LICENCIATURA EN QUMICA

Proyecto Determinacin Actividad

Enzimtica de la Invertasa
Integrantes:

INTRODUCCIN
La invertasa (-D-fructofuranosidasa, -D-fructofuransido fructohidrolasa,EC
3.2.1.26), cataliza la hidrlisis de restos terminales no reductores -Dfructofuranosdicos de fructofuransidos. Entre los sustratos sobre los que acta el
ms significado es, sin duda, la sacarosa, de ah que el enzima se designe con el
nombre de sacarasa. La denominacin trivial de invertasa, con la que tambin se
conoce, hace referencia al hecho de que los productos de la reaccin son
conocidos desde antiguo como azcar invertido ya que mientras la sacarosa es
dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su
hidrlisis es levorrotatoria, por lo que en el proceso se origina un cambio de signo
(de positivo a negativo) del valor de rotacin ptica.

La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en

microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel importante en
el catabolismo de fructanos y ms especficamente en el de la sacarosa, en
especial en aquellos organismos en los que dichos azcares son utilizados como
fuente de carbono y energa. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran
inters tanto desde un punto de vista acadmico como de investigacin aplicada,
siendo uno de los enzimas ms conocidos. A modo de ejemplo podemos referir
que la invertasa fue el primer enzima cuya cintica se estudi en profundidad
(estudios clsicos de Michaelis-Menten) y que fue utilizado industrialmente.
Para la determinacin de la actividad invertasa se utilizar un ensayo indirecto en
el que los productos de reaccin sern detectados espectrofotomtricamente tras
su conversin en derivados coloreados.
En concreto, la extensin de la hidrlisis enzimtica de sacarosa (azcar no
reductor) en glucosa ms fructosa (azcares reductores) se valorar mediante uno
de los diversos mtodos existentes para la estimacin de azcares reductores.
Nos referimos exactamente al
mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), el cual se basa en la reduccin del
DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azcar reductor al cido 3-amino-5nitrosaliclico (Chaplin, 1986), cuya presencia puede detectarse por lectura de la
Absorbancia en la zona de 540-570 nm.
Usos
El uso frecuente de la invertasa en alimentos azucarados se basa en la
transformacin lenta y parcial de la sacarosa en azcar invertido que tiene mayor
poder edulcorante, mayor carcter humectante, mayor solubilidad y, por lo tanto,
menor tendencia a cristalizar y endurecer. De esta manera, acta como un agente
de reblandecimiento en alimentos azucarados con tendencia a cristalizar la
sacarosa y evaporar agua, lo que afecta su aspecto y consistencia. Adems, la
fructosa resultante tiene cierto carcter humectante y da sensacin de frescura al
producto. Productos de confitera, como bombones con relleno, productos de
jaleas, fondants, mazapanes y pasteles adquieren entonces una consistencia
suave, cremosa y blanda, an despus de un almacenamiento prolongado.

La actividad enzimtica de la invertasa depende del pH, siendo su ptimo de 4,5 a

5,0, y de la temperatura que puede variar de 25 a 55C; no debe agregarse a
productos con ms de 65C ni a aquellos con ms de 20% de alcohol (bombones
con relleno), pues la enzima es inactivada. Como la invertasa produce una
hidrlisis, exige la presencia de agua (por lo menos 5% del peso del azcar). De
un preparado lquido de invertasa se agregan normalmente 100-125 ml para 100
kg de masa; dicha cantidad puede aumentarse si no se puede llevar al pH ptimo
mediante la adicin de cido ctrico, por razones de sabor.
A veces se agrega la invertasa al producto previamente mezclado con sorbitol, que
tambin posee un gran poder higrosttico o estabilizador de la humedad, en el
sentido de retenerla frente a variaciones en la humedad ambiente. Mientras que el
sorbitol reblandece de inmediato y su accin contina durante el almacenamiento,
la invertasa acta de preferencia en el transcurso del almacenamiento.
Otra aplicacin importante de la invertasa est en la elaboracin de azcar
invertido a partir de sacarosa por va enzimtica, la cual aventaja a la hidrlisis
cida, por ser ms fcil de controlar. Adems, el jarabe resulta de mayor
concentracin, presenta mejores caracteres de color y sabor y no contiene indicios
de productos secundarios como el furfural. Una vez elaborado el jarabe por
inversin enzimtica, se calienta a 80C para inactivar la enzima, teniendo
aplicacin en diferentes productos azucarados y licores.
Por otra parte, desechos de frutas ricas en sacarosa pueden ser hidrolizados por
invertasa en glucosa y fructosa y stas fermentadas por levaduras para producir
etanol y/o protenas unicelulares (74, 11).
Es interesante que la accin cariognica del azcar invertido es bastante inferior
ala causada por la sacarosa. La propiedad de no producir caries es an mucho
ms manifiesta en el xilitol, alcohol pentavalente, de poder edulcorante, semejante
al de la sacarosa.

Objetivo
realizar un estudio cintico de la actividad invertasa, que comprender
la determinacin de velocidades iniciales
as como estudios del efecto de los siguientes factores en la actividad enzimtica:
1) concentracin del enzima;
2) pH, con establecimiento del rango de valores de pH en el que el enzima es
activo y determinacin del pH ptimo.

