HETEROBETAINAS

EL CROMATOGRAFO HPLC SHIMATZU

(Preparado por M Jos Reyes y Ramn Alajarn, a quienes agradecemos el esfuerzo)
(21/03/03)
Introduccin.
Este trabajo pretende sentar las nociones bsicas para el empleo del HPLC
Shimatzu que disponemos en el mdulo II.
Este instrumento, a diferencia del que existe en el mdulo I, permite trabajar en
gradiente. De esta forma se pueden lograr con xito separaciones utilizando mezclas
variables de disolventes.
Los componentes bsicos que constituyen el equipo son los que muestra la
figura a continuacin:

Nuestro equipo concretamente consta de:

-dos bombas: es importante saber que la bomba A es la situada a la izquierda y la
B a la derecha para este caso en concreto.
-inyector automtico: que permite la inyeccin de series de muestras en
secuencia. De esta forma, automticamente y uno tras otro pinchar los viales que les
hayamos indicado en la secuencia.
-detector: como se observa el detector pertenece a un equipo antiguo. Por tanto,
slo detecta a la longitud de onda indicada en la ventana.

-controlador: es la parte ms importante del equipo. Para nuestro caso constituye

el ordenador real y en l es donde se disean los mtodos de trabajo, se controlan flujos
y presiones y se realizan las secuencias.
-ordenador: en este equipo constituye una herramienta para el registro de datos
ya que no disponemos del software para utilizarlo como controlador de todo el sistema.
Las bombas y el inyector automtico disponen de un pequeo software. Tambin
disponen de una ventana, un teclado numrico y unas teclas de funciones especiales.

Antes de empezar.
Hay que tener en cuenta que el equipo de HPLC es una herramienta muy
sensible y, por tanto, hay que cuidar todo lo que se va a introducir en el HPLC:
- Muestras: todas las muestras se preparan con disolventes de alta pureza o grado
HPLC y se deben filtrar con filtros de 0.4 .
- Eluyentes: deben filtrarse y desgasificarse (5 min. Mnimo) antes de su
utilizacin. De estos procesos depender la vida del equipo y las columnas,
adems de los resultados obtenidos.

Para encender el equipo se sigue el siguiente orden:

Bombas

Inyector automtico

Detector

Controlador

Ordenador

Para apagar se sigue el orden inverso.

- Purga del sistema.

Se debe de purgar el sistema de conducciones antes de colocar la columna para
evitar restos de otros eluyentes. De esta forma tambin evitamos las indeseables
burbujas de aire en todo el sistema.
Para purgar el sistema hay que abrir las vlvulas que tienen las bombas y el
inyector automtico a la derecha de las misma y pulsar la tecla azul PURGE . cada uno
de estos sistemas contiene un tiempo programado de purga que no conviene cambiar. Si
el sistema contiene todava burbujas de aire, repetimos la operacin. Una vez finalizada
se cierra las vlvulas de purga.
- Colocacin de la columna.
El controlador dispone de una tecla azul act, pulsarla. De esta forma empezar a
salir eluyente por donde est la conexin a la columna. Dejar salir un rato. La columna

dispone de una etiqueta que adems de indicar de qu tipo de columna se trata contiene
una flecha con la direccin que debe seguir el flujo. Colocar la entrada de la columna
con la salida del inyector y esperar hasta que salga eluyente por el extremo superior.
Conectar el final de la columna con la conduccin al detector. Secar bien las uniones y
esperar unos minutos para no detectar fugas.

Controlador.
Como comentbamos antes, el controlador se encarga del mtodo para la
inyeccin y de la secuencia con que se inyectan las muestras.
Un mtodo en el controlador sirve para establecer:
A.
B.
C.
D.

Cunto tiempo va a durar la inyeccin.

La Pmax. y Pmin. a la que va a trabajar la columna.
El flujo.
Y, lo ms importante, el gradiente con el que va a trabajar la columna
durante la inyeccin.

En la pantalla inicial del controlador, aparece un men principal. Las ventanas

ms importantes son Sequence 0, Analysis File 1, Edit 2.

- Editar un mtodo.
Pulsando 2 del men principal, accedemos a la pantalla de edicin de un mtodo.
Aparece una pantalla que nos indica el flujo, la concentracin de B y la presin mxima
que contiene el mtodo metido por defecto. En la parte inferior siempre aparece una
barra con comandos a los que se accede bien directamente con las teclas azules F1
como F5 o bien nos movemos con a tecla func blanca en las barras ocultas de
comandos.

Func, FILE (F1) y abrimos un mtodo (puede ser cualquiera en principio).

Introducimos los parmetros iniciales de trabajo que queramos, por ejemplo:
Flow: 1 mL/min.
B Conc.: 0.0%
P. max.: 200 bar.

