Determinacin espectrofotomtrica de la protena Albmina srica bovina en

una muestra problema utilizando el mtodo de Lowry

Garca Hernndez Jenie M.; Gutirrez Acevedo Naxhielli; Leyva Arteaga Daniela
Fernanda; Martnez Heredia Mariana; Meraz Rodrguez Marco Antonio.
Departamento de Biologa, Facultad de Qumica, Universidad Nacional Autnoma de
Mxico

Resumen
La espectroscopa UV-visible es una tcnica de anlisis basada en la absorcin de radiacin por
parte de las molculas en funcin de la cantidad de sustancia presente, descrita en la ecuacin de
Lambert y Beer. Esta tcnica se aplica en el campo de bioqumica para la determinacin de
protenas y otras biomolculas. El mtodo espectrofotomtrico propuesto por Lowry es til para
determinar la cantidad de protenas de tipo fenlicas presentes en una muestra puesto que en
condiciones alcalinas, el in cobre divalente es reducido en los enlaces peptdicos. Este cobre
reducido junto con los grupos radicales de la tirosina, triptfano y cistena reaccionan con el
reactivo de Foln para producir un producto de color azul que puede ser ledo por un
espectrofotmetro en la regin visible del espectro. Dos muestras problemas A y B fueron
analizadas con este mtodo dando como resultado 0.343954802 g ASB/L y 0.329039548 g
ASB/L respectivamente, muy aproximado a la concentracin real de 0.33 g/L. Dicha
determinacin se realiz a partir de una curva de calibracin de Albmina Srica Bovina.

Introduccin
La cuantificacin de protenas en solucin es una tcnica importante en la vida de todo qumico y
una prctica rutinaria en bioqumica experimental y en laboratorios de investigacin cientfica. Los
ensayos de cuantificacin de protenas por medio de mtodos espectroscpicos son aquellos que
utilizan radiacin UV y visible para determinar rpidamente la concentracin o cantidad de protena,
relativo a un patrn.
La espectroscopia es una rama de la ciencia que comprende todos aquellos fenmenos de
absorcin y emisin de radiacin por parte de la materia. Existen varias espectroscopias, por
ejemplo: microondas, IR, electrnica, rayos X y de emisin. stas se clasifican de la siguiente
manera:
-Por una reaccin qumica.
-Por absorcin de radiacin.
- Mediante el paso de una corriente elctrica.
-Aplicacin de campos magnticos.

En un espectro de absorcin, la radiacin procede de una fuente de radiacin, si sta es

descompuesta en diferentes frecuencias con ayuda de un monocromador entonces podemos
seleccionar una longitud de onda deseada.
Cuando la radiacin pasa a travs de una celda que contiene todo excepto el analito que queremos
cuantificar, se obtiene el espectro de referencia F 0.

Cuando se interpone en el paso ptico de la radiacin el analito a ser cuantificado, se obtiene el

espectro F. En este espectro puede observarse que la seal disminuye, debido a la absorcin
molecular. A la relacin entre la intensidad de radiacin de salida, F, y la intensidad de radiacin de
entrada, F0, se le conoce como transmitancia. La absorbancia se define como log (T)
En un medio homogneo en el que la densidad molecular sea constante, se comprueba que la
absorbancia es proporcional a la concentracin y a la longitud del paso ptico que atraviesa la
muestra: A=elC donde C es la concentracin y es una constante de proporcionalidad
denominada absortibidad molar (especfico para cada sustancia) y l (longitud de paso ptico) en
cm. A la ecuacin anterior se le conoce como Ley de Lambert-Beer.
Si l se mantiene constante, la absorbancia resulta linealmente relacionada con la concentracin y
se usa en las curvas patrones de concentracin. Con la ayuda de tales curvas se puede determinar
fcilmente la concentracin de una muestra problema.
El mtodo de Lowry es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de protenas. A la
muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la
intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer.
Este mtodo consta de dos etapas: Los iones Cu 2+, en medio alcalino, se unen a las protenas
formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cuprotena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura
tridimensional de la protena, exponindose los residuos fenlicos de tirosina que participan en la
segunda etapa de la reaccin.
La reduccin en medio bsico del reactivo de Folin es provocada por los grupos fenlicos de los
residuos de tirosina (presentes en la mayora de las protenas), actuando el cobre como
catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin es el cido fosfomolibdotngstico, de
color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul
intenso. Esta reaccin nos permite hacer una relacin directa entre la cantidad de color azul
producido con la cantidad de protena presente en la muestra.
La BSA es una protena ampliamente utilizada en la industria biomdica. Muy soluble en agua y su
punto isoelctrico es de 4,78. Su peso molecular es de 66,430 kD. Es una cadena polipptidica
simple, constituida por 583 aminocidos residuales, entre ellos tirosina y triptfano (fenlicos).
Con base en esta informacin, en este trabajo se cuantific la cantidad de albmina srica bovina
contenida en una muestra problema a travs de la elaboracin de una curva patrn utilizando como
referencia albmina srica bovina (0.1 mg/ml). Con base al mtodo de Lowry y a la ley de LambertBeer, la concentracin de la muestra problema debe encontrarse dentro de la curva de calibracin
y su concentracin puede ser correctamente determinada a partir de la ecuacin de la curva de
calibracin.

