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Manual do utilizador
NDICE
ndice
Introduo
Contedos do kit
Experincia 1
Parte 1 - Extraco de DNA genmico
Introduo
Material necessrio
Material Opcional
Protocolo experimental
Proposta de Experincia
5
5
5
5
5
6
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10
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16
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20
21
Figuras
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Crditos e Contactos
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Introduo
O kit Biognius o resultado de uma colaborao longa e
frutuosa entre professores de Biologia do ensino secundrio e
investigadores da rea da biologia molecular de diversas instituies,
no mbito de uma parceria com a Ordem dos Bilogos.
O principal objectivo foi o de fazer chegar aos professores um
conjunto de materiais que lhes permitam realizar aulas prticas
direccionadas para o programa de Biologia do 12 ano, nomeadamente
no captulo da Biotecnologia, que sejam didcticas, motivadoras e que
permitam a participao activa de todos os alunos.
A principal preocupao foi a de fazer chegar esse material a
todas as escolas do pas, permitindo que um docente possa realizar
estas experincias independentemente de existirem ou no
infraestruturas laboratoriais disponveis (laboratrios, bancadas,
equipamento, material descartvel, etc.). Na realidade, para a
realizao de todas as experincias deste kit, um professor necessita
apenas de gua destilada e de um forno microondas ou pequeno fogo
para banho-maria.
Adicionalmente, foi um objectivo deste projecto conceber um kit
que proporcionasse escola uma base de equipamento simples, eficaz
e pouco dispendioso que possa ser utilizado ano aps ano, num
sistema aberto que possa ser utilizado com recargas disponveis de
reagentes ou material biolgico preparado pelos professores.
O presente manual disponibiliza toda a informao para a
realizao das experincias. Para qualquer informao adicional
desejada so disponibilizados contactos que podem funcionar como
uma help desk para os docentes e formadores.
Este material foi testado em Escolas Secundrias de todo o pas
nos ltimos dois anos por professores e alunos de Vinhais a
Almodvar, de Bragana a Faro. A todos os envolvidos, os nossos
agradecimentos. Aos novos utilizadores, os nossos votos de sucesso.
Jos Matos
(coordenador do Projecto)
Experincia 1:
Parte 1 - Extraco de DNA genmico
Parte 2 - Proposta de Experincia: O DNA parte-se?
Experincia 2:
Conformao de plasmdeos
Experincia 3:
CSI: Fraude canina?
CONTEDOS DO KIT:
1
Seringa
Placa de Petri
Tina de electroforese
Experincia 1:
Parte 1 - Extraco de DNA genmico
Introduo:
Nesta experincia os alunos tero possibilidade de visualizar
DNA genmico com um grau de pureza substancialmente mais elevado
do que aquele que normalmente fazem nas aulas, vulgarmente a partir
de extractos de cebola, morango ou kiwi. Alm disso, esta experincia
no termina com a visualizao do DNA. Os alunos podero,
posteriormente, analisar, manipular e visualizar o DNA atravs de
electroforese em gel de agarose, utilizando este kit.
Para esta experincia foi utilizada uma estirpe de bactrias E.
coli, (obviamente no patognica), cultivada em meio lquido rico, com
agitao moderada a 37 C. Aps 24 horas a cultura foi centrifugada a
10 000 rpm durante 10 minutos. As clulas recolhidas no fundo do
tubo esto includas no kit (tubo clulas bacterianas). A extraco
poder ser realizada previamente ou durante as aulas com os alunos.
(Nota: a segunda parte desta experincia pode ser tambm realizada
com DNA extrado a partir de qualquer outro material biolgico e/ou
com mtodos de isolamento alternativos, por exemplo o DNA extrado
a partir de morango ou kiwi, pelos mtodos rudimentares
convencionais.)
Material necessrio (enviado no kit):
-
Protocolo experimental:
1 - Ressuspender as clulas em 2,5 mL de tampo TE
Pipetar cerca de 2,5 mL de tampo TE para dentro do tubo (pode
utilizar uma pipeta normal do laboratrio ou medir com um copo
de vidro pequeno, ou simplesmente verter metade do volume
fornecido (~5 mL)), fechar o tubo com a tampa e ressuspender
por inverso do tubo na mo vrias vezes (alguns minutos)
suavemente, at a suspenso ficar homognea (No agitar
vigorosamente, o que provoca formao de espuma)
2 - Adicionar 300 L de SDS
Utilizar a seringa e uma ponta amarela. Inverter como no passo
anterior e deixar a incubar durante cerca de 20 minutos
temperatura ambiente, com agitao ocasional do tubo.
