Micro Biolog I A

MICROBIOLOGIA GENERAL
MANTENIMIENTO Y CONSERVACION DE CEPAS MICROBIANAS

1. INTRODUCCION
Los microorganismos representan un papel esencial para el mantenimiento y

funcionamiento de los ecosistemas globales y como fuente de nuevos recursos
para el desarrollo de la medicina, la industria, la agricultura y la biotecnologa. Por
eso es necesario conservar toda esta fuente microbiana y esto se garantiza
mediante las colecciones de cultivos. En la ltima dcada, se ha visto un marcado
aumento en la concientizacin del valor de las colecciones de cultivos.
Actualmente, existen en el mundo alrededor de 488 colecciones de 65 pases
registradas en el Centro de Datos Mundial de Microorganismos de Japn.
Adems, se han establecido organizaciones mundiales, regionales y nacionales.
El acelerado desarrollo en Cuba de la industria farmacutica y biotecnolgica, as
como el potencial uso de los microorganismos, obligan cada vez ms a promover
actividades de aseguramiento de la calidad para su conservacin, de manera que
puedan ser utilizados en diversos ensayos analticos en los laboratorios de control
microbiolgico. La necesidad de mantener y disponer de cultivos de calidad
impuso la introduccin de mtodos de conservacin de microorganismos que
reducen al mnimo la posibilidad de contaminacin y garantizan al menos la
supervivencia del 70 % de las clulas por un periodo determinado de tiempo. La
liofilizacin es el mtodo de eleccin debido a sus numerosas ventajas, entre las
que se puede resaltar la posibilidad de minimizar al mximo el riesgo de cambio
gentico en las clulas y las mantienen viables por 10 aos o ms. Adems es
recomendable por su comodidad en almacenamiento y transporte de las cepas,
pues una vez conseguidos los lifilos pueden almacenarse a una temperatura
ambiente de 18 a 20 C o bien de 4 a 6 C. El laboratorio de control microbiolgico
de Laboratorios Lio rad dispona de una coleccin de cepas procedentes de
subcultivos de cepas de referencia de la American Type Culture Coleccin (ATCC).
El mtodo de conservacin empleado era la congelacin a 70 C, metodologa
que no resulta la ms conveniente para la conservacin por largos periodos de
tiempo, por tal motivo surgi la necesidad de evaluar otra estrategia de
conservacin para estos microorganismos. La metodologa propuesta fue emplear
el Caldo Triptona Soy (CTS) como medio de crecimiento, la leche descremada y el
INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS UNSA
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glicerol al 20% (sustancias lioprotectoras), la liofilizacin como mtodo de

conservacin y ensayos de calidad: viabilidad, pureza e identidad.
2. OBJETIVOS
Para hacer este trabajo hemos tomado en cuenta principalmente tres objetivos
para una correcta conservacin:
1. Mantenimiento del cultivo puro (pureza).
2. Que la cepa microbiana este viva (viabilidad).
3. La cepa debe guardarse genticamente estable (estabilidad).
Los dos primeros objetivos no son muy difciles de conseguir cuando se conoce
bien la tcnica microbiolgica, pero el tercero puede presentar dificultades. Motivo
por el cual existen varios mtodos de conservacin para los microorganismos, y
ninguno de ellos es de utilizacin general. Vamos a resumir estos mtodos
agrupndolos en tres apartados, que son: Mtodos de eleccin o de conservacin
a largo plazo, mtodos alternativos y mtodos restringidos.
El objetivo tambin es verificar la viabilidad y el mantenimiento de los caracteres
fisiolgicos de cepas bacterianas originalmente preservadas en medio semislido
de conservacin desde finales de 1980, se estudiaron 60 cepas bacterianas de las
familias Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae y Pseudomonaceae,
mantenidas como patrones de referencia en la coleccin de cultivos microbianos
del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiologa y Microbiologa. El 85,0 % de las
cepas se mantuvo viable durante 12 aos con un 45,3 de sus niveles de viabilidad
del orden de 107 Ufc/mL y un 87,0 de pureza, as como un 95,2 de preservacin
de las caractersticas fenotpicas. El medio permiti la conservacin con buenos
resultados de las cepas, lo que sugiere su empleo como mtodo simple en los
laboratorios con limitados recursos.
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3. REVISION BIBLIOGRAFICA
En un ensayo se utilizan cepas de Salmonella typhimurium, construidas por

ingeniera gentica, capaces de detectar compuestos que causan mutaciones
gnicas. La mayor dificultad del trabajo con estas cepas es la disminucin de la
calidad en cuanto a la prdida total o parcial de los marcadores fenotpicos, por
ser susceptibles a los cambios de temperatura. El objetivo de este trabajo es
profundizar sobre el tema de cmo conservar estas cepas eficientemente, siendo
evaluadas mediante las pruebas fenotpicas como parmetro de calidad del
proceso. Se hace alusin a los mtodos generales de conservacin, utilidad del
ensayo de ames, evaluaciones a incluir en las pruebas fenotpicas y su utilidad
para definir el mtodo ms eficaz de conservacin. Los mtodos ms eficaces de
conservacin lo constituyen la liofilizacin en primer lugar y la congelacin a -80C
como mtodo alternativo para un corto periodo de tiempo, las pruebas fenotpicas
utilizadas como parmetros de calidad nos permiten definir cul es el mtodo ideal
de conservacin. Bajo nuestras condiciones experimentales, para el caso de las
cepas TA 98, 100 y 102 evaluadas durante 3 aos, el mejor mtodo de
conservacin es la liofilizacin con mantenimiento a 4C, sin modificaciones
significativas en el efecto mutacin his y la frecuencia espontnea de reversiones.
Palabras clave: Conservar, Salmonella typhimurium, ensayo de ames, pruebas
fenotpicas, TA 98, TA 100, TA 102.
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4. ANTECEDENTES
4.1. PRIMERAS COLECCIONES DE CULTIVO

Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catlogo-La ms antigua Lovaina
(Blgica) (Hongos)-La ATCC,en 1925.No vnculos directos con la Universidad, es
de carcter comercial (Manassas, USA).-La CECT,nace en el CSIC(Villanueva)
(1960).-PRCC ,Profesor J.L.Ramos (Pseudomonas putida)A partir de 1972 las CC
se agrupan en la organizacin internacionaldenominada World Federation for
Culture Collection (WFCC).En Europa a su vez estan agrupadas en la European
Culture ColletionOrganization (ECCO) que se fund en 1982.
1677 VAN LEEWENHOEK (HOLANDA): Animalculos en agua y cerveza.
1830 CAGNIARD-LATOUR (FRANCIA): Alcohol es producido por bacterias.
1860 PASTEUR (FRANCIA): FERMENTACIN = Microorganismos. Emplea
como medios slidos, papa y meln.
1890 HANSEN Desarrolla la tcnica del cultivo puro con levaduras.
1900 Cultivos puros de bacterias y levaduras se mantienen en medios
slidos a base de caldo nutritivo y extracto de malta y se propagan
peridicamente. Se requiere conservacin a largo plazo para preservar las
caractersticas de los cultivos.
1909-1911 SHACKEL; HAMMER: Primeros mtodos de liofilizacin para
bacterias y virus, empleo de suero y leche como protectores.
1914 LUMIERE Y CHERROTIER Conserva cultivos de gonococcus bajo
una capa de parafina lquida, el mtodo es perfeccionado por Morton y
Pulski (1938).
1945-1950 La produccin industrial de antibiticos estimula el desarrollo de
nuevas tcnicas. Liofilizacin, crio-conservacin, adsorcin en suelo, etc.;
permite el mantenimiento de cultivos por 10 o 20 aos.
1950 Se descubre el efecto crioprotector de varios compuestos: glicerol,
dimetilsulfxido, sacarosa.
1890 FRANTISEK KRAL Genera la primera coleccin de bacterias y hongos
en praga. Cepas de mycobacterium (koch). Cierra en 1911. Se pierden las
cepas.
2003 23 instituciones internacionales autorizadas para recibir material
biolgico con una patente de aplicacin (tratado de Budapest 1991).
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5. DESARROLLO DEL TEMA
5.1. METODOS DE ELECCION O CONSERVACION A LARGO PLAZO

Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas
microbianas, pero stas no han muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad
gentica, por evitarse la aparicin de generaciones sucesivas. An as no se
puede descartar algn cambio originado por el mtodo preparatorio en si mismo.
Los mtodos de conservacin pertenecientes a este grupo son dos: Congelacin y
liofilizacin.
5.1.1.
O
N
S
E
RVACION
CONGELACION
POR
Al bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste

se reduce el metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente
anularlo
con
nitrgeno
lquido
(-196C).
Sin embargo, existen una serie de problemas que debemos tener en
cuenta. La formacin de cristales de hielo pueden romper las clulas,
adems al eliminar el agua lquida por convertirse en hielo existe una
concentracin de sales que puede ser perjudicial. Para evitar estos
problemas se deben utilizar suspensiones que contengan el mnimo de
sales posibles as como utilizar agentes protectores como el glicerol (25%)
o dimetilsulfxido (DMSO c.a. 10%) que neutralizan el efecto de las sales.
El realizar el proceso de congelacin de una forma rpida o gradualmente
no est claro. Algunos recomiendan una bajada gradual (1C/min) hasta
-20C para posteriormente enfriar rpidamente, Las distintas temperaturas
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que se utilizan para la conservacin de los microorganismos por

congelacin son:
-30C: congelador de frigorfico. No se recomienda debido a la
formacin de eutcticos (suspensin con distintos puntos de
congelacin debido a los solutos que pueden daar a las clulas).
-70C: nieve carbnica (CO2 slido) o ultracongeladores. Es el mtodo
ms utilizado en los laboratorios.
-196C: nitrgeno lquido. Se utiliza para la conservacin de bacterias,
virus y lneas celulares. Existen varios problemas prcticos: el nitrgeno
se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se
deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que
estn bien cerrados para evitar la entrada de nitrgeno lquido.
Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente
crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados
centgrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer
las clulas de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere
trabajar con las clulas as conservadas, se recuperan subiendo la
temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde todos los
puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales,
y adems existe el peligro de que algn fallo del sistema produzca una
subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento. Tambin
resulta ser el mtodo ms molesto para realizar el envo de las cepas. Los
cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las clulas
conservadas por este mtodo son los siguientes:
A. Edad de las clulas
En la mayora de los casos conviene utilizar clulas maduras del
inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando
se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algn estado
que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es
preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de
microorganismos que esporulan, en algunos pleomrficos e incluso
en algunos ms sencillos.
B. Velocidad en la congelacin y descongelacin
Aunque hay programas de congelacin bien estandarizados para
determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las
variaciones de la temperatura sean rpidas, tanto para la
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congelacin como para la descongelacin, por lo que para

