REA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGA AMBIENTAL

GRUPO
QU-301
MATERIA
MICROBIOLOGA AMBIENTAL
Reporte de diagnstico microbiolgico en sitio alterado Presa Blanca Compuerta 2 de
acuerdo a la NMX-AA-42-SCFI-1987 y PROY-NMX-AA-042/1-SCFI-2008
PRESENTAN:

Cruz Romo Diana Laura

Gaona Aboytes Mara Alejandra
Gonzlez Snchez Carla Valeria
Mireles Villasana Alejandra
Prez Gmez Cynthia Sarai

Generacin: 2014-2016
Len, Guanajuato. 24 JUNIO 2015

ANTECEDENTES
En el municipio de Len Guanajuato cuenta con Presas de aguas negras y residuales un ejemplo
muy claro es la Presa Blanca (Figura 1 y 2) ubicada al suroeste de la ciudad y la cual se encuentra a
1784 metros sobre el nivel del mar (snm).

Figura 1. Recuperado el 20 de junio de 2015 de:

https://www.google.com.mx/maps/@21.0857414,101.7137486,2970m/data=!3m1!1e3

En donde desembocan todo tipo de desechos industriales y domsticos, el agua de dicha presa
se conduce a travs de un canal a cielo abierto, hacia las comunidades de Santa Rosa Plan de Ayala en
donde su estructura econmica es de un total de 1027 hogares en donde estos tienen 967 viviendas, 23
tienen piso de tierra y unos 48 consisten de una sola habitacin, 910 de todas las viviendas tienen
instalaciones sanitarias, 933 son conectadas al servicio pblico, 957 tienen acceso a la luz elctrica. 1
En San Pedro del Monte en cual su estructura econmica es de un total de 173 hogares. De
estas 166 viviendas, 2 tienen piso de tierra y unos 8 consisten de una sola habitacin, 141 de todas las
viviendas tienen instalaciones sanitarias, 166 son conectadas al servicio pblico, 164 tienen acceso a la
luz elctrica.2
En la presa blanca, los riesgos y vulnerabilidad, se pueden ver como de mayor importancia por
las consecuencias a la poblacin, que hacen vulnerable el entorno urbano son los riesgos por fugas de
los ductos de Pemex ya que alrededor de la presa se encuentra una planta de Pemex y los riesgos
implcitos por la colindancia a la carretera, por falta de accesos y salidas adecuadas que den seguridad a
la poblacin.
En la comunidad

se presentan usos de suelo tales

como:

uso urbano-habitacional
uso agrcola potencial.
uso mixto agrcola
Figura 2 Ubicacin de La Presa Blanca.

En donde su destino final es para el riego de alfalfa y lechuga, estas aguas estn fuertemente
contaminadas qumica y bacteriolgicamente, al no sufrir ningn tratamiento de remediacin.

San Pedro del Monte (La Huizachera) - Guanajuato. Consultado el 20 de junio del 2015. Recuperado de: http://www.nuestromexico.com/Guanajuato/Leon/San-Pedro-del-Monte-La-Huizachera/
2

Plan de Ayala
(Santa Rosa) - Guanajuato. Consultado el
http://www.nuestro-mexico.com/Guanajuato/Leon/Plan-de-Ayala-Santa-Rosa/

20

de

junio

del

2015.

Recuperado

de:

PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DE MUESTRA Y SIEMBRA IN SITU

MUESTREO
Materiales, equipos y reactivos.

2 Frascos o recipientes para colectar la muestra de condicin estril.

4 Hisopos en condicin estril
2 Jeringa estril
2 cajas Petri con agar
2 Metros de Aluminio esto es para envolver las muestras recolectadas.
1 Hielera pequea
Hielo (para la preservacin de las muestras recolectadas).
Medio de cultivo de Agar de bilis y rojo violeta

Nota: Los frascos o los recipientes de muestreo deben estar estriles esto es para el material no
se contamine ya que en la esterilizacin elimina todo tipo de microorganismos.
Preparacin de medios de cultivo
Agar de Bilis y rojo violeta
Ingredientes

Extracto de levadura 3 g
Peptona de gelatina 7 g
Mezcla de sales biliares 1.5 g
Lactosa 10 g
Cloruro de sodio 5 g
Agar 15 g
Rojo neutro 0.03 g
Cristal violeta 0.002 g
Agua para llevar a 1000 mL
pH 7.4 0.2

Mtodo de preparacin

Se suspendieron 4.98 g de Agar de bilis y rojo violeta en 120 mL de agua destilada y se mezcl
perfectamente, posteriormente se procedi a esterilizarlo en autoclave a 121 C por 15 minutos.

