Ebola Patognesis Virus: Implicaciones para las Vacunas y Terapias

Nancy Sullivan, Zhi-Yong YangY Gary J. Nabel*

1.

doi: 10.1128/JVI.77.18.9733-9737.2003J. Virol. September 2003 vol. 77 no. 18 9733-9737

Virus bola es un patgeno agresivo que causa un sndrome de fiebre

hemorrgica altamente letal en los humanos y los primates no humanos. Primero
reconocieron cerca del valle del ro bola durante un brote en Zaire en 1976 ( 6 ,
20 ), se han producido brotes en frica en los siguientes 27 aos, con tasas de
mortalidad que van desde 50 a 90% ( 26 , 28 ). Los brotes se han identificado al
ao durante los ltimos 3 aos en el centro de frica, la ms reciente de las
cuales contina en la Repblica del Congo, con ms de 125 muertes al da,
segn la Organizacin Mundial de la Salud ( http://www.who.int / CSR / don /
2003_05_07 / es / , consultado el 07 de mayo 2003). El husped natural del virus
bola es desconocida, por lo que no ha sido posible poner en prctica programas
para controlar o eliminar los reservorios virales de transmisin a las poblaciones
humanas. La rpida progresin de la infeccin por el virus bola ha complicado
an ms el control de esta enfermedad, dando pocas oportunidades para
desarrollar la inmunidad adquirida. Actualmente no existe una terapia antiviral o
una vacuna que sea eficaz contra la infeccin por el virus de bola en los seres
humanos.
Aunque su curso clnico es bien conocido, los mecanismos especficos que
subyacen a la patogenicidad del virus de Ebola no han sido claramente
delineado. Esto es debido, en parte, a la dificultad en la obtencin de muestras y
el estudio de la enfermedad en las reas relativamente remotas en las que se
producen los brotes. Adems, se requiere un alto grado de contencin de riesgo
biolgico para estudios de laboratorio y anlisis clnicos. Aislamiento de los ADNc
virales y el desarrollo de sistemas de expresin han permitido el estudio de bola
productos gnicos virus bajo condiciones menos restrictivas y facilitado una
comprensin de los mecanismos subyacentes dao celular inducida viralmente.

EBOLA VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE PROGRESIN

Por lo general, la infeccin por el virus de Ebola sigue su curso dentro de 14 a 21
das. La infeccin se presenta inicialmente con sntomas de gripe no especficos
como fiebre, mialgia y malestar general. A medida que la infeccin progresa, los
pacientes presentan sangrado y coagulacin graves anomalas, incluyendo
sangrado gastrointestinal, erupcin cutnea, y una serie de irregularidades
hematolgicas, como linfopenia y neutrofilia. Las citoquinas se liberan cuando
las clulas reticuloendoteliales encuentran virus, que puede contribuir a las
respuestas inflamatorias exageradas que no son de proteccin. El dao al
hgado, combinado con viremia masiva, conduce a coagulopata intravascular
diseminada. El virus eventualmente infecta las clulas endoteliales
microvasculares y compromete la integridad vascular. Las fases terminales de la
infeccin por el virus del Ebola por lo general incluyen hemorragia difusa, y las
cuentas de choque hipotensores para muchas vctimas mortales del virus Ebola
(para una revisin, ver referencias 9 y 28 ).
ESTRUCTURA Y CLASIFICACIN DE LA virus del bola
Virus bola y la relacionada con el virus de Marburg son miembros de la Filovirus
familia, que son, los virus de ARN de sentido negativo pleomrficas cuya
organizacin del genoma es ms similar a la Paramyxoviridae . De las cuatro
cepas identificadas del virus bola, tres el Zaire, Costa de Marfil y Sudn cepas
han demostrado que causan enfermedades en los seres humanos y los primates
no humanos, con la cepa Zaire exhibe la tasa de letalidad ms alta ( 13 , 29 ).
Los brotes slo documentados de infeccin por el virus bola en los Estados
Unidos fueron afortunadamente restringidos a los primates no humanos en la
celebracin de las instalaciones en Virginia y Texas, causada por la cepa Reston,
que an no ha causado la enfermedad fatal en seres humanos ( 19 ).
El genoma del virus bola es de 19 kb de largo, con siete marcos de lectura
abierta que codifican protenas estructurales, incluyendo la envoltura del virin
glicoprotena (GP), nucleoprotena (NP), y protenas de la matriz VP24 y VP40;
protenas no estructurales, incluyendo VP30 y VP35; y la polimerasa viral
(revisado en referencia 28 ). A diferencia de la del virus de Marburg, el marco de
lectura abierta GP de virus bola da lugar a dos productos de genes, una soluble
60- a la protena 70-kDa (PEC) y una larga duracin de 150 a 170 kDa protena
(GP) que insertos en la membrana viral ( 29 , 41 ), a travs de la edicin de la
transcripcin.
Virus bola GP y la patognesis viral
El virus Ebola GP se sintetiza en una secretada (PEC) o de longitud completa
forma transmembranal, y cada producto gnico tiene propiedades bioqumicas y
biolgicas distintas. Por ejemplo, GP parece formar un complejo trimrico ( 30 ) y
se une preferentemente a las clulas endoteliales, mientras que PEC no hace
( 49 ). La unin del virus Ebola GP al endotelio preferencial se demostr
mediante el uso de dos metodologas independientes como sigue: la unin