descongelar conviene poner las clulas a 37C.
C. Temperatura de almacenamiento
Debe ser lo ms baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o
sellados, que contengan las clulas microbianas, sumergidos en
nitrgeno lquido, que tiene una temperatura de 195C, o bien en la
fase gaseosa del nitrgeno lquido, con una temperatura de 140C.
En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los
cuales los ms aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo
de 70C. Aquellos que slo alcanzan temperaturas entre 20C y 40C,
como ocurre con la mayora, no son aconsejables, entre otras cosas porque
debido a la gran concentracin de solutos que existen en la suspensin
celular, su punto de congelacin baja. El dao que se produce en las
clulas es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones
y descongelaciones. Si se aade un crioprotector no inico, como por
ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita
el aumento de la concentracin inica.
Para la conservacin en armarios congeladores, las clulas se almacenan
en crio tubos (tubos de plstico esterilizables resistentes a la congelacin
que cierran hermticamente), preparando lotes de varios tubos para cada
cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasin. De
esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias
veces. Esto tambin se puede evitar empleando tubos con criobolas (bolas
de tipo abalorio que se impregnan con la solucin celular a congelar), ya
que para tomar una muestra basta con emplear una o varias bolitas sin
necesidad de descongelar el resto. Este mtodo no se debe emplear para la
conservacin de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el gnero
bacteriano Clostridium, ya que al estar las clulas en una superficie hay un
mayor contacto con el oxgeno y puede afectarse la viabilidad.
Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del dao que
se pueda producir en las clulas microbianas en el momento de la
congelacin. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como
crioprotectores, pero el que se utiliza con ms frecuencia es el glicerol, a
una concentracin del 15 al 20%. Tambin se pueden utilizar el
dimetilsulfxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa,
lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su eleccin influye el tipo de
microorganismo que se quiera conservar.
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5.1.2. CONSERVACION POR LIOFILIZACION.

A. Definicin
La liofilizacin es una forma de desecado en frio que sirve para
conservar sin dao los ms diversos materiales biolgicos. EL
producto se conserva con muy bajo peso y a temperatura ambiente y
mantiene todas sus propiedades al rehidratarse. En el proceso,
primero se congela el material, y luego el hielo se elimina por
sublimacin.
La liofilizacin es un proceso que consiste en desecar un producto
previamente congelado, logrndose la sublimacin del hielo bajo
vacio. Es por lo tanto el paso directo del hielo (solido) a gas (vapor),
sin que en ningn momento aparezca el agua en estado liquido, Se
obtiene una masa seca, esponjosa de ms o menos el mismo
tamao que la masa congelada original, mejorando su estabilidad y
siendo fcilmente redisuelta en agua.
B. Fundamentos de la liofilizacin
El proceso de liofilizacin consta de dos etapas: congelacin y
secado. La congelacin debe ser muy rpida con el onjeto de
obtener un producto con cristales de hielo pequeos y en un estado
amorfo. La etapa de secado se realiza a presiones bajas para
permitir la sublimacin del hielo.
El proceso de liofilizacin se desarrolla en tres fases:
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1. La fase de pre congelacin hasta la temperatura en la que el

material est completamente slido, que ser inferior a 0C.
2. La fase de sublimacin propiamente dicha, tambin llamada
desecacin primaria en la que se elimina alrededor del 90%
del agua. Lo que lleva al producto a una humedad del orden
del 90%. Se elimina el hielo libre.
3. La fase del desercin o desecacin secundaria, que elimina
el 10% de agua ligada restante. Con lo que se puede llegar
hasta productos de una humedad del 2%. Esta fase consiste
en un evaporizacin a vacio, a una temperatura positiva de 20
a 60C.
En la grafica se representa, sobre el diagrama de fases, la
comparacin de los procesos que tienen lugar en el secado
evaporativo y en la liofilizacin. En el secado evaporativo el agua en
el punto A es calentada hasta alcanzar el equilibrio con su presin de
vapor en B. En este punto si se suministra la energa correspondiente
al calor latente de vaporizacin, se produce el paso de lquido a
vapor. En el secado por liofilizacin el agua en el punto A se enfra
hasta un punto inferior al de congelacin D. Cuando el agua esta
completamente congelada, se reduce la presin, se hace vaco,
hasta el punto E consiguiendo una presin absoluta inferior a la
presin de vapor del hielo. Por ultimo, con el suministro del calor
latente de cristalizacin y evaporacin, el hielo sublima a vapor de
agua a temperatura constante.
Como los constituyentes de material estn congelados, permanecen
inmovilizados durante la sublimacin. La forma de la sustancia seca
es prcticamente la misma que la de la congelada y se reduce o
incluso se elimina la migracin de slidos hacia la superficie. Como el
secado por liofilizacin tiene lugar a baja temperatura, se minimizan
los daos por calor y se retienen los componentes voltiles.
El secado por atomizacin requiere exposiciones a temperaturas de
ms de 100C durante periodos de segundos, el secado en horno
requiere temperaturas tpicas de 60C durante periodos de minutos, y
la liofilizacin expone el material a temperaturas por debajo de 0C
durante periodos de horas.
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Por otra parte como los cristales sublimados de hielo dejan

cavidades, el material seco contiene miles de intersticios por los que
el agua puede penetrar produciendo una rpida y completa
rehidratacin cuando sea necesaria.
5.1.3. PROCESO DE LA LIOFILIZACIN

