gnralit ?

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Dfinitions

Les mesures deffets biologiques peuvent se faire diffrents


niveaux, de linfra-individuel jusqu lcosystme

Les biomarqueurs sont dfinis comme des paramtres biologiques


de rponses sub-ltales et deffets des polluants sur des organismes
aquatiques. Cette dfinition inclut un certain nombre de paramtres
molculaires, cellulaires et physiologiques, qui peuvent, en
principe, tre mesurs par des mthodes peu onreuses (Lagadic et
al., 1997).
Lunit biologique du monde vivant rend possible lutilisation
des mmes types de biomarqueurs chez des organismes
appartenant des groupes taxonomiques trs varis du rgne
animal et vgtal.

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Dfinitions

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Dfinitions

Xnobiotique

On distingue gnralement plusieurs types de biomarqueurs :


Organisme vivant
Le biomarqueur dexposition indique que le polluant prsent dans
le milieu a pntr dans lorganisme. Gnralement, il est le rsultat
dinteractions avec des molcules naturelles ou des liquides
biologiques.

Distribution tissulaire
Biotransformations
(systmes
enzymatiques)
Mtabolites
hydrosolubles
inactifs

Mtabolites ractifs
Toxicit
Macromolcules
cellulaires

limination

Le biomarqueur deffet indique, quaprs avoir pntr, le


polluant sest rpandu dans les diffrents tissus, en exerant des
effets toxiques ou non.
+ les indices gnraux de stress, dits non spcifiques et
les marqueurs plus spcifiques
difficult

valuer les consquences de la contamination des individus sur


des niveaux dorganisation biologiques plus levs (populations,
communauts), et finalement sur lcosystme.

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Dfinitions

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Systmes de biotransformation

La mtabolisation de toute molcule xnobiotique caractre hydrophobe met en jeu des


mcanismes permettant daugmenter son hydrosolubilit

Lutilit des biomarqueurs comme outil dvaluation de la


qualit de lenvironnement selon Wolfe, 1992

Xnobiotique
Organisme vivant
Distribution tissulaire

estimer la distribution de substances potentiellement toxiques


la fois dans lenvironnement et dans les organismes vivants,

Biotransformations

mettre en vidence des rponses des organismes lexposition


des contaminants,

Phase I

Phase II

tablir des relations de cause effet entre la prsence des


contaminants et les rponses biologiques,
valuer les consquences de la contamination des individus
sur des niveaux dorganisation biologiques plus levs
(populations, communauts), et finalement sur lcosystme

Phase I

Mtabolites
hydrosolubles
inactifs

Phase II

Mtabolites ractifs
Toxicit
Macromolcules
cellulaires

Elimination

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Systmes de biotransformation

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Systmes de biotransformation

Des transformations non enzymatiques peuvent galement se produire par captage de


formes actives de loxygne induites par le mtabolisme oxydant.= peroxydation
Malgr ces mcanismes de detoxication, certains mnent la formation

Phase I = phase de fonctionnalisation


une oxydation rendant la molcule plus polaire. Ce
mcanisme est assur par les complexes multienzymatiques
dpendants du cytochrome P450.

4 sources potentielles despces toxiques drives du contaminant


Xnobiotiques

des mtabolites issus de


la phase I
des drivs radicalaires
des espces ractives de
loxygne
Esp.toxiques lectrophiles
susceptibles de se lier de
manire covalente avec
des sites nuclophiles
(ADN, ARN, Prot.)

C
E
L
L
U
L
E

Pntration

Xnobiotiques

Xnobiotiques

Pigeurs de
radicaux
libres

Ractions
radicalaires
Mtabolisme de
Phase I

Mtabolites

Mtabolisme de
Phase II

Composs
radicalaires

Cycles
redox +
autres

Mtabolisme de
Phase I

Conjugus

Espces
ractives de
loxygne

protections

Le contaminant lui
mme

Enzymes
antioxydantes

Mtabolisme
de phase II

Mtabolites
lectrophiles

E
F
F
E
T
S

Dtrioration
des
membranes

T
O
XI
Q
U
E
S

Enzymes
inactives

Proxydation
lipidique

Dtrioration
de lADN

+ autres

Excretion

Les enzymes intervenant sont principalement les UDPglucuronosyl-transfrases, les glutathion-S-transfrases, les
sulfotransfrases et catalysent respectivement la conjugaison
du substrat avec l'acide glucuronique, le glutathion, le sulfate
ou une molcule d'eau. Les xnobiotiques, ainsi oxyds puis
conjugus, sont hydrosolubles et donc excrtables.

