LABORATORIO BIOQUMICA N3

REPORTE DE DNA

PROFESORAS:
CAROLINA LAGOS
VALENTINA MUOZ

INTEGRANTES:

ESTEVES ZIGA KAREN

PALMA CIFUENTES MARCO

FECHA DE ENTREGA :
17/06/2013

1.-Explique las caractersticas qumicas, fsicas y estructurales del DNA

Caractersticas qumicas
Qumicamente el ADN est constituido por cadenas de nucletidos, siendo estos las unidades
esenciales del ADN, un nucletido est constituido por cido fosfrico, pentosa (azcar de 5 tomos de
C) y por bases nitrogenadas, las bases nitrogenadas son de tipo Purinas (Adenina y Guanina) y
Pirimidinas (Citosina y Timina). Cuando los nucletidos de ambas cadenas se enfrentan, se agrupan las
bases nitrogenadas formando complementos o pares de bases nitrogenadas complementarias, es decir,
la adenina se une con la timina, la citosina con la guanina, por medio de uniones lbiles o puentes
hidrgeno, entre el par A T hay 2 puentes H y entre el par C G hay 3 puentes H, por poseer un puente
hidrgeno ms, el par CG le da la forma helicoidal del ADN y su estabilidad.
El ADN, es una molcula extremadamente larga y delgada enrollada en forma de una doble hlice.
Cada molcula de ADN est compuesta por dos cadenas de nucletidos, unidades que se repiten a lo
largo de cada cadena. Cada nucletido est formado por tres componentes caractersticos:

Una base nitrogenada,

Una pentosa ( azcar) y

Un fosfato.

Caractersticas fsicas

Caractersticas estructurales
Tanto en la molcula de ADN como en la de ARN el esqueleto de la cadena est formado por las
pentosas

los

fosfatos

de

manera

alterna.

(Figura

1)

Las bases nitrogenadas se unen a los azcares y se proyectan hacia fuera de la cadena. Los
nucletidos se unen covalentemente a travs de enlaces fosfodiester entre el azcar de un nucletido y
el fosfato del siguiente.
El enlace fosfodiester se refiere a las uniones formadas por la reaccin entre el grupo hidroxilo (-OH) del
carbono 5 y 3 de la ribosa con el grupo fosfato, (Figura 1).
Una caracterstica muy importante de las bases nitrogenadas se ve reflejada en la estructura de doble
hlice del ADN, ya que las dos cadenas polinucleotdicas permanecen juntas por la accin de puntes de
hidrgeno que se forman entre bases nitrogenadas complementarias. (Figura 1)

Figura 1. Representacin esquemtica de la cadena de la doble cadena de ADN

2. Mencione y explique al menos dos formas de extraccin y dos de purificacin del DNA de cualquier
muestra (tejido animal, tejido vegetal, bacterias, levaduras, entre otros).
Formas de extraccin
1. Ruptura de tejidos y paredes celulares.
Pulverizar el tejido a bajas temperaturas
2. Ruptura de membranas
Una vez el tejido es disgregado en clulas, se hace necesario romperlas membranas celulares para
liberar el ADN, entre las sustancias para ruptura de membranas se tiene: SDS, Triton o detergentes
comerciales.

3. Inhibicin de enzimas que destruyen al ADN

Como un mecanismo de defensa natural, las clulas contienen enzimas que destruyen al ADN
ADN asas : Estas enzimas deben ser inactivadas para garantizar la calidad de las preparaciones de
ADN
Purificacin del DNA
Hay distintos procedimientos para la purificacin de DNA plasmdico, aunque todos incluyen los tres
pasos siguientes:

Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas que llevan el plsmido.

Lisis de las bacterias para la liberacin del plsmido.
Purificacin del DNA plasmdico.

El problema principal que hay que resolver es la separacin del DNA plasmdico y DNA cromosmico.
En esta prctica hemos elegido el mtodo de lisis alcalina, por su simplicidad, bajo coste y
reproducibilidad.
Lisis alcalina: Este mtodo explota las diferencias en las propiedades de desnaturalizacin y
renaturalizacin entre el DNA plasmdico (pequeos crculos de DNA cerrados covalentemente) y el
DNA cromosmico

(fragmentado). La alcalinizacin con NaOH en presencia de un detergente

fuertemente aninico (SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las
protenas, y la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos se ven menos afectados por su pequeo
tamao y estructura superenrollada. La neutralizacin del medio en presencia de una concentracin alta
de sal (acetato potsico), provoca la precipitacin de las protenas (por el tratamiento con el detergente
y la insolubilidad de la sal potsica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosmico (por reasociaciones
aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de protenas y DNA cromosmico se separan por
centrifugacin del DNA plasmdico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su
estructura nativa.