A. Etapas de la liofilizacin
Se realiza a temperaturas inferiores a la solidificacin total, o sea, el
producto debe estar congelado a temperaturas entre 10 y 15 C por
debajo de su temperatura autentica para evitar la formacin de
cogulos de H2O.
B. Congelacin inicial
Es una operacin previa y obligatoria, El tiempo de duracin depende
de varios factores como la cantidad, concentracin y naturaleza
propia del producto. En lneas generales podemos decir que una
congelacin adecuada es la base de que el producto liofilizado
presente ptimas condiciones de aspectos, conservacin de sus
propiedades originales y rpida rehidratacin.
C. Sublimacin o desecacin primaria
Es la etapa en la que mayor parte del agua libre pasa a vapor. Los
parmetros temperatura, presin y tiempo pueden ser modificados
independientemente pero estn ntimamente relacionados, no es
posible modificar, sin que se afecten los otros, por lo que en todo
momento deben ser considerados conjuntamente y analizados sus
efectos.
D. Desorcin o desecacin secundaria
Su misin es eliminar las ultimas trazas de vapor de agua,
evaporando el agua no congelada ligada al producto, Se lleva a cabo
a una temperatura inferior a la de desnaturalizacin del producto y se
logra una humedad final hasta valores inferiores al 1%.
5.1.4. IMPORTANCIA DE LA LIOFILIZACION
La liofilizacin se ha mostrado como un mtodo efectivo para ampliar
la vida media de los alimentos y tiene dos caractersticas importantes:
Virtual ausencia de aire durante el procesado. La ausencia de
aire y la baja temperatura previene el deterioro debido a la
oxidacin o las modificaciones del producto.
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Secado a una temperatura inferior a la de ambiente: los

productos que se descomponen o sufren cambios en su
estructura, textura, apariencia, y/o aromas como consecuencia
de temperaturas altas, pueden secarse bajo vacio con un dao
mnimo.
Los productos liofilizados que han sido adecuadamente
empaquetados pueden ser almacenados durante tiempos ilimitados,
reteniendo la mayora de propiedades fsicas, qumicas, biolgicas y
sensoriales de su estado fresco; adems, reduce las prdidas de
calidad debidas a las reacciones de pardeamiento enzimtico y no
enzimtico. Sin embargo, la oxidacin de lpidos, inducida por los
bajos niveles de humedad conseguidos durante el secado, es superior
en los productos liofilizados, Esta oxidacin lipdica puede controlarse
con envasados en paquetes impermeables al paso del oxigeno. El
pardeamiento no enzimtico apenas ocurre durante el secado, ya que
la reduccin de la humedad del producto en el proceso es casi
instantnea. El uso de bajas temperaturas tambin reduce la
desnaturalizacin de protenas en este tipo de secado.
Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este
mtodo, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilizacin,
que es un proceso suave. Con ello la estabilidad gentica es alta, pero
a veces no tanto como en la congelacin, porque la liofilizacin se
consigue por sublimacin del hielo de las clulas. Por lo tanto, primero
tenemos que congelar el agua libre de las clulas y despus eliminarla
mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo
que acabara afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este
proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los
que hay muchos modelos en el mercado. Las clulas microbianas as
conservadas se someten a un tratamiento ms complejo que en el
caso de la congelacin, pues la liofilizacin se hace en dos etapas y
se aade la sublimacin del agua a la congelacin previa. Sin
embargo, este es un mtodo muy recomendable por su comodidad
para el almacenamiento y para el envo de las cepas, pues una vez
conseguidos los lifilos pueden almacenarse a temperatura ambiente
(18C-20C), con lo cual su envo es muy cmodo.
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Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la

liofilizacin como medio de conservacin son
A. Tipo de microorganismo
Hay algunos microbios que no resisten la liofilizacin y lgicamente
sern aquellos que contengan ms agua en su interior. Algunos
hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se
pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros mtodos.
B. Concentracin celular
Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentracin
del orden de 108-109 clulas/ml en el caso de las bacterias y algo
inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras.
C. Temperatura durante la sublimacin
Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C.Grado
de deshidratacin alcanzado. Debe ser lo ms alto posible, aunque la
concentracin de solutos puede conllevar una pequea cantidad de
agua remanente que no es perjudicial.
D. Atmsfera de oxgeno en el tubo
Las clulas liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vaco para
evitar, tanto la rehidratacin como la presencia de algn gas dentro
del tubo, como el oxgeno que puede daar a las clulas.
E. Condiciones de almacenamiento
La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18C y sin
bajar de los 0C. Los lifilos se deben guardar en la oscuridad.
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CRECIMIENTO DE LA CEDA MICROBIANA

5.1.5. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CONSERVACION POR EL
METODO DE LIOFILIZACION
A. VENTAJAS
Reduccin de la variabilidad del microorganismo
Largo tiempo de conservacin.
Aplicabilidad para la produccin y distribucin de los lotes.
B. DESVENTAJAS
El alto coste del equipo.
La preparacin de la forma incorrecta de los distintos lotes puede
desembocar en el estancamiento de la viabilidad y/o en perdidas
en la estabilidad de los caracteres de los microorganismos.
5.2. METODOS ALTERNATIVOS
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Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin,
bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no
resiste los tratamientos de la conservacin por estos mtodos. Conviene tener en
cuenta que nunca se debe usar un nico mtodo alternativo, sino que se
recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos mtodos.
5.2.1.
CONSERVACION POR TRANSFERENCIA PERIODICA.