directa se evalu por anlisis clasificador de clulas activadas por fluorescencia,

y se realizaron experimentos pseudotipado en la que los ttulos de virus, el
nmero de clulas, y se determinaron confluencia cuidadosamente de modo que
la multiplicidad de infeccin fue controlada e iguales en todos los tipos celulares.
Otro estudio no pudo demostrar esta unin preferencial ( 17 ), pero la unin de
GP a las clulas endoteliales directa no se midi y ni la multiplicidad de infeccin,
el nmero de clulas diana, ni la confluencia celular se inform en ese estudio.
Los receptores necesarios para la unin celular y la infeccin no se entienden
completamente. Un receptor relacionado con folato puede servir como un
cofactor para facilitar la infeccin ( 8 ), pero si sirve como un receptor sigue
siendo poco clara. La lectina de la superficie celular DC-SIGN tambin puede
facilitar la unin a las clulas GP a travs de determinantes virales de hidratos
de carbono, pero no parece mediar en la entrada por s mismo ( 1 , 32 ). En
contraste con GP, SGP da lugar a una protena dimrica ( 30 ) que interacta con
neutrfilos ( 49 ). sGP media la unin de neutrfilos, directa o indirectamente, a
travs de CD16b, la forma de neutrfilos especfico del receptor Fc gamma III
( 49 ). Despus de la descripcin inicial de la unin de sGP de neutrfilos, se ha
demostrado que la inmunoglobulina G (IgG), pero no un fragmento Fab, contra
sGP se necesitaba para detectar la unin (T. Maruyama, MJ Buchmeier, PWHI
Parren, y Burton DR neutrfilos, Comentario Tcnica, Ciencia 282: 843-844,
1998). Un estudio posterior demostr que la unin tambin se poda ver si una
IgG irrelevante se utiliz con el fragmento Fab contra sGP (Z.-Y. Yang, R. Delgado,
L. Xu, RF Todd, EG Nabel, A. Snchez, y GJ Nabel, Respuesta del autor, Ciencia
282: 844-846, 1998). Aunque tales unin potencialmente podra surgir de la
unin de complejos inmunes, los estudios adicionales utilizando transferencia de
energa de resonancia mostraron que los neutrfilos incubados con sGP
mostraron una reduccin significativa en la seal de CR3-Fc gamma RIIIB RET
( 22 ), lo que demuestra que el PPD altera la interaccin fsica y funcional entre
Fcy RIIIB y CR3. A travs de esta interaccin, el PPD puede contribuir a la evasin
inmune mediante la inhibicin de los primeros pasos en la activacin de
neutrfilos (medida por la baja modulacin de L -selectin) que normalmente
ayudar en la eliminacin de virus ( 49 ).