Procedimiento
Muestreo en cuerpos receptores (agua):

1. Tomar 1 mL de muestra con la jeringa estril sumergindola en el agua sin sacarla evitando
contaminar en todo momento.
2. Verter el volumen tomado con la jeringa en una caja Petri preparada un da antes del muestreo
con agar de bilis y rojo violeta.
3. Llenar un frasco de vidrio (previamente

debe de estar esterilizado) hasta 2/3 partes de su

volumen (cantidad menor sera insuficiente, mayor, disminuira el espacio de aire disponible),
evitar contaminar en todo momento.
NOTA: El volumen suficiente para efectuar el anlisis bacteriolgico, debe de ser de un aproximado de
100mL.
4. Para tomar el volumen de muestra en el frasco quitar el papel aluminio del cuello del frasco e
introducir el frasco aproximadamente 30 mL bajo la
superficie del agua. (figura 3).
5. Destapar el frasco dentro del agua. (La boca del envase
debe quedar en sentido contrario al flujo de la corriente, si
no

existe

corriente,

crearla

empujando

el

frasco

horizontalmente, en direccin opuesta al movimiento de la

mano).
6. Tapar sin sacarlo del agua teniendo cuidado de que el
papel aluminio vuelva a cubrir el cuello de la botella.
Figura 3. Toma de muestra microbiolgica en
matriz de agua.

7. Si no es posible la recoleccin de muestras en las

condiciones antes anunciadas; fijar un lastre al frasco, al que se hace descender en el agua.
Procedimiento
Muestreo en cuerpos receptores (suelo):

1. Tomar con ayuda de un hisopo estril la muestra de suelo de forma rpida, y cultivarla en la
placa de cultivo preparada un da antes del muestreo con agar de bilis y rojo violeta el cual es
usado para el crecimiento de organismos coliformes.
2. En el frasco receptor almacenar la muestra del suelo cerca y rpida para no contaminar el
recipiente.
NOTAS: Se recomienda tomar la muestra de suelo cerca al rea de la muestra de agua.
3. Los frascos estriles para el muestreo no se deben destapar sino hasta el momento en el que se
efecte el muestreo.

4. Evitar que el cuello del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material
contaminante.
5. Realizar el muestreo lo ms pronto posible, para evitar proliferacin o muerte de las bacterias.
6. Cuando se practica dos horas despus de tomar la muestra, los resultados empiezan a ser
inciertos.

PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DE COLIFORMES TOTALES (NPM): PRUEBA PRESUNTIVA

Fundamento:
El caldo lactosado es un medio rico en nutrientes, y no contiene inhibidores del crecimiento
bacteriano.
Sus ingredientes como el extracto de carne y la peptona, son la fuente de carbono y nitrgeno,
mientras que la lactosa es el hidrato de carbono. Las bacterias fermentadoras de lactosa requieren de la
accin de dos enzimas: la permease de lactosa y la galactosidasa, la primera es necesaria para ingresar
la molcula de lactosa a la clula bacteriana y la segunda hidroliza el enlace glucosdico y produce
glucosa y galactosa. Por la fermentacin de la lactosa, (la cual es llevada a cabo por los coliformes
totales) se produce cido y gas, y ste ltimo se demuestra al usar las campanas Durham. Para bacterias
coliformes debe incubarse de 35 a 37 C durante 24-48 horas.
Materiales, equipos y reactivos.
9 Tubos de cultivo
1 Gradilla
5 Vasos de precipitados de 250 mL
9 Campanas Durham
8 Pipetas de diferentes volmenes
1 Esptula
3 Matraz Erlenmeyer 250 mL
1 Incubadora
1 Autoclave
Balanza analtica
Agua destilada
Caldo lactosado
Preparacin de medios de cultivo
Caldo lactosado
Medio de doble concentracin:

Ingredientes
Peptona de gelatina 5 g
Extracto de carne 3 g
Lactosa 5 g
Agua para llevar a 1000 mL
pH final 6.9 0.2

Mtodo de preparacin

Se suspendieron 1.56g de caldo lactosado en 120 mL de agua destilada y se mezcl

perfectamente y se distribuy en 9 tubos de cultivo con campana Durham. Esterilizar a 121C de 12 a 15
minutos.

Prueba presuntiva
1. Preparar la muestra para el anlisis para lograr una distribucin uniforme de los microorganismos
(agitando, mezclando la muestra).

NOTA: Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar diluciones.

2. A partir de una muestra de 100 mL de agua o una dilucin del suelo con 1 g de suelo, inocular los
tubos de con 10 mL de medio de cultivo lquido a doble concentracin (caldo lactosado) con 3
volmenes diferentes de agua o dilucin de suelo los volmenes son de 10 mL, 1 mL y 0.1 mL,
tomndolos con pipetas estriles en cada caso. Cada tubo de ensayo con su respectiva campana
Durham.