3. Seale la funcin de los siguientes componentes utilizados en el protocolo a seguir en el laboratorio

de extraccin de DNA.

a) Sal:
Contribuye a deshidratar el tejido y ayudada por la accin de la licuadora se rompe la pared celular,
membrana plasmtica, luego el detergente cumple la funcin de lisar por completo el ncleo celular,
para dejar el ADN libre.
b) Licuadora:
Es capaz de romper la pared celular y las membranas plasmtica y nuclear
c) Detergente:
Posee ciertas propiedades, una de ellas y para este laboratorio la fundamental es que puede romper o
desintegrar las molculas de fosfolipidos , esto se debe a que los detergentes presentan una punta
hidrfoba que es a su vez lipfila y en su otro extremo presenta una punta hidrfila que a su vez es
lipofoba, es as que la reaccin del detergente es romper la membrana plasmtica y la envoltura nuclear
ya que estas estn compuestas de una gran cantidad de fosfolipidos, el detergente crea unas micelas
de las grasas que encierra. A simple vista y dejando reposar la muestra se puede apreciar las
diferencias que crea el detergente
d) Jugo de pia: fue aplicado para que sus enzimas contribuyeran a eliminar las protenas que pudieran
contaminar el ADN.
e) Alcohol:

El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol
se desenrolla y precipita en la interface entre el alcohol y el agua.
Si se utilizan helados en muestras calientes, ocasionan un choque trmico a la muestra. Los choques
trmicos provocados al ADN, permiten el enrollamiento de sus hebras y con ello la visualizacin directa.

4. Explique una tcnica de laboratorio que requiera del aislamiento de DNA

Los

mtodos

para

aislar

el

ADN

ms

comnmente

utilizados

son:

Mtodo comercial InstaGeneMatrix:

Se extrae DNA a partir de sangre entera, diseado para aislar DNA que posteriormente ser utilizado en
reacciones de PCR. En un tubo Eppendorf se agrega solucin de Lysis Buffer(pH: 7.9) y sangre entera.
Luego de varios lavados y centrifugaciones con este buffer, se descarta el sobrenadante y seagrega el
InstaGene Matriz al pellet obtenido. Por ltimo, se realizan dos incubaciones, una a 70C y otra a 95C.
Lasmuestras son guardadas a -20C hasta la realizacin de la tcnica de PCR, digestin con
endonucleasas

de

restriccin,southernblot

Dotblot.

Mtodo SaltingOut:
En este mtodo se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K (Tris-HCl, pH 8.3,Tween 20,Nonidet P40,
Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solucin los cidos nucleicos.
Elpaso siguiente consiste en la precipitacin de los cidos nucleicos, ya que el DNA presente en
soluciones con altaconcentracin de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la
adicin

de

alcohol

etlico

dichassoluciones.

Extraccin de DNA de sangre perifrica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB): El fundamento es

similar al mtodoanterior, pero en este caso no se utiliza el buffer con Proteinasa K y, la liberacin de los
cidos nucleicos se realiza conuna solucin de homogeinizacin (CTAB, NaCl, b-mercaptoetanol, EDTA,
Tris-HCl pH 7.5). El CTAB es una sal de amoniocuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran
magnitud molecular, y tiene propiedades detergentes; se conocencon el nombre de jabones invertidos,
debido a que su actividad superficial se debe a la presencia de un ion positivo y noa uno negativo, como
sucede en los sulfatos de alquilo e hidrgeno, que son los detergentes usuales. Luego se realiz
laextraccin de los cidos nucleicos con cloroformo: alcohol isoamlico, y la posterior precipitacin del
DNA con etanolabsoluto primero, y posteriormente con etanol 70%. Esta es considerada por muchos la
una tcnica que rene losrequisitos fundamentales para purificacin del DNA, ya que sirve para
amplificacin PCR, mostrando una pureza muy altadel material que separa.

BIBLIOGRAFIAS: