El mecanismo de la

acotinasa: estructura
cristalina del complejo
citrato de la S642A con
una resolucin de 1,8
angstroms.

LEILA SAMIRA NAHIM GRANADOS

El mecanismo de la acotinasa: estructura cristalina del complejo citrato

de la S642A con una resolucin de 1,8 angstroms.
La acotinasa emplea un cluster [4Fe-4S] para catalizar la deshidratacin-rehidratacin
estereoespecfica de citrato en isocitrato a travs del cis-aconitato en el ciclo del cido
tricarboxlico.
La aplicacin de marcajes isotpicos del sustrato, inhibidor y molculas de solvente en
experimentos de Mossbauer, EPR y ENDOR en combinacin con las estructuras
cristalinas, la cinetica, el uso de la reaccin con intermedios anlogos y la mutagenesis
dirigida al sitio activo han dado lugar al planteamiento de un mecanismo de varios pasos
de la reaccin cataltica:

En primer lugar el sustrato (citrato proquiral) se une estereoespecificamente

sufriendo una deshidratacin y dando lugar al intermedio estable cis-aconitato.
Para que la reaccin contine, es necesario que el cis-aconitato sea liberado de
la enzima y vuelva a unirse con las posiciones de sus tomos C y C invertidas.
Cinticamente, este paso puede implicar el desplazamiento por una segunda
molcula de cis-aconitato con la configuracin invertida, siendo el efecto neto
un sustrato girado 180o alrededor del doble enlace C-C.
A continuacin se lleva a cabo la rehidratacin del cis-aconitato formando el
isocitrato (2R,3S).

Las configuraciones posibles del cis-aconitato se denominan modo citrato o modo

isocitrato (Figura 1). En este trabajo la mutagnesis dirigida se usa para poder visualizar
el modo citrato no visto anteriormente y confirmar as que este modo est implicado en
el mecanismo.

Figura 1. Modelos de la reaccin catalizada por acotinasa.

Con respecto a la estructura, la acotinasa mitocondrial es un polipeptido simple, donde

tres cistenas estn coordinadas al cluster [3Fe-4S] que a su vez une a un cuarto hierro
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(Fe4) tras su activacin. Este hierro interacta con grupos carboxilo e hidroxilo del
sustrato y con molculas de solvente. Anteriormente se han obtenido estructuras de alta
resolucin de la enzima libre de sustrato y de complejos de la enzima unida al isocitrato
o al inhibidor, ya que la enzima nativa cristaliza preferentemente unida al isocitrato, por
lo que no ha sido posible obtener cristales de la enzima unida al citrato o al cisaconitato.
El mutante S642A se eligi para el anlisis estructural basandose en las propiedades
cinticas y de EPR. Este mutante presenta la mayor reduccin de la V max con respecto a
la enzima nativa y una Km ligeramente superior. Adems, exhibe una interaccin nativa
del citrato con el cluster [4Fe-4S].
En el mecanismo propuesto, la Ser642 ser la base que abstrae un protn del C del
citrato (C del isocitrato). La estructura cristalina de los complejos citrato e isocitrato
del mutante S642A , da apoyo directo a la suposicin de la existencia del modo citrato.
La estructura cristalina de los complejos citrato e isocitrato del mutante S642A de la
acotinasa mitocondrial fue refinada a 1,8 y 2 angstroms de resolucin respectivamente.

Figura 2. Superposicin de los complejos isocitrato de la aconitasa. a) Los complejos isocitrato (verde
oscuro) con la enzima nativa (Ser642) y con el mutante (Ala642); b) El complejo isocitrato (verde
oscuro) con la enzima nativa (Ser 642) y el complejo citrato (verde claro) con el mutante (Ala642).

En el complejo isocitrato del mutante, el sustrato de une de una manera muy similar que
en la enzima nativa, demostrando que el reemplazamiento de la Serina por Alanina no
altera el modo de unin del sustrato al sitio activo. (Figura 2a)
En el caso del complejo citrato, el citrato est coordinado directamente al Fe4 del
cluster a travs del C carboxlico y el tomo de oxigeno del grupo hidroxilo. Dando
lugar a la inversin del enlace C-C con respecto al isocitrato lo que confirma la
presencia del modo citrato en el mecanismo (Figura 2b).

LEILA SAMIRA NAHIM GRANADOS