NOTA: Se harn 3 rplicas del medio que ser incubado.

3. Incubar los tubos de 24 a 48 horas ya sea a 35 C a 37 C.

4. Posterior a la incubacin examinar los tubos despus de haber transcurrido de 18 a 24 horas y

considerar como resultados positivos a aquellos en los que se produjo gas dentro de la campana
Durham, turbidez. Si es necesario reincubar aquellos tubos que no muestran alguno o todos estos
cambios y examinarlos nuevamente a las 48 horas.
5. Mediante tablas estadsticas llevar a cabo el clculo del nmero ms probable (NMP) de organismos
coliformes, organismos coliformes fecales y E. coli que puedan estar presente en 100 mL de muestra,
partiendo del nmero de tubos que resultaron positivos por rplica as como de la concentracin de
donde proviene.

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA LA IDENTIFICACION DE COLIFORMES TOTALES

Fundamento:
La presencia y extensin de contaminacin fecal es un factor importante en la determinacin de
la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de
resistencia de los mismos, involucrando organismos patgenos, los cuales son un riesgo para la salud
pblica al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la
presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el intestino humano y de
otros animales de sangre caliente, da una indicacin. Dada la limitada capacidad de algunos miembros
del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus nmeros tambin pueden emplearse
para estimar el grado de contaminacin fecal.

EL caldo lactosa bilis verde brillante Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el
aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clnicas, alimentos,
y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp.
Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran nmero de muestras de heces o
alimentos, por su alta capacidad de diferenciacin de las colonias sospechosas
En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de
nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el
rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay produccin de cido a partir de la
fermentacin de azcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el verde brillante acta
como agente selectivo.
La prueba confirmativa consiste en analizar los tubos una vez que resultaron positivos en la prueba presuntiva.
Materiales, equipos y reactivos

Pipetas de diferentes volmenes

1 Matraz Erlenmeyer 250 mL
2 Asa de nicromo
2 Mechero
2 Vasos de precipitados 250 mL
1 Gotero
1 Autoclave
1 Incubadora

Caldo lactosa bilis verde brillante

Agua destilada
Reactivo Kovacs
Peptona

Preparacin de medios de cultivo

Agar verde brillante bilis
Ingredientes:
Bilis de buey 20 g
Lactosa 10 g
Peptona de gelatina 10 g
Verde brillante 13.3 mg
Agua para llevar a 1000 mL

Mtodo de preparacin

Disolver 3.2 g del medio deshidratado en 80 mL de agua destilada, agitando frecuentemente

para disolver el producto, disperse en tubos con campana de Durham. Esterilizar a 121 C durante 15
minutos.
Solucin salina de peptona
Ingredientes
Peptona 1.0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 8.5 g
Agua para llevar a 1000 mL

Mtodo de preparacin

Disolver los componentes en agua hirviendo. Si es necesario ajustar el pH de modo que al

terminar la esterilizacin sea de 6.7. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 min.
Prueba confirmatoria

1. Reinocular con un asa de nicromo (esterilizndola en mechero) en caldo lactosa bilis verde
brillante un volumen (0.1 mL) del contenido de los tubos que resultaron positivos en la
prueba presuntiva.
2. Incubar los tubos por 48 horas a 37 C para la deteccin de organismos coliformes y a 44C
por 24 horas para organismos termotolerantes (fecales). Para confirmar la presencia de E.

coli. presuntiva, incubar un tubo de agua de peptona tanto para agua como para suelo para
detectar la formacin de indol a 44C durante 24 horas.
3. Despus de incubacin examinar los tubos, observar si se produjo gas en la campana
Durham esto para confirmar la presencia de coliformes pero para la presencia de E.coli se
podr ver el desarrollo de un anillo de color rojo despus de agitar as como despus de
haber aadido el reactivo de Kovacs.

PRUEBA CONFIRMATORIA DE INDOL PARA E. coli PRESUNTIVA

Fundamento:
En la realizacin de la prueba de indol, el reactivo Kovacs y el agua peptona son los que
detectan la presencia del microorganismo E.coli presentes en la muestra de agua y suelo de La Presa
Blanca. Su deteccin fue instantnea tanto en agua como en suelo.
El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminacin reductiva del triptfano y esta
reaccin es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto
triptofanasas. Para detectar la produccin de indol se utiliza el medio Caldo triptfano y la lectura de la
prueba se realiza con el reactivo de Kovacs con el que el indol producido reacciona generando una
coloracin rosa intensa.
Inoculacin del medio.
1. Resembrar a partir de cada tubo de medio de aislamiento de verde brillante bilis que muestre un
resultado positivo en uno o ms tubos de medio confirmativo para detectar la produccin de gas
e indol.
2. Para confirmar la presencia de organismos coliformes, incubar un tubo de Caldo Bilis Lactosa
Verde Brillante o Caldo EC a 37C y examinarlo para ver si hay produccin de gas dentro de un
perodo de 48 horas.
3. Para confirmar la presencia de E. coli presuntiva, incubar un tubo de agua de peptona para
detectar la formacin de indol a 44C durante 24 horas.
4. Despus aadir de 0.2 a 0.3 cm3