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio
de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas clulas no pueden
permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas
excretan productos txicos del metabolismo que se acumulan,
provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es
necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es
el peor mtodo para conseguir la estabilidad gentica, puesto que al
estar las clulas creciendo hay una alternancia de generaciones, y al
cabo del tiempo las clulas que se estn guardando sern
descendientes lejanas de las clulas iniciales y es posible que ya no
conserven algunas de sus caractersticas.
Si se va a utilizar este mtodo es aconsejable retardar el
envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se
puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo
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la cantidad de inculo; rebajando la proporcin de algunos nutrientes

en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos
que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de
oxgeno es ms rpido y origina productos generalmente txicos; y
almacenando los cultivos a 4C-8C. A veces tambin se suele recubrir
el crecimiento con una capa de aceite mineral estril. Con esto se
consigue tambin evitar en la medida de lo posible la desecacin del
medio de cultivo, que podra ser txico para las clulas al aumentar su
concentracin. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy
aerobios, como por ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden
guardar en tubos completamente cerrados. Por ltimo, otro
inconveniente que tiene la transferencia peridica es que la
contaminacin de los cultivos resulta ms fcil al tener que manejar los
tubos a lo largo del tiempo y tambin por la posibilidad de entrada de
caros en los mismos.
5.2.2. CONSERVACION POR DESTILACION EN AGUA DESTILADO O
EN AGUA DE MARFIL
Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de
viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos
filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en
suspender en agua estril unas cuantas clulas del cultivo que se
quiere conservar. Se pueden preparar en crio tubos de los
anteriormente mencionados. En este caso la concentracin celular no
debe ser superior a 104-105 clulas/ml en el caso de bacterias y
levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden
poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En
el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en agua
de mar diluida.
Los resultados obtenidos por la CECT en la conservacin de
microorganismos por este mtodo muestran altos porcentajes de
viabilidad en periodos a veces superiores a 5 aos. La estabilidad para
caracteres morfolgicos y fisiolgicos es buena, pero no se ha
comprobado para caracteres especficos como la virulencia, el poder
fermentativo, etc.
5.2.3. METODOS RESTRINGIDOS
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En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente,

pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de
microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilizacin
o la congelacin, como por ejemplo los gneros bacterianos Spirillum,
Rhodospirillum, etc. Los cuatro mtodos que vamos a citar se basan
en la paralizacin del crecimiento por eliminacin del agua disponible
para las clulas.
A.
DESECACION EN PAPEL FILTRO

Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann n 3) que se
impregna con una solucin muy densa de clulas y se deja secar al
aire (en condiciones estriles). Tambin es posible desecarlos por el
procedimiento que se llama desecacin lquida (L-Dry) porque se
utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelacin
previa de las clulas. El vaco producido por el liofilizador deseca las
clulas, pero hay que evitar que un vaco excesivo provoque
evaporacin brusca con ebullicin o que la temperatura disminuya
demasiado, ocasionando la congelacin incontrolada de las clulas.
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B. DESECACION EN SUELO, ARENA, SILICATO

Se aaden las clulas a estos sustratos que las protegern al
desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden
conservar durante bastante tiempo por este mtodo.
Es importante esterilizar el soporte por aplicacin de calor seco, No
esterilizar en autoclave.
La tierra estril puede ser inoculada con un cultivo e incubada varios
das para inducir esporulacin de bacilos aerobios y anaerobios. Una
vez que la esporulacin se manifiesta, la tierra es secada y el cultivo
es mantenido de esta forma en una atmosfera seca o en refrigerador.
El mtodo ha sido utilizado ampliamente con hongos y actinomicetos,
los cuales han sido mantenidos en estas condiciones varios aos.
Tambien se puede utilizar tierra para la conservacin directa de
suspensiones de esporas.
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C. DESECACION EN BOLITAS DE ALGINATO

ste es un procedimiento bastante eficaz. Las clulas se encuentran
en una matriz de alginato y la eliminacin del agua se hace por
tratamiento con soluciones hipertnicas sucesivas y posterior
desecacin al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en
agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos
cerrados hermticamente y a temperaturas de entre 4C y 18C,
pudindose guardar incluso a 80C debido al bajo contenido en
agua de las clulas y la proteccin que suministra el soporte de
alginato. Este es un mtodo que se est utilizando incluso para la
conservacin de algas y clulas vegetales.
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D.
D.
D.
D.
D.
D.
D.
DESECACION EN SAL GORDA PARA HALOBACTERIAS
Para su conservacin por este mtodo se mezclan las clulas con sal
y se dejan desecar espontneamente. Debido a la higroscopicidad
de la sal, la desecacin no es total, pero las clulas dejan de
multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.
Por ltimo, y a modo de resumen, unas consideraciones finales.