Varias lneas de evidencia sugieren que el GP viral juega un papel clave en las
manifestaciones de la infeccin por el virus de bola. La forma transmembrana
de GP se dirige al virus del bola en las clulas que son relevantes para su
patogenia. Especficamente, GP permite que el virus para introducir su contenido
en monocitos y / o macrfagos, donde el dao celular o la exposicin a partculas
virales pueden causar la liberacin de citoquinas ( 34 ) asociado con la
inflamacin y la fiebre, y en las clulas endoteliales, lo que daa la integridad
vascular ( 48 ) (Fig. 1 ). Por lo tanto, el PPD puede alterar la respuesta inmune
mediante la inhibicin de la activacin de neutrfilos, mientras que el GP
transmembrana puede contribuir a los sntomas de la fiebre hemorrgica por la
orientacin virus a las clulas de la red reticuloendotelial y el revestimiento de
los vasos sanguneos.

FIG. 1.

FIG. 1.
Respuestas inmunes del husped contra el virus de bola y el dao
celular debido a la infeccin directa de monocitos y macrfagos causar
la liberacin de citoquinas asociadas con la inflamacin y la fiebre (A).
La infeccin de clulas endoteliales tambin induce un efecto citoptico
y el dao a la barrera endotelial que, junto con los efectos de
citoquinas, conduce a la prdida de la integridad vascular (B). La
expresin transitoria de virus Ebola GP en las clulas endoteliales de
vena umbilical humana o clulas 293T provoca una reduccin de las
integrinas especficas (molculas principales responsables de la
adhesin celular a la matriz extracelular) y molculas inmunes en la
superficie celular. Desregulacin de las citoquinas y la infeccin por
virus pueden sinergizar en la superficie endotelial, promoviendo la
hemorragia y colapso vasomotor.

GP expresin en las clulas epiteliales endoteliales humanas cultivadas

y causa redondeo celular y desprendimiento ( 48 ). GP es el nico de los
siete productos gnicos del virus de bola para ejercer este efecto, y
aunque GP de las cuatro cepas del virus de bola documentados acta
de manera similar, la cepa Zaire altamente patgena tiene la actividad
ms potente en este ensayo de cultivo celular ( 33 ). Estos efectos
requieren la presencia de la, dominio de serina-treonina-y-rica similar a
la mucina de GP y se corresponden con la baja regulacin de molculas
especficas en la superficie celular ( 48 ). La citotoxicidad parece estar
controlada con precisin por un mecanismo que implica la baja
regulacin de la expresin de GP a travs de un evento de la edicin de
ARN de transcripcin por la polimerasa viral. La importancia de este

fenmeno se demostr mediante el uso de un sistema de gentica

inversa para la replicacin de virus de bola en la que una mutacin
que incrementa el nivel de expresin de longitud completa GP es
significativamente ms citotxico que el virus de tipo salvaje ( 42 ).

La relevancia in vivo de toxicidad celular endotelial inducida por GP se

explor en explantes de los vasos sanguneos ( 48 ) en la cual las venas
safena humanos fueron infectados con vectores adenovirales de
replicacin defectuosa que llevan el gen para GP o PEC. La tincin con
peroxidasa de rbano picante y microscopa electrnica de barrido se
utilizaron para observar daos graves en el revestimiento de clulas
endoteliales en los vasos que recibieron el virus de codificacin de
longitud completa GP virus Ebola pero no sGP o vectores en los que se
elimin el dominio de mucina de GP. El dao celular en cultivos de
explantes paralelo a la especificidad de especie de las diferentes cepas
del virus de bola: no se observ toxicidad cuando Reston cepa GP se
introdujo en explantes vasculares humanas, mientras que se observ
dao tisular significativo en explantes vasculares de primates no
humanos.

