Protocolos de Biologia Molecular

LABORATRIO DE FARMACOLOGIA MOLECULAR
Protocolos de Tcnicas de Biologia Molecular
Braslia, Fevereiro de 2011
Este trabalho foi elaborado para que fosse possvel um melhor acompanhamento nas
tcnicas de Farmacologia Molecular aplicadas a esse Laboratrio. Para que fosse possvel sua
realizao, contei com a colaborao de muitos colegas, alguns, verdadeiros amigos que
passaram pelo Laboratrio de Farmacologia Molecular. Assim como Karime Bicas,
Alessandra Menezes, Gustavo Barra, Anglica Amato, Rutnia Pessanha, Raniere e Cristina.
Agradeo tambm aos professores que fazem parte do Farmol.
A sua verso atual est sendo revisada pela Profa. Dra. Marie Togashi e est sujeita
alteraes.
A todos que ajudaram os meus agradecimentos, pois a elaborao desse trabalho foi
muito gratificante e com certeza contribuir a todos que ainda iro passar pelo Farmol.
Laboratrio de Farmacologia Molecular

Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
ii
Dedico este trabalho aos meus filhos Murilo e Isabella.

Espero muito em Deus que eles cresam e se tornem adultos maduros e responsveis,
que tenham iniciativas, sejam idneos e tenham sempre Deus em primeiro lugar. Creio que
estas so as virtudes do alicerce da vida.

iii
ORAO DO BILOGO
Credo Molecular
Creio no DNA todo poderoso

Codificador de todos os seres vivos
E no RNA, seu nico filho
que foi concebido pelo poder da RNA polimerase
Nasceu como transcrito primrio
padeceu sob RNAses
Foi processado, modificado e transportado
Desceu ao citoplasma
Foi traduzido em protena
Subiu pelo Retculo Endoplasmtico ao complexo de Golgi
E est ancorado direita de uma protena G na
membrana plasmtica
De onde h de vir a controlar a transduo de sinais
em clulas normais e apoptticas
Creio na Biologia Molecular

Na terapia gnica e na biotecnologia
no sequenciamento do genoma humano
na correo de mutaes
na clonagem da Dolly
na vida eterna.
Amm

iv
ndice
Preparo de Clulas Competentes _______________________________4
Introduo
Teste de Controle de Qualidade das Clulas Competentes____________5
Teste de Esterilidade das Clulas Competentes ____________________6
Teste de Eficincia das Clulas Competentes______________________6
Preparo de Clulas Competentes - CaCl_________________________7
Preparo de Clulas Competentes TB___________________________8
Tampo TB 1x
Preparo de Clulas Competentes MgCl2 / CaCl2_________________9
Preparo de Clulas Competentes Cloreto de Rubdeo - RbCl_________10
Solues
Preparo de Clulas Eletrocompetentes____________________11
Preparo de Clulas de Baixa Competncia________________________12
Preparo do Tampo TSS1x.
Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes_________13
Introduo
Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes_________14
Procedimento
Estoque em Glicerol 30%
Teste para simples verificao do plasmdeo ______________________15
STE pH 8.0
Extrao e Purificao de DNA plasmidial________________________16
Introduo
Extrao e Purificao - kit Miniprep da Promega._________________18
Extrao e Purificao - Miniprep modificado por Marie/Joaquim______19
Extrao e Purificao - kit Midiprep da Promega.__________________20
Extrao e Purificao - Maxprep com PEG 30%__________________21
Purificao de DNA com Fenol Clorofrmio______________________23
Solues PEG 30%_________________________________________24
Extrao e Purificao - kit Maxprep da QIAGEN__________________26
Solues Maxpreps da QIAGEN________________________________28
Extrao e Purificao - Kit Maxprep /Qiagen Modificado Prof: Luiz__30
Meio de cultura LB Medium (Luria Bertani)______________________31
Meio de cultura 2x YT Medium
Meio de cultura SOB Medium _________________________________32
Meio de cultura SOC Medium
Meio de cultura NZY Top Agarose______________________________33
M9 Minimal Medium
Preparo do 10x M9 Salt_______________________________________34
Eletroforese de DNA em gel de agarose__________________________35
Quantificao do DNA _______________________________________36
Manuseio do espectrofotmetro.
Diluio do DNA - 1/100 ou 1/50
Clculo da leitura do DNA dupla fita
Frmula
Preparo do Gel de agarose 1% (100mL)__________________________37
Aplicando o gel de Agarose ___________________________________38
Preparo das amostras de DNA reciclagem de gel de Agarose__________39
Preparo de reagentes e solues_________________________________40
Manipulao da Sala de Cultura_________________________________41
Introduo
Origem das Clulas Hela______________________________________43
Origem das clulas U937______________________________________45
Reao da Transfeco _______________________________________47
Experimento programad
Check list Transfeco / UV por 30 minutos______________________48
Transfeco de Clulas Aderentes Hela ________________________49
Contagem das Clulas na Cmara de Newbauer___________________51
Leitura de Transfeco de Clulas Aderentes______________________52
Descongelamento___________________________________________53
Cultivo e Replicao de Clulas Aderentes
Congelamento de Clulas Aderentes____________________________54
Transfeco em Clulas em suspenso U937______________________55
Leitura da Transfeco de Clulas em suspenso - U937_____________57
Cultivo das Clulas em Suspenso______________________________58
Congelamento de Clulas em Suspenso_________________________59
Antibitico / Solues para cultura de Clulas_____________________60
Soluo de Congelamento I e II
Tampo de Lise _ modificado
PBS (1000 mL) Tampo de Fosfato e Salina) _____________________61
PBS com clcio e glicose
Tripsina____________________________________________________62
Meio de Cultura DMEM______________________________________63
Meio de Cultura RPMI_______________________________________64

vi
Preparo de Clulas Competentes

Introduo
As linhagens de E.coli mais comumente empregadas para construo e propagao de
plasmdeos em biologia molecular so DH5 e XL1 Blue. O protocolo que permite a
preparao de bactrias aptas para serem transformadas com DNA plasmidial chamado
competncia. Basicamente as bactrias podem ser tornadas competentes por tratamentos
qumicos (quimiocompetncia) ou por descargas eltricas (eletrocompetncia). Ambos tm
em comum a necessidade de obteno de culturas bacterianas em crescimento exponencial e,
a partir desse ponto, os protocolos diferem de acordo com o mtodo de competncia.
O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria competente tem como a
hiptese de que as molculas do DNA passam atravs de canais situados nas chamadas zonas
de adeso, que so locais onde as membranas interna e externa da clula bacteriana unem-se
formando poros. Estes poros s esto presentes durante o crescimento bacteriano (fase de
crescimento exponencial). Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil devido
repulso eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipdeos da
membrana bacteriana e dos grupos fosfato da molcula do DNA.
Um dos mtodos mais usados para transformao bacteriana o mtodo que utiliza
cloreto de clcio. Neste mtodo as clulas bacterianas so previamente tratadas com soluo
de cloreto de clcio para tornarem-se competentes, ou seja, mais aptas a receberem DNA
exgeno. Todo o tratamento feito sob banho de gelo. O papel do clcio explicado pela
hiptese de que a 0oC a fluidez da membrana celular cristalizada, estabilizando a
distribuio dos fosfatos carregados. Os ons Ca
+2
formam um complexo com este
grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atrao eletrosttica com as

molculas do DNA na zona de adeso. O choque trmico da transformao complementa este
processo de captao, provavelmente criando um desbalano trmico entre o interior e o
exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA atravs da zona de adeso.
possvel aumentar a eficincia do processo por recurso a outros ons monovalentes (K+ ou
Rb+) ou divalentes (Mg2+ ou Mn 2+).

Teste de Controle de Qualidade das Clulas Competentes

Concentraes dos antibiticos somente para controle de qualidade das clulas competentes
estoque
100ug/mL Ampicilina
- 100mg/mL
50ug/mL Kanamicina
- 50mg/mL
15ug/mL Tetraciclina
- 15mg/mL
20ug/mL Clorafenicol
- 20mg/mL
100ug/mL Streptomicina - 100mg/mL
1 dia - estriar
Plaquei as clulas a serem testadas em meio de cultura sem antibitico e Ou no antibitico no
qual ela resistente.
2 dia - isolar
Escolha de algumas colnias para teste. (pode-se escolher umas 4 colnias)
Diluir 1 colnia em 1000uL de H2O estril e plaquei 10uL em meio sem antibitico e Ou no
antibitico no qual ela resistente.
3 dia selecionar
Estriar 1 colnia da placa isolada (fazer a mesma diluio do passo anterior) em placas com
antibiticos, testando os vrios antibiticos, concentraes acima.
Marque na placa a colnia testada.
4 dia - verificar se houve crescimento

A colnia que no tiver crescido em nenhum dos antibiticos, a colnia certa para proceder
com a o preparo de clulas competentes, ela esta livre de contaminaes.
No caso de clulas resistentes a algum antibitico, proceda com uma colnia crescida no
antibitico no qual ela resistente.

Teste de Esterilidade das Clulas Competentes
Controle negativo
Estrie as clulas preparadas em meio de cultura LB com todos os antibiticos, se possvel
veja tabela de antibiticos de Controle de Qualidade.
No deve crescer em nenhum dos antibiticos, exceto se a clula for resistente a algum
antibitico.
Libere a clula para uso s aps fazer este teste.
Teste de Eficincia das Clulas Competentes

1. Em um tubo no gelo coloque 50uL das clulas preparadas
2. Adicione 10 ng de DNA plasmidial (conhecido)
3. Incube 30 minutos no gelo
4. D um choque trmico de 42C por 45 segundos a 1 minuto e meio
5. Retorne para o gelo por 2 minutos
6. Adicione 950uL de meio de cultura ambiente estril
7. Incube 37C por 1 hora
8. Plaquei 100uL (1ng) em placa com antibitico de interesse.
9. Incube 37C overnight
10. No dia seguinte faa a contagem de colnias
11. Deve-se contar 1000 colnias para que a clulas estejam com uma boa eficincia

Preparo de Clulas Competentes - CaCl2

1. Plaquei as clulas de interesse XL1 Blue ou DH5 ou outra (estoque 80C) em meio LB
agar ou meio mnimo. (com antibitico de resistncia ou s/ antibitico)
2. Incube 37C por 16 horas ou overnight, no meio mnimo incube mais tempo.
3. Inocule uma colnia em 3 ou 5 mL de meio LB sem antibitico
4. Incube a 37C 16 horas ou overnight
5. Transfira 3 ml da cultura overnight para 100 mL de LB sem antibitico
6. Incube a 30C 250 rpm at OD - 0.4/0.5, 600nm
7. Transfira para tubos de 50 mL estries
8. Centrifugue 3000 rpm 10 minutos a 4C e descarte o sobrenadante
9. Ressuspenda o pellet gentilmente em 15 mL de CaCl2 gelado (50mM)
10. Incube no gelo por 15 minutos
11. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante
12. Ressuspenda o pellet gentilmente em 2,85 mL de CaCl2 gelado (50mM)
13. Adicione 150 L de glicerol puro estril
14. Faa aliquotas de 100 e 300L
15. Freeze em nitrognio lquido (opcional)
16. Armazene imediatamente a 80C
Se for usar as clulas a fresco ressuspenda apenas em 3 mL de CaCl2 gelado (50mM) e use
em seguida. OBS.: use solues estreis e geladas.