Effets subcellulaires

Conjugus

Mtabolisme

Phase II = phase de conjugaison

Activation

Protection

Toxicit

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Systmes de biotransformation

Phase I = phase de fonctionnalisation


La distribution des monooxygnases P450 (ou MFO pour MultiFunction Monoxygenase) semble universelle
Des systmes enzymatiques complexes intervenant :
dans l'limination des substances trangres l'organisme
(xnobiotiques),
dans la mtabolisation de substrats physiologiques essentiels, le
P450 tant aussi impliqu dans le mtabolisme endogne. Cela
comprend des ractions d'hydroxylation du cholestrol, des
strodes, des vitamines A et D, d'alcanes et d'acides gras.

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Systmes de biotransformation

Phase I = phase de fonctionnalisation


Cytochrome P-450, sousfamilles et substrats
principaux
IA
xnobiotiques plans
(ex: HAP)

IIB
xnobiotiques globulaires
(ex: barbiturates)
IIIA
(ex: strodes)
IVA
(ex: acides gras)

Inducteurs majeurs

HAP
3-mthylcholanthrne (3-MC)
- naphtoflavone
dibenzo-p-dioxines et
dibenzofuranes chlors
PCB plan
phnobarbital
PCB non plan
prgnnolone-16a-carbonitrile
phnobarbital
dexamthasone
clofibrate
esters de phtalate

Activits types

EROD
ECOD
BPH

PROD, EMND,
APND
EMND
T6H
P6H
LAH

EROD (7-thoxyrsorufine O-dthylase); ECOD (7-thoxycoumarine O-dthylase); BPH (benzo(a)pyrne hydroxylase);


PROD (pentoxyrsorufine O-dalkylase); EMND (thylmorphine N-dmthylase); APND (aminopyrine N-dmthylase); T6H
(testostrone 6-hydroxylase); P6H (progestrone 6-hydroxylase); LAH (laurate hydroxylase)

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Systmes de biotransformation

Phase II = phase de conjugaison


Le plus souvent indissociable de la phase I : la phase I prpare le
xnobiotique pour la conjugaison, tape finale de la dtoxication
Les ractions de phase II ont comme rle physiologique :

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Gnotoxicit

ADN = structure molculaire dpositaire du patrimoine


gntique
Lintgrit de sa structure complexe est essentielle la
survie de la cellule

la rgulation de l'activit biologique de composs endognes


tels que les hormones strodes
Modifiable par des agents dits gnotoxiques
le transport de ces hormones dans l'organisme afin de
prolonger leur demi-vie et d'atteindre slectivement leurs
cellules cibles
les plus importantes pour le
mtabolisme des xnobiotiques

la glucuronidation, la sulfatation et
la conjugaison au glutathion

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Gnotoxicit

Dtectable par :

lanalyse directe de la structure de lADN


la dtection des traductions fonctionnelles

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Gnotoxicit

Formation d adduits
Les xnobiotiques peuvent induire deux types daltrations
susceptibles dtre utilises comme biomarqueurs:

Liaisons covalentes entre un


xnobiotiques (
(lectrophiles) et les
sites nucl
nuclophiles de l
lADN

1) la formation de produits daddition entre le xnobiotique


et les nuclotides, appels adduits
N-2-benzo[a]pyrnediol-dsoxyguanosine

2) des cassures au niveau dun seul brin, ou des deux brins,


dADN conduisant parfois la formation de
micronoyaux.
Reprsentation schmatique de lactivation des
HAP amenant la formation dadduits lADN

