REA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL
GRUPO
QU-304
MATERIA
MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

TITULO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
DE LA MATRIZ AMBIENTAL: _____Suelo_________
ASESORA
Dr. ROSA RICO MATA
DATOS DE IDENTIFICACIN DE LOS ANALISTAS
Fecha de inicio del anlisis: 1 de Julio del 2015
Fecha de trmino: 9 de Julio de 2015
Nombre
Salas Padilla Mara Guadalupe Regina

Cargo
Responsable

Pia Cardona Vctor Manuel Guadalupe

Administrador

Ramrez Snchez Andrs

Laboratorista 1

Pedroza Daz No Miguel ngel

Laboratorista 2

Rentera Aldana Jorge

Laboratorista 3

GENERACIN: 2014-2016

MICROBIOLOGA AMBIENTAL UTL

ASESORA:

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DATOS DEL SITIO EN ESTUDIO

1.- Breve descripcin del estatus ambiental del sitio de estudio:
Hace ms de once aos, dio inicio uno de los proyectos ms emblemticos de la Universidad Tecnolgica de Len (UTL). Su nombre
original: Campaa Universitaria de Proteccin al Ambiente (CUPA), ha sido heredado a travs de las generaciones de alumnos que han
estudiado dentro de la Universidad, ha sobrellevado los cambios organizacionales (tres rectores), ha sobrevivido al crecimiento de la
infraestructura, matrcula y profesores; al tiempo y a la falta de recursos (humanos, econmicos, entre otros). Ha crecido de ser un
proyecto llevado solamente por los alumnos de tecnologa ambiental a ser un proyecto que toda la Comunidad Universitaria empieza a
conocer y a adoptar como propio

Nombre

Ubicacin
/coordenadas GPS
21.064583,
-101.582469

CUPA, Universidad
Tecnolgica de Len

SITIO DE
MUESTREO

Imagen de mapa satelital

2. Evidencia fotogrfica del sitio

Fecha:30 de Junio del 2015
Hora:10:30 a.m.

Fecha:30 de Junio del 2015

Hora:10:35 a.m.

DATOS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR

1. Identificacin
Matriz ambiental:suelo
Hora de toma de muestra:10:30 a.m.
Hora de siembra: 11:00 a.m.
Punto de Muestreo (ubicacin /coordenadas GPS):
Tiempo de exposicin (aplica solo para muestra de aire)
21.064583, -101.582469
Nombre del/ los analistas que tomaron la muestra:Pia
Nombre del/ los analistas que sembr la muestra:Ramrez
Cardona Vctor Manuel
Snchez Andrs

2.Parmetros Fisicoqumicos
Color:Caf
Olor:Tierra hmeda

Temperatura (oC) ambiental: 27 oC

pH:5
Describir condiciones climatolgicas:Cielo despejado,
poca concentracin de nubes pero hmedo el suelo

3. Evidencia fotogrfica del sitio de toma de muestra

MICROBIOLOGA AMBIENTAL UTL

ASESORA:

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Justificacin del proceso para la identificacin bacteriana
Cada gnero de bacteria, de hongo, protozoo, etc., inclusive su especie, tienen diferentes reacciones cuando se les
enfrentan diferentes pruebas, esto se hace a partir de un cultivo puro, en este caso un hongo. Con estas pruebas
podremos decir casi con exactitud que gnero y que especie de hongo es.
Para la identificacin bacteriana en el laboratorio es importante sus caractersticas morfolgicas, la reaccin a la tincin de
Gram, agrupacin, morfologa colonial, reacciones metablicas como presencia de actividades enzimticas o reacciones
oxido-reduccin.
Debido a la interaccinmicrobiana se tienen una estabilidad ambiental, en este caso, trichoderma harzianum acta como
fungicida de hongos parsitos y provee de nutrientes a otros microorganismos con una simbiosis.

