AREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADEMICO DE QUIMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL

MATERIA
MICROBIOLOGA AMBIENTAL
PROFESORA
DR. ROSY MATA RICO
ACTIVIDAD
REPORTE DE DIAGNSTICO MICROBIOLGICO EN UN SITIO ALTERADO; PRESA
BLANCA, COMPUERTA DOS DE ACUERDO A NMX-042/1-SCFI-2008
PRESENTAN
PEDROZA DAZ NOE MIGUEL NGEL
PIA CARDONA VCTOR MANUEL GUADALUPE
RAMREZ SNCHEZ ANDRS
RENTERA ALDANA JORGE
SALAS PADILLA MARA GUADALUPE REGINA

GENERACIN: 2014-2016
LEN, GUANAJUATO. 23 DE JUNIO DE 2015
ASPECTO DEL SER (20%)________
ASPECTOS ACADMICOS (80%)________
CALIDAD DE CONTENIDO (45%)________
HOJA DE PRESENTACIN CON DATOS
COMPLETOS (10%)________
ORTOGRAFA (10%)________
PRESENTACIN Y LIMPIEZA (5%)________
REDACCIN (10%)________
CALIFICACIN TOTAL________

ANTECEDENTES DEL SITIO

La zona sur del municipio de Len es la ms contaminada debido a la quema de
pastizales y a los tiraderos clandestinos de desechos industriales, la quema de 80
hectreas en el vaso de la presa Blanca, ha puesto al descubierto que ah se arrojan en
forma clandestinas toneladas de desechos industriales, es por ello que las autoridades de
Medio Ambiente ya han interpuesto denuncia ante las autoridades federales para que se
apliquen sanciones contra quienes resulten responsables las labores se han complicado,
dijo, debido a que la presa a se ha convertido en un tiradero de desechos industriales,
desde lodos de teneras, hasta llantas, madera, lo cual sumado a las toneladas de lirio
seco, ha dificultado combatir el fuego, hay un gran problema de contaminacin por las
descargas que se estn haciendo en la presa Blanca, que es histrico. Las descargas
industriales de Len llegan a la presa de San Germn y Silva, por ello se han registrado
mortandad de peces en aos anteriores. Lo nico que se hizo fue relocalizar el problema
ambiental, pero esto tiene ms de 10 aos
Realmente no se tienen investigaciones previas sobre este lugar, as que se llevar a cabo
un muestreo exploratorio para poder generar datos sobre la misma. El fotgrafo Gustavo
Rodrguez Mena el 11 de Enero del ao 2011, pudo capturar una imagen de la misma. (Fig.
1)

Fig. 1 Imagen de la Presa Blanca en

Enero del 2011.

RELATORA
El da 11 de Junio del 2015, se realiz el muestreo en la Presa Blanca, todos nos
empezamos a alistar alrededor de las 8:00 am, fuimos al laboratorio a recoger el material
necesario, asegurando que no fuese a faltar nada. Alrededor de las 9:30 empezamos a
subir las cosas al camin, en compaa de la profesora Leonor, El Ingeniero Isidro, y los
profesores Roberto y Esa. Llegando as al lugar de muestreo a las 10:30
Al llegar al sitio del muestreo notamos que el agua tena una tonalidad verdosa muy
peculiar.
El lugar del muestreo se seleccion previamente. El sitio del muestreo fue en la presa
blanca; compuerta 2 (Figura 1).
La hora de toma de muestra fue a las 11:00 a.m. con un clima soleado y hmedo en el sito.
Muestreo y siembra in situ (suelo)
Se procedi hacer la siembra de suelo in situ en dos agares bilis rojo y violeta para
comprobar la existencia de organismos coliformes.
La siembra se realiz de manera de estras como se muestra en la figura 1 para la
distribucin de los microorganismos vivientes en esa muestra de suelo.
Despus se introdujo el hisopo estril dentro de la superficie del suelo para diferenciar el
crecimiento superficial y profundo.
Las coordenadas de los puntos de muestreo para suelo y agua fueron los siguientes:

Suelo:
Punto 1: -102: 42,89932 lon- 21.511253 lat
Punto 2: -101:42,90024 lon -.21:511288 lat
Agua
Punto 1: -101:714,999 lon21.0885221 lat
Punto 2: -101:714991lon- 21.085221lat.

FIG.1 Lugar del

muestreo

MUESTREO Y SIEBRA IN SITU EN SUELO.