Preparo de Clulas Competentes TB

1. Plaquei as clulas de interesse (estoque 80C) em meio LB agar ou meio mnimo. (com
antibitico de resistncia ou s/ antibitico)
6. Incube a 30C 250 rpm at OD - 0.4/0.5, 600nm. Incube no gelo por 10 minutos
9. Ressuspenda o pellet gentilmente em 32 mL de TB gelado
11. Ressuspenda o pellet gentilmente em 8 mL de TB gelado
12. Adicione DMSO para concentrao final de 7% (560 L). Incube no gelo por 10 minutos
14. Freeze em nitrognio lquido (importante)
Tampo TB 1x.
p/ 250mL
HEPES (10mM final) ...................651 mg

CaCL2 (15mM final) ....................551 mg
KCl (250mM final)....................... 4.66g
Ajuste pH 6.7
MnCl2 (55mM final) .....................2.8g
Esterelize filtrando 0,22um
Estoque a 4C
Preparo de Clulas Competentes MgCl2 / CaCl2

1. Plaquei as clulas de interesse (estoque 80C) em meio LB agar ou meio mnimo. (com
antibitico de resistncia ou s/ antibitico)
2. E.Coli TOP 10 Resistente a Streptomicina
4. Inocule uma colnia em 5 mL de meio LB - Streptomicina [ ] final 60g/mL
5.
Incube a 37C 16 horas ou overnight
6. Transfira 2 ml da cultura para 300 mL de LB - Streptomicina [ ] final 60g/mL

7. Incube a 30C 250 rpm at OD - 0.4/0.5, 550nm
10. Ressuspenda o pellet gentilmente em 15 mL de MgCl2 gelado (100mM)
16. Adicione 15% de Glicerol 900L de glicerol puro estril (novo)
17. Faa alquotas de 100 e 300L
18. Freezer em nitrognio lquido por 1 minuto

Preparo de Clulas Competentes Cloreto de Rubdeo RbCl

1. Transfira 400L da cultura ON /37C para 200mL de LB ou SOB
2. Incube a 30C 200rpm at OD 0.5 590nm
3. Centrifugue a 4000 rpm por 5 minutos de possvel a 4C. Despreze sobrenadante
4. Ressuspenda o pellet em 30mL RF1 gelado
5. Incube no gelo por 15 minutos.
6. Centrifugue novamente e descarte sobrenadante
7. Ressuspenda o pellet em 8mL RF2 gelado
9. Faa alquotas de 100 e 300L
10. Freeze no nitrogneo lquido (opcional)
11. Armazene a 80C.
Solues:
Acetato de Potssio - C2H3O2K 1M
9,8g para 100mL H2O. Ajuste pH 7.5 com cido actico
MOPS 0.5M
2,1g para 20mL H2O. Ajuste pH 6.8
RF1
g/100mL
RbCl 10mM
1,2g
MnCl22H2O 50 mM
1g
C2H3O2K 30mM
3mL 1M pH 7.5 ( acetato de potssio)
CaCl22H2O..10mM
1,5g
Glicerol 15%
15mL
Ajuste pH 5.8 com cido actico 0,2 N
Esterilize por filtrao 0,22m
Armazene a 4C
RF2
g/100mL
MOPS 10mM
2mL 1M
RbCl 10 mM
0.12g
CaCl22H2O..75mM
1,1g
Glicerol 15%
15mL
Ajuste pH 6.8 com NaOH
Esterilize por filtrao 0,22m
Armazene a 4C
10
Preparo de Clulas Clulas Eletrocompetentes

1. Plaquei as clulas de interesse BL21 DE3 (cloranfenicol) ou outra (estoque 80C) em
meio LB agar ou meio mnimo. (com ou s/ antibitico)
6. Incube a 30C 250 rpm at OD - 0.5 a 0.7, 600nm
8. Transfira para tubos de 50mL estries
9. Centrifugue 3000 rpm 10 minutos a 4C e descarte o sobrenadante completamente.
10. Ressuspenda o pellet gentilmente em 200mL 10% de glicerol gelado
12. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante completamente.
13. Repita a lavagem com 10% de glicerol gelado com 100mL, 4mL e 1mL ressupenda
gentilmente e centrifugando a cada passo.
15. Freeze em nitrognio lquido (opcional)
* Trabalhe no gelo.

11
Preparo de Clulas de Baixa Competncia

Clulas BL21 DE 3 de Baixa Competncia.
1 Preparo da placa
Em uma placa com meio Mnimo + Cloranfenicol plaquei a clula BL21 DE3
Incube a 37C por 16 horas ou overnight
2 - Inoculo em 3ml.
Em um tubo estril p/ cultura de clulas coloque assepticamente
3mL de meio de cultura (ex: 2 YT) inocule uma colnia das clulas da placa
Incube 37C por 24horas ou overnight em um shaker.
3 - Inoculo em 25ml.
Da cultura obtida do inoculo de 3ml transfira 500L para:
25ml de meio (2 YT ou LB) sem antibitico em um Erlen meyer de 100ml.
Incube 37C em um shaker at OD 590nm (absorbncia de 0.3 ou 0,4)
4 - Centrifugue 4000rpm, por 5 minutos
5 - No Gelo ressuspenda o pellet em 2 ml do tampo TSS 1x, (equivalente a 1/10(um dcimo)
do
volume original)
6 - Incube por 5 a 15 minutos no gelo

7 - Faa pequenas alquotas de 100L em eppendorfs de 0,5mL
8 - Freeze a 80C ou nitrogneo lquido
9 - Estoque a 80C
Preparo do Tampo TSS1x.

Para 100ml
para 10ml
LB ou 2YT..........95mL........................... 9,5mL
PEG (10%)..........10g...........................1g (polietilene glicol)
2M MgCl2...........2mL...........................200L (20-50 mM final)
DMSO 5%........... 5mL...........................500 L
Esterilize filtrando 0,22m..
Armazene a 4C.

12
Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes

Introduo
A competncia natural das bactrias para receber o DNA plasmidial do meio
circundante um fenmeno raro (verificando-se apenas em determinadas espcies e em
condies fisiolgicas especficas). Assim, necessrio desenvolver essa capacidade, ou seja,
necessrio tornar as clulas competentes para viabilizar a introduo do DNA recombinante
no hospedeiro selecionado. Ao processo de entrada de DNA livre (isto , DNA em soluo,
fora do invlucro celular) na clula d-se o nome de transformao. A introduo de DNA em
clulas bacterianas (como por exemplo na linhagen da Escherichia coli DH5 ou XLI-Blue)
pode ser realizada recorrendo s tcnicas de transformao clssica ou eletroporao
Na transformao qumica (ou clssica) as clulas (principalmente de E. coli) so
tornadas competentes, por tratamento com uma soluo fria de cloreto de clcio ou outros
+2
ons carregados positivamente. Os ons Ca formam um complexo com este grupamento,

cobrindo as cargas negativas da membrana celular e assim facilitando a atrao eletrosttica
com as molculas do DNA na zona de adeso. O choque trmico da transformao
complementa este processo de captao, provavelmente criando um desbalano trmico entre
o interior e o exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA atravs da
zona de adeso a que se segue um choque trmico de curta durao. Este DNA exgeno passa
a fazer parte do material gentico bacteriano que ser herdado pelas novas clulas medida
que a bactria se multiplica. As bactrias, ao receberem este DNA, geralmente adquirem uma
ou mais caractersticas novas, como por exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura
contendo antibitico permitindo o processo seletivo.

13
Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes

Procedimento:
1.
Identifique os tubos a serem usados e coloque-os no gelo.
2.
Coloque de 0,5uL a 1uL de DNA plasmidial (de 100ng a 1ug).
3.
Retire as clulas competentes do freezer 80C e desconge-as no gelo.
4.
Homogeneize bem e transfira 50uL de clulas competentes para os tubos com os

plasmdeos aliquotados.
5.
Incube no gelo por 30 minutos. Ligue o banho maria.
6.
Choque trmico: Coloque a 42C. por 1 minuto e 30 segundos.
7.
Volte para o gelo por 2 minutos
8.
Imediatamente, adicione com assepsia 500uL de meio de cultura LB sem antibitico. Use
o bico de busen.
9.
Incube a 37C por 1 hora.
10.
Plaquei 50uL em meio agar com antibitico no qual o plasmdeo confere resistncia.
11.
Incube a 37C por 16 horas ou overnight com o meio de cultura voltado para cima
12.
No dia seguinte passe um parafilme na placa e transfira 4C
Estoque em Glicerol 30%

O estoque de plasmdeo dentro da bactria e conservado em glicerol pode ser
armazenado por tempo indeterminado, desde que no descongele. Tambm pode ser feito
estoque em glicerol da prpria clula competente vazia.
A partir da cultura crescida 37C overnight contendo o plasmdeo de interesse dentro da
bactria prepare o estoque em 30% de glicerol.
1-
700 uL da cultura e 300 uL de glicerol.
2-
Homogeneze bem at misturar completamente
3-
Armazene imediatamente no freezer 80C
4-
Evite que o estoque descongele quando for reutilizar.
5-
Prepare tudo que for precisar antes de retirar o estoque do 80C
6-
Trabalhe no gelo e seja rapidssimo.

14
Teste para simples verificao do plasmdeo

O teste de verificao do plasmdeo deve ser feito antes do processo de extrao e
analisado em gel de agarose m confirmar se o DNA em estudo esta presente na colnia
inoculada, evitando o processo de extrao e purificao de colnias vazias e
consequentemente o gasto de reagentes
Procedimento
1 Colete 500L da cultura
2 Centrifugue 13.000 rpm 2 minutos
3 - Ressuspenda o pellet em 40L de STE ( TE + 0,1 %de NaCl)
4 Adicione 20L de fenol pH 7.0
5 Adicione 20L de Clorofrmio/Acool isoamlico (24:1)
6 Centrifugue 13.000 rpm 5 minutos
7 Aplique 20L em gel de agarose 1% (pode ser reciclvel)
* Se aparecer uma banda ntida de acordo com o peso/tamanho de seu plasmdeo, proceda
com a purificao.
Soluo de STE pH 8.0
Maniatis 3 B20
10 mM Tris HCl (pH8.0)

1 mM EDTA (pH8.0)
0,1 %de NaCl

15
Extrao e Purificao de DNA plasmidial

Introduo
Entre as tcnicas de DNA recombinante normalmente utilizadas, a purificao

de plasmdeos consiste naquela mais bsica e fundamental, necessria para quase todos os
fins, seja para clonagem, sequenciamento, transfeco, introduo de modificaes em
sequncias, mutagnese stio-dirigida, entre outras. O princpio bsico de isolamento consiste
em primeiro passo na transformao bacteriana (inserir o plasmdeo de interesse dentro de
uma bactria a mais comumente empregadas em biologia molecular so as linhagens de
E.coli; DH5 e XL1 Blue.) e o crescimento de uma colnia contendo o plasmdeo de interesse
em condies que maximize o nmero de cpias do plasmdeo por clula bacteriana.
O mtodo mais utilizado para o isolamento e purificao de DNA de plasmdeo se
baseia na lise alcalina, proposto originalmente por Birboim e Doly (1979). Esse mtodo
muito robusto e apresenta bons resultados qualitativos e quantitativos Entretanto, o tamanho
do plasmdeo no deve ser muito grande (<20 kb). O mtodo de isolamento por lise alcalina
baseia-se na diferena em desnaturao, em condies alcalinas (pH ~12) entre o DNA
plasmidial circular e o cromossomal de alto peso molecular. Plasmdeos grandes apresentam
propriedades mais prximas ao DNA cromossomal dificultando a separao entre eles. O
mtodo de extrao inicia-se com a ressuspenso das clulas, coletadas atravs de
centrifugao, com a soluo I (Tris, EDTA e glicose como tampo e osmtico). O EDTA
responsvel por seqestrar o magnsio, impedindo que a cascata da DNase inicialise As
clulas tambem podem ser lisadas incluindo lisozima na Soluo I.que produz orifcios nas
membranas originando estado hipotnico
A soluo II contm SDS e NaOH. O SDS
(detergente) possui a funo de lisar as membranas da clula e desnaturar as protenas

celulares (incluindo enzimas), enquanto que o NaOH eleva o pH do extrato para valores muito
alcalinos (pH 12 a 12,5). Nessas condies, ocorre a desnaturao diferencial do DNA, com o
DNA cromossomal sendo desnaturado, enquanto que o DNA plasmidial circular menor
permanecendo inalterado. Ao incorporar o Acetato de Potssio (ou Acetato de Sdio) com
pH 5,5, o extrato neutralizado sob condies de alta concentrao de sais, fazendo com que
o DNA cromossomal precipite, enquanto que o DNA plasmidial permanea em soluo. A
adio dessa soluo tambm causa a precipitao de protenas complexadas ao SDS,
incorporado pela adio da soluo II. A centrifugao final produz um extrato claro com o
16
DNA plasmidial em soluo. O DNA ressuspenso em TE, faz-se tratamento com RNase.
Para reduzir a contaminao do DNA purificado com protenas, pode-se empregar a extrao
com fenol:clorofrmio:lcool isoamlico e/ou clorofrmio:lcool isoamlico. O DNA ento
precipitado atravs da adio de alcool (0,8 1,0 X volume de isopropanol ou 2,5 x volumes
de etanol gelado) na presena de sais. Aps a lavagem com etanol 70% para remoo do
excesso de sais e RNAses.
Para algumas aplicaes, tais como o sequenciamento ou transfeco de clulas, existe
um requerimento alto para pureza do DNA plasmidial. Tradicionalmente, empregava-se a
purificao por gradiente com cloreto de csio. Esse mtodo requer uma ultracentrfuga, alm
de ser oneroso e usar grandes quantidades de brometo de etdeo. Por essas razes, houve uma
tendncia a usar cada vez menos esse mtodo, passando a utilizar outros mtodos que
empregam resinas de afinidade com DNA plasmidial e disponveis em kits comerciais. Outra
alternativa vivel consiste no emprego de precipitao em polietilenoglicol (PEG).
Os Kits comerciais prontos para extrao e purificao de plasmdeo, tais como o
Wizard Plus Minipreps da Promega; ou Qiagen so baseados no emprego de resinas de slica,
especficas para a purificao dos plasmdeos. De modo geral, esses Kits comerciais iniciam
a purificao do plasmdeo utilizando o mesmo protocolo de Lise Alcalina at a obteno do
lisado, seguido de ligao do plasmdeo com uma resina especfica que aps a lavagem da
coluna e remoo das impurezas e contaminantes, o plasmdeo pode ser eludo com gua Milli
Q ou TE de forma pura.
Aps a purificao de um plasmdeo, sempre recomendvel analisar a identidade e
caractersticas do plasmdeo atravs da digesto com enzimas de restrio, para confirmar o
tamanho dos fragmentos esperados, ou em simples eletroforese de gel de Agarose