Schma dactivation du benzo[a]pyrne en


carcinogne ultime (diolepoxyde) et
formation de ladduit correspondant

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Gnotoxicit

Fragmentation de l ADN
Cassures de monomono-brins
dADN (Single Strand
Break)
Extraction, dnaturation et droulement
de l ADN
Les brins casss sont les premiers
Sparation par chromatographie et
quantification

Le test comte
Pas d extraction
Analyse sur les noyaux inclus dans de
l agarose et prsents sur lame
Dnaturation et migration par
lctrophorse

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress

Les protines de stress - toutes les protines inductibles


par un sens au sens large : protines de choc thermique,
protines glucose rgules , ubiquitine,
mtallothionines ou P-glycoprotines du systme MXR...
Une rponse similaire chez tous les organismes. Des
molcules ubiquistes, marqueurs phylogntiques.
La rponse universelle un stress = induction de
protines jouant un rle cl dans les processus de
protection, rparation et/ou limination des protines
endommages
Des protines susceptibles daccrotre la tolrance des
organismes
Leur accumulation peut permettre d identifier les organes
cibles de substances chimiques nouvelles

Thierry Perez

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP


Famille

Protines de stress :

HSP 110
HSP 90 (83-90 kDa)

Maintien de l homostasie
cellulaire sous l influence de
stress environnementaux

HSP 70 (68-73 kDa)

Des gnes et des protines


remarquablement conservs

Fonctions

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP

Localisation

Chaperon

Noyau

Association au rcepteur des

Cytoplasme,

strodes, antignes tumoraux

rticulum

Chaperon molculaire :

Cytoplasme,

- assemblage des protines

rticulum,

- translocation des protines

mitochondrie,

- maintien de la solubilit des

noyau

protines nuclaires et
cytosoliques

Des protines normalement exprimes en labsence de stress


Elles peuvent reprsenter jusqu 5% des protines cellulaires totales
Elles jouent un rle dans la rcupration (aprs dnaturation) ou dans
la mise en place initiale (aprs synthse) de la conformation
tridimensionnelle d autres protines
Elles sont sur-exprimes pour faire face une grande varit de stress

- ciblage des protines vers les


lysosomes

Protines de choc
thermique :

- apprtement de lantigne
HSP 60

Chaperon molculaire

Cytoplasme,
mitochondrie,
chloroplaste,

Plusieurs familles de HSP de


diffrents poids molculaires,
surexprimes en rponse
une grande varit de stress

cytoplasme
HSP de faible poids

Protines de liaison du collagne, Cytoplasme

molculaire (20-30

chaperons molculaires,

kDa)

constitution du protasome

Nucloplasmide

Formation du nuclosome

Noyau

Ferritine

Stockage du fer

Cytoplasme

Ubiquitine (7-8 kDa)

Constituant du protasome

Cytoplasme

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP

Facteurs de
HSP
stress
Temprature,
70
PCB, TBT, Cd
Temprature
70
Actiniaires
Madrporaires Temprature 20-30, 70, 90
90
Octocoralliaires Temprature,
PCB (CB118)
Temprature,
70
Mollusques
Cd, PCB
bivalves
Spongiaires

Rfrences
Batel et al., 1993 ; Mller et al., 1995 ; Koziol, 1998 ;
Mller et al., 1998 ; Schrder et al., 1999
Sharp et al., 1994
Black et al., 1995
Wiens et al., 2000
Sanders, 1988 ; Brown et al., 1995 ; Bradley et al., 1998 ;
Smerdon et al., 1995 ; Chapple et al., 1998 ; Steinert &
Pickwell, 1993 ; Lundebye et al., 1997

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP 70

PROBLEME
Bien que prometteur, ce biomarqueur a t rarement employ en
conditions naturelles
Une majorit dtudes effectues en conditions exprimentales de
stress aigu

OBJECTIFS
tudier in situ les variations des niveaux dexpression de la HSP 70
Confronter les rsultats aux variations de la qualit du milieu, et en
particulier aux variations de la contamination chimique de S.
officinalis

Une mthode de dtection : le western-blot

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP 70

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - HSP 70

Expression des prot


protines de choc thermique
en relation avec les fluctuations saisonni
saisonnires
de temp
temprature
Temperature (C) 24
22
20
18
16
14
12
10