Objetivos

Conocer el mtodo de micro pipetas y espectofotmetro.

Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena.
Construir curvas de calibracin y comprender su importancia.
Calcular la cantidad de protena presente en una muestra desconocida.
Aplicar la ecuacin de Lambert y Beer a un problema experimental.
Utilizar correctamente micropipetas y el espectofotmetro.
Llevar a cabo correctamente el mtodo de Lowry.

Materiales y mtodos

Resultados

Tabla 1.
Registro de la absorbancia obtenida de diferentes volmenes de ASB (1g/L). Cantidad de
protena presente en cada volumen de BSA y alcuota preparada para la curva patrn en
correlacin con el espectro UV-visible con el mtodo de Lowry.
Volumen BSA (uL)

Absorbancia (750 nm)

Cantidad (ug)

0.257

10

0.303

10

15

0.36

15

20

0.467

20

25

0.53

25

30

0.608

30

35

0.701

35

0.245

8.59

0.384

16.45

muestra problema
(25)
muestra problema
(50)

0.8
0.7
0.7

f(x) = 0.02x + 0.09

R = 0.95

0.61

0.6

0.53
0.47

0.5

Absorbancia

0.38
0.36

0.4

Curva patrn
Linear (Curva patrn)

0.3
0.3

Muestra problema 25 uL

0.260.25

Muestra problema 50 uL

0.2
0.1
0
0

10

15

20

25

30

35

40

Cantidad de BSA (ug)

Fig 1. Curva patrn de Albmina Srica Bovina 0.1 mg/mL a diferentes cantidades para el mtodo
espectroscpico de Lowry. Se muestran adems los puntos correspondientes a las muestras
problemas. Estos puntos se encuentran dentro de la curva de calibracin y puede determinarse su
cantidad en la muestra problema. Se encuentra en la esquina superior la ecuacin que describe la
curva de calibracin y el coeficiente de correlacin de 0.95.

Tabla 2.
Absorbancia obtenida para el clculo de la cantidad de protena de la muestra problema.
Volumen de la muestra problema (uL)
25
50
Clculos

0.2450.0928
= 8.598 ug
0.0177 u g
0.3840.0928
= 16.451 ug
0.0177 u g

Absorbancia (750 nm)

0.245
0.384

8.598 ug/25 uL= 0.3439 ug/uL = 0.3439 mg/mL

16.45 ug/50 uL = 0.3290 ug/uL = 0.3439 mg/mL

Concentracin final en el Stock

0.3439 mg/mL

=
( 31 mL
mL )

1.031 mg/mL

3 mL
0.3290 mg/mL 1mL ) = 0.9871 mg/mL

Discusin

Conclusin

Cuestionario
1. Investiga qu factores contribuyen en la desviacin de la lnea recta al graficar la absorbancia
contra concentracin (desviaciones a la ley de Beer).

Empleo de luz no monocromtica, es decir, que la luz que penetra en la solucin contiene
radiaciones de longitudes de onda diversas comprendida dentro de un cierto intervalo. Si
este intervalo es muy amplio, el haz luminoso contendr cuantos que atravesarn la
solucin ms fcilmente que otros.
Asociacin o disociacin de las especies absorbentes de la luz provocando que la
concentracin de la sustancia absorbente no aumente o disminuya proporcionalmente a la
concentracin total.
Adicin insuficiente de reactivo cromgeno.
Disoluciones concentradas o diluidas
Variaciones en el ndice de refraccin, por ejemplo: material ptico inadecuado, celdas mal
colocadas y/o sucias, absorcin por reflexin de la luz incidente.
Problemas con las fuentes de luz, por ejemplo: Lmparas fundidas o gastadas, paso ptico
bloqueado y variaciones altas de voltaje.
Fluorescencia y turbidez debido a la disminucin de absorbancia por radiacin emitida o
aumento de absorbancia por partculas en suspensin

2. Cules son los principales mtodos colorimtricos usados en la determinacin de protenas?

El mtodo de Biuret, BCA (cido bicinconnico), Bradford y Lowry.
3. Qu sustancias pueden interferir con la determinacin de protenas por el mtodo de Lowry?
4. Investiga cul de los siguientes mtodos es ms sensible y menos costoso para determinar la
concentracin de protenas de una muestra: Lowry, Absorbancias 280 nm y Bradford.