17
Extrao e Purificao - kit Miniprep da Promega.

(5 a 10 mL de Cultura)
*Para purificao com cultura de 10 mL use 400ul das solues 1, 2 e 3.
1. A partir da placa transformada inocule uma colnia em 5 ou 10 mL de Cultura LB com

antibitico, incube 37C overnight.
2. Transfira a cultura para tubos de centrfuga 14 mL ou tubos eppendorfs 1,5mL
3. Centrifugue a 4.000 rpm por 3minutos e descarte o sobrenadante.
4. Se usar tubos eppendorfs 1,5 mL repita o procedimento no mesmo tubo
5. Adicione 200uL da soluo I (cell resuspension solution)
6. Resuspenda por frico ou com uma pipeta, at ficar homogneo. Incube 5 minutos a
temperatura ambiente.
7. Transfira para tubo eppendorfs de 1,5mL (se for o caso)
8. Adicione 200uL da soluo II (cell lysis solution).
9. Homogeneize por inverso vrias vezes (lentamente) incube 5 minutos a temperatura
ambiente. (no ultrapasse de 5 minutos) nesta fase o aspecto ficar viscoso.
10. Adicione 200uL da soluo III (cell neutralization solution). Homogeneize por inverso vrias
vezes, incube 5 no gelo.
11. Agite bem a resina e coloque a 37C por 10 minutos para entrar em soluo.
12. Centrifugue os tubos 13.000 rpm por 5 minutos.
13. Identifique uma coluna para cada amostra.
14. Adicione 1 mL da soluo de resina (agite antes de usar).
15. Adicione na mesma coluna o sobrenadante do tubo centrifugado.
16. Filtre a vcuo.
17. Adicione 2 mL da soluo de lavagem de coluna.
18. Continue filtrando (no deixe a coluna secar)
19. Retire a parte inferior da coluna introduza em tubo eppendorf 1.5mL
20. Centrifugue a 13.000 rpm por 1 minuto (para retirar o excesso)
21. Transfira a coluna para outro eppendorf.
22. Adicione 30uL de H2O Milli Q ou TE (se possvel aquecido a 65)
23. Espere de 1 a 3 minutos.
24. Centrifugue a 13.000 rpm por 1 minuto.
25. Faa leitura no espectrofotmetro. Armazene o DNA extrado a 20C.
18
Extrao e Purificao - Miniprep modificado por Marie/Joaquim

1. A partir da placa transformada inocule uma colnia em 5 ou 10 mL de Cultura LB
com antibitico, incube 37C overnight.
2. Transfira a cultura para tubos de centrfuga 14 mL ou tubos eppendorfs 1,5mL
3. Centrifugue por 5 minutos 4000 rpm
4. Ressuspenda o pellet em 200L de soluo I, mais 2L de lisozima (50mg/mL)
incube 5 minutos 37C
5. Adicione 400L soluo II, incube 5 minutos temp. ambiente
6. Adicione 200L soluo III, incube 5 minutos no gelo.
7. Centrifugue por 5 minutos 13000 rpm.
8. Transfira o sobrenadante para outro tubo, acrescente 750L isopropanol. Incube por 5
minutos temperatura ambiente.
9. Centrifugue por 5 minutos 13000 rpm. Descarte sobrenadante. Retire bem todo o
lcool.
10. Ressuspenda em 200L de TE (incube 37C, se precisar).
11. Adicione mesmo volume de acetato de amnio 5M (200L) agite forte.
12. Centrifugue por 10 minutos 13000 rpm. Transfira o sobrenadante para outro tubo.
13. Adicione 750L de etanol 100%.Centrifugue por 10 minutos 13000 rpm. Descarte
sobrenadante.
14. Adicione 500L de etanol 70%. Centrifugue por 2 minutos 13000 rpm. Descarte
sobrenadante e espere o pellet secar.
15. Ressuspenda em e200L de TE. Adicione 1L de RNAse (10mg/mlL) para cada
100L de TE.
16. Incube a 37C por 30 minutos.
17. Proceda com fenol /clorofrmio

19
Extrao e Purificao - kit Midiprep da Promega.

(200mL de Cultura)
1. A partir da placa transformada inocule uma colnia em 5 ou 10 mL de Cultura LB com
antibitico, incube 37C overnight.
2. Transfira a cultura para tubos de centrfuga.
3. Centrifugue a 4.000 rpm por 10 minutos. Decante o sobrenadante.
4. Adicione 3ml da soluo (cell resuspension solution) em cada tubo.
5. Resuspenda com a pipeta, at que no haja mais glbulos e fique homogneo.
6. Incube 5 minutos a temperatura ambiente.
7. Adicione 3ml da soluo (cell lysis solution).
8. Homogenize por inverso (lentamente) at ficar viscoso. Incube 5 minutos a temperatura
ambiente. (no ultrapasse de 5 minutos).
9. Adicione 3ml da soluo (cell neutralization solution) Homogeneize por inverso
10. Incube 5 minutos no gelo
11. Centrifugue a 13.000 rpm por 15 minutos a 4C.
12. Transfira o sobrenadante para outro tubo
13. Identifique uma coluna para cada amostra. (identifique a parte inferior)
14. (Agite a resina antes de usar se preciso incube a 37C por 10 minutos).
15. Adicione 10 ml da soluo de resina.
16. Adicione na mesma coluna o sobrenadante do tubo centrifugado.
17. Filtre a vcuo.
18. Adicione 25 ml da soluo de lavagem de coluna.
19. Filtre a vcuo novamente.
20. Corte a parte inferior da coluna e introduza em eppendorf identificado.
21. Centrifugue a 13.000 rpm por 30 segundos. (retirar o excesso).
22. Transfira a coluna para outro eppendorf.
23. Adicione 200 de H2O Milli Q ou TE (se possvel aquecido a 65C).
24. Espere de 1 a 3 minutos.
25. Centrifugue a 13.000 rpm por 1 minuto.
26. Faa quantificao no espectrofotmetro
27. Armazene o DNA extrado a 20C
20
Extrao e Purificao - Maxprep com PEG 30%

Procedimento:
1 A partir da placa transformada inocule uma colnia em 5 mL de meio LB com antibitico
- incube 37C overnight
2 - Transfira para um erlen de 1 litro com 500 mL de meio LB e antibitico
-incube 37C overnight
3 - Colete as clulas:
- transfira a cultura para tubos de centrfuga, centrifugue 4.000 rpm por 10 minutos.
* Obs.: retire 500 uL para teste fenol e 1000uL para estoque glicerol
- centrifugue 5700 rpm por 10 min
* se no for continuar frize o pellet a -20C
4 - Adicione 20 mL da soluo I
- ressuspenda at que no haja mais gumos,
- adicione 10mg de lisozina diluda em gua
- incube 5 min a temperatura ambiente
5 - Adicione 40 mL de soluo II (fresca)
- homogeneze por inverso delicadamente, cerca de 6 a 10 vezes
-incube a temperatura ambiente por 5 minutos
* no deve ultrapassar 5 minutos
6 - Adicione 20 mL da soluo III
- homogeneze por inverso de 6 a 10 vezes
- incube 20 min no gelo
* veja se os tubos estam com o mesmo volume/ peso
7 - Centrifugue 5700 rpm por 20 minutos
- Filtre o sobrenadante em gaze em outro tubo identificado
8 - Adicione 60 mL de isopropanol a temperatura ambiente (espere de 2 a 40 minutos
opicional), balanceie os tubos
9 - Centrifugue 5700 rpm por 20 minutos
- descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de gua
- transfira para tubos de 50 mL

21
Purificao
10 - Adicione um volume NH4Ac 5M (acetato de amnio) e agite bem
- centrifugue 4000 rpm por 15 minutos
- transfira o sobrenadante para tubos de 50 mL
11 - Adicione 2 o volume de etanol absoluto
-incube a temperatura ambiente 5 minutos
- centrifugue 4000 rpm por 15 minutos - descarte o sobrenadante
-ressuspenda o pellet em 4 mL de gua, - adicione (4 uL RNAse 10mg / mL)
Incube 37C por 1 hora
* se no for continuar pode frizar -20C aps RNAse
12 - Adicione 4 mL de PEG 30% + 1.5M NaCl , incube no gelo 40 minutos
* pode substituir a incubao no gelo por geladeira 4C overnight
- transfira para TUBOS TAMPA ROXA OU AMARELA
- centrifugue por 40 minutos 4 C a 13000 rpm
13 - Ressuspenda o pellet em 400 uL de gua Milli Q
- adicione 40 uL buffer 10 X e 4 uL PK 10 mg/ mL
- incube 37 C por 30 minutos
14 - Proceda com Fenol/Clorofrmio

22
Purificao de DNA com Fenol Clorofrmio

Ao trabalhar com fenol use luvas e culos protetores se possvel, evite contato com a pele
e roupa, evite respirar vapores. Se possvel use capela de exausto qumica.
Considerando que tenha 200uL de amostra
.Obs: Pipete a fase inferior do fenol.
1. Acrescente mesmo volume de fenol pH8 em cada eppendorf 200 L).
2. Agite bem ou vortex. Centrifugue a 13000rpm por 10 minutos.
3. Retire a 1 fase e passe para outro eppendorf. Tome cuidado para no pipetar as
impurezas, deve formal um anel entre as duas fazes. Se necessrio repita o tratamento
com fenol.
4. Acrescente o mesmo volume de fenol (clorofrmio e lcool isoamlico 24:1) 1:1, ou
seja 100L de um e 100 L do outro. Agite bem ou vortex.
5. Centrifugue a 13000 rpm por 10 minutos
6. Retire a 1 fase e passe para outro eppendorf.
7. Certifique que no haja mais impurezas para proceder com clorofrmio.
8. Acrescente igual volume de clorofrmio e lcool isoamlico (200 L).
9. Agite bem ou vortex. Centrifugue a 13000 rpm por 2 minutos.
10. Retire a 1 fase e passe para outro eppendorf. Acrescente 1/10 do volume de Acetato
de Sdio 3M pH 5.2 (20L) e o mesmo volume de isopropanol absoluto (200L) ou 2
vezes e meio o volume de Ethanol absoluto gelado (100%). 500uL
11. Deixe no freezer a 20C por 10 minutos, (so quando usar ethanol absoluto, esse passo
tambm opcional) Centrifugue a 13000 rpm por 15 minutos
12. .Aspire o sobrenadante e adicione 500 L de ethanol a 70% gelado.
13. Repita a lavagem com ethanol 70% mais uma vez ou at sair o cheiro do fenol.
14. No toque no pellet, coloque o tubo para centrifugar no mesmo sentido.
15. Centrifugue a 13000 rpm por 2 minutos.Aspire o sobrenadante.
16. Espere secar e ressuspenda o pellet com TE Buffer (pH 8.0). Ou H2O Milli Q .
17. A quantidade do solvente depende do tamanho do precipitado. Ou 100 L para cada
100uL da cultura inicial.
18. Identifique bem. Determine a concentrao no espectrofotmetro
19. Armazene no freezer a 20C.
23
Solues Protocolo Maxprep PEG 30%
Soluo I
500mL
50 mM Glucose______________________25mL 1M
25 mM Tris HCl( pH 8.0)_____________12,5 mL -1M
10mM EDTA (pH 8,0)_________________10mL 0,5M
H2O q. s. p. _________________________ 500mL
Autoclave 15 minutos a 121C
Armazene a 4C.
Soluo II
500mL
100mL
0,2 M NaOH_______________________20mL 5 M______________4mL