Cualquiera que haya sido el mtodo empleado en la conservacin de
las cepas microbianas, cuando stas se recuperan para hacer nuevos
lotes para su conservacin o para trabajar con ellas, se recomienda no
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utilizar directamente las clulas que se han estado guardando, porque

stas vienen de una situacin de estrs ms o menos fuerte (sobre
todo cuando se han conservado por liofilizacin) y por lo tanto no son
adecuadas para ningn tipo de prueba.
Primero habra que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrndolas en un
medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo ms posible el
crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar
con ellas, cultivndolas en medios selectivos cuando sea necesario.
Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad
microbiana, cada microorganismo soportar determinados mtodos de
conservacin mejor que otros, o ser necesario tomar precauciones
especiales en su conservacin. Como ya dijimos al comienzo, no
existe un mtodo general de conservacin de los microorganismos,
aunque no resulta difcil determinar el ms aconsejable en cada caso.
La mayora de microorganismos de inters sanitario pueden
conservarse a largo plazo con los mtodos generales de congelacin
y/o liofilizacin, y para periodos cortos pueden mantenerse vivos por
alguno de los mtodos alternativos si se hace en las condiciones
adecuadas y bien controlados por un microbilogo.
Con lo anteriormente expuesto pretendemos contestar a las
numerosas preguntas que se plantean a la CECT sobre esta cuestin.
Este artculo se ha confeccionado no solamente mediante una
consulta bibliogrfica que se puede ampliar con la completa
bibliografa que se incluye al final, sino tambin gracias a la
experiencia adquirida por el personal de la CECT a lo largo de los
aos, y los autores agradecen su informacin y consejos.
Por ltimo, la CECT organiza cada ao en el mes de Septiembre un
curso terico-prctico de 40 horas de duracin repartidas en cinco
das consecutivos sobre el tema Conservacin y control de cepas
microbianas. Las plazas disponibles son 15, y en l los alumnos
pueden aprender con ms detalle lo que antes hemos resumido.
6. CONCLUSIONES
Pgina 20
A. Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase logartmica, a

la temperatura optima, en el medio adecuado.
B. Aadir los crioprotectores adecuados a una concentracin optima.
C. Repartir la suspensin en la ampolla de congelacin, cerrarla hermticamente
y mantenerla 30 minutos a 30C.
D. Disminuir la temperatura lo ms rpido posible.
E. A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar rpidamente,
sumergiendo las ampollas con el cultivo congelado en un bao a 37 - 40C.
En cualquier laboratorio de microbiologa es fundamental el mantenimiento y
conservacin de las colecciones de microorganismos con las que trabajamos ya
que, obviamente, son nuestro reactivo primordial. Existen una gran variedad de
mtodos de mantenimiento y conservacin de los microorganismos cuya
utilizacin va a depender en parte del tiempo previsto y en parte de las
caractersticas de los diferentes microorganismos (bacterias, hongos, virus, algas,
protozoos).
7. RECOMENDACIONES
Consideraciones para la preservacin de cepas microbianas:
A. Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua (destilada,
deionizada, corriente) empleados.
B. Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, lquido, slido), el estado
fisiolgico de las clulas al momento de la cosecha (cultivos lquidos
cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de fase
logartmica), si se emplean clulas con medio lavadas. Determinar si el
agente protector es txico.
C. Definir condiciones de proceso: concentracin de clulas, tiempo de secado,
agregado de protectores en procesos industriales la viabilidad no es lo nico
importante.
D. La cepa debe mantener sus propiedades productivas.
E. Desarrollar un test de produccin o bioensayo durante la recuperacin de la
especie conservada deben determinarse: viabilidad, pureza, morfologa,
formacin de producto, rasgos recombinantes (plsmidos, resistencia a
antibiticos, etc.).
8. ANEXOS
Pgina 21
Conservacin bacteriana por mtodo simple a temperatura ambiente: una

alternativa viable Lic. Zulia Weng Alemn, 1 Dra. Raquel de los ngeles Junco
Daz, 2 Tc. Olvido Esther Daz Rosa, 3 Tc. Inalvis lvarez Molina,4 Jos Ramn
Beltrn Daz3 y Tc. Mara Caridad Rodrguez Salazar3
RESUMEN
Con el objetivo de verificar la viabilidad y el mantenimiento de los caracteres
fisiolgicos de cepas bacterianas originalmente preservadas en medio semislido
de conservacin desde finales de 1980, se estudiaron 60 cepas bacterianas de las
familias Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae y Pseudomonaceae,
mantenidas como patrones de referencia en la coleccin de cultivos microbianos
del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiologa y Microbiologa. El 85,0 % de las
cepas se mantuvo viable durante 12 aos con un 45,3 de sus niveles de viabilidad
del orden de 107 Ufc/mL y un 87,0 de pureza, as como un 95,2 de preservacin
de las caractersticas fenotpicas. El medio permiti la conservacin con buenos
resultados de las cepas, lo que sugiere su empleo como mtodo simple en los
laboratorios con limitados recursos.
Palabras clave: Temperatura ambiente, medio semislido de conservacin,
viabilidad, cepas bacterianas.
Numerosas instituciones mantienen colecciones vivientes de microorganismos, ya
sea con fines docentes, investigativos o para disponer de cepas patrones tiles en
el aseguramiento de la calidad de mltiples procesos industriales, evaluacin de
materias primas, productos y tecnologas. En la actualidad, para la conservacin
de estos cultivos por largos perodos de tiempo se emplean la liofilizacin y la
criopreservacin,1,2 como mtodos de eleccin que aseguran la viabilidad, pureza
y estabilidad de las cepas. Cuando no existen los recursos necesarios para la
utilizacin de estas tcnicas, la bsqueda de alternativas de preservacin menos
costosas es una constante.
La coleccin de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene,
Epidemiologa y Microbiologa (CCINHEM) ha provisto de cepas bacterianas a
numerosos laboratorios microbiolgicos en todo el pas, en medio semislido de
conservacin (MSC), el cual es de fcil preparacin, manipulacin, costo y buenos
resultados en el mantenimiento de los cultivos a mediano plazo, convertido en el
mtodo bsico de transporte y preservacin de los cultivos de la coleccin.
Despus de transcurrir ms de 10 aos desde su introduccin a la prctica y al
constatarse que mantena su apariencia,
Pgina 22
consistencia e hidratacin, se decidi verificar la viabilidad y el mantenimiento de