Func,

t.prog. (F3) y accedemos a un programa de tiempos y

concentraciones de B para esa inyeccin. Por ejemplo:

[B]

10 12

18

21

Tiempo (min)

Para esta tabla de gradientes se elaborara este time program:

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Time
0.01
0.01
5.00
10.00
12.00
18.00
21.00
25.00
25.00

Func.

Value

T. flow
B Conc.
B Conc.
B Conc.
B Conc.
B Conc.
B Conc.
B Conc.
Stop

1.000
0.0
0.0
50.0
100.0
100.0
0.0
0.0

Exit (F5), Menu (F5)

De esta forma tenemos escrito un mtodo que creemos que puede servir para
purificar o caracterizar una reaccin o producto.

-Analysis File.
En esta pantalla es donde realmente se controlan los flujos y concentraciones de
eluyentes en cada momento. Por eso, resulta ms interesante cargar el mtodo que
anteriormente hemos elaborado. Par ello, func
File (F1) introducir el mtodo
preparado y comprobar que las condiciones generales coinciden con las que hemos
preparado anteriormente. De esta manera dejamos el sistema estabilizndose durante 1 h
aproximadamente.

Preparacin de la secuencia de inyecciones:

INJ

VOL (L)

FILE #/Run T.

..

SMPL #

A. Indica el nmero que ocupa esa muestra en el Rack de muestras. Por

ejemplo:
- si slo queremos inyectar una muestra que est en la posicin 5,
introduciremos 5-5.
- si queremos inyectar ms de una muestra y todas seguidas, introduciremos
del 5-10.
B. Nmero de inyecciones de cada muestra.
C. Volumen que toma de inyeccin (10 L).
D. Contiene el numero de mtodo con el que queremos que inyecte la muestra.

El ordenador:
El programa para utilizar el cromatgrafo se llama CLASS-VP (cliquear dos
veces). Aparee un men principal. Cliquear sobre hplc para acceder a nuestro equipo.

Hay que tener en cuenta tres conceptos previos:

a. La ventana de Preview: cuando cliqueas sobre ella aparece la seal que el
detector esta registrando en ese momento. Esto es til para ver la estabilidad
de la lnea base. Para detener el cromatograma se cliquea nuevamente sobre la
ventana de STOP.
b.
Crear / editar un mtodo: el concepto de mtodo en el ordenador es
diferente que en controlador. Un mtodo en el ordenador sirve principalmente
para establecer los parmetros del cromatograma como integracin y el tiempo
de adquisicin.
Resulta interesante crear cada uno su mtodo, o bien, utilizar el de otra
persona.
c. Inyeccin de muestra: las muestras se pueden inyectar individualmente o con
una secuencia de muestras.
-inyeccin individual: Single Run Rellenar las ventanas que van
apareciendo y cuando se observe que en al parte inferior de la
ventana aparezca parpadeando Waiting for Trigger, se pulsa
RUN en el controlador y comenzar la inyeccin.
-inyeccin en secuencia: est relacionado con lo que se denomina
Batch. Conviene abrir uno ya existente y cuando finalice
guardarlo con un nuevo nombre. El nmero que contiene cada fila
no corresponde con el nmero que ocupa el vial en el rack, sino con
el orden de la inyeccin.
Hay que diferenciar entre sample que corresponde con la descripcin del
producto y file name que es el nombre con el que se guarda el cromatograma. Conviene
en este caso utilizar un nombre (mximo ocho dgitos).00X con una extensin para que
inyecciones sucesivas del mismo vial no borren cromatogramas anteriores. Por ejemplo,

mjr270.001

inyectado con el mtodo F13

mjr270.002

inyectado con el mtodo F1

mjr270.003

inyectado con el mtodo F1 pero otro da

- Impresin del cromatograma.

Bsicamente se obtiene as:
Men principal del CLASS-VP, Analysis Reprocesing
Open Data (Buscar el cromatograma en concreto)

Analysis
Custom
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Cmo cuidar el equipo de HPLC antes y despus de su uso?

Recuerda que antes y despus de usar este equipo debes cuidar los siguientes detalles:
1. Filtrar (membrana 45 m) y desgasificar (ultrasonidos, mnimo 15 min) la fase
mvil (calidad HPLC).
2. Filtrar la muestra (filtro de jeringa, membrana 45 m).
3. Purgar las bombas y el autoinyector con fase mvil.
4. Terminados los anlisis la columna debe ser lavada (Fase reversa: MeOH o
MeCN; Fase normal: n-Hexano).
5. Si se ha trabajado con una fase mvil que contiene sales, cidos o bases, al
finalizar la bomba debe purgarse primero con fase mvil pura.
6. Si una bomba, despus del lavado, queda con agua y se va a utilizar en fase
normal deben hacerse antes los siguientes lavados: MeOH o MeCN, isopropanol
o acetato de etilo, hexano.
7. Si una bomba, despus del lavado, queda con un disolvente orgnico inmiscible
en agua y se va a utilizar en fase reversa deben hacerse antes los siguientes
lavados: isopropanol o acetato de etilo, MeOH o MeCN, agua.