1% SDS ___________________________50mL 10%_____________10mL
H2O q. s. p. _______________________ 500mL_________________ 100mL
* aconselhvel o uso de soluo fresca
Soluo III
100mL
500L
5M acetato de potssio________________60mL ___________________300mL

cido actico glacial__________________11,5mL__________________57,5mL
H2O ______________________________28,5 mL__________________142,5mL
PEG 30%
......................................100mL
H2O destilada___________50mL
30% de PEG 8000________30g
1,5M de NaCl ___________8.7g
Agite aquecendo
Complete o volume com H2O p/ 100mL
Filtre 0,22m ou autoclave
24
Solues Protocolo Maxprep PEG 30%

Lisozima
Lisozima_________________10mg
H2O destilada_____________ 1mL
10X PK Buffer
100mL
H2O destilada____________ 40mL
0,2 M Tris (pH 8,0) _______ 20mL (1M)
25mM EDTA_____________ 5mL (0,5 M)
0,3 M NaCl ______________6mL (5M)
2% SDS ________________ 20mL (10%)
Complete o volume com H2O p/ 100mL
PK 10mg/ml
Ressuspenda 10mg de Proteinase K em gua destilada
TE pH 8.0 Maniatis 3
10 mM Tris HCl (pH8.0)
1 mM EDTA (pH8.0)
B20
RNase 10mg/mL
*Uso no protocolo Qiagem - prepare 25ug/ml na soluo 1

*Uso no protocolo fenol / clorofrmio prepare 10mg/ml
10mg de RNase A
0,1 M acetato de sdio pH 4.8
0,3mM EDTA pH 8.0
Complete volume para 1mL com gua destilada, homogeneze
Aquea a 80C por 10 minutos
Deixe esfriar a temperatura ambiente lentamente - overnight
Faa alquotas de 100uL e frize a -20C
25
Extrao e Purificao - kit Maxprep da QIAGEN

1. Colete as clulas centrifugando a cultura de 300 a 500mL a 5.000 rpm por 10 minutos.
Descarte sobrenadante. Remova todos os traos do sobrenadante atravs da inverso do
tubo sobre um papel toalha.
2. Adicione 10 mL de Buffer P1 com RNAse tampo de ressuspenso.
3. Homogeneze com vortex ou suco com pipetas at que no haja mais grumos
Certifique-se que a RNAase A foi adicionada ao Buffer P1. A bactria deve ser
ressuspendida completamente. Transfira para tubo de 50 mL.
4. Adicione 10 mL de Buffer P2 - tampo de lise. Homogeneize levemente por inverso 4 a
6x incube a temperatura ambiente por 5 minutos. No aplique o vortex, isso pode resultar
em rompimento do DNA genmico. O lisado deve parecer viscoso. No permita que a
reao de lise proceda por mais de 5 minutos.
5. Adicione 10 mL do Buffer P3 gelado - tampo neutralizador
6. Homogeneize por inverso + ou 6x, incube no gelo por 20 minutos.
7. A precipitao potencializada usando Buffer P3 resfriado e incubando no gelo. Aps
adio de Buffer P3 forma-se um material branco e precipitado e o lisado tornam-se
menos viscoso. O material precipitado contm DNA genmico, protenas celulares e SDS.
O lisado deve ser misturado suavemente para evitar precipitao do SDS.
8. Centrifugue 13.000 rpm por 15 minutos a 4C.
9. Aps a centrifugao o sobrenadante dever tornar-se translcido.
10. Filtre o sobrenadante em gaze ou papel toalha, para evitar entupimento da coluna.
11. Adicione 10 mL do Bufffer QBT - tampo equilibrador na coluna e espere filtrar. Coloque
a coluna em um tubo de centrfuga.
12. Transfira o sobrenadante para a coluna equilibrada e espere que a coluna esvazie
completamente por gravidade.
13. Adicione 2 x 25 mL de Buffer QC - soluo de lavagem
14. A primeira lavagem suficiente para remover todos os contaminantes da maioria das
preparaes de DNA. A segunda lavagem particularmente necessria quando grandes
volumes de cultura ou quando cepas de bactrias produzem grandes quantidades de
carboidratos.

26
15. Todas as solues devero estar em temperatura ambiente para minimizar a precipitao
de sais, embora as centrifugaes seja realizada a 4oC para prevenir um superaquecimento
da amostra.
16. Adicione na coluna 15 mL de Buffer Q.F tampo eluidor
17. Adicione 0,7 do volume de isopropanol temperatura ambiente ( p/ 15 mL de Q.F.
adiciione10,5mL de isopropanol
18. Centrifugue 13.000 rpm por 15 minutos e descarte o sobrenadante
19. Sem ressuspender o pellet, adicione 500L de etanol 70% em temperatura ambiente e
centrifugue a 13.000 rpm por 10 minutos. . O etanol a 70% remove sais precipitados, pois
mais voltil, tornando-se mais fcil a ressuspenso do DNA.
20. Descarte o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet. O pellet de isopropanol
pode parecer hialino e podem dificultar a visualizao
21. Deixe os tubos invertidos sobre um papel toalha e espere que o pellet seque a temperatura
ambiente. Certifique que todo etanol tenha evaporado.
22. Ressuspenda o pellet em 300 L de TE e transfira para um eppendorf. Ressuspenda o
pellet de DNA enxaguando as paredes do tubo. Pipetar o DNA vrias vezes pode causar
danos e deve ser evitado. Uma secagem exacerbada do DNA pode dificultar sua
ressuspenso. O DNA dissolve melhor em condies levemente alcalinas, no fcil
dissolv-lo em tampes cidos.
23. Quantifique em espectrofotmetro e depois analise uma alquota (500ng) em gel de
agarose 1%
24. Armazene a 20C

27
Solues para Maxpreps da QIAGEN

50 mM Tris.Cl, pH 8.0;
Buffer P1
10 mM EDTA;
(Resuspension Buffer)
Buffer P2
(Lysis Buffer)
Buffer P3
(Neutralization Buffer)
100 g/ml RNAase A

200 mM NaOH, 1% SDS(m/v);
3,0 M acetato de potssio pH 5.5

2 a 8oC, aps adio

de RNAase A.
Use fresco
Temp. ambiente
Temp. ambiente
28
Extrao e Purificao - Kit Maxprep /Qiagen Modificado Prof: Luiz

1. Procedimento para 200mL de Cultura
2. Transfira os 200 mL da cultura para tubos de centrfuga, balancei e centrifugue 4000

rpm por 15 minutos.
3. Descarte o sobrenadante. Deixe os tubos virados para baixo para escorrer todo o lquido.
4. Ressuspenda o pellet com TEG Buffer, utilizando 5 mL para cada tubo. Utilize pipeta de
vidro e homogeneize bastante aspirando e soltando o lquido at que todo o precipitado se
solte e se desfaam todos os grumos.
5. Transfira com a mesma pipeta para tubos de 50 mL. Incube a temperatura ambiente por 5
minutos
6. Acrescente 10 mL em cada tubo da Soluo Lyses Buffer. Homogeneize lentamente por
inverso (6x). Incube a temperatura ambiente por 5 minutos.
7. Acrescente 5 mL em cada tubo da Soluo Neutralizante. Homogeneize e deixe no gelo
por 5 minutos.
8. Centrifugue 4000 rpm por 20 minutos.
9. Filtre em guardanapo de papel branco transfira para tubo de centrfuga (tampa roxa ou
amarela).
10. Acrescente igual volume de isopropanol. Se necessrio divida em dois tubos. Balancei
com isopropanol.
11. Centrifugue 13000 rpm 40C por 20 minutos. Descarte o sobrenadante.
12. Ressuspenda o pellet em 500 L de H2O milli Q e homogeneize bem. Transfira para um
eppendorf, acrescente mais 500 L de H2O no tubo de centrfuga, lave bem e transfira
para o mesmo eppendorf. Homogeneize e divida o contedo para outro eppendorf.
13. Obs: a quantidade de H2O depende do tamanho do precipitado.
14. Prossiga com purificao Fenol/Clorofrmio.

29
Solues: Kit Maxprep /Qiagen Modificado por Prof:

Soluo TEG Buffer : Ressuspenso
Preparo de 250 mL de soluo, com as seguintes concentraes finais:

Tris base 25 mM (pH 8.0) ......................6,26mL (de uma soluo estoque 1M)
EDTA 10 mM (pH 8.0)...........................5mL (de uma soluo estoque 0.5M)
Glicose 50 mM .....................................12,5mL (de uma soluo estoque 1M)
- Complete o volume com H2O destilada para 250 mL.
- Homogeneze no agitador magntico.
- Transfira para um frasco com tampa.
- Armazene na geladeira.
Obs: Quando for utilizar, acrescente 5mg de lisozima por mL de soluo a ser utilizada.
Soluo 2: Lyses
Para cada 20 mL de soluo calcule as concentraes finais de:
0,2 M de NaOH........................0,8mL (de uma soluo estoque 5M)
1% de SDS...............................2mL (de uma soluo estoque 10%)
- Complete o volume com H2O destilada.
- Prepare apenas a quantidade a ser utilizada.
Soluo 3: Neutralizante:
Para volume de 100 mL:
-Acetato de Potssio (KAc) 5 M...................60 mL
- cido Actico Glacial ..............................11,5 mL
- Complete o volume com H2O destilada.
- Homogeneze no agitador magntico.
- Armazene 4C

30
Meio de cultura LB Medium (Luria Bertani) (Maniatis 3 pg A.1)

P/ 1 litro
p/ 100 mL
1. H2Obidestilada........800mL......................................80 mL
2. Bacto triptone ...........10g................................................1g
3. Bacto yeast extract......5g.............................................2,5g
4. NaCl...........................10g ..............................................5g
5. Homogeneize em agitador magntico at dissolver.
6. Ajuste pH 7,0 com NaOH 5M.
7.
Ajuste o volume final (p/ quantidade que esta fazendo) com H2O destilada
8. Autoclave por 20 minutos a 121C.

Se for fazer meio agar adicione 1,5% de agar, depois de ter ajustado o pH.
Adicione o antibitico na concentrao especificada pelo protocolo na temperatura entre
37 a 40C e plaquei.
Meio de cultura 2x YT Medium (Maniatis 3 pg A.3)

P/ 1 litro
p/ 500mL
p/ 200mL
1. H2Obidestilada........... 900mL..............400mL......................150mlL
2. Bacto triptone ..............16g....................8g............................3.2g
3. Bacto yeast extract.......10g....................5g..............................2g
4. NaCl...............................5g....................2,5g..........................1g
6. Ajuste pH 7,0 com NaOH 1M (+ ou 1,3 ml /500ml)
7. . Ajuste volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.
9. Se for fazer meio agar adicione 1,5% de agar, depois de ter ajustado o pH.
10. Adicione o antibitico na concentrao especificada pelo protocolo na temperatura entre
37 a 40C
31
Meio de cultura SOB Medium (Maniatis 3 pg A.2)
P/ 1 litro
p/ 100mL
1. H2Obidestilada...................900mL................................ 80mL
2. Bacto triptone ....................20g..................................... 2g
3. Bacto yeast extract..............5g....................................... 0,5g
4. NaCl....................................0,5g.................................... 0,05g
6. KCl. 250 mM ......................10mL................................ 1mL
7. Ajuste pH 7,0 com NaOH 5N
8.
Ajuste volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.
9. Autoclave por15 20 minutos a 121C

10. Depois adicione 5mL/L de uma soluo estril de MgCl2 2M (500L/100ml)
Obs: KCl 250mM (1.86g de KCl em 100ml de H2O bidest) (MW 74.551)
Meio de cultura SOC Medium
(Maniatis 3 pg A.2)
O SOC Medium similar ao SOB exceto por ele conter 20mM de glucose.
Aps autoclavar o meio SOB adicione a uma temperatura de 60C, 20mL/L de uma soluo
estril de Glucose 1M.