los caracteres fisiolgicos de los primeros cultivos inoculados en l, empleados
como microorganismos patrones en el control de la calidad de medios de cultivos y
reactivos en el Departamento de Microbiologa Sanitaria del Instituto Nacional de
Higiene, Epidemiologa y Microbiologa.
MTODOS
Se preservaron en medio semislido de conservacin a temperatura ambiente 60
cepas bacterianas que integran el banco primario de trabajo de la coleccin de
cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiologa y
Microbiologa (CCINHEM), desde su aislamiento y/o incorporacin entre 1986 y
1990. Despus de su estudio se mantuvieron en este medio hasta mediados del
2000, fecha en que se comenz la verificacin nuevamente de su viabilidad y
clasificacin (tabla 1).
Tabla 1. Relacin de microorganismos en estudio. INHEM 2000-2002
Cepas
Rplic
Rplic
Cepas
Ao
microbi Ao
as
as
microbiana conserv
anas
conserv
disponi
disponi
s
acin
(INHE acin
bles
bles
M)
Bacillus
cereus IN 1989
HA
Bacillus
subtilis AT 1990
CC 6633
Budvicia
aquatica 1989
IHE 27426
Citrobacter
freundii IN 1988
HEM
Salmon
ella
1987
allenton
Salmon
ella
1988
anatum
Salmon
ella
1988
binza
Salmon
ella
1987
braend
erly
Pgina 23
Citrobacter
1986
sp INHEM
Salmon
ella
1987
breden
ey
Edwarsiell
a
1989
tarda IHE
27456
Salmon
1987
ella B
Enterobact
1989
er sp
Salmon
1987
ella C
Salmon
ella
1987
cerro
Enterobact
er
1989
sakazakii I
HE 28132
Salmon
ella
1987
edmont
on
Enterococ
cus
1988
faecalis
Salmon
ella
1987
havana
Salmon
ella
1987
heidelb
erg
Salmon
ella
1987
infantis
Salmon
ella
1987
kentuck
y
Enterobact
er
1988
aerogenes
Enterococ
cus
1989
faecalis AT
CC 19433
Pseudomo
nas
1988
aeruginos
a 2327
Escherichi
a
1988
coli ATCC
25922
Pgina 24
ELABORACIN
Pesar las cantidades exactas indicadas y calentar los ingredientes hasta lograr su
total disolucin.
Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min.
Distribuir aspticamente 3 mL del medio en tubos de 90 x 10 mm (bacilo) y tapar
con tapn de goma previamente esterilizados (tubos y tapones por separado).
Mtodo de siembra del medio de conservacin:
Tomar inculos de las cepas cultivadas, previa comprobacin de pureza; sembrar
en el medio con aguja de nicrn hasta mitad del tubo; incubar por 18-24 h a 37 C
y posteriormente mantener a temperatura ambiente.
CHEQUEO DE VIABILIDAD
Los cultivos conservados en MSC fueron sembrados en caldo cerebro corazn y
se incubaron a 37 C por 18-24 h. A los cultivos viables se les realizaron las
pruebas de tincin de Gram, evaluacin de la viabilidad en medios slidos
mediante los mtodos de cultivo en placa por agotamiento4 y la tcnica de Miles y
Misra "modificada",5 as como el chequeo de las propiedades bioqumicas por el
mtodo convencional de los tubos de ensayo, segn lo que reporta la literatura de
consulta.6,7,8 Adems, se verific el mantenimiento de las caractersticas
antignicas para las cepas del gnero Salmonella sp mediante la tcnica de
aglutinacin en lmina portaobjetos segn el esquema de Kauffman-White,9 para
lo que se utilizaron antisueros comerciales (Wellcome). La figura ilustra la marcha
tcnica seguida para el desarrollo del trabajo.
FIG. Procedimiento de comprobacin de los cultivos en la CCINHEM.
INHEM, 2000-2002.
En la ejecucin de este estudio fueron utilizados medios de cultivo BIOCEN10 y
reactivos MERCK11 de calidad certificada, y los resultados obtenidos referente a
la caracterizacin bioqumica fueron comparados con los datos del estudio inicial
correspondiente a la fecha de conservacin de las cepas.
RESULTADOS
La tabla 2 muestra los valores de porcentaje de viabilidad de los cultivos
estudiados en correspondencia con la familia microbiana a que pertenecen las
Pgina 25
cepas, mientras que las tablas 3 y 4 ilustran los resultados de las pruebas
fisiolgicas evaluadas y la nomenclatura y estructura antignica de las cepas
de Salmonella sp incluidas en el estudio, respectivamente. El 87,04 % de los
cultivos viables permaneci puro y conserv su respuesta frente a la tincin de
Gram, y se obtuvo una buena recuperacin de los cultivos en medios slidos.
Tabla 2. Resultados de la viabilidad de los cultivos por familia bacteriana
Familia bacteriana
Cantidad de cepas
Evaluadas
Viables
Bacillaceae
100
Enterobacteriaceae
55
47
85,45
Enterococaceae
50,0
Pseudomonaceae
100
Total
60
51
85,0
Pgina 26
Tabla 3. Resultados de las pruebas bioqumicas
Pruebas
bioqumicas
Respuestas
Respuestas
no
coincidentes (% coincidentes
(%
de positividad)
de positividad)
Oxidasa
100
Catalasa
100
Reaccin en medio de Kligler