5. De acuerdo con tus resultados, cul es el intervalo en el que se podra determinar la

concentracin de una protena en una muestra utilizando la curva estndar de determinacin de
protenas por Lowry? Da una explicacin.
Debido a que presenta una mayor linealidad en la curva obtenida, se considera que el intervalo
entre 15 y 35 g es el mejor para la determinacin, es decir, empleando una concentracin de
protena entre 0.0125mg/mL y 0.02916mg/mL.
6. Cules son las aplicaciones de una curva de calibracin o estndar?

Determinacin de la concentracin de diferentes analitos de inters , entre las cuales

pueden encontrarse protenas, carbohidratos y lpidos.
Monitoreo de cinticas enzimticas.
Determinacin de constantes de equilibrio
Caracterizacin de la estequiometra de un complejo metal-ligando

ANEXO CUESTIONARIO 1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA PARTE I:

REPORTE CIENTFICO
1.

Qu finalidad persigue el cientfico al escribir y publicar un artculo cientfico?

2.

Investiga cmo se lleva a cabo el diseo de un experimento e incluye qu son las variables
independientes, las dependientes y las del control?
Se lleva a cabo considerando ciertos requisitos mnimos:
Debe poder comprobar las hiptesis objeto de estudio,
- Debe poder revelar la existencia de cualquier causa importante de variacin, aunque no haya
sido adelantada como hiptesis.
- Debe mantener los costes de experimentacin a un nivel razonable, en comparacin con el
problema objeto de estudio.
- Debe tener un alto grado de seguridad en las respuestas.
- Si el Experimento se realiza en un laboratorio, ste ha de ser, respecto a las variables estudiadas,
un buen indicador de las pruebas que se obtendran en el taller o "in situ".

- Si el Experimento se realiza durante el desarrollo normal del proceso en estudio, se tendr

adems cuidado de interferir lo menos posible en el trabajo normal y protegerse de las
interferencias no autorizadas o involuntarias en la prueba por parte del personal adepto.

Variable independiente (VI) : es la variable que el investigador mide, manipula o selecciona para
determinar su relacin con el fenmeno(s) observado. Puede tener su origen en el sujeto o su
entorno. Es la variable que el investigador manipula para ver los efectos que produce en otra
variable.

Variable dependiente (VD): es el factor que el investigador observa o mide para determinar el
efecto de la variable independiente o variable causa. Es la variable respuesta, es decir, es el
comportamiento resultante de un organismo que ha sido estimulado. Es el factor que aparece,
desaparece, vara, etc. Como concecuencia de la manipulacin de la variable independiente.

Variable control (VC): Aquella que el investigador controla con el fin de eliminar o neutralizar sus
efectos en la variable dependiente.

3.

Qu estructura debe tener una hiptesis?

Cuando se construye una hiptesis de trabajo lo importante no es que explique el proceso
verdicamente (en la etapa inicial, esta faceta interesa poco al investigador), sino que proporcione
datos que permitan seguir analizando este proceso, que le ayude a encausar el pensamiento hacia
un estudio ms detallado y profundo del objeto observado. La hiptesis de trabajo es una
estructura totalmente provisional, una de las armas posibles y necesarias del investigador, que
puede admitirse y desecharse en consonancia con las necesidades que presente la investigacin
del objeto.

4.

Cules son las secciones de un reporte cientfico?

Ttulo, autores, resumen, palabras clave, introduccin, material y mtodo, resultados, discusin,
conclusin, referencias, agradecimientos.

5.

Qu diferencia(s) hay entre la seccin de resultados y la discusin?

Que en la seccin de resultados se exponen los datos obtenidos a lo largo del experimento y en la
discusin se explica lo que significan al comparar, justificar e interpretar estos datos

6.

Qu informacin bibliogrfica deben contener las referencias, si son libros, artculos o catlogos o
pginas de internet?