32
Meio de cultura NZY Top Agarose

P/ 1 litro
p/ 200mL
1. H2O bidest.........................................900mL..............180mL
2. NaCl .................................................. 5g.....................1g
3. MgSO4 .............................................. 2g.....................0,4g
4. Yeast extratct......................................5g......................1g
5. NZ amine (casein hydrolysate)..........10g.....................2g
6. Agarose...........................................7%
7. Ajuste pH 7,0 com NaOH
8. Ajuste o volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.
OBS: Temos NZY pronto. Veja rtulo em anexo
M9 Minimal Medium (Based on Maniatis and Notebook: Dec 1, 1993

and April 8, 1993 , also see Notebook III: p79).
P/ 500ml
P/200ml
1. H2Obidestilada...............445mL...................................................175mL
2. Agar 1.5%........................7,5g......................................................3g
3. Autoclave por 20 minutos a 121C
4. Aps autoclavar a temperatura de 55C adicione:
5. CaCl2 1M........................50 L (autoclavado) (MW 110.99g/mol)....20L
6. M9 Salt 10x.................... 50mL (autoclavado)..................................20mL
7. MgSO4 1M......................1mL (autoclavado) (MW 246,5g/mol).......400 L
8. Glucose 20%.................10mL (autoclavado)...................................4mL
9. Vit. B1 1%.....................100 L. (filtre o,22m)...............................40 L
10. Arginine 100mg/ml......0,5mL (filtre o,22m)...................................100 L
11. Plaquei

33
Preparo do 10x M9 Salt
p/ 500mL
p/250mL
p/ 100mL
1. H2Obidest.........400mL.......... ..........200mL............................ 6g
2. Na2 HPO4..........30g..........................15g (corrigir H2O).... .... 3g
3. KH2PO4............15g..........................7,5g.................................. 1g
4. NH4CL..............5g...........................2,5g.................................. 0,5g
5. NaCl..................2,5g........................1.25g...............................0,5g
6. Ajuste o volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.
7. Autoclave 121C por 20 minutos.
Nota 1: Correo da H2O do Na2HPO47 H2O

Peso molecular do Na2HPO4 142
PM 142..............15g ...250mL
Peso molecular do Na2HPO4 7 H2O 268
PM 268...........x=28,3g
Nota 2: In Maniatis Na2 HPO4 64g.

Este protocolo baseado em Current protocol Red Book
Nota 3: Antibitico/Clorofenicol (Maniatis 3 A6)

Prepare 34mg em 1ml de ethanol. - M9 (clula DE3) Conc. final = 68g/ml

34
Eletroforese de DNA em gel de agarose

A agarose um polissacardeo, e forma uma rede que prende as molculas durante a
migrao de agarose, a diferena no gradiente de separao depende da concentrao do gel.
A eletroforese em gel uma tcnica de separao de molculas de protenas, DNA e
RNA, que envolve a migrao de partculas em um determinado gel durante a aplicao de
uma diferena de potencial. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, pois
as de menor massa iro migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o
formato da molculas tambm influi, pois algumas tero maior facilidade para migrar pelo
gel.
A eletroforese de gel de agarose usada como mtodo analtico e preparativo, aps
separar os fragmentos digeridos em tamanho especfico, possvel retir-lo do gel e purificar
para ser usado posteriormente em vrios procedimentos de tcnicas de manipulao gentica.
comumente usados gel de agarose para fragmentos entre 100pb a 12 mil pares de bases,
fragmento menor indicado gel de acrilamida 10% ou utilizao de agarose especial
A velocidade de migrao bem como o poder de resoluo de um gel depende de
vrios parmetros, como concentrao do gel, tamanho e forma da molcula, voltagem
aplicada e tampo de corrida.
Para visualizao e interpretao correta dos resultados obtidos, so necessrias a
incorporao de um agente intercalante de DNA (Brometo de Etdeo) (WHITE et al., 1998) e
a utilizao de marcadores de massa moleculares apropriados de maneira que migrem em
paralelo s amostras e um tampo de corrida com glicerol e corante azul, o glicerol consiste
que as amostras afundem no poinho e o azul em acompanhar a corrida.
Nota:
Para purificar bandas no use agarose reciclada. Use culos de proteo contra a luz Ultra
Violeta. O Brometo de Etdeo altamente txico e carcinognico, deve-se ter o mximo de
cuidado ao manuse-lo, use luvas, no aspire vapores.

35
Quantificao do DNA - Maniatis 3 E-5

Manuseio do espectrofotmetro.
Ligue o estabilizador e aparelho na lateral, levante o visor.
Espere que todas as estrelinhas se iluminem.
Escolha a opo Spectrum
Use o aparato menor cuveta de quartzo
Coloque 200ul de seu diluente ex. gua em cada cuveta.
Aperte F1 Base correct zerar o aparelho.
Retire a cuveta do compartimento inferior e coloque a amostra a ser lida.
Aperte Start espere a curva da leitura ser feita
Aperte F2 Data Process Digite 5, enter, 20 e enter. Anote a leitura.
Diluio do DNA - 1/100 ou 1/50 volume final de 200uL
A quantificao e feita em Espectrofotmetro com amostra diluda.
Exemplo: diluio de 1/100 (2L de DNA e 198L de H2O Milli Q)
Leitura da Protena: em 280 nm 0,162
Leitura do DNA: em 260 nm 0,306
Clculo da leitura do DNA dupla fita

Clculo do fator r razo (fator de pureza do DNA)
260nm / 280nm
0,306 : 0,162 =1.8%
OBS: 1,6 % DNA contaminado com protenas

de 1,7 % a 1.9% DNA puro
2.0 % DNA contaminado com RNA
Frmula
Leitura da Abs.em 260nm x diluio x 50(=OD) : 1000 = g/L
g/uL
0,306 x 50 x 100 : 1000 = 1.5g/L (Concentrao em g/L)

36
Preparo do Gel de agarose novo 1% ou 0,7%

Prepare apenas a quantidade suficiente para o uso no momento
Gel pequeno 0,7% - 0,42g agarose...............30 mL TAE 1x ou TBE 1x
Gel grande 0,7%- 0,21g agarose ...................60 mL TAE 1x ou TBE 1x
Faa os clculos para saber quanto precisa pesar de agarose, para a quantidade e concentrao
diferentes.
1.
Em um erlem j destinado vidraria para uso com agarose e brometo de etdeo coloque a
agarose, e adicione a tampo TAE 1x (estoque 10x) ou TBE 1x (estoque 10x) leve ao
microondas por uns 3 minutos ou at que a agarose esteja completamente derretida, evite
ferver.
2.
Espere a agarose derretida ficar a temperatura de pelo menos 50C adicione Brometo de
Etdeo 10mg/mL (estoque 10.000x) para que fique na concentrao final de 1x, ou 0,5x se
preferir manusear menos quantidade de brometo, (d certo), evite aspirar vapores.
Gel pequeno 1,5L de Brometo
Gel grande - 3L de Brometo
3.
O aparato (caminha) j deve estar montada e nivelada, coloque 8 a 10mm de agarose,

coloque o pente espere polimerizar
4.
Aps completa polimerizao retire o pente com cuidado, firmando a caminha para baixo
e puxando o pente reto para cima.
5.
Transfira o gel na posio horizontal para a cuba e cubra-o com o mesmo tampo usado
para fazer o gel.
Se for usar agarose reciclada, veja protocolo:

Guarde o restante da agarose no prprio bquer e cubra com papel alumnio ou filme
Identifique com fita crepe:
Concentrao, tampo usado, se tem brometo de etdeo ou no.
Quando precisar s aquecer.

37
Aplicando o gel de agarose

Preparo das amostras de DNA para aplicar no gel
Aplique 0.5g a 1.0g de DNA ou 10L da PCR ou sistema de digesto
2L de da amostra ( 0.5g) - 8L de de H2O destilada - 2L de Tampo de Corrida 6x
Ex:
1.
Aps completa polimerizao do gel retire o pente com cuidado, firmando a caminha para
baixo e puxando o pente reto para cima.
2.
Transfira o gel na posio horizontal para a cuba e cubra-o com o mesmo tampo 1x.
3.
Aplique 6L de marcador de peso molecular no primeiro poinho (1g/L)
4.
Aplique todo o volume da amostra preparada - uma cada poo
5.
Tampe a cuba de eletroforese e encaixe os eletrodos (+ positivo / - preto)
6.
Ligue a fonte de eletroforese, selecione a corrente do negativo para positivo.
7.
100 Volts / mais ou menos uns 40 minutos.
8.
A confirmao do fluxo de corrente dada pela observao da formao de bolhas a partir

dos eletrodos. OBS. DNA (-) migra para o anodo (+)
9.
Monitore a migrao do DNA pela migrao dos corantes do tampo de corrida,

aconselhvel correr 1/3 do gel
Azul de bromofenol: migra ~ 300bpCianol de xileno: migra ~ 4.000bp

10.
Desligue a fonte de energia, desconecte os eletrodos, retire o gel da cuba e visualize o

DNA no transluminador luz Utra Violeta.
11.
Ou visualize no foto documentao, salve e fotografe (se for possvel)
12.
A leitura deve ser rpida porque o DNA se difunde no gel com o tempo. Quando for cortar
a banda do gel, evite a luz ultravioleta sobre o DNA.
Foto

38
Reciclagem de gel de agarose

Em laboratrios de biologia molecular, a eletroforese em gel de agarose usada,
rotineiramente para separar molculas de cidos nuclicos. A agarose um polmero extrado
de algas marinhas que apresenta custo elevado e pode ser reciclada para uso em anlise
simples de DNA.
Procedimentos:
1.
Estoque os gis em H2O destilada, quando houver um volume considervel inicie a

descontaminao.
2.
Troque diariamente a H2O destilada durante 15 dias.
3.
Derreta a agarose em forno de microondas.
4.
Para maior pureza do gel filtre a vcuo(aquecido) em gaze.
5.
Para cada 90 mL de agarose reciclvel; acrescente de10 mL a 20mL de H2O destilada.
6.
Faa uma alquota em um pratinho de pesagem e compare a concentrao com um gel

novo. (opcional).
7.
Faa alquotas de 90 mL, espere gelatinar
8.
Transfira para recipiente maior cubra com H2O destilada, esse processo permite
hidratao do gel at o momento do preparo final.
Preparo final:
9.
Transfira uma alquota de 90mL da agarose pr-reciclada para um bquer.
10.
Acrescente 10 mL de tampo TBE 10x ou TAE 10x
11.
Leve ao microondas at derreter espere esfriar a uma temperatura de 50C
12.
Acrescente 5L de brometo de etdeo 10.000x 10mg/ml
13.
Coloque na cuba com o pente. A quantidade que for usar no momento.
14.
Guarde o restante no prprio bquer, identifique e cubra-o com papel alumnio.
15.
Quando for reutilizar s aquecer.
16.
Faa a seguinte identificao no recipiente de gel reciclado pronto e disponvel.

Gel agarose 1% reciclavel
Com Brometo de Etdeo
Tampo........................
Data..............................
Nome ..........................
39
Preparo de reagentes e solues

O preparo de solues com rigor passa pela avaliao do reagente qumico que ser
utilizado. O acondicionamento adequado dos reagentes (temperatura, condies higroscpica
e voltil e sensibilidade a luz) conservao e manuteno dos equipamentos bsicos como
balana e pHmetro so fatores importante no preparo correto de solues e devem ser
monitorados adequadamente.
Cuidados necessrios devem ser tomados no momento da dissoluo do soluto em H2O ou em
outro solvente, para que o volume final no ultrapasse aquele requerido, de forma a no
alterar a concentrao final da soluo. Aconselha-se dissolver o soluto em pequenos volumes
do solvente, em seguida completar um pouco mais, ajustar o pH e s depois ajustar o volume
final.
Tcnicas de Biologia Celular. Oliveira e tal
Solues para eletroforese em gel de agarose

TBE 5x
Soluo Estoque (Tris / cido brico / EDTA) Maniatis 3 B23
Para 1 litro
1.
Tris base 54g
2.
cido brico ..27.5g
3.
EDTA0,5 M(pH8)..20mL
4.
Coloque 400ml de H2O bidestilada.
5.
Homogeneze em agitador magntico
6.
Complete com H2O bidestilada at 1000mL
7.
Filtre a vcuo, papel de filtro comum.
8.
Armazene em frasco de vidro temperatura ambiente.