Figura 3. Siembra en estras

Figura 4. Hisopo con muestra de suelo

Se debe de realizar de la manera ms asptica posible, en este caso con guantes, hisopos,
agares y esptulas estriles para evitar la contaminacin (figura 5).

a)

b)
c)
Figura 5. Recoleccin y siembra: a) remocin del suelo para la siembra b) siembra en estras c) rotacin de 90
para la distribucin de la muestra por todo el agar

A dems de cubrir la abertura de las cajas de Petri con cintaparafilm y as evitar la

contaminacin por factores externo tales como el aire o el agua dentro de los recipientes de
contencin (figura 6).

Figura 6. Cubierta de cinta parafilm en la caja de Petri

Las muestras para el siguiente anlisis se introdujeron en frascos recientemente

esterilizados en autoclave a 120C (figura 7).
Se tomaron dos muestras, suelo superficial y profundo
comparacin entre ellas.

a 30 cm para que haya

Figura 7. Toma de muestras profunda

Toma de muestras superficial

MUESTREO Y SIEMBRA IN SITU EN AGUA

La siembra in situ en agares del mismo tipo se realiz de manera que se verti un mL de
agua dentro del agar y se distribuy dndole una pequea serie de movimientos circulares
y lineales (figura 8).

Figura 8. Adicin de agua al agar y distribucin de la muestra en l

Las muestras para el siguiente anlisis se introdujeron en frascos recientemente

esterilizados en autoclave a 120C (figura 10).

Figura 10. Embotellamiento de muestras

Al finalizar el muestreo, todas las muestras fueron depositadas en una hielera con hielo
para conservar a los microorganismos sembrados intactos para posteriormente incubarlos
a la temperatura ptima (figura 9).

Figura 9. Preservacin de las

muestras a 4

ANLISIS DE

COLIFORMES TOTALES NMP

PROCEDIMIENTO 1

PROCEDIMIENTO DE PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES TOTALES

Materiales y equipos
9 tubos de ensaye
Gradilla
Balanza analtica
9 campanas Durham
Reactivos
Alcohol etlico
Cloro

Pipeta 10mL
Indicador de bromocresol
Autoclave
Incubadora

Caldo lactosado
Agua destilada

Preparacin de reactivos
al
Caldo lactosado doble concentracin
Tomar 1.86 g y disolver en 70mL de agua destilada
Dejar reposar 5 minutos y agitar frecuentemente hasta su disolucin completa
CONFIRMATIVA COLIFORMES
Purpura de bromocresol PRUEBA
10 %
Equipos
y Materiales
Disolver un
gramo de purpura de bromocresol en 10 mL de etanol
2 matraz Erlenmeyer
1 esptula

2
vasos
de
precipitado
2 pro pipetas
Procedimiento
6 campanas Durham
1 cucharilla
1. Esterilizar
de(o
trabajo
6 tubosel
derea
cultivo
ensaye de 20x250)
1 probeta 100mL
2. Preparar
9 tubos con distinto nmero de concentracin
y volumen del medio de cultivo.
2 Picetas
1 incubadora
2 pipetas
de 5mL
con
algodn
3. Tubos
con 10mL
a doble concentracin, 3 tubos
4mL y 3 tubos con 5mL a concentracin
1 ygradilla
Aluminio
normal
agregar 5mL de agua destilada a estos ltimos
2, y agregar 10, 1 y 0.1mL, a cada
correspondientemente
2 charolas de pesado
gasas
tubo
Autoclavemorada)
(u olla de ypresin)
4. Agregar el indicador a los 9 tubos (tomara unacoloracin
una campana Durham

invertida a c/u, despus llevarlos a esterilizar durante 15 min.

5. Incubar los tubos
y dejarlos
por 48 hrs a 37C.
PRUEBA
CONFIRMATIVA
DE COLIFORMES TOTALES
6. Dar como positivos aquellos tubos que presenten una coloracin amarilla y presencia de
Equipo
de
gas.
Fundamento
proteccin
personal
El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrgeno mientras que la lactosa
PRUEBA CONFIRMATIVA DE COLIFORMES
es el hidrato de carbono a fermentable. Por la fermentacin de la lactosa se produce cido y
,
gas(CO2
y H2)esterilizados
el cual se evidencia al utilizar campanas Durham).
Guantes
Bata
Cubre bocas
Lentes de seguridad
C6H12O6 C3H4O3 + NADH + H+ C3H3O3 + CO2

PRUEBA CONFIRMATIVA DE COLIFORMES

Material del laboratorio utilizado

Botas de seguridad
Bata
Cubre bocas
Lentes y botas de seguridad.