Glucosa
100
Lactosa
100
Gas
100
H2S
100
Descarboxilacin en medio de Moeller

Control
100
Lisina
91
Arginina
75
25
Ornitina
91
Pruebas miscelneas
Indol
100
Urea
100
Citrato
100
Pgina 27
Movilidad
100
Fermentacin de carbohidratos
Salicina
91
Sorbitol
85
15
Manitol
90
10
De los resultados obtenidos en este trabajo se concluye que el medio semislido

de conservacin result apropiado para el mantenimiento de las cepas bacterianas
en estudio durante ms de 12 aos, al permitir la conservacin de los cultivos con
un 85,0 % de viabilidad del orden de 107 Ufc/mL, la pureza en un 87,0 y la
estabilidad de las propiedades fisiolgicas en un 95,2.
Pgina 28
9. BIBLIOGRAFIA
1. LAB. Microbiologa Ambiental y Biotecnologa, Facultad de Ciencias
Biolgicas, UNMSM LIMA-PERU
2 Lab. Microbiologa, Instituto del Mar del Peru IMARPE.
2. Beech, F.W.; and Davenport, R.R. "Isolation, purification and maintenance of
yeasts". Methods in Microbiology.Vol 4.Academic Press.London, 153-182
(1971).
3. Day, J.G and McLellan, M.R. (eds.) "Cryopreservation and freeze-drying
protocols". Humana Press. Totowa.New Jersey (1995).
4. Hatt, H. (ed.) "American Type Culture Collection Methods: I. Laboratory
manual on preservation, freezing and freeze-drying". American Type Culture
Collection. Rockville (1980).
5. Hunter-Cevera, J.C. and Belt, A. (eds.) "Maintaining cultures for
biotechnology and industry". Academic Press. London. (1996).
6. Juarros, E., Tortajada, C., Garca, M.D. and Uruburu, F. "Storage of stock
cultures of filamentous fungi at 80C.: effects of different freezing-thawing
methods". Microbiologa SEM. 9, 28-33 (1993).
Pgina 29

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MICROBIOLOGIA GENERAL

MANTENIMIENTO Y CONSERVACION DE CEPAS MICROBIANAS

Los microorganismos representan un papel esencial para el mantenimiento y

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glicerol al 20% (sustancias lioprotectoras), la liofilizacin como mtodo de

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En un ensayo se utilizan cepas de Salmonella typhimurium, construidas por

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4.1. PRIMERAS COLECCIONES DE CULTIVO

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5. DESARROLLO DEL TEMA

5.1. METODOS DE ELECCION O CONSERVACION A LARGO PLAZO

Al bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste

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que se utilizan para la conservacin de los microorganismos por

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congelacin como para la descongelacin, por lo que para

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5.1.2. CONSERVACION POR LIOFILIZACION.

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1. La fase de pre congelacin hasta la temperatura en la que el

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Por otra parte como los cristales sublimados de hielo dejan

5.1.3. PROCESO DE LA LIOFILIZACIN

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Secado a una temperatura inferior a la de ambiente: los

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Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la

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CRECIMIENTO DE LA CEDA MICROBIANA

5.2. METODOS ALTERNATIVOS

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CONSERVACION POR TRANSFERENCIA PERIODICA.

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la cantidad de inculo; rebajando la proporcin de algunos nutrientes

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En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente,

DESECACION EN PAPEL FILTRO

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B. DESECACION EN SUELO, ARENA, SILICATO

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C. DESECACION EN BOLITAS DE ALGINATO

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Por ltimo, y a modo de resumen, unas consideraciones finales.

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utilizar directamente las clulas que se han estado guardando, porque

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A. Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase logartmica, a

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Conservacin bacteriana por mtodo simple a temperatura ambiente: una

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consistencia e hidratacin, se decidi verificar la viabilidad y el mantenimiento de

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Tabla 2. Resultados de la viabilidad de los cultivos por familia bacteriana

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Tabla 3. Resultados de las pruebas bioqumicas

Reaccin en medio de Kligler

Descarboxilacin en medio de Moeller

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De los resultados obtenidos en este trabajo se concluye que el medio semislido

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