40
TAE 50x
Soluo Estoque - Maniatis 3 B23
100ml 50X
500mL 10x
1.
Tris base
24,2g............................24,4g
2.
cido actico
5.71ml..........................5,71g
3.
EDTA 0,5M pH8,0
10ml ............................10mL
4.
Filtrar a vcuo, papel de filtro comum.
5.
Armazenar em frasco de vidro temperatura ambiente.
TAE 1x - Soluo de trabalho

Para 500ml
TAE 50x .........usar 10 ml
H2O Bid..........Completar p/ 500 ml
Tampo azul de corrida 6x Maniatis 3 pg B24 n III

1.
0,25% de bromophenol blue (azul escuro)
2.
0,25% de xylene cyanol (azul claro)
3.
30% de glicerol em gua
4.
Armazene a 4C
Usamos apenas o bromophenol blue, mas isso no afeta seu efeito e visualizao.
Marcador de peso molecular

1 kb DNA Ladder - Estoque 1g/L
DNA1ug/uL ...........1L
Tp azul 6x .............1L
H2O ......................4L
Estoque a 4C ou 20C Aplique 6L no gel

41
Manipulao na Sala de Cultura de Clulas
Introduo
Trabalhar com cultura de clulas exige cuidado e ateno redobrada. Um simples

procedimento realizado de forma errada pode comprometer todo o experimento. Lave todo
material usado na cultura de clula com jato forte de gua vrias vezes e enxge com gua
destilada. No caso de contaminao use detergente especial para laboratrio no material que
ser autoclavado. Use a pia indicada para tratamento e lavagem do material microbiolgico no
caso de contaminao. Lave-os imediatamente aps o uso para evitar proliferao e
contaminao pr bactrias.
* A incubadora de clulas de responsabilidade de cada um mesmo tendo algum designado
para limpeza e manuteno do equipamento.
Na sala de cultura de clulas so realizados os seguintes experimentos:
Cultivo de clulas tumorais imortalizadas,
Preparo e cultivo de clulas primrias,
Ensaio de Transfeco,
Congelamento de clulas,
Filtragem de meio de cultura e reagentes entre outras atividades
OBS.: Mantenha a sala limpa e organizada.
No lave o material usado em cultura de clulas na pia destinada ao material microbiolgico.

42
Origem das Clulas Hela
Henrietta Lacks: Imortal
Henrietta morreu h mais de 55 anos, e apesar disto, existem mais clulas suas
atualmente do que quando ela era viva. Clulas tumorais extradas de seu tero so cultivadas
at hoje e so responsveis pela elucidao de muitos mecanismos celulares e outras questes
importantes como o desenvolvimento da vacina da plio.
Em fevereiro de 1951, Henrietta Lacks deu entrada no Hospital Johns Hopkins, em
Baltimore, EUA, e foi diagnosticada com um tumor cervical. Uma amostra tecido uterino foi
enviada ao pesquisador George Gey que estava na poca tentando cultivar tecidos humanos
em meio sinttico, porm sem sucesso. As clulas de Lacks no entanto cresciam muito bem,
num ambiente ideal se duplicam a cada 24hrs. E comearam a ser enviadas a pesquisadores de
todo o mundo, recebendo o nome de clulas HeLa. Se voc colher uma amostra de tecido
prpria, um pedao da sua pele por exemplo, mantendo num ambiente a 37C, com
oxigenao controlada e meio nutritivo, suas clulas vo continuar se dividindo como se ainda
estivessem no seu corpo. Porm, elas no passaro da 52 gerao, limite conhecido como
limite de Hayflick, devido ao encurtamento dos telmeros, uma espcie de controle celular
para impedir que clulas se dividam sem controle (como o tumor que originou as clulas
HeLa). Acontece que as clulas HeLa so clulas chamadas transformadas e so capazes de
43
manter-se em diviso constante, o que permite que essas clulas sejam cultivadas at hoje.
Henrietta morreu cerca de 8 meses aps seu diagnstico, em 4 de outubro de 1951,
aparentemente seu tumor foi diagnosticado como epitelial tpico e tratado com radiao, o que
no funcionou (no seu caso, o necessrio seria a remoo cirrgica do tecido). Sua famlia s
ficou sabendo do uso de suas clulas em 1975, e apesar das diferentes aplicaes e inclusive
da comercializao de alguns mtodos celulares que envolvem o uso de clulas HeLa, nunca
receberam um centavo. Atualmente se sabe que o que provavelmente causou o tumor de
Lacks foi uma infeco com HPV, o herpes papiloma vrus, conhecido por estar presente em
grande parte dos casos de cncer cervical, e que tem marcadores moleculares que podem ser
encontrados nas clulas HeLa. Hoje em dia existem vrias outras linhagens celulares, de
diferentes tecidos, transformadas ou no, mas nenhuma to estudada e utilizada como a
linhagem de Henrietta.
Alguns pesquisadores consideram suas clulas como um organismo parte, ou mesmo uma
outra espcie (devido ao nmero diferente de cromossomos que elas tm), batizada de
Helacyton gartleri.
Fontes:
SEXO E AS ORIGENS DA MORTE - WILLIAM R. CLARK - ISBN: 8501074004
AS DEZ MAIORES DESCOBERTAS DA MEDICINA - MEYER FRIEDMAN, GERALD
WIRILDLAND - ISBN: 8535908684

44
Origem Clulas U-937

Organismo: Homo sapiens (Homem)
Fonte: Linfoma histoctico
Morfologia: Moncito
Produtos celulares: Lisozima, beta-2-microglobulina,fator de necrose tumoral(TNF-)
Propriedades de Crescimento: Suspenso
Restries: A linhagem original de clulas U937 foi estabilizada pelo laboratrio do
Dr. K. Nilssons em 1974; e foram feitas algumas requisies:
1) Em todos os trabalhos que reportem o uso desta linhagem celular ou derivados,
deve ser citada referncia direta Sundstrom & Nilsson (Int. J. Cancer 17: 565577, 1976);
2) Qualquer uso com finalidade de comercializar deve ser nogociado com
Pharmacia Diagnostics AB, S-751 82 Uppsala, Sweden;
3) No devem ser feitas distribuio por terceiros;
4) Estas clulas devem ser usadas com propsitos: no-clnicos, no-comercial,
somente para pesquisa.

45
Condies de Sobrevivncia
Meio de cultura:
90% de RPMI, 2mM de L-glutamina, 2 g/L de bicarbonato de sdio,
4,5g/L de glicose, 10mM de HEPES, 1mM de piruvato de sdio,
10% de Soro Fetal Bovino, 10 mL de penicilina (100U/mL) estreptomicina (100/mL).
RPMI a abreviao de Roswell Park Memorial Institute. Este meio de cultura contm uma
grande quantidade de fosfato e formulado para ser utilizado em uma atmosfera de 5% de
CO2. O meio sempre suplementado com soro e soluo de antibiticos.
O meio de cultura deve ser trocado 2 a 3 vezes por semana.
Temperatura: 37C. Atmosfera: 95% de ar e 5% de CO2
Preservao das clulas:
Congeladas em nitrognio liquido ou freezer 80C
Meio para congelar: Meio de cultura completo com 5% (v/v) de DMSO.
Temperatura de congelamento: fase de vapor do nitrognio lquido

46
Reao da Transfeco
No ncleo da clula, via plasmdeo de expresso, a transcrio do RNA feita e os
RNAm so transferidos para o citoplasma e codificados na protena (gene de interesse do
plasmdeo de expresso), que volta para o ncleo da clula e se senta no endereo do
elemento responsivo, plasmdeo reprter / gene da luciferase.
O ligante (droga) se liga protena sintetizada dando-lhe uma conformao diferente,
proporcionando a ao juntamente com protena RXR ou no, e ativar a maquinaria do gene
da luciferase.
A transcrio RNA feita no ncleo e os RNAm so transferidos para o citoplasma e
traduzido na protena luciferase que age com a luciferina adicionada e produz luz. A
intensidade da luz medida e correlacinonada ao controle positivo.
Experimento programado
Plasmdeos
Tratamento
1- CMV _LUC (1g) - DMSO/ETHO

2- CMV h TR1(1g) e F2 LUC(4g) - DMSO/ETHO
3- CMV h TR1(1g) e F2 LUC(4g) T3 10-4

47
Check list Transfeco

UV por 30 minutos:
Cuvetas (abertas: descartar ou aspirar o lcool)
Placas de 12 poos (abertas: descartar ou aspirar o lcool)
Pipetas descartveis de transferncia
Tubos falcon 50mL para coletar clulas e identificado para experimento
Pipetas estreis - Pasteur e sorolgica 10mL e 25mL
Pipetador automtico carregado
Pipetas P1000, P10 e P200
Ponteiras 1000L, 200 L e 10 L
Bquer vazio para descarte
Proveta 250mL com gua para descartar a pipetas usadas
lcool 70%
Luvas
Papel toalha
Obs.: Cuvetas e placas de 12 poos: mant-las abertas durante exposio por 30 min luz
UV. Utilizar placas novas ou esterilizadas com lcool.
CHECAR
Rascunho da transfeco
Plasmdeos aliquotados
Ligantes - concentrao
Meio de cultura aquecido
PBS 1x
PBS + Ca2+ + glicose (temperatura ambiente)
Tripsina para clulas aderentes
H2O autoclavada
Pipetadores carregados
Rotor da centrfuga
Calculadora, lpis e papel para rascunho
Cmara de Newbauer
48
Transfeco de Clulas Aderentes Hela

Objetivo:
Tem como objetivo testar a eficincia da transfeco com o plasmdeo CMVLUC que o promotor do gene da Luciferase.
E avaliar a resposta da expresso do receptor do hormnio tireoidiano pelo plasmdeo
TR1 com o ligante T3 o controle positivo. A fim de avaliar o controle e prosseguir
com os experimentos.
Procedimento:
1. Verifique no microscpio se clulas esto bem nutridas e se esto livre de
contaminaes. O meio deve ser trocado com no mximo 48 horas antes da
transfeco. Se ultrapassar s 48 horas, retire o excesso do meio de cultura.
2. . Complete com meio novo e deixe crescer por mais 12 horas.
3. Identifique um tubo eppendorf de 1,5mL para cada transfeco e aliquote os
plasmdeos (na bancada) na concentrao desejada para cada experimento. Deve-se
colocar uma gota em cada lateral do tubo.
4. NA CAPELA: Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur e uso da bomba de
vcuo. Adicione 10ml de soluo PBS na placa 150X15. Homogeneze
cuidadosamente em movimentos circulares e aspire soluo.
5. Adicione 2ml de Tripsina. Homogeneze cuidadosamente em movimentos circulares.
6. Coloque na incubadora de CO2 a 37C por 1 minuto, at as clulas soltarem da placa.
Observe ao microscpio (s vezes necessrio deixar uns 5 minutos)
7. Adicione 8ml de meio de cultura DMEM com 10% de SFB na placa para bloquear a
Tripsina. (quem faz o bloqueio o soro)
8. Antes de aspirar s clulas, lave toda superfcie da placa (incline placa e pipeta para
que sua mo no fique por cima da placa, se possvel no abra toda a placa).
9. Transfira para 2 falcons de 50ml, retire 10uLe coloque na cmara de newbauer para a
contagem. Centrifugue os tubos por 5 minutos a 2000 rpm.
10. Coloque o meio de cultura novo na placa. Use outra pipeta. Coloque a placa na
incubadora de CO2 a 37C.
11. Coloque em tubo falcon de 50mL, 12mL de meio de cultura DMEM para cada cuveta
eletroporada Reserve. Adicione um pouco mais para que no falte ao finalizar a
49
distribuio. Descarte o meio das clulas centrifugadas (vertendo sobre o bquer de

descarte ou aspirando com a pipeta pasteur.
12. Ressuspenda as clulas inicialmente com metade do volume desejado para a
transfeco. Faa a contagem das clulas usando a cmara de mewbauer.
13. Aps a contagem faa a diluio _ 5 milhes de clulas em 500L de PBS + Ca2+ +
glicose para cada cuveta.
14. EX.: Se for (para 4 cuvetas). Ressuspenda em 2,200mL final (coloque 200L a mais
para que no falte ao finalizar a distribuio) .
15. Transfira 500L do pool de clulas ressuspendidas ( Hela - 5 milhes de clulas por
cuveta,, no deve usar menos que 3 milhes), para os eppendorfs com os plasmdeos,
homogeneze com a prpria pipeta e transfira para a cuveta.
16. Condies de eletroporao clulas aderentes - Hela
17. Voltagem 0.240 Kv ( kilovolts) Capacitncia 0,950F (microfire) (para HeLa)
18. Pressione os 2 botes ao mesmo tempo at apitar.
19. Transfira as clulas eletroporadas com pipeta de transferncia ou P1000 para o tubo
contendo meio DMEM(item 10). Homogeneze bem, ao transferir. Junte as clulas
eletroporadas com os mesmos parmetros, para que tenha um pool de clulas
transfectadas mais homogneo.
20. Distribua 1mL em cada poinho da placa de 12 poos. Homogeneze bem a cada
retirada para ter o mesmo nmero de clulas em cada poo.
21. Pipete sempre na posio inclinada, no tubo e placa para evitar contaminaes
Tratamento: Usando uma p10 bem calibrada coloque 1L do veculo na lateral interna
dos trs primeiros poos. Puxe a pipeta com cuidado ainda pressionando o dedo, tenha
certeza de que no aspirou de volta o reagente pipetado.
22. Proceda com o tratamento nos demais poos de acordo com o experimento.
23. De leves tapinhas na lateral da placa e faa gentilmente alguns movimentos circulares
para homogeneizar bem. Cuidado para o meio de cultura no encostar-se tampa
proporcionando contaminaes.
24. Incube com 5% de CO2 a 37C por 20 a 24 horas
25. Faa a leitura veja protocolo de leitura de clulas aderentes.