Reactivos
Alcohol
Caldo bilis verde brillante
Cloro
Preparacin de reactivos
Caldo bilis verde brillante
Suspender 1.6g en 40mL de agua destilada en un matraz Erlenmayer, Disolver agitando
frecuentemente y distribuir 5mL en cada tubo.
Procedimiento
1. Esterilizar el medio de trabajo
2. Preparar el caldo bilis verde brillante y distribuir el volumen indicado en los tubos de
cultivo.
3. Agregar campana Durham a cada tubo de cultivo
4. Agregar 1mL de muestra en cada tubo
5. Incubar durante 48 horas a 35+/-0.5C
6. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas
7. Dar como positivos los tubos que presenten formacin de gas y turbidez

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la
fermentacin de la lactosa con produccin de cido y gas.

PRUEBA CONFIRMATIVA DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES

Equipos y Materiales

2 matraz Erlenmeyer
2 vasos de precipitado
6 campanas Durham
6 tubos de cultivo (o ensaye)
2 Picetas
2 pipetas de 5mL
1 gradilla
2 charolas de pesado

1 esptula
2 Propipetas
1 cucharilla
1 probeta 100mL
1 incubadora
Algodn
Aluminio
gasas
Autoclave (u olla de presin)

Equipo de proteccin personal

Guantes esterilizados
Bata
Cubre bocas

Lentes de seguridad
Botas de seguridad

Reactivos
Alcohol
Cloro
Medio EC
Preparacin de reactivos
Medio EC
Suspender 37.4g del medio EC en 100ml de agua destilada y dejar reposar por 5 minutos
Calentar con agitacin frecuente.
Preparacin de materiales
Aparte de los aparatos que se surten ya esterilizados, el material de vidrio y otros equipos
deben ser esterilizados.
Procedimiento
8. Esterilizar el medio de trabajo
9. Preparar el medio EC y distribuir el volumen indicado en los tubos de cultivo
10. Agregar campana Durham a cada tubo de cultivo
11. Homogeneizar cada tubo que dio positivos a la prueba confirmativa de coliformes
12. Inocular con tres asadas los tubos del medio EC a partir de los tubos que contienen
el caldo Bilis Verde Brillante
13. Incubar durante 24 horas a 35+/-0.5C
14. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas
15. Dar como positivos los tubos que presenten formacin de gas y turbidez
Prueba confirmativa de coliformes fecales (E. coli)
Equipos y material

2 matraz Erlenmeyer
2 vasos de precipitado
6 campanas Durham
6 tubos de cultivo (o ensaye)
2 Picetas
2 pipetas de 5mL
1 gradilla
2 charolas de pesado
Autoclave (u olla de presin)

1 esptula
2 pro pipetas
1 cucharilla
1 probeta 100mL
1 incubadora
Algodn
Aluminio
Gasas

Equipo de proteccin personal

Guantes esterilizados
Bata
Cubre bocas

Lentes de seguridad
Botas de seguridad

Reactivos
Alcohol
Cloro

Agua destilada
Agua de triptona

Preparacin de reactivos
Suspender 1.5g del polvo en 1 litro de agua destilada y dejar reposar durante 5 minutos
Mezclar calentando hasta ebullicin durante 1 minuto
Preparacin de materiales
Aparte de los aparatos que se surten ya esterilizados, el material de vidrio y otros equipos
deben ser esterilizados.
Procedimiento
1. Esterilizar el medio de trabajo
2. Preparar el agua de Agua de triptona y distribuir en cada tubo de cultivo
3. Agregar campana Durham a cada tubo de cultivo
4. Incubar a temperatura ambiente por 24 horas para la formacin de indol
5. Homogeneizar los tubos de la prueba confirmativa de coliformes Termotolerantes
6. Inocular con 3 asadas los tubos con Agua de triptona a partir de los tubos con medio
EC
7. Incubar durante 24 horas a 44C
8. Adicionar de 0.2mL a 0.3mL del reactivo de Kovacs a cada tubo
9. Agitar suavemente, el desarrollo de un color rojo denota la presencia de indol