3 - Adicionar 5 mL de lcool
Adicionar etanol no dobro do volume do tampo TE (2 x 2,5 mL
= 5 mL), agitar suavemente invertendo o tubo algumas vezes.
Imediatamente se ver o DNA precipitado, de cor branca e
aspecto viscoso.
NOTA: No passo de adicionar o etanol convm que todos
os alunos prestem ateno, porque o surgimento do DNA
precipitado imediato. Se as clulas forem frescas, o DNA
aparece num novelo. De as clulas forem velhas (mais de
1 ms) provavelmente o DNA aparece em flocos brancos
dispersos.
4 - Retirar o DNA precipitado no tubo
O DNA dever ser retirado do tubo com um material estril. Ou
com uma ponta de pipeta amarela (fornecida) ou com uma
pipeta de Pasteur de vidro com a ponta previamente dobrada em
forma de anzol num bico de Bunsen/lamparina (por exemplo).
Alternativamente, o contedo do tubo pode ser vertido para
dentro da placa de Petri (fornecida) e da retirado para um tubo
de microcentrfuga novo.
5 Evaporar o etanol ao ar
6
Protocolo experimental:
O DNA recolhido no passo anterior dever ser dividido por vrios
tubos, cada um distribudo a um grupo de alunos, ficando um dos
tubos no laboratrio da escola (por exemplo 5 grupos formados,
dividindo o DNA extrado por 6 tubos, cada um com 30-50 L cada
um).
Cada grupo dever levar o seu tubo de DNA para casa
sujeitando-o a diferentes condies de armazenamento. Por exemplo:
Grupo
Grupo
Grupo
Grupo
Grupo
1:
2:
3:
4:
5:
Alternativas:
-
Experincia 2:
Conformao de plasmdeos
Introduo:
Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA circular fechado,
que se encontram em clulas de microrganismos (por exemplo
bactrias e leveduras) e que tm capacidade de replicao autnoma
(independente da replicao do DNA cromossmico do organismo). O
seu tamanho varivel, podendo atingir centenas de milhares de
bases (megaplasmdeos). Todavia, os plasmdeos que so utilizados
como vectores de transporte de inseres de DNA estranho (foreign
DNA) para o interior das clulas tm normalmente uma dimenso
muito pequena para facilidade de manipulao (2-5 kpb).
As trs caractersticas principais de um plasmdeo para poder ser
utilizado como vector so:
-
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Material necessrio
-
Protocolo experimental:
So fornecidos no kit amostras de plasmdeo normal (DNA
plasmdico, tubo branco) e plasmdeo digerido (DNA plasmdico
digerido) tubo verde.
A experincia consiste em calcular o tamanho aproximado do
plasmdeo e analisar a sua conformao atravs de electroforese em
gel de agarose (Ver abaixo: Electroforese em gel de agarose).
Para tal, os alunos tero que
1-
2-
3-
4-
Corar o gel
5-
6-
Resultados esperados:
Marcador:
O marcador constitudo por 3 bandas (ver foto 5) de 3000,
1000 e 500 pares de bases, respectivamente. Em alguns casos ser
ainda visvel uma 4 banda de cerca de 2000 pares de bases.
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12
Experincia 3:
CSI: Fraude canina?
Introduo:
Esta experincia pretende ser uma introduo rea do DNA
fingerprinting e da utilizao de marcadores genticos em cincias
forenses, atravs dos quais possvel identificar/excluir um potencial
suspeito.
Aproveitando a popularidade das sries televisivas norteamericanas CSI Miami/SCI NY, etc., podem designar este trabalho
como CSI Lisboa, CSI Mogadouro, etc.
Tentando afastar a utilizao de casos (hipotticos) humanos, foi
criada a seguinte situao:
O Sr. Alo comprou um co a um criador de uma raa muito
apreciada. Querendo um animal de grande qualidade, sem olhar a
custos, pediu ao criador que lhe vendesse o melhor co da sua
explorao.
O criador vendeu-lhe um co garantindo que o pai era um co
da sua explorao, campeo nacional em exposies.
Imensamente feliz, o Sr. Alo levou para casa um belo cachorro
que em breve se desenvolveu num co adulto nada parecido com o
seu pai, sem aquele porte altivo nem caractersticas de campeo.
Admitindo a hiptese de ter sido ludibriado, o Sr. Alo voltou
explorao, recolheu amostras de plo da me, do alegado pai,
campeo, mas tambm de um outro macho adulto daquela raa que
partilhava o canil, e que poderia muito bem ser ele o verdadeiro pai,
pois no partilhava as caractersticas de porte e pujana do afamado
co e tinha fortes semelhanas com o animal adquirido.