50
Contagem das Clulas na Cmara de Newbauer

Colete as clulas, ressuspenda na metade do volume desejado e faa a diluio. Use 10L
de clulas ressuspendidas e 990L de PBS + ccio + glicose. Cubra a Cmara de
Newbauer com uma lamnula e coloque 10L da diluio 1:100 em cada retculo.
Ao microscpio focalize a cmara em uma objetiva menor, passe para uma objetiva maior
e centralize cada um dos 4 quadrantes externos e conte-os. Tire uma mdia dos 4
quadrantes contados. Se preferir pode contar o outro retculo para comparar.
Quadrante externo
Frmula
Nmero de clulas contadas x diluio x 104 (constante) = n de clulas /mL
25x100x10000 = 25.000.000 clulas/mL
Clculo para encontrar 5 milhes para cada cuveta 500uL (cl. Hela aderentes)
C1
V1
C2
V2
25.000.000 V1
5.000.000 . 500L
V1 = 100L das clulas ressuspendidas e 400L de PBS + clcio + glicose por cuveta.
As clulas tambm podem ser contadas sem diluio, antes de centrifugar coloque
10L da cultura de clulas na cmara de Newbauer. Multiplique o nmero de clulas
contadas por 10 000 e por o volume centrifugado.
Frmula
38x10.000x 80mL = 30.000.000
Ressuspender:
Se quero 5000.000
em 0,5mL
Se tenho 30.000.000 quantos preciso resuspender ....x= 3mL de PBS

Que da para 6 cuvetas
51
Leitura de Transfeco de Clulas Aderentes

1. Observe as clulas transfectadas no microscpio poo por poo, verificando se elas
esto bem ou se esto contaminadas. Certificando que esto bem, proceda com os
procedimentos, na bancada.
2. Aspire o meio dos poos e lave com o mesmo volume de PBS e aspire.
3. Adicione 100uL de Tampo de Lise (modificado).
4. Incube a 4C por 10 minutos. Homogeneze a placa Verifique ao microscpio se as
clulas esto em suspenso. Se necessrio incube mais alguns minutos.
5. Transfira 20L para o tubo de leitura. Troque a ponteira a cada triplicata.
6. Ligue o luminmetro e espere estabilizar (voltar ao zero)
7. No momento da leitura, adicione 20L da luciferina. Coloque o tubo imediatamente
no aparelho e aperte o ENTER.
8. Anote a leitura. No necessrio trocar a ponteira, desde que no encoste a ponteira
usada no lquido do eppendorf.
CMV LUC-DMSO/ETHO
2,101
1,316
1,383
CMV h TR1 DMSO/ETHO
0,6810
1,451
0,377
CMV LUC + T3 10-4

4,295
3,753
3,948
CMV h TR1 - T3 10-4
10,54
13,25
7,199
CLCULO
DA
MDIA E FATOR
DE ATIVAO
Mdia:
Somam-se as leituras e
divide por trs.
Fator de ativao:
Diviso da Mdia / Mdia
basal.
ATIVAO.
CMV +DMSO/ETOH
CMV +T3
TRb +DMSO/ETOH
TRb + T3
Triplicatas
2
1
1
4
4
4
1
1
0
11
13
7
Mdia
Fator de ativao
1,00
2,50
1,00
10

12,35
52
Descongelamento
1. Prepare a capela/materiais.
2. Aquea o meio de cultura em banho maria a 37C.
3. Retire 2 frascos das clulas de interesse do freezer -80C.
4. Coloque a 37C. por alguns minutos
5. . Transfira imediatamente para uma placa pequena
6. Coloque 10ml de meio de cultura na placa
7. Incube com 5% de CO2 a 37C
8. Troque o meio de cultura no dia seguinte
*Quando as clulas so descongeladas h um acmulo de DMSO, morte celular e liberao de

toxinas, por isso necessria troca do meio no dia seguinte.
Cultivo e Replicao de Clulas Aderentes

1. .Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur e uso da bomba de vcuo
2. Adicione 10ml de soluo PBS na placa. Homogeneze cuidadosamente em
movimentos circulares e aspire a soluo.
3. .Adicione 2ml de Tripsina. Homogeneze cuidadosamente em movimentos circulares.
4. Coloque na incubadora de CO2 a 37C por 2 minutos, at as clulas soltarem da placa.
(s vezes necessrio deixar uns 5 minutos)
5. Adicione 8ml de meio de cultura DMEN na placa para bloquear a Tripsina.
6. Distribua 2 a 3mL em cada placa
7. Complete a placa com meio de cultura at 20mL (se for a placa grande 100x25)
8. Cultive na incubadora com 5% de CO2 a 37C
9. Troque o meio a cada 48 horas, se necessrio.

53
Congelamento de Clulas Aderentes

1. Verifique no microscpio se clulas esto bem nutridas com meio de cultura DMEM e
10% de soro fetal bovino, e se esto livre de contaminaes. O meio deve ser trocado
com no mximo 48 horas antes do congelamento. A placa deve estar com uns 70% de
confluncia.
2. Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur e uso da bomba de vcuo
3. Adicione 10ml de soluo PBS na placa. Homogeneze cuidadosamente em
movimentos circulares e aspire soluo.
4. Adicione 2ml de Tripsina. Homogeneze cuidadosamente em movimentos circulares.
5. Coloque na incubadora de CO2 a 37C por 1 minuto, at as clulas soltarem da placa.
(s vezes necessrio deixar uns 5 minutos)
6. Adicione 8ml de meio de cultura DMEM na placa para bloquear a Tripsina.
7. Deixe uns 2mL na placa e coloque 20ml de meio em placa para continuar o
crescimento. ( Se for mesangial basta 0,5mL)
8. Transfira as clulas para falcons de 50ml e centrifugue, 5 minutos a 2000 rpm.
9. Descarte o sobrenadante
10. Ressuspenda com a soluo de congelamento escolhida, quantidade suficiente para
que fique na concentrao de no mnimo 3 milhes / mL. Faa a contagem das clulas
para confirmar concentrao.
11. Transfira 1,5mL desse contedo para cada tubo de congelamento devidamente
identificado (clula, data e nome)
12. Coloque em recipiente prprio para congelamento cuba redonda com isopropanol
que deve estar temperatura ambiente
13. Transfira para o freezer -80C.
14. No dia seguinte comporte os tubos congelados para caixinhas prprias e identificados
no freezer -80C. e retire o recipiente de congelamento do freezer.
*As clulas s devem ser congeladas aps a replicao e quando estiverem em com
confluncia de uns 70% da placa. Use o mesmo meio de cultivo para o congelamento, ou soro
com DMSO-Veja soluo de congelamento.

54
Transfeco em Clulas em suspenso U937

Objetivo:
Tem como objetivo testar a eficincia da transfeco com o plasmdeo CMVLUC que o promotor do gene da Luciferase.
E avaliar a resposta da expresso do receptor do hormnio tireoidiano pelo plasmdeo
TR1 com o ligante T3 o controle positivo. A fim de avaliar o controle e prosseguir
com os experimentos.
Procedimento:
1. Verifique no microscpio se clulas esto bem nutridas e se esto livre de contaminaes.
O meio deve ser trocado com no mximo 48 horas antes da transfeco. Se ultrapassar s
48 horas, retire o excesso do meio.
2. . Complete com meio novo e deixe crescer por mais 12 horas.
3. Identifique um tubo eppendorf de 1,5mL para cada transfeco e aliquote os plasmdeos
(na bancada) na concentrao desejada para cada experimento. Deve-se colocar uma gota
em cada lateral do tubo.
4. NA CAPELA: Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur use a bomba de vcuo.
5. Antes de aspirar s clulas, lave toda superfcie da placa (incline garrafa e pipeta para que
sua mo no fique por cima da garrafa).
6. Transfira para 2 falcons de 50ml e centrifugue por 5 minutos a 2000 rpm.
7. Coloque o meio de cultura novo na garrafa. Use outra pipeta. Coloque a garrafa na
incubadora de CO2 a 37C.
8. Coloque em tubo falcon de 50mL, 6mL de meio de cultura RPMI para cada cuveta
eletroporada Reserve.
Adicione um pouco mais para que no falte ao finalizar a
distribuio. Descarte o meio das clulas centrifugadas (vertendo sobre o bquer de

descarte ou aspirando com a pipeta pasteur.
9. Ressuspenda as clulas inicialmente com metade do volume desejado para a transfeco.
10. Faa a contagem na Cmara de newbauer.
11. Aps a contagem faa a diluio _ 10 milhes de clulas em 500L de PBS + Ca2+ +
glicose para cada cuveta.
12. EX.: Se for (para 4 cuvetas). Ressuspenda em 2,200mL final (coloque 200L a mais para
que no falte ao finalizar a distribuio) .
55
13. Transfira 500L do pool de clulas ressuspendidas ( U937 - 10 milhes de clulas por
cuveta,, no deve usar menos), para os eppendorfs com os plasmdeos, homogeneze com
a prpria pipeta e transfira para a cuveta.
14. Condies de eletroporao clulas em suspenso U937
15. Voltagem 0.300 Kv ( kilovolts) Capacitncia 0,950F (microfire)
16. Pressione os 2 botes ao mesmo tempo at apitar.
17. Transfira com pipeta de transferncia as clulas eletroporadas para o tubo contendo meio
RPMI (item 8). Homogeneze bem, ao transferir. Junte as clulas eletroporadas com os
mesmos parmetros, para que tenha um pool de clulas transfectadas mais homogneo.
18. Distribua 1mL em cada poinho da placa. Homogeneze bem a cada retirada para ter o
mesmo nmero de clulas em cada poo.
19. Pipete sempre na posio inclinada, no tubo e placa para evitar contaminaes
Tratamento: Usando uma p10 bem calibrada coloque 1L do veculo na lateral interna dos
trs primeiros poos. Puxe a pipeta com cuidado ainda pressionando o dedo, tenha certeza
de que no aspirou de volta o reagente pipetado.
20. Proceda com o tratamento nos demais poos de acordo com o experimento.
21. De leves tapinhas na lateral da placa e faa gentilmente alguns movimentos circulares para
homogeneizar bem. Cuidado para o meio no encostar-se tampa proporcionando
contaminaes.
22. Incube com 5% de CO2 a 37C por 20 a 24 horas
23. Faa a leitura veja protocolo de leitura de clulas em suspenso.

56
Leitura da Transfeco de Clulas em suspenso - U937

1. Observe as clulas transfectadas no microscpio poo por poo, verificando se elas esto
bem ou se esto contaminadas. Certificando que esto bem, proceda com os
procedimentos, na bancada.
2. Colete as clulas das placas, utilizando p1000. Ateno ao lavar a parede dos poos e
retirar as clulas que estiverem aderidas.
3. Transfira o contedo dos poos para um eppendorf de 1,5mL (os eppendorfs devem estar
devidamente identificados).
4. Centrifugue os eppendorfs a 13.000 rpm por 2 minutos.
5. Aspire o sobrenadante utilizando a bomba de vcuo acoplada a uma ponteira.
6. Ao terminar de aspirar todo o sobrenadante, lave a mangueira da bomba aspirando
hipoclorito de sdio.
7. Dilua o tampo de lise para 1X (estoque 5X).
8. Acrescente 150L do tampo de lise 1x.
9. Vortex os eppendorfs para homogeneizar o pellet.
10. Incube por 30 minutos -80oC.
11. Quanto mais tempo o tampo de lise agir a baixas temperaturas, melhor.
12. Vortex novamente os eppendorfs para homogeneizar o pellet.
13. Transfira 20L para o tubo de leitura. Troque a ponteira a cada triplicata.
14. Ligue o luminmetro e espere estabilizar (voltar ao zero)
15. No momento da leitura, adicione 20L da luciferina. Coloque o tubo imediatamente no
aparelho e aperte o ENTER.
16. Anote a leitura. No necessrio trocar a ponteira da luciferina, desde que no encoste a
ponteira usada no lquido do eppendorf.