HSP 60 (g/
g/g
de prot
protine)
0.08
0.06

Analyse de corr
corrlation multiple :
temp
temprature et facteurs biotiques

Hemimysis margalefi
1 chantillonnage mensuel
2 p
priodes entre 2000 et 2004

HSP 85
pas de corr
corrlation avec la temp
temprature
aucun autre facteur pris en compte
nexplique la variabilit
variabilit

0.04
0.02
0
fev mar avr mai jun

jul

aou sep oct

2000

nov dec

jan

fev mar avr mai jun

2001
HSP 60 (g/
g/g de prot
protine)

HSP 60
corr
corrlation significative avec la temp
temprature
variation partiellement expliqu
explique par le % de
femelles gravides dans l
chantillon ( HSP)
lchantillon

Temperature (C)
24
22
20
18
16
14
12
10

0.08

0.06

0.04

HSP 45
corr
corrlation significative avec la temp
temprature
variation partiellement expliqu
explique par le %
dindividus immatures (
( HSP)

0.02

0
oct nov dec jan fev mar avr mai jun jul

2002

aou sep oct nov dec jan fev mar avr mai jun jul aou

2003

2004

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - Mtallothionines

Expression des prot


protines de choc thermique et
production de d
dfenses chimiques dans le contexte de
la maladie de 2003
10/09/2003

Des ligands intracellulaires inductibles par les mtaux

10/09/2003

HSP 70 (
(g / g prot.)

La famille des mtalloprotines : faible PM (<10Kda), de 25 64 AA,


thermorsistantes, et une composition en AA particulire

EC 50 g / ml

2,4

500

1,8

400

1,2

300

0,6

200

0,0

100

Riches en cystine

Dates (chantillonnage mensuel)


0

Cys

Cys

Cys

Cys
Cys

30 % des AA

Cys

Des groupements thiols


libres
Dates (chantillonnage mensuel)

Ref
Refrence

Maladie

27/08/2003
1re observation de n
ncroses
chez les spongiaires

1,96*Ec.-Type
1,00*Ec.-Type
Moyenne

Formation de complexes
metal-thiolates
Affinit pour les ions
mtalliques lourds : Zn, Cd,
Ag, Cu, Hg

Cys

Cys

Cys

Cys

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - Mtallothionines

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Protines de stress - Mtallothionines

Trois classes de protines de type MT (PTM ou MTLP)


Classe I : MT des vertbrs, certains invertbrs, certains champignons
Classe II : entre autre, les MT des oursins
Classe III : petits peptides non cods gntiquement, des plantes, des champignons

Deux rles essentiels


Homostasie : Zn et Cu sont essentiels, activit des
polymrases, facteurs de transcription et autres
mtalloenzymes. Les MT sont des formes de stockage de ces
ions et peuvent librer en cas de ncessiter.

Des groupements thiols


libres
Formation de complexes
metal-thiolates

Detoxication : Fixe (squestre, chlate) les mtaux. Leur


induction lors de contaminations suggrent leur implication
dans la protection contre la toxicit des mtaux.

Affinit pour les ions


mtalliques lourds : Zn, Cd,
Ag, Cu, Hg

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs de Neurotoxicit

Action toxique des pesticides organophosphors et des


carbamates au niveau du systme nerveux
Toxicit lie leur action inhibitrice sur lactivit de
lactylcholinestrase
Lenzyme (AChE) met fin au signal
nerveux en liminant le neuromdiateur
des synapses

Sinon...
Blocage de linflux nerveux

Les toxiques prsentent des analogies


avec lactylcholine. Il s agit donc
d une inhibition comptitive
(fixation du comptiteur au niveau du
site actif de lenzyme)

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs physiologiques

Atteinte du m
mtabolisme nerg
nergtique

BILAN METABOLIQUE = F (tat de sant)

Deux mthodes appliques en routine aux bivalves

Scope for Growth

C=R+F+U+P

(daprs Widdows)

C: consommation
R: nergie lie au catabolisme endogne, estime par la conso. en O2

ol
c

lo
ng
ea

nn
xo
-sa

F: nergie rejete sous forme particulaire


U: nergie rejete sous forme d urine (ou excrtion azote)
P: nergie disponible pour la production = gain brut (tissus, scrtion)