Fundamentos
Coliformes totales:
Los coliformes son un grupo de microorganismos, su nombre significa en forma de
coli haciendo referencia a la bacteria principal en el grupo la Escherichiacoli (Escherichia
por honor a su descubridor y son utilizados como indicadores de contaminacin en agua,
suelo y aire. Principalmente indicadores de contaminacin fecal en el control de la calidad
del agua, ya que, en medio acuoso los coliformes son ms resistentes que las bacterias
intestinales, para esto se utilizan diversos mtodos, en nuestro caso utilizamos la tcnica
de diluciones en tubo mltiple (nmero ms probable o NMP). (Centro Panamericano de
Ingeniera Sanitaria, 1983)
Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el intestino de los humanos
y de los animales de sangre caliente, aunque tambin son altamente frecuentes en el
ambiente, su principal induccin hacia la naturaleza es por medio de las heces de los
animales. En este grupo se encuentran ms comnmente los gneros de bacterias:
1.Escherichia
2.Klebsiella
3.Enterobacter
4.Citrobacter
Las cuales poseen caractersticas que las diferencian de otros gneros y da la capacidad
de identificarles por ejemplo, que son bacterias Gram negativas en forma de bacilo, aunque
algunas fuentes consideran ms importante la capacidad de fermentar lactosa (disacrido
formado por glucosa y galactosa) que es un proceso catablico anaerobio de media
oxidacin, la fermentacin es relacionada con la enzima lactasa y es utilizada para obtener
energa en base a la glucosa que se degrada para formar dos molculas de ATP y dos de
cido lctico.(Vargas, 1983).
Al fermentarse la lactosa se produce gas (CO2) en un tiempo estimado de 48 horas a una
temperatura de 37 C (tambin existen los coliformes termotolerantes que fermentan la
lactosa a 44.5C en aproximadamente 24h)
Eleccin del medio: Para la determinacin de coliformes en necesario poseer un cultivo que
inhiba el crecimiento de bacterias a excepcin de los coliformes, este medio debe contener
lactosa el cual es el hidrato de carbono fermentable y debe poseer nutrientes necesarios
para el desarrollo de los mismos. El Caldo Verde Bilis Brillante, es un aislado de bilis de
buey que adems contiene peptona que proporciona los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano y lactosa que es el hidrato fermentable necesario para los coliformes.
(Britania, 2010)

Caldo bilis verde brillante

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el

desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la

lactosa es el hidrato de carbono fermentable
Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin de
cido y gas.
Medio EC
En el medio de cultivo la triptena es la fuente de pptidos, amino-cidos y nitrgeno. La
lactosa es el hidrato de carbono fermentable y favorece el desarrollo de bacterias
coliformes, las sales biliares inhiben el crecimiento de la flora acompaante Gram positiva,
las sales fosfato constituyen un sistema buffer que impide que los productos cidos
originados por la fermentacin de lactosa afecten el crecimiento microbiano y el cloruro de
sodio mantiene el balance osmtico. (Britania, 2010)
Las bacterias coliformes fecales forman parte del total del grupo coliforme. Son definidas
como bacilos Gram-negativos, no esporulados.
Fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 44.5 C +/ 0.2 C dentro de las 24
+/ 2 horas. (Cepis, Ed. 1078)

Agua de triptona
Su base nutritiva permite el desarrollo de diversas especies bacterianas. La triptona
presenta alto contenido en triptofano, el cual es el sustrato utilizado por los
microorganismos para la produccin de indol, cido pirvico y amonaco. El cloruro de
sodio mantiene el balance osmtico (Britania, 2010)

Escherichia Coli se puede distinguir de los dems coliformes termotolerantes por su

capacidad para producir indola partir de triptfano o por la produccin de la enzima glucuronidasa. (Cepis, 1983)
Escherichia Coli se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los
intestinos animales, y por ende en las aguas negras pero que se puede encontrar en todos
lados, dado que es un organismo ubicuo, necesario para el funcionamiento correcto del
proceso digestivo, adems de producir las vitaminas B y K. (Moredo, 2012)

Reactivo de Kovacs
El indol generado puede ser revelado por el agregado del reactivo de Ehrlich (Indol
Reactivo) o el reactivo de Kovacs debido a que se forma un complejo color rojo al
reaccionar el indol con el grupo aldehido del p-dimetilaminobenzaldehido presente.
(Britania, 2010)

Referencias
Britania, L. (2010). Laboratorios Britania. Obtenido de Britania
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/verdebribilis.htm

Lab web

site:

Centro Panamericano de Ingeniera Sanitaria. (1983). coliforme fecal. Determinacin del

nmero ms probable de coliforme fecal por la tcnica de tubos multiples . Lima, Per
Cepis, Gua para la evaluacin de laboratorios bacteriolgicos de anlisis de agua, Serie
documentos tcnicos N3, Ed revisada, Lima, Cepis, 1078
Vargas, M, C, 1983, Mtodos simplificados de anlisis microbiolgicos, CEPIS, Lima, Per.
Moredo, Fabiana (2012). Prevalencia, de Escherichia coli enteroxigenico y Escherichia coli
productor de toxina Shiga en cerdos sin manifestacin clnica de diarrea de la provincia de
buenos aires p. 246. Consultado el 19 de abril de 2015.
PROY-NMX-AA-042-/1 SCFI- 2008. ANLISIS DE AGUA DETECCION Y
ENUMERACIN DE ORGANISMOS COLIFORMES, ORGANISMOS COLIFORMES
TERMOTOLERANTES, Y E. COLI.
Vargas, C. (1983). Mtodos simplificados de anlisis microbiolgicos. Lima, Per: CEPIS.