Adems anlisis in vitro han comenzado a dilucidar los mecanismos

moleculares que subyacen a la citotoxicidad inducida por GP.
Mediadores crticos de la adhesin celular a la matriz y la sealizacin
inmune (por ejemplo, las integrinas y las principales protenas de la
superficie celular del complejo de histocompatibilidad de clase I) se
encuentran entre las molculas de la superficie celular que se
dysregulated ( 33 , 37 ). La expresin transitoria de GP virus bola en
clulas 293T de rin humana caus una reduccin de las integrinas
especficas (molculas principales responsables de la adhesin celular a
la matriz extracelular) en la superficie celular. GP mutantes que carecen
de la regin que abarca la membrana del ectodominio no causar esta
regulacin a la baja, lo que sugiere que el anclaje de GP a la membrana
celular es necesaria para este efecto. La interrupcin de la expresin
principal de histocompatibilidad de clase I en la superficie celular es un
mecanismo para evadir la respuesta inmune del husped que es
compartido por varios patgenos, incluyendo el citomegalovirus, el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y herpesvirus ( 27 ). No se
sabe si GP afecta los niveles de integrina alterando el trfico
intracelular o por la modulacin de la sntesis o degradacin de
protenas, pero los experimentos preliminares sugieren un papel para
maquinaria de transporte protena celular en la citotoxicidad mediada por GP (N.
Sullivan, observaciones no publicadas). En cualquier caso, los efectos biolgicos
de GP solo pueden explicar en gran medida por las caractersticas de la infeccin
por el virus de bola que conducen a la enfermedad fatal, incluyendo

disregulacin inflamatoria, la supresin inmune, y prdida de la integridad

vascular.
Los anlisis estructurales de GP han revelado caractersticas en comn con otras
protenas de la envoltura viral. La estructura cristalina del ectodominio GP revel
un dominio espiral de la bobina se asemeja a un trmero de bucles en horquilla
como helicoidales ( 23 , 44 ). La estructura de horquilla es adyacente a la regin
de fusin de pptido ( 16 ) la hiptesis de que insertar directamente en la
membrana de la clula diana. Regiones anlogas enrollado de la bobina se han
definido para los mdicos de virus de la influenza, los retrovirus murinos, el VIH y
el virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV), as como para algunas protenas
celulares, llamado SNARES, esa funcin en la fusin de vesculas intracelulares
( 44 ). Para gp160 del VIH, ha sido posible identificar pptidos que se unen a una
forma intermedia transitoria que precede a la formacin de horquilla. Debido a
su potente inhibicin de la entrada viral, estos reactivos han mostrado una
promesa considerable en ensayos clnicos ( 21 ). El GP virus bola contiene una
estructura homloga horquilla para que un posible pptido inhibidor se ha
identificado ( 43 ), una regin que sigue siendo una potencial diana teraputica.
Respuesta inmune a virus bola INFECCIN
Virus Ebola se replica a una tasa inusualmente alta que supera el aparato de
sntesis de protenas de las clulas infectadas y las defensas inmunitarias del
husped ( 28 ). Tanto los sistemas inmunes e inflamatorias adaptativas
responden a la infeccin, al mismo tiempo que algunos tipos de clulas,
especficamente monocitos y macrfagos, son metas pertinentes para la
patognesis de la enfermedad. Esta caracterstica de la infeccin se sugiri
inicialmente por la localizacin inmunohistoqumica del virus de Ebola in vivo: las
clulas endoteliales, los fagocitos mononucleares, y los hepatocitos son los
principales objetivos de la infeccin ( 3 , 4 , 12 , 50 ).

Los componentes del sistema inmune que puede proteger contra la infeccin por
el virus de bola no se han definido. Los ttulos de anticuerpos contra el virus de
Ebola mdicos son fcilmente detectables en los pacientes que se recuperan de
la infeccin del virus del bola; Sin embargo, los informes anecdticos han
indicado que el suero de pacientes recuperados no protega constantemente
contra la infeccin o presentan neutralizacin de la replicacin del virus en
cultivo celular. Adems, la transferencia pasiva de anticuerpos en modelos
animales slo retrasa la aparicin de los sntomas y no altera la supervivencia
global ( 18 ). Ms recientemente, la neutralizacin de la replicacin del virus por
anticuerpos monoclonales seleccionados aisladas de la mdula sea de
pacientes recuperados se demostr in vitro ( 24 ), y los anticuerpos
monoclonales que reconocen eptopos especficos de GP virus Ebola han
demostrado conferir proteccin inmune en un modelo murino de la infeccin por
el virus de bola ( 15 , 45 ) y en los conejillos de indias ( 25 ). Sin embargo, es
relativamente fcil de proteger contra la infeccin en el modelo de ratn, y la
proteccin de los conejillos de indias requiere una alta dosis de anticuerpo