2. Dos medios de siembra (Nombre y Receta)

Agar Sabouraud

Agar dextrosa papa

Agar
Dextrosa
Infusin de papa

15 g
20 g
4g

Glucosa
Pluripeptona
Agar

40 g
10 g
15 g

Clorafenicol

0.05 g

Morfologa Colonial (Medio 1)

Descripcin
Es un hongo que posee estructuras del tipo de conidias
hialinas uniceluladas, ovoide en conidioforo hialino
largo no verticilado, nace en centros pequeos. Tiene
la capacidad de producir clamidosporas en sustratos
naturales, estructuras de vital importancia para la
sobrevivencia del gnero en el suelo bajo condiciones
adversas. Es saprofito del suelo y de la madera y el
crecimiento en el suelo es muy rpido.

Morfologa Colonial (Medio 2)

Descripcin
La mayora de las colonias de Trichoderma en su
inicio
tienen colorblanco,
que
se
tornan
a verde oscuro o amarillento, con esporulacin
densa. El micelio es raro en su mayora, y visto
al microscopio es
fino,
los conidiforos son
ramificados, parecen un rbol pequeo. Los mismos
se presentan como penachos compactados que
forman anillos con un sistema de ramas irregular de
manera piramidal.

Imagen

Imagen

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ASESORA:

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3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y receta)

Agar rosa bengala

Agar dextrosa papa

Agar
Dextrosa
Infusin de papa

15 g
20 g
4g

Morfologa Colonial (Medio 1)

Descripcin
Las colonias se muestran rizoides, pulvinada y
filamentosas color verde rodeadas de un halo color
blanco.

Imagen

Dextrosa
Peptona
Fosfato de potasio
Sulfato de magnesio
Cloranfenicol
Rosa bengala
Agar bacteriolgico

10 g
5g
1g
0.5 g
0.1 g
0.05 g
15 g

Morfologa Colonial (Medio 2)

Descripcin
Colonia ampliamente distribuida por el medio,
filamentosa color blanco-marrn y con halos
detectables parecidos a un espiral.

Imagen

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ASESORA:

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4. Procedimiento de Aislamiento
(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)
Materiales/Reactivos/Medios de cultivo/ Equipo a utilizar
Materiales y equipo:
1 parrilla de calentamiento
1 agitador de vidrio
2 matraces Erlenmeyer 250 mL
2 vasos de precipitado 250 mL
2 cajas Petri

Medios de cultivo y reactivos

Agar dextrosa papa
cido tartrico

2 charolas de pesado
1 esptula
Equipo para esterilizacin
Agua destilada

Preparacin de medios de cultivo:

Se pesan 2.77 g de medio agar dextrosa papa en 70 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
hasta una dilucin considerable. Se calienta en la parrilla y se deja hervir por un minuto. Se hace un tapn para
el matraz y se esteriliza por 15 minutos a una presin de 15 psi. Despus, el contenido se vierte a dos cajas Petri
en cantidades de 35 mL en cada una (aproximadamente) y se agrega 1 mL al agar ya servido en las cajas. Se deja
solidificar.
Para cido tartrico:
Pesar 0.98 g de cido tartrico y disolver en 70 mL de agua desionizada. Esterilizar por 15 min a una presin de
15 psi

Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, seleccin de la colonia y resiembra):

Siembra:
La muestra se recolect se le introduce el asa, previamente esterilizada en el mechero, al centro. La muestra en
el asa se distribuy en uno de los 2 medios en siembra por estriado, identificando la mitad del medio.se incuba
a una temperatura de 37 5 de 2 a 5 das.
Seleccin de la colonia:
Despus de ver crecimiento en la placa, se selecciona una colonia con las caractersticas previstas (colonias
verdes con un halo blanco a su alrededor).
Resiembra:
Con el asa, previamente esterilizada en mechero, se toma una fraccin de la colonia identificada. En la otra caja
con medio se realiza la siembra por estriado nuevamente para la aislacinde las colonias despus de la
incubacin. Se incuba a una temperatura de 37 5 de 2 a 5 das y se observa el crecimiento despus de este
tiempo.