de reactivo de Kovacs al tubo de agua de peptona; el

desarrollo de un anillo de color rojo despus de agitar suavemente denota la presencia de indol.
NOTA.- La deteccin de E. coli presuntiva se considera una evidencia satisfactoria de
contaminacin fecal.
Sin embargo, pueden efectuarse mayores pruebas para la confirmacin de E. coli si se considera
necesario.

PRUEBA CONFIRMATORIA DE OXIDASA PARA E. coli

Fundamento:
Esta prueba est basada en la identificacin de una enzima bacteriana llamada citocromo C
oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energa en forma de ATP a partir del proceso de
respiracin tambin llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana,
en las siguientes lneas se dar una breve explicacin de la cadena respiratoria solo con la finalidad de
entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromo C oxidasa, entindase que todo este
proceso tiene la finalidad de producir ATP.

En la respiracin hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones
desde sus sustratos hasta llegar al citocromo C, la enzima llamada citocromo C oxidasa le quita
electrones al citocromo C, estos electrones son transferidos por la enzima al oxgeno siendo este el
ltimo aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxgeno tiene un
exceso de electrones puede atraer tomos de Hidrgeno formando dos posibles productos: Agua o
perxido de hidrgeno.

Algunas bacterias que se encuentran en el agua pueden conformar la definicin de organismos

coliformes en muchos aspectos, pero son capaces de producir gas a partir de lactosa solo a
temperaturas abajo de 37 C.

Por consecuencia dan resultados negativos en las pruebas confirmativas de rutina para
organismos coliformes, y su presencia en agua no es usualmente considerada como significativa.

Las especies de Aeromonas, las cuales es natural que estn presentes en agua, interfieren con
la determinacin slo a temperatura de 37 C o menor, se requiere la prueba confirmativa de la oxidasa
solo cuando se estn determinando coliformes totales.

El fundamento bsico es que el reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la
enzima citocromo C oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es
una amina aromtica y la oxidacin de esta produce quinolonas de color morado-azulado.

Materiales y equipos

2 Papel filtro
2 Cajas Petri
1 Gotero
2 Asa metlica de platino
Reactivos

Se utilizan colorantes cromgenos que actan como aceptadores artificiales de electrones que
sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, Tetrametil-p-fenilendiamina.

El reactivo basado en una disolucin acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%. Este reactivo

se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso.

Procedimiento

Incubacin de los tubos

Incube los tubos inoculados por 48 horas ya sea a 35 C 0,5 C a 37 C 0,5.
Revisin de los tubos en cultivo presuntivo

1. Examinar los tubos de cultivo despus de incubarlos por 18 a 24 horas y registre con reaccin
positiva aquellos que muestren turbidez debido al crecimiento bacteriano y/o formacin de gas
en el interior del tubo invertido (Durham). As como la produccin de acido si el medio de
aislamiento contiene un indicador de pH.
2. Reincubar aquellos tubos que no muestren alguno o todos estos cambios y examnelos
nuevamente para reacciones positivas a las 48 horas.
Prueba de oxidasa

1. Lleve a cabo la prueba de la oxidasa con subcultivos puros de organismos fermentadores de

lactosa, desarrollados en medio de agar nutritivo, de la siguiente manera: Coloque dos o tres
gotas de reactivo de oxidasa preparado recientemente en un papel filtro colocado sobre una caja
Petri.
2. Con una varilla de vidrio, palillo de madera o asa metlica de platino (no de nicromo) de punta
redonda, unte una pequea porcin del crecimiento sobre el papel filtro preparado.

3. Considere la aparicin de un color azul-morado profundo en un lapso de 10 segundos como una

reaccin positiva.
NOTA: Cada ocasin en que se utilice el reactivo de oxidasa, deben realizarse pruebas control con
cultivos de organismos que se sabe dan reaccin positiva (Pseudomona aeruginosa) y una reaccin
negativa (E. coli).
Factores a considerar en la prueba de oxidasa.
No considerar un resultado positivo despus de 30 seg, ya que el oxgeno molecular del ambiente oxida
al reactivo.
No usar asa bacteriolgica metlica ya que la mayora de estas con tienen hierro y este es capaz de
oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.
No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que
contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentacin del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando
como resultado falsos negativos en la prueba.