administrado muy cerca del momento de la exposicin al virus. Tomados en

conjunto, estos resultados sugieren que los anticuerpos solos no proporcionan
inmunidad protectora en un contexto natural y que la inmunidad celular es
probable que desempee un papel significativo en el aclaramiento de virus. Ya
sea suero hiperinmune de los animales supervivientes vacunados o ciertos
anticuerpos que ocurren con poca frecuencia son capaces de atenuar la infeccin
sigue siendo desconocido, pero tales anticuerpos podran contribuir
potencialmente a la terapia si pueden ser identificados y optimizados.

Una comparacin de los parmetros inmunes en los supervivientes y no

supervivientes de la infeccin ha proporcionado pistas en los componentes de
una respuesta inmune efectiva. Bayeta et al. ( 2 ) caracteriz la respuesta
inmune de los pacientes en dos grandes epidemias de virus de bola en Gabn
en 1996. No hubo diferencia significativa en la carga de antgeno viral entre los
sobrevivientes y no sobrevivientes, pero la respuesta inmune variada, lo que
sugiere que la supervivencia depende de la inicial o inmune innata respuesta a la
infeccin. Los supervivientes mostraron respuestas ms significativas IgM,
liquidacin de antgeno viral, y sostenidos respuestas de citoquinas de clulas T,
como se indica por altos niveles de ARNm relacionadas con clulas T en la
sangre perifrica. En contraste, los anticuerpos especficos para el virus eran casi
indetectables en los casos fatales, y mientras el interfern gamma (IFN-) se
detecta a tiempo despus de la infeccin, los niveles de ARN de citoquinas de
clulas T eran ms indicativo de una falta de desarrollo de la inmunidad
adaptativa en los das anteriores muerte.

Durante la infeccin, hay pruebas de que tanto husped y las protenas virales
contribuyen a la patognesis del virus de bola. Los aumentos en los niveles de
citoquinas inflamatorias IFN-, IFN-, interleucina-2 (IL-2), IL-10, y factor de
necrosis tumoral alfa se asociaron con letalidad de fiebre hemorrgica del bola (
40 ). Adems, los experimentos in vitro demostraron que el factor de necrosis
tumoral liberado de los monocitos y los macrfagos infectados por filovirus
aument la permeabilidad de monocapas de clulas endoteliales humanas
cultivadas ( 12 ). Sin embargo, otros informes han observado una asociacin
entre niveles elevados de IFN- mRNA y la proteccin de la infeccin ( 2 ), y se
sugiere un efecto protector de IFN- y - por el hecho de que el virus ha
evolucionado al menos una protena, VP35, que acta como un antagonista de
IFN- / ( 5 ). Si los efectos de las citoquinas son protectora o perjudicial puede
depender no slo en el perfil de citoquinas, pero tambin puede representar un
equilibrio delicado influenciado por la ruta y el ttulo de virus entrante, as como
factores especficos de la respuesta inmune del husped individual.
DESARROLLO DE VACUNAS
Se han desarrollado varios modelos animales para el estudio de la patognesis
de la infeccin por el virus bola y para evaluar la eficacia de los diversos

enfoques de vacunas. Los conejillos de Indias y primates no humanos

representan los modelos animales primarios para el desarrollo de vacunas
debido a la progresin y la patognesis se asemejan ms estrechamente a los de
la enfermedad humana ( 10 , 46 , 47 ). Un modelo murino fue desarrollado ms
tarde por el paso en serie de virus en ratones ( 7 ). Aunque el modelo permite el
uso de cepas knockout y puras para evaluar determinantes genticos de la
enfermedad, se considera menos predictivo de la enfermedad humana porque se
basa en un virus atenuado por pases seriados. Si bien los sntomas y evolucin
temporal de la enfermedad en los conejillos de indias son paralelos a los de los
seres humanos, la infeccin de primates no humanos se considera el ms
predictivo y til para el desarrollo de vacunas ( 14 ).