Stress on stress

(Daprs Viarengo)

= la rsistance l anoxie
c

e
ol

lie
ita

e
nn

En dautres termes le temps de survie


l air en laboratoire

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs physiologiques

Atteinte des fonctions reproductrices

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs physiologiques

Atteinte des fonctions reproductrices

Les facteurs du milieu exercent leur influence sur les gniteurs


(gamtognse et fcondit), sur les gamtes (fcondabilit,
spermiotoxicit, ovotoxicit) et sur ltat de la descendance
(embryotoxicit, tratognse)

Nucella lapillus (gastropodes)

IMPOSEX
Marqueur spcifique d une
contamination par les TBT
En grande partie due linteraction avec le
mtabolisme des strodes

Trs employ chez les poissons

Reproduction success

Trs employ chez les mollusques


+++ tests de toxicit
Employ chez les chinodermes

Apparition de caractres mle chez des


femelles
Un indice TRP (%) = moy X / moy Y
RSP
moy X = valeur moyenne (male) du rapport poids
penis / poids du corps
moy Y = valeur moyenne (femelle) du rapport
poids penis / poids du corps

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs morphologiques

Changements
physiologiques et
biochimiques induits par
les contaminants

Lsions des cellules,


des tissus et organes
Les altrations
morphologiques permettent
dvaluer les effets
dexposition de longues
dures, mme de faibles
niveaux de contamination

3. Mesures d effets biologiques - les biomarqueurs - Marqueurs morphologiques

Ncroses chez les invertbrs


marins

Un concept applicable aux


mtazoaires et macrophytes

Biomarqueur deffet , indicateur cologiques ?

Variabilit
Variabilit de llexpression des prot
protines de
choc thermique chez un gorgonaire

Variabilit
Variabilit de llexpression des prot
protines de
choc thermique chez un gorgonaire

Un marqueur de rsistance au stress

Un marqueur de rsistance au stress


HSP 70 Paramuricea clavata

HSP 70 Paramuricea clavata


Peu de variabilit
variabilit intraintraindividuelle
Forte variabilit
variabilit intraintraindividuelle

Variabilit
Variabilit plus forte
faible profondeur :
Plane Cv = 85% (contre 40%)
Riou Cv = 40% (contre 22%)
Une variabilit
variabilit des capacit
capacits de r
rsistance visible lil
il nu !

Les limites des biomarqueurs


Les traitements des chantillons
La rfrence bruit de fond
Facteurs gntiques (MXR Multi-XenobioticResistance)

Facteurs physiologiques (lage, le sexe, les facteurs


nutritionnels, les saisons)

Les pollutions mixtes et les interactions avec


dautres polluants
La dure des effets biologiques
Le caging pour matriser les sources de variations

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

Effets biologiques des perturbations: fondements dcotoxicologie et


notions de bioindicateurs
1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu
1.1. Dfinitions
1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale
1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE
2. Accumulation de contaminants dans les organismes
2.1. Mthodes de dtection : avantages et inconvnients des mesures dans leau
(air), les sdiments (sols) et les organismes
2.2. Les bioaccumulateurs idaux
3. Mesures deffets biologiques
3.1. Les biomarqueurs
3.1.1. Dfinitions : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non
spcifiques
3.1.2. Le systme de biotransformation
3.1.3. Gnotoxicit
3.1.4. Protines de stress
3.1.5. Mtallothionines
3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit
3.1.7. Les marqueurs physiologiques : exemple de limposex chez les
gastropodes
3.1.8. Les marqueurs morphologiques
3.2. Les tests de toxicit
3.3. Effets biologiques au niveau des populations
3.3.1. Les indicateurs cologiques

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

Les tests ltaux

Les tests subltaux

Ces tests sont les plus couramment utiliss en laboratoire, du fait de


leur simplicit et de leur rapidit de mise en uvre. Les effets ltaux
sont facilement identifiables et la courte dure du test ne pose pas de
problme en ce qui concerne le maintien technique des organismestest et des conditions exprimentales. Ces tests sont raliss partir de
concentrations en polluant nettement suprieures celles mesures
dans le milieu. De ce fait, leur manque de reprsentativit et la
difficult d'extrapolation au milieu naturel leur ont valu de
nombreuses critiques. Cependant, malgr leurs limites, ils restent
indispensables ( condition qu'ils soient rigoureusement conduits)
pour des tudes prliminaires sur l'valuation de l'impact de nouveaux
produits chimiques, le suivi des effluents, les accidents ptroliers
impliquant l'utilisation de dispersants, les "screening" des rejets de
produits chimiques et les installations offshore.