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ASESORA:

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5. Esquema del Perfil bioqumico (metablico )

para la identificacin del microorganismo seleccionado
HONGO A IDENTIFICAR
casena
-

hidrlisis de almidn
+

prueba de indol
+

prueba de movilidad
-

catalasa
+

citrasa
+

tincin de Gram
+

cpsula
+

produccin de gas, CO2

+

produccin de H2S
+

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ASESORA:

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RESULTADOS DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA)

2. MORFOLOGA COLONIAL OBSERVADA

Tipo de colonia 1: Descripcin
Colonia sealada en la imagen. Una colonia negruzca, filamentosa
y muy uniforme en su desplazamiento en el medio.

FOTO 1

Tipo de colonia 2: Descripcin

La segunda era una colonia puntiforme color amarillo claro, muy
separada a las dems. Plana y de desplazamiento tardado

FOTO 2

Tipo de colonia 3: Descripcin

La tercera era una colonia color verde claro, difuminada,
filamentosa y rizoide. Este hongoes el indicado para el aislamiento.

FOTO 3

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ASESORA:

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3. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO PURO ( RESIEMBRA)

FOTO 1
Medio de cultivo Agar dextrosa papa

Colonia que se seleccion para resiembra

FOTO 2
Medio de cultivo Agar dextrosa papa

Colonia resembrada

4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA

FOTO 1
Descripcin

La resiembra se realiz en el agar de dextrosa

papa y se observ que el crecimiento fue
favorable para el hongo a la temperatura de
37C.
La propagacin del hongo fue acorde al estriado
mostrndose colonias blancas con una leve
tonalidad verde en el centro de la lnea que
denotaba la presencia del hongo que se
buscaba.
Aun no estaba en una etapa mayor, as que se
volvi a incubar a la temperatura ya
mencionada para que creciese un poco ms.

FOTO 2

FOTO 3

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ASESORA:

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5. EVIDENCIA FOTOGRFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUMICO

Nombre de la
prueba

1.-Prueba de
casena

Medio de cultivo
utilizado

Agar leche
descremada

Resultado obtenido
(positivo/negativo)

Evidencia fotogrfica

Negativo (-)

Fundamento de la prueba
Las proteasas son excretadas al medio para la degradacin de protenas, la casena es la protena de la leche que le
da el color blanco, cuando la casena es hidrolizada por las proteasas o enzimas que degradan esta protena, desaparecer
el color blanco alrededor del crecimiento bacteriano.

C43H64N10O12 + CASEINASA AMINOACIDOS + PEPTIDOS + CO2 + H20

2.- Hidrlisis de
almidn

Agar mtodos
estndar y
almidn

Negativo (-)

Fundamento de la prueba
El almidn se constituye principalmente por amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amiolticas hidrolizan almidn y sus
productos. El lugol con el almidn forman un complejo color caf-prpura que desaparece cuando el almidn ha sido
degradado

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ASESORA:

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Agua peptonada

Negativo (-)

3.-prueba de indol

Fundamento de la prueba
Es una prueba realizada en microorganismos para determinar la habilidad de romper el indol del aminocido
triptfano. Es realizado por la enzima que se llama con frecuencia triptofanasa. Los resultados positivos se
muestran por la presencia de un color rojo en la superficie de la capa de alcohol en el cultivo despus de
agregar el reactivo de kovac.
Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la molcula intermediaria cido
indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la reaccin de desaminacin, durante el cual se remueve el
grupo amino (NH2) de la molcula de triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol, cido
pirvico, amonaco (NH3) y energa. Comocoenzima de la reaccin se requiere al fosfato de piridoxal.

Medio SIM

Negativo (-)

4.-Prueba de
movilidad

Fundamento de la prueba

El medio de cultivo tiene consistencia semislida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del
microorganismo en todo el tubo, ms all de la zona de inoculacin se detectara por la presencia de turbidez
alrededor del punto de inoculacin (picadura). Los microorganismos inmviles solo crecern en la zona
inoculada, mientras que los organismos con la capacidad de motilidad se recorrern en el medio.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms all de la lnea
de inoculacin. Esto se debe a la presencia de flagelos que le permiten desplazarse por el medio en busca de
alimento. Puede ser en medio aerbico o anaerbico.