57
Cultivo das Clulas em Suspenso

Observa-se as clulas no microscpio para avaliar as condies vitais e ausncia de
contaminaes.
*Se tiver um baixo nmero de clulas ou deseja apenas conservar-las:
1. Transfira o meio de cultura com as clulas para um tubo de 50mL.
2. Centrifugue 2.000rpm por 5 minutos e aspire o meio de cultura.
3. Ressuspenda as clulas delicadamente em alguns mL de meio de cultura a 37C ou
temperatura ambiente.
4. Transfira as clulas ressuspendidas para a mesma garrafa, complete com meio de cultura
para o mesmo volume anterior. O volume depende do tamanho da garrafa, ou seja,
recipiente de crescimento. A quantidade do meio no deve alcanar o gargalo da garrafa
quando a mesma estiver deitada, (posio de crescimento) para evitar contaminaes.
5. Devolva a garrafa para incubadora com cuidado, na posio correta, se a garrafa no tiver
filtro na tampa deixe-a entre aberta (95%)
6.
Cultive na incubadora com 5 % de CO2 a 37C
7. Troque o meio a cada 48 horas

*Se o nmero de clulas estiver saturado na superfcie de crescimento e deseja descartar
parcialmente ou precisa de espao para que as clulas cresam no fim de semana:
1. Faa uma lavagem aspirando e devolvendo o meio de cultura vrias vezes sobre a
superfcie de crescimento.
2. Descarte todo o meio de cultura com as clulas.
3. Adicione o meio de cultura a 37C (o mesmo volume anterior). O volume depende do
tamanho da garrafa, ou seja, recipiente de crescimento. A quantidade do meio no deve
alcanar o gargalo da garrafa quando a mesma estiver deitada, (posio de crescimento)
para evitar contaminaes.
4. Devolva a garrafa para incubadora com cuidado, na posio correta, se a garrafa no tiver
filtro na tampa deixe-a entre aberta (95%)
5.
Cultive na incubadora com 5 % de CO2 a 37C
6.
Troque o meio a cada 48 horas

58
Congelamento de Clulas em Suspenso

Verifique ao microscpio se clulas esto bem nutridas com meio de cultura RPMI e 10% de
soro fetal bovino, e se esto livre de contaminaes. O meio deve ser trocado com no mximo
48 horas antes do congelamento. A placa deve estar com uns 70% de confluncia.
1. Transfira as clulas para falcons de 50ml e centrifugue, 2 minutos a 4000 rpm.
2. Descarte o sobrenadante
3. Faa a contagem das clulas e ressuspenda com a soluo de congelamento escolhida,
quantidade suficiente para que fique na concentrao de no mnimo 3 milhes / mL.
4. Transfira 1,5mL desse contedo para cada tubo de congelamento devidamente
identificado (clula, data e nome)
5. Coloque em recipiente prprio para congelamento cuba redonda com isopropanol
que deve estar temperatura ambiente
6. Transfira para o freezer -80C.
7. No dia seguinte comporte os tubos congelados para caixinhas prprias e identificados
no freezer -80C. e retire o recipiente de congelamento do freezer.
*As clulas s devem ser congeladas aps a replicao e quando estiverem em com
confluncia de uns 70% da placa. Use o mesmo meio de cultivo para o congelamento.

59
Antibitico / Solues para cultura de Clulas

Penicilina + Estreptomicina 100X
Para 100mL
1. Penicilina G potssica ou sdica (10.000U/mL).........600mg
2. Estreptomicina.(10mg/mL).........................................1,0g
3. NaCl.......................................................................... 0,85g
4. Citrato de Sdio (10mM)...........................................294mg
5. H20 q.s.p....................................................................100mL
6. No necessrio filtrar, filtre junto com o meio de cultura, na hora que estiver
preparando o meio.
7. Faa alquotas de 10 mL e estoque no freezer -20C
Observao: se o meio de cultura no tiver glutamina adicione 2,9g
*Se preferir use 10mL de soluo estoque 100mM de Citrato de Sdio
[ ] da soluo final no meio de Cultura:
Penicilina 100U/mL Estreptomcina - 100g/mL
Soluo de Congelamento I............................... Soluo de Congelamento II
Meio de Cultura sem soro.......7mL
Soro Bovino Fetal................9mL
20% de Soro fetal bovino........2mL
10% de DMSO 10%...........1mL
10% de DMSO.........................1mL
Use na hora
O que no for usar, congele, aconselhvel usar a fresco
Tampo de Lise _ modificado
100mM TRIS pH 7,6
Estoque 1,5M - 3.3mL
0,2% Triton 100x
Estoque puro - 100uL

H2O q.s.p. 50mL
60
PBS (1000 mL) Tampo de Fosfato e Salina) Maniatis 3 B12
10X
1x
1. 800 mL de gua
800 mL de gua
2. 80 g de NaCl
8 g de NaCl
3. 2 g de KCl
0,2 g de KCl
4. 14.4g Na2HPO4 fosfato de sdio dibas
1,44 g - Na2HPO4
* Se for usar Na2HPO 47H2O faa correo da gua

5. 2,4 g KH2PO4
KH2PO4 0,24 g
6. Ajuste o pH para 7.4 + ou 0,2 de variao com HCl

7. Complete o volume para 1 litro
8. Filtre (membrana de 0,22 m) O PBS 10X e 1X pode ser autoclavado
PBS com clcio e glicose

Observao no deve ser autoclavado (o clcio precipita)
PBS 1x .............................................100mL
Cloreto de Clcio..............................0,01g
Glicose..............................................0,1g
Valores padres- Clcio 0,1g por Litro / Glicose 0,1%.
* Correo da H2O do Na2HPO47H2O

Peso molecular do Na2HPO4 PM142
PM 142..............1,44 g
Peso molecular do Na2HPO4 7 H2O PM 268
PM 268...........x=2,7g
27g p/ 1Litro

61
Tripsina
Soluo de PBS 1x....................................................250ml

EDTA 372,24 (10Mm ou 0,3%) .............................0,955g
Ajustar pH para 7,5
Tripsina 1: 250 0,5%.................................................1,25g
O PBS 1x deve ser sem clcio e glicose. Se for estril use a capela para abrir o frasco.
Na bancada com o uso de um agitador magntico prepare a soluo.
Volte para a capela e filtre esterilizando, 0,22m.
Obs.Tripsina 1:250 (crude) use 0,5%

Tripsina purified 0,05ug/mL

62
Meio de Cultura DMEM

DMEM a abreviao de Dulbeccos Modified Eagles Mdium. a modificao do
Basal Mdium Eagle (BME) e contm quatro vezes maior concentrao de aminocidos e
vitaminas. A formulao original contem 1.000mg/L de glicose e suporta culturas de
clulas primrias, assim como uma grande variedade de clulas normais e transformadas.
O meio sempre suplementado com soro e soluo de antibiticos, concentrao final de
penicilina 100U/mL / estreptomicina 70g/mL.
Meio DMEM (1000 mL)

1) 890mL de H20 destilada
2) Um envelope de DMEM para 1 litro
3) 3,7g de bicarbonato de sdio
4) Ajuste o pH para 6,9 com HCl 50%
5) Adicione 10mL da soluo estoque de penicilina / estreptomicina 100x
6) Filtre membrana de 0,22m,
7) Adicione 100 mL de soro fetal bovino
Procedimento
1) Coloque a gua em um bcker 2 litros. Adicione o envelope DMEM e o bicarbonato,
homogeneze no agitador magntico com auxlio de uma bailarina.
2) Ajuste o pH para 6,9 com HCl 50% (se for puro mais ou menos umas 3 gotas ser o
suficiente, porm aconselhvel usar um HCl diludo)
3) Adicione o antibitico ajuste o volume para 900mL H20 destilada e transfira tudo para
o fluxo laminar e filtre em membrana estril, com poros de 0,22m).
4) Acrescente soro fetal bovino. Transfira para garrafas autoclavadas, identifique.
5) Armazene a 4oC.
Teste de Esterilidade
Faa alquotas de 1mL em tubo de start estril e coloque no shaker a 37C e observe se houve
crescimento em 24 horas / 48 horas / 72 horas
63
Aps 72 horas de observao libere o meio para uso e retire o tubo de 15 mL do shaker.
Meio de Cultura RPMI
RPMI a abreviao de Roswell Park Memorial Institute. Este meio de cultura contm
uma grande quantidade de fosfato e formulado para ser utilizado em uma atmosfera de 5%
de CO2. O meio sempre suplementado com soro e soluo de antibiticos na concentrao
final de penicilina 100U/mL / estreptomicina 70g/mL.
Meio RPMI (1000 mL)
1. 890mL de H20 destilada para um envelope de RPMI para 1 litro
2. 2g de bicarbonato de sdio
3. Ajuste pH para 6.9 com HCl a 50% (0.2 a 0. 3 abaixo do pH final desejado.
4. Adicione 10mL da soluo estoque de penicilina / estreptomicina 100x
5. Filtre membrana de 0,22m
6. Adicione 100 mL de soro fetal bovino
Procedimento
1. Coloque a gua em um becker 2 litros. Adicione o envelope - RPMI e o bicarbonato,
homogenezem no agitador magntico com auxlio de uma bailarina.
2. Ajuste o pH para 6.9 com HC a l50% (se for puro mais ou menos uma 3 gotas ser o
suficiente, porm aconselhvel usar um HCl diludo)
3. Adicione o antibitico e transfira tudo para o fluxo laminar e filtre em membrana estril,
com poros de 0,22m).
4. Acrescente soro fetal bovino. Transfira para garrafas autoclavadas, identifique.
5. Armazene a 4oC.
Teste de Esterilidade
Faa alquotas de 1mL em tubo de start estril e coloque no shaker a 37C e observe se houve
crescimento em 24 horas / 48 horas / 72 horas
Aps 72 horas de observao libere o meio para uso e retire o tubo de 15 mL do shaker.
64

65

Protocolos de Biologia Molecular

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LABORATRIO DE FARMACOLOGIA MOLECULAR

Protocolos de Tcnicas de Biologia Molecular

Braslia, Fevereiro de 2011

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Dedico este trabalho aos meus filhos Murilo e Isabella.

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Creio no DNA todo poderoso

Creio na Biologia Molecular

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Preparo de Clulas Competentes

formam um complexo com este

grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atrao eletrosttica com as

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Teste de Controle de Qualidade das Clulas Competentes

100ug/mL Streptomicina - 100mg/mL

4 dia - verificar se houve crescimento

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Teste de Esterilidade das Clulas Competentes

Teste de Eficincia das Clulas Competentes

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Preparo de Clulas Competentes - CaCl2

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Preparo de Clulas Competentes TB

HEPES (10mM final) ...................651 mg

Preparo de Clulas Competentes MgCl2 / CaCl2

Incube a 37C 16 horas ou overnight

6. Transfira 2 ml da cultura para 300 mL de LB - Streptomicina [ ] final 60g/mL

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Preparo de Clulas Competentes Cloreto de Rubdeo RbCl

Preparo de Clulas Clulas Eletrocompetentes

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Preparo de Clulas de Baixa Competncia

6 - Incube por 5 a 15 minutos no gelo

Preparo do Tampo TSS1x.

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes

ons carregados positivamente. Os ons Ca formam um complexo com este grupamento,

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes

Identifique os tubos a serem usados e coloque-os no gelo.

Coloque de 0,5uL a 1uL de DNA plasmidial (de 100ng a 1ug).

Retire as clulas competentes do freezer 80C e desconge-as no gelo.

Homogeneize bem e transfira 50uL de clulas competentes para os tubos com os

Incube no gelo por 30 minutos. Ligue o banho maria.

Choque trmico: Coloque a 42C. por 1 minuto e 30 segundos.

Volte para o gelo por 2 minutos

Incube a 37C por 1 hora.

No dia seguinte passe um parafilme na placa e transfira 4C

Estoque em Glicerol 30%

700 uL da cultura e 300 uL de glicerol.

Homogeneze bem at misturar completamente

Armazene imediatamente no freezer 80C

Evite que o estoque descongele quando for reutilizar.

Prepare tudo que for precisar antes de retirar o estoque do 80C

Trabalhe no gelo e seja rapidssimo.

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Teste para simples verificao do plasmdeo

Soluo de STE pH 8.0

10 mM Tris HCl (pH8.0)

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Extrao e Purificao de DNA plasmidial

Entre as tcnicas de DNA recombinante normalmente utilizadas, a purificao

0,2 M NaOH_________20mL 5 M4mL

5M acetato de potssio60mL ___300mL