Ils sont bass sur l'apprciation d'effets indsirables sur les individus.
Ces effets ont souvent une origine biochimique tant donn que la
plupart des toxiques exercent leurs effets par le biais de modifications
d'activits enzymatiques. Les effets les plus couramment tudis
concernent des arrts de croissance, des perturbations de la
reproduction, des baisses de l'activit, des effets mutagnes L'effet
pourra tre qualifi "d'indsirable" dans la mesure o l'on connat sa
signification physiologique et cologique et o il ne s'agit pas d'une
raction d'adaptation bnfique pour l'espce tudie.

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

Les tests incluant des cosystmes exprimentaux


Ces tests consistent soit reproduire des cosystmes en laboratoire,
soit raliser des expriences in situ par contamination du milieu.
Leur finalit est l'tude des phnomnes de fixation et de
concentration des polluants rmanents travers les espces.

Diffrents tests de toxicit disponibles


Souvent empiriques (ne tiennent pas compte des
mcanismes biochimiques et physiologiques qui
aboutissent un effet ltal ou sub-ltal)
Pour une meilleure valuation de la qualit du milieu
est envisager de coupler des bio tests avec des
mesures de biomarqueurs

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

Tests de toxicit oprationnelles:


Tests letaux

Des tests standardiss


Effet ltal sur le loup ou la truite : CL 50

Acartia torsa
Chaetogamarus marinus
Crangon crangon
Brachionus plicatilis
Nitocra spinipes
Dicentrachus labrax
Artemia salina
Fundulus heteroclitus

boues de forage
effluents industriels

Test Microtox : bioluminescence dune bactrie Vibrio fischeri


(ex- Photobacterium phosphoreum)

produits chimiques
dispersants dHC

Tests subletaux
Photobacterium phosphoreum
Skeletonema costatum
Balanus improvisus
Mytilus edulis
Mysidopsis bahia
Arbacia punctulata
Cyprinodon variegatus

boues de forage

effluents

Test Microtox : bioluminescence dune bactrie Vibrio fischeri


(ex-Photobacterium phosphoreum)

Expression des prot


protines de choc thermique et
production de d
dfenses chimiques dans le contexte de
la maladie de 2003
HSP 70 (
(g / g prot.)

Extraction des substances toxiques


dans un solvant organique

2,0

(mthanol/di-chloromthane)

1,6

Dissolution de lextrait dans de leau


de mer synthtique

EC 50 g / ml
400

300

1,2
0,8

200

0,4
100
0,0

Test pour une gamme de


concentrations constante

Chromatographie
(CCM, GCGC-MS)

Toxicit
Toxicit

EC 50

Rfrence

Composition
de l
lextrait

Maladie

Expression HSP 70
 2 fois sup
suprieure

Ref
Refrence

Maladie

Production de d
dfenses chimiques
1,5 fois inf
infrieure
1,96*Ec.-Type
1,00*Ec.-Type
Moyenne

3. Mesures d effets biologiques - les tests de toxicit

Expression des prot


protines de choc thermique et
production de d
dfenses chimiques dans le contexte de
la maladie de 2003

Des tests standardiss


Effet ltal sur le loup ou la truite : CL 50

EC 50 g / ml

Une diminution significative de la


production de d
dfenses chimiques
400

Test Microtox : bioluminescence dune bactrie Vibrio fischeri


(ex- Photobacterium phosphoreum)