3) temperatura, con establecimiento del rango de valores de temperatura en el que

el enzima es activo y determinacin de la temperatura ptima.
4) concentracin de sustrato, con establecimiento del modelo cintico (michaeliano
o cooperativo) y determinacin de los parmetros cinticos del enzima.
Justificacin.
La Invertasa es una de las enzimas esenciales que la naturaleza utiliza para
ayudarnos a digerir azcares, comnmente hallada en el polen de las abejas y en
fuentes de levadura, la invertasa juega un rol clave no slo en los procesos
digestivos, sino tambin en la prevencin en general de las enfermedades en
humanos, el rejuvenecimiento fsico y los procesos de anti-envejecimiento.
Conforme crecemos, tenemos menos acceso a esta enzima natural, lo que
provoca una menor habilidad para extraer los nutrientes vitales de los alimentos
que comemos. Tambin puede aletargar nuestro proceso digestivo. Mientras que
algunas formas de azcares y carbohidratos son buenas para el cuerpo, no
pueden absorberse ni digerirse bien sin la ayuda de la enzima invertasa:
Material
Balanza (sensibilidad de 1 mg)
Bloque seco o bao de agua hirviendo
Centrfuga preparativa
Espectrofotmetro/Colormetro
Homogeneizador
pH-metro
Reactivos
Acetato sdico
buffer fosfatos
cido clorhdrico
invertasa en levadura polvo
Reactivo de DNS
Hidrxido sdico

Obtencin de un extracto crudo de invertasa

Suspender 1 g de preparado de levadura en 200 ml de tampn de extraccin
(tampn acetato 0,1 M, pH 5,0, en NaCl 0,5 M). Agitar la mezcla durante 15 min,
centrifugar y tomar el sobrenadante como extracto enzimtico. El extracto
enzimtico, cuando no se est utilizando, se guardar en fro (frigorfico)
PROCEDIMIENTO

Preparar 5 series de tubos (1 blanco y 2 problemas para cada serie o

tiempo de incubacin) con las mezclas de ensayo indicadas en la Tabla

. Las mezclas de ensayo se incuban a 55 C durante 5-15 minutos.
Mezcla de ensayo estndar para la determinacin de la actividad
invertasa.
Componentes
Blanco (blanco de
Problema (x2)
sus)
Sacarosa 0,1 M
0,0
1,0
(ml)
Tampn Fosfatos 0,1
2,0
2,0
M, pH 5 (ml)
Agua destilada (ml)

2,0

1,0

Extracto enzimtico
(l)

100,0

100,0

Pasado el periodo de incubacin se toma 0,1 ml de cada tubo y se le aade 1 ml

del reactivo DNS, colocandose posteriormente a 100 C durante 5 minutos. Enfriar
y determinar la absorbancia a 570 nm de la mezcla problema utilizando como
blanco la mezcla de ensayo del blanco de sustrato. A partir de los valores de
absorbancia y tiempo de incubacin se pueden determinar los valores de actividad
enzimtica. Alternativamente, se puede preparar una nica serie de tubos,
tomndose a los intervalos de tiempo indicados alcuotas de 0,1 ml que se
vertern sobre 1 ml de reactivo DNS, previamente dispensado en un tubo de
ensayo de tapn de rosca, mezclndose inmediatamente para detener la reaccin
enzimtica

Construccin de una curva de calibrado

A partir de una solucin stock de glucosa 40 mM y por dilucin con agua
destilada, preparar una gama de soluciones del azcar de distinta concentracin,
tal y como se indica en la Tabla 1. Hacer las diluciones en tubos de ensayo. Una
vez hechas las mezclas, agitar bien para homogeneizar la solucin.
Preparacin de una gama de soluciones de glucosa de diferente concentracin a
partir de una solucin stock 40 mM.
Concentracin
Agua destilada
Glucosa 40 mM
Tubo
(mM)
(ml)
(ml)
0
0
5,0
0,0
1
2
4,75
0,25

2
3
4
5
6
7

4
6
8
10
20
40

4,5
4,25
4,0
3,75
2,5
0,0

Resultados Obtenidos
Tiempo

Concentracion

0.04

0.1

0.17

0.24

10

0.31

20

0.5

40

1.126

Curva

0,5
0,75
1,0
1,25
2,5
5,0

1.5
1
Absorbancia

0.5
0
0

10 20 30 40 50

Concentracion miliMolar

Donde Y=mx+b
Y=Absorbancia
M=pendiente
X=concentracion
B=interseccion
m=0.0282
y=2.74e-3