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ASESORA:

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5.-prueba de
catalasa

Portaobjetos y
agua oxigenada

Positivo (+)

Fundamento de la prueba
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y en algunos casos, los hongos. Descompone el
perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxgeno indica que la prueba
es positiva.

H2O2 + catalasa -------------------H2O + O2

6.- Prueba de
citrasa

Agar citrato de
Simmons

Negativo (-)

Fundamento de la prueba

Se determina la utilizacin del citrato como nica fuente de carbono y energa. El citrato permeasa permite el
transporte de citrato al interior de las clulas y la enzima Citrasa convierte el citrato en acidooxalacetico y acetato,
productos que son convertidos enzimticamente en cido pirvico y CO2. El CO2 liberado se combina con el sodio y agua y
forman carbonato de sodio que es alcalino cambiando el bromotimol de verde a azul intenso.
C6H5O7-3 + Citrasa C4H5O5 + C2H30 C3H4O3 + CO2
CO2 + H2O + Na CO3-2

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ASESORA:

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Positivo (+)
7.- tincin de Gram

Fundamento de la prueba
Es un tipo de tincin diferencial empleado en la microbiologa para la visualizacin de microorganismos y su morfologa. El
cristal violeta (colorante catinico) penetras en todas las clulas bacterianas (tanto Gram negativas como positivas) a
travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por Yodo en equilibrio con yoduro de potasio y agua
destilada los cuales estn presentes para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije
con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El yodo entra en las clulas y forman un complejo insoluble en
solucin acuosa con el cristal violeta. El alcohol decolora el complejo, las Gram positivas no se decoloran. Ya que todo
depende de su pared celular, si esta es sana ser Gram positivo.

8.- prueba de
cpsula

Tinta china o
henna

Negativo (-)

Fundamento de la prueba

La cpsula es una cubierta de grosor vartiable formada habitualmente por unidades de polisacridos, protenas
o ambos. Si est bien estructurada y se encuentra bien adherida a la clula, se le denomina cpsula; si por el
contrario, tiene estructura mal definida y su adhesin es dbil, se le conoce como glicoclix. De acuerdo a su
estructura qumica, puede ser flexible o rgida. La rigidez le confiere la caracterstica de una matriz
impermeable. Determina la adhesin a superficies (biopelculas), constituye una barrera de proteccin contra la
fagocitosis y los anticuerpos e impide la desecacin y la accin de otros agentes.

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ASESORA:

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Caldo lactosado

Negativo (-)

9.-Prueba
produccin de gas

Fundamento de la prueba
El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrgeno mientras que la lactosa es el hidrato de carbono a
fermentable. Por la fermentacin de la lactosa se produce cido y gases (H2,CH4 y CO2 loscuales se evidencian al utilizar
campanas Durham).

C6H12O6 C3H4O3 + NADH + H+ C3H3O3 + CO2

10.-prueba
produccin de
cido sulfhdrico

Agar triple azcar

hierro (TSI)

Negativo (-)

Fundamento de la prueba

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona aportan los nutrientes adecuadas para el
desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de
sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sustrato de hierro y amonio, es la
fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfato de hierro, color negro.
Si produce cido sulfhdrico (debido a la reduccin de las sales de hierro), se presentar un ennegrecimiento del
tubo. La produccin de sulfhdrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentacin de la
glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa.
SO4 2 + ATP + 2H+ ---- APS + Ppi
APS + 2e- + 2H+ -------> HSO3 - + AMP
HSO3 - + 6e- + 2H+ ---- HS- + H2O
ATP sulfurilasa

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IDENTIFICACIN DEL MICROORGANISMO AMBIENTAL

EN LA MATRIZ DE ESTUDIO: _________________suelo______________________
1.- Nombre cientfico del o los microorganismo identificado de acuerdo a los resultados
del perfil bioqumico planteado ( gnero y especie)
Trichoderma harzianum