?
300

Expression de
certaines
mol
molcules

Test dinhibition de la croissance de Skeletonema costatum


200

Des critres de slection

100

Sensibilit : dceler des petites variations


0

Capacit
Capacit de d
dfense 

=
Porte ouverte aux pathog
pathognes

Ref
Refrence

Maladie

Spcificit : rponse un paramtre donn


1,96*Ec.-Type

Reprsentativit : de phnomnes naturels

1,00*Ec.-Type
Moyenne

Effets biologiques des perturbations: fondements dcotoxicologie et


notions de bioindicateurs
1. Concept et Utilisation de bioindicateurs de la qualit du milieu
1.1. Dfinitions
1.2. Concept dune stratgie de bio-surveillance idale
1.3. Le Contexte lgal : application de la DCE
2. Accumulation de contaminants dans les organismes
2.1. Mthodes de dtection : avantages et inconvnients des mesures
dans leau (air), les sdiments (sols) et les organismes
2.2. Les bioaccumulateurs idaux
3. Mesures deffets biologiques
3.1. Les biomarqueurs
3.1.1. Df. : marqueurs deffet, dexposition, spcifiques, non spcif.
3.1.2. Le systme de biotransformation
3.1.3. Gnotoxicit
3.1.4. Protines de stress
3.1.5. Mtallothionines
3.1.6. Marqueurs de neurotoxicit
3.1.7. Les marqueurs physiol. : ex. de limposex chez les gastrop.
3.1.8. Les marqueurs morphologiques
3.2. Les tests de toxicit
3.3. Effets biologiques au niveau des populations
3.3.1. Les indicateurs cologiques

3. Mesures d effets biologiques au niveau des populations et communauts

3. Mesures d effets biologiques au niveau des populations et communauts

Les indicateurs cologiques


Les changements de structure des assemblages benthiques peuvent
permettre une meilleure caractrisation de la distribution spatiotemporelle de la pollution. Il est ainsi possible de classer les espces des
diffrents grands groupes dorganismes marins selon leur sensibilit ou
leur tolrance aux perturbations dorigine anthropique (Glmarec,
1985) :
les espces sensibles, dominant largement le peuplement en conditions
normales,
les espces tolrantes, parmi lesquelles certaines ne fluctuent pas de
faon significative dans des conditions anormales, et dautres prolifrent
lorsquil y a une perturbation,
les espces opportunistes, supportant aisment des conditions de
perturbation extrmes.

3. Mesures d effets biologiques au niveau des populations et communauts

Les indicateurs cologiques

Les indicateurs cologiques

Des espces indicatrices : prsence, absence, abondance,


morphologie (biomarqueur?)

Des indices mathmatiques ou indices biotiques : des indices


de diversit (Shannon), des distributions thoriques

Distribution log-normale (Gray, 1981; Warwick; 1993)


Indice trophique (Word, 1990)
Indice Annelidien de Pollution (Bellan, 1979)
Indices biotiques et coefficient biotiques (Borja et al., 2000)
etc etc.
des indices simplifies (peut tre la solution?)

3. Mesures d effets biologiques au niveau des populations et communauts

Capo (1998). Evaluation des bryozoaires comme bioindicateurs. Diplome d'Etudes


Approfondies. Universit de la Mditerrane, 38 pages

3. Mesures d effets biologiques au niveau des populations et communauts

Distribution des grandes esp


espces dress
dresses sur le gradient de pollution

Harmelin & Capo (2002). Effects of sewage on bryozoan diversity in


Mediterranean rocky bottoms. In : P. Wyse Jackson, C. Buttler & M. Spencer Jones
(eds), Bryozoan Studies 2001: Proceedings of the 12th International Bryozoology
Association Conference , Swets & Zeitlinger Publishers, Sassenheim.

Richesse sp
spcifique des assemblages de bryozoaires en soussous-blocs
Large erect bryozoans
Richness & abundance (x + sd)/quadrat

12

N Colonies
N Species

10
DOMINANT CIRCULATION: E - W
8
5000m

2400m

900m

700m

400m

400m

1300m

5000m

6
6

SEWER
OUTLET

4
4

1
0

0
Riou

Sormiou Vaisse 1 Vaisse 2

Calsom CORTIOU Melette

0
Cirque

Maire

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