Virus vivos atenuados y protenas recombinantes se han utilizado con xito en

una variedad de vacunas, pero la seguridad y la inmunogenicidad de las vacunas
a base de genes han demostrado ser cada vez ms atractivo. Entre los enfoques
basados en genes, ADN de plsmido desnudo ha sido utilizado con xito en
modelos animales para dirigir la sntesis de inmungenos dentro de las clulas
husped y ha demostrado ser til en una variedad de enfermedades infecciosas
(revisado en las referencias 11 y 38 ).

La inmunizacin gentica con ADN de plsmido se desarroll en el conejillo de

Indias y fue la primera vacuna eficaz para el virus de bola ( 47 ). En este
modelo, NP provoc una respuesta principalmente humoral y fue menos eficaz,
mientras que PEC y GP suscit de clulas T respuestas proliferativas y
citotxicas, as como una respuesta humoral. Proteccin contra el desafo letal
fue conferido por cada uno de estos inmungenos cuando los animales fueron
infectados dentro de 1 mes de la ltima inmunizacin, pero slo GP o sGP
proporciona una proteccin duradera. El grado de proteccin correlaciona con el
ttulo de anticuerpos y respuestas de clulas T especficas de antgeno. Estudios
posteriores de NP y plsmidos GP confieren inmunidad protectora en ratones ( 39
), pero no se sabe si el virus murino atenuada es ms sensible a la neutralizacin
de los virus de tipo salvaje. Por lo tanto, la potencia relativa de NP, o su requisito
como un inmungeno para proporcionar proteccin a largo plazo, sigue siendo
incierto.

Aunque las vacunas de ADN han sido muy eficaces en los roedores, su eficacia
en primates no humanos o seres humanos ha sido menos impresionante.
Imprimacin-impulsar protocolos de inmunizacin que utilizan la inmunizacin
con ADN seguido de refuerzo con vectores de poxvirus que llevan los genes para
las protenas de patgenos han dado respuestas inmunes mejoradas
dramticamente en estudios con animales, con aumentos de 30 veces o ms en
el ttulo de anticuerpos de la dosis de refuerzo ( 31 ). Una estrategia de cebadoimpulso diferente utilizando adenovirus de replicacin defectuosa para una

vacuna contra el virus del bola fue probado en macacos cangrejeros ( 36 ). Este
estudio demostr la eficacia inmunolgica superiores de esta combinacin de
cebado-impulso para ambas respuestas celulares y humorales. Estos animales
muestran la proteccin inmune completa contra un reto letal de virus,
proporcionando la primera demostracin de un enfoque de vacuna de virus Ebola
que protege primates contra la infeccin. Recientemente, un acelerada de
vacunacin ha sido desarrollado que confiere proteccin contra una exposicin al
virus letal en primates no humanos despus de una sola inmunizacin ( 36a ). Si
esta vacuna funciona de manera similar en los seres humanos, puede ser til en
la contencin de brotes agudos por vacunacin en anillo.

En resumen, una comprensin de los mecanismos subyacentes de bola efectos

citopticos inducidos por virus ha facilitado el proceso de desarrollo de vacunas y
terapia antiviral, que a su vez ha proporcionado nueva informacin sobre la
patognesis y la respuesta inmune. Virus Ebola no presenta el alto grado de
variabilidad que otros virus con envoltura pueden emplear para evadir la
inmunidad del husped, pero GP virus Ebola altera la funcin de clulas objetivo
y ejemplifica una nueva estrategia para la evasin inmune que pueden haber
surgido a travs de la evolucin del virus Ebola con su husped natural. Los
efectos citotxicos de GP sobre los macrfagos y la funcin de la clula
endotelial alteran la funcin de clulas inflamatorias y la integridad de la
vasculatura. Adems, mediante la alteracin de la expresin en la superficie
celular de las protenas de adhesin y molculas de reconocimiento inmune, el
virus de Ebola puede interrumpir los procesos crticos a la activacin inmune y la
funcin de clulas T citoltica. Estos fenmenos probable que cuenta para la
desregulacin de la respuesta inflamatoria y la disfuncin vascular caracterstica
de la infeccin por el virus de bola letal, proporcionando una justificacin para
centrarse en GP como diana para una vacuna preventiva y proporcionar
oportunidades de venta para otras intervenciones clnicas.