Tiempo

Concentracion

0.04

0.1

0.17

0.24

10

0.31

20

0.5

40

1.126

Si despejamos en cada uno de nuestros resultados de observancia para cada

punto,logramos convertir la Absorvancia en Conentracion miliMolar

X=(y-b)/m

Concentracion miliMolar vs Tiempo

Concentracion vs Tiempo
40
35
30
Concentracion
milimolar

25
20
15
10
5
0
0

10

20

30

40

50

60

Tiempo

Concentracion milimolar

7.136

10

12.38

15

16.67

20

26.64

25

29.22

30

32.58

35

34.15

40

35.25

45

34.76

50

35

Concentracion miliMolar vs pH

 La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo

la reaccin. La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de
enzima
En el caso ms general la curva tiene forma de campana.
Durante el ajuste de pH se usaron los siguientes buffer entre ph 3 y 4 realizando
varias disoluciones hasta alcanzar los Ph 2-5 empleando acetatos
En un rango de 6 a 8 empleamos fosfatos
Para amortiguar el pH de 9 a 11 empleamos amoniaco

PH
3
4
5
6
7
8
9
10

Concentracion
12
13.3
17.38
11.46
8.21
8
7.63
6

Concentracion vs pH
20
15
Concentracion
10
5
0
2

10 11

pH ptimo= 4 a 6
pH de desnaturalizacin= 6 hasta 14
Aminocidos: Fenil alanina pKa 5.5
Cistena pKa 5
Treonina pKa 5.6
Tirosina pKa 5.7

Concentracion mM vs Temperatura
La velocidad de una reaccin enzimtica vara al aumentar la temperatura
de acuerdo a lo indicado , donde se representa una tpica curva de
actividad enzimtica/temperatura. Tal dependencia refleja un doble efecto
de la temperatura: positivo a bajos valores, debido al incremento general
que experimenta la velocidad de cualquier reaccin qumica al hacerlo la
temperatura, y negativo a valores altos, debido a la desnaturalizacin
trmica del enzima.
Para elevar la temperatura se mantuvo el sistema de tubos en bao maria
monitoreando la temperatura
Temperatura C
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Concentracion
8.84
12.9
14.8
21.6
25.08
24.12
21.74
7.61
3.94

Conc vs Temperatura
30
20
10
0
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Axis Title

Temperatura optima de trabajo

40 a 55 C
Temperatura de desnaturalizacin
60 a 65 C

Concentracion mM de Sustrato
El efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una reaccin
catalizada enzimticamente. Este comportamiento cintico, conocido como curva
de saturacin hiperblica por el sustrato, constituye la norma seguida por la
mayora de los enzimas, los denominados enzimas michaelianas.
El anterior modelo cintico se ajusta a la ecuacin:
v = Vmax [S] / (Km + [S])
donde Km es la constante de Michaelis e indica la afinidad de la enzima.

450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0

20

40

60

80

Concentracion (s)

Concentracion

7.082

17.72

10

36

20

72

50

190

100

350

110

390

130

396

100

120

140

160

150
400
Con estos resultados y teneiendo en cuenta la velocidad en donde hay
mayor actividad enzimtica se calculo la Km

1 /Vo

vs

1
/S

1 /S

 v max=13.16
1/Km=0.38
Km=2.63

Inhibidores usando PbCl2

Se aadieron a cada uno 1ml de PbCl2 de concentracin 0.1 M y determin la
absorbancia a 570 nm utilizando como blanco la mezcla de ensayo del blanco del
sustrato.
Se repiti el mismo procedimiento pero agregando al final 1ml de PbCl 2 de
concentracin 0.2 M

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

Inhibicion competitiva km mayor de 5.02

Los inhibidores competitivos se pueden unir a (E), pero no a (ES). La
inhibicin competitiva aumenta el valor de Km (es decir, el inhibidor
interfiere con la unin del sustrato), pero no afecta a la Vmax (el
inhibidor no obstaculiza la catlisis en (ES) porque no se puede unir a
(ES))

Conclusiones
Durante la Practica se tuvo como finalidad la estimacin de la actividad
invertasa,tomando temperatura,pH,tiempo,Concentracion de sustrato optimos y
modificndose cada uno de estos durante las diversas pruebas realizadas, del
mtodo descrito en la literatura podemos destacar que durante la tcnica solo se
modifico en una ocasin el buffer de acetatos por fosfatos a un ph de 5 sin mostrar
cambio alguno y dando resultados muy similares por lo que comprobamos que la
solucin de fosfatos no afecta la actividad enzimtica ya que solo est aportando
protones al medio para mantener un pH de 5,
En la literatura la actividad enzimtica se determinaba con absorbancia pero
nosotros queramos comprobar y discutir sobre cuantos milimoles se consuman o
se producan durante la hidrolisis de sacarosa en glucosa y fructosa, cabe
mencionar que la curva patrn estaba dirigida a concentracin de glucosa es decir
que para obtener datos y comprobar la reproducibilidad de este debe construirse
una curva de calibracin con fructosa para comparar resultados y comprobar que
este mtodo es correcto y reproducible en las condiciones descritas.
Durante nuestras pruebas podemos concluir
1.-El sustrato sacarosa tiene gran afinidad por la enzima invertasa
2.-El pH ptimo de trabajo est entre pH 4 a 6
3.-La temperatura de trabajo est entre los 40 a 55 C
4.-Tiempo mximo de reaccin es de 35 min.
5.-temperatura de Desnaturalizacin de 60 a 65 C