2. Taxonoma del o los microorganismo identificados

Reino: Fungi
Divisin: Ascomycota
Subdivisin: Pezizomycotina
Clase: Sordariomycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Hypocreaceae
Gnero: Trichoderma
Especie: T. harzianum

3. Caractersticas generales
La mayora de las Trichoderma no tienen un periodo sexual simplemente producen esporas asexuales. Sin
embargo a unas pocas lneas de Trichoderma si se les conoce un periodo sexual pero no entre las lneas que
se usan en el control biolgico.
Mientras que las cepas silvestres son muy adaptables y pueden ser heterocariticas (contienen ncleos
genotipicamente distintos en un mismo organismo), las cepas usadas en control biolgico en agricultura son,
o deben ser, homocariticas (todos los ncleos son genticamente similares o idnticos).

4. Ciclo(s) biogeoqumicos en el(los) que intervienen

Ciclo del Nitrgeno
Ciclo del Carbono
5. La funcin que juegan en la transformacin de la materia orgnica a travs
de los ciclos biogeoqumicos

Segn Nalk et al, ayuda a la disminucin de agentes patgenos, ayudan a la fijacin de nitrgeno en plantas,
estimulando el crecimiento en algunos tipos de plantas y rboles, como la vainilla, por ejemplo.
Cada microorganismo cumple una funcin importante en los ciclos biogeoqumicos. Uno de ellos es el hongo
Trichoderma harzianum, el cual est presente en suelos de cultivos, pastizales, etc.
Se ha comprobado que no cumple con muchas funciones metablicas como la degradacin de casena,
produccin de indol, incluso si poda vivir del citrato como nica fuente de carbono.
La interaccin que realiza dentro de la matriz del suelo suele ser utilizada por agricultores en sus campos
para la eliminacin de hongos, como e Botrytis, Fusarium y Penicillium sp,que le sean dainos al cultivo que
se tenga.

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6. Conclusin parcial sobre las interacciones bacterianas en la matriz estudiada y la importancia de la

microbiologa en el rea ambiental
Como conclusin del presente proyecto ,conocimos que los microorganismos son los componentes ms
importantes del suelo. Constituyen su parte viva y son los responsables de la dinmica de transformacin y
desarrollo. La diversidad de microorganismos que se encuentran en una fraccin de suelo cumplen funciones
determinantes en la transformacin de los componentes orgnicos e inorgnicos que se le incorporan. Esto
permite comprender su importancia en la nutricin de las plantas al efectuar procesos de transformacin
hasta elementos que pueden ser asimilados por sus races. La humificacin de la materia orgnica es un
proceso netamente microbiolgico.
Tambinal investigar y aislar elTrichoderma spp. aprendimos que son hongos los cuales estn presentes en
casi todos los suelos. Normalmente son los hongos con mayor presencia en ellos.
Trichoderma coloniza rpidamente las races de las plantas Trichoderma spp. tambin ataca, parasita y/o se
alimenta de otros hongos.
ste ha desarrollado numerosos mecanismos para atacar a otros hongos y a la vez mejorar el crecimiento de
las races de las plantas. Sin embargo la mayora de las cepas son ms efectivas contra un hongo patgeno
que otro y ser tambin no efectivos en un gran nmero de hongos.
Gracias a loaprendido en el curso de microbiologa ambiental pudimos realizar varias de las pruebas
bioqumicas necesarias para la clasificacin del hongo en cuestin, al igual que identificar su funcin dentro
de los ciclos biogeoqumicos que, tienen una gran importancia para el correcto funcionamiento del
ambiente.
Adquirimos conocimientos acerca de los mtodos utilizados para las pruebas usadas en este trabajo que
pueden ser aplicadas para el reconocimiento o el aislamiento en cualquier microorganismo o bien, si no son
los mismos mtodos, se asemejan a los diferentes existentes y as facilitar el aprendizaje de nuevos mtodos
y abrir espacio a conocimientos ms elaborados.

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ASESORA:

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