Tendo assim amostras de plo dos dois putativos pais, da me e
do filho (o seu prprio co), o Sr. Alo pediu a um geneticista
molecular que corresse uma bateria de testes com marcadores
genticos, que permitissem identificar a paternidade do seu animal.
No laboratrio, os tcnicos extraram DNA dos plos de cada um
dos animais (em extraces totalmente separadas, de modo a evitar
13
(tubo
(tubo
(tubo
(tubo
(tubo
cor-de-rosa)
azul)
amarelo)
verde)
transparente)
3
4
5
6
Resultados:
Para facilidade, diremos que tanto a me como um dos pais
putativos so homozigticos para este marcador, pelo que s
apresentam uma banda. O filho ser heterozigtico, apresentando
duas bandas. Uma vinda da me e outra do pai. Como h certeza
sobre a me, uma das bandas do filho ser automaticamente
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identificada. O outro alelo (a outra banda) ter que vir do pai. Falta
ento identificar qual dos potenciais pais possui um alelo igual ao do
filho.
Tendo a me dois alelos de 1000 pares de bases (homozigtica),
o filho ter obrigatoriamente esse fragmento. O filho ter outro
fragmento de 600 pb. Como apenas um dos possveis pais possui a
banda de 600 pb, esse pai compatvel com a paternidade. O outro
NO pode ser o verdadeiro pai, uma vez que homozigtico para a
banda a 3000 pb, no tendo o filho nenhuma banda desse tamanho.
O professor seleccionar qual das situaes deseja contemplar:
Ausncia de fraude: o campeo nacional o pai verdadeiro
Presena de fraude: o campeo nacional no o pai verdadeiro
Perguntas:
-
seguinte
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20 mL
380 mL
400 mL
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1
2
3
4
5
6
7
8
Marcador
DNA congelado (grupo 1)
DNA fervido (grupo 2)
DNA armazenado a 4 C (grupo 3)
DNA incubado com saliva (grupo 4)
DNA sujeito a microondas (grupo 5)
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e) Colorao do gel
-
21
Figuras
4
1
2
5
6
8
12
13
11
10
10
22
23
24
3000 pb
1000 pb
500 pb
(a)
1
(b)
2
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26
Figura 11: Retirar o pente do gel aps solidificao (com uma das
mos segurar o tabuleiro e com a outra puxar o pente para cima,
perpendicularmente ao gel).
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(B)
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29
ND
M
L
SE
R
3 kb
L
SE
500 pb
30
P1
P2
Legenda:
M = Me;
P1 = Pai possvel 1;
P2 = Pai possvel 2;
F = Filho
O filho heterozigtico com dois alelos diferentes (1000 pb e
600 pb). Uma das bases vem da me, que homozigtica (1000 pb),
logo o alelo de 600 pares de bases s pode vir do Pai 1, porque o Pai 2
no tem esse alelo.
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CRDITOS
Este trabalho foi financiado pelo Programa Cincia Viva6 e
teve o apoio das seguintes Instituies e colaboradores, sem os quais
no teria sido possvel a sua realizao.
Ordem dos Bilogos Doutor Pedro Loureno
Escola Secundria da Amadora (Amadora) Prof. Maria dos
Prazeres Cardoso Amaral Fragoeiro
Escola Secundria Fernando Lopes Graa (Parede) - Prof Joana
Capucho
Escola Secundria Ibn Mucana (Alcabideche) Prof Ana Maria
Queiroz de Macedo
Escola Secundria Jos Saramago (Mafra) Prof. Pedro Passos e
e Prof. Martinho Rangel
Escola Secundria Padre Alberto Neto (Queluz) Prof Manuela
Moura Lopes
Escola Secundria Stuart de Carvalhais (Massam) Prof Ana
Morais, Prof ngela Neves e Prof. Joo Carlos Ribeiro
INETI (Inst. Nac. Engenharia,
Grupo de Biologia Molecular do
Coordenador: Jos Matos
Investigadores: Fernanda Simes;
(design)
Tcnicos de Investigao: Diogo
Possante.
CONTACTOS:
Para dvidas tcnicas:
Jos Matos
e.mail: jose.matos@inrbi.pt; jose.matos@ordembiologos.pt
Telefone: 217 127 141
Para aquisio de novos kits, seus componentes ou reagentes em
separado:
Bioprincpio: bioprincipio@gmail.com; Telef: 927 577 997 (Dr Sara
Duarte)
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