Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco
Review: Beer Production: Spoilage
Microorganisms and Detection Methods
AUTORES
AUTHORS
Giuliano DRAGONE
Universidade do Minho
Departamento de Engenharia Biolgica
Campus de Gualtar
CEP: 4710-057
Braga, Portugal
e-mail: gdragone@deb.uminho.pt

Solange Ins MUSSATTO

Universidade do Minho
Departamento de Engenharia Biolgica
e-mail: solange@deb.uminho.pt

Alvaro Dertinate NOGUEIRA

Servio Nacional de Aprendizagem Industrial (SENAI)
Centro de Tecnologia de Alimentos e Bebidas
e-mail: adnogueira@alimentos.senai.br

Joo Batista de ALMEIDA e SILVA

Universidade de So Paulo (USP)
Escola de Engenharia de Lorena
Departamento de Biotecnologia
e-mail: joaobatista@debiq.eel.usp.br

RESUMO
A cerveja uma bebida que apresenta caractersticas desfavorveis para a
multiplicao de vrios microrganismos, sendo reconhecida como um produto de
considervel estabilidade microbiolgica. Porm, algumas espcies de microrganismos,
incluindo bactrias Gram-positivas (Lactobacillus e Pediococcus), Gram-negativas
(Pectinatus e Megasphaera) e leveduras selvagens (Saccharomyces e no-Saccharomyces)
so capazes de se multiplicar nesta bebida, conferindo caractersticas indesejveis, tais
como turbidez e mudanas sensoriais, as quais prejudicam a qualidade do produto final.
Este fato tem motivado uma srie de pesquisas visando ao desenvolvimento de mtodos
rpidos e especficos para a deteco dos microrganismos deteriorantes da cerveja.
Apesar de a deteco desses microrganismos, por cultivo em meios de laboratrio, nem
sempre proporcionar a especificidade e sensibilidade requerida, o uso de diferentes meios
seletivos e condies de incubao continua sendo o mtodo preferido pelas cervejarias.
O presente artigo apresenta uma reviso da literatura sobre os principais microrganismos
deteriorantes da cerveja, incluindo as causas que favorecem sua multiplicao e os
mtodos que podem ser empregados para sua deteco.

SUMMARY

PALAVRAS-CHAVE

Beer is a beverage that presents unfavourable features for the growth of several
microorganisms, being recognized as a product of considerable microbiological stability.
However, some species of microorganisms, including Gram-positive (Lactobacillus and
Pediococcus) and Gram-negative bacteria (Pectinatus and Megasphaera) and wild yeasts
(Saccharomyces and non-Saccharomyces) are able to grow in this beverage, providing
undesirable characteristics, such as turbidity and sensory changes, which damage the
quality of the final product. This fact has motivated a number of research projects aiming
at the development of fast and specific methods for the detection of beer spoilage
microorganisms. Although the detection of these microorganisms by cultivation in
laboratory media does not always provide the required specificity and sensibility, the
use of different selective media and incubation conditions still represent the method
preferred by breweries. The present article is a literature review about the main beer
spoilage microorganisms, including the causes that favour their growth and the methods
that can be used for their detection.

KEY WORDS
Bebida; Contaminao; Bactrias Gram-positivas;
Bactrias Gram-negativas; Leveduras selvagens.
Beverage; Contamination; Gram-positive bacteria;
Gram-negative bacteria; Wild yeasts.

Autor Correspondente
Corresponding Author

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

240

Recebido/Received: 30/03/2007. Aprovado/Approved: 18/02/2008.

DRAGONE, G. et al.

1. INTRODUO
Durante sculos a cerveja tem sido reconhecida como uma
bebida de singular estabilidade microbiolgica. De fato, diversos
fatores contribuem para que a cerveja seja um meio desfavorvel
para a multiplicao de vrios microrganismos, os quais incluem:
a) presena de etanol (0,5 a 10% p/p, equivalente a aproximadamente 0,6 a 12,3%v/v) e de compostos do lpulo (17 a 55 ppm
de iso--cidos); b) elevada concentrao de dixido de carbono
(aproximadamente 0,5% p/p); c) baixo valor de pH (3,8 a 4,7) e
d)reduzida concentrao de oxignio (<0,1 ppm). Apesar dessas
caractersticas desfavorveis, alguns microrganismos ainda conseguem se multiplicar nessas condies e a presena destes (tambm
chamados de microrganismos deteriorantes da cerveja) na cerveja
pode causar alteraes, tais como aumento da turbidez e desagradveis mudanas sensoriais, as quais afetam negativamente a qualidade
do produto final (SUZUKI et al., 2006a; SAKAMOTO e KONINGS,
2003). Desta forma, os problemas causados pela contaminao
da cerveja provocam no somente grandes prejuzos econmicos,
com a retirada dos produtos do mercado, mas tambm perda de
confiana do consumidor, estes podem levar falncia da empresa.
Por esse motivo, a contaminao da cerveja uma das principais
preocupaes das indstrias cervejeiras no mundo inteiro (IIJIMA
et al., 2007).
Alguns microrganismos tm sido relatados como deteriorantes da cer veja, incluindo bactrias Gram-positivas e

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

Gram-negativas e leveduras selvagens. Dentre as bactrias Grampositivas encontram-se as bactrias cido lcticas pertencentes aos
gneros Lactobacillus e Pediococcus, as quais so consideradas
como as mais perigosas nas cervejarias modernas. Dentre as
bactrias Gram-negativas encontram-se as dos gneros Pectinatus
e Megasphaera. Por serem anaerbias estritas, o risco de contaminao por estes dois gneros de bactrias tem aumentado com o
aumento da produo de cervejas no pasteurizadas e flash pasteurizadas, aliado melhora da tecnologia de engarrafamento, que tem
resultado numa significativa reduo da concentrao de oxignio
no produto final (VAUGHAN et al., 2005; CHIHIB e THOLOZAN,
1999; JESPERSEN e JAKOBSEN, 1996). Com relao s leveduras
selvagens, as do gnero Saccharomyces destacam-se como as
responsveis pelos maiores problemas de deteriorao das cervejas
por leveduras, sendo ainda de difcil deteco pelas similaridades
que apresentam com as leveduras cervejeiras (BOULTON e QUAIN,
2006; BRIGGS et al., 2004; LEWIS e YOUNG, 1995).
Em uma cervejaria so vrios os pontos onde pode ocorrer
contaminao microbiana, os quais incluem desde a matria-prima
utilizada at as condies ambientais e o contato humano (BACK,
1994a). A Figura 1 mostra um esquema dos principais pontos de
contaminao no processo de elaborao da cerveja. As matriasprimas, tais como malte, lpulo e gua, e os tanques da sala de
preparo do mosto (sala de brassagem) so potenciais pontos de
contaminao microbiana. As garrafas e barris que retornam do

Moagem

Preparo do mosto

Malte* e gua*

Lpulo*

*
Malte modo

Mosturao

Clarificao,
aerao* e
resfriamento
do mosto

Fervura do
mosto

Filtrao

Leveduras*

Estabilizao biolgica/envasamento
Pasteurizador flash
(trocador de placas)

Barris*

*
*

Filtrao

Fermentao
Maturao

Garrafas e latas
*

Pasteurizador de tnel

Enchedora

FIGURA 1. Principais pontos de contaminao por microrganismos (*) no processo de elaborao da cerveja (modificado de VAUGHAN etal.,
2005).

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

241

DRAGONE, G. et al.

comrcio tambm podem apresentar elevada contaminao, pois

geralmente contm pequenas quantidades de cerveja onde pode
ter ocorrido multiplicao microbiana durante longos perodos de
tempo. No entanto, todos os pontos de contato com garrafas limpas
ou cheias, porm destampadas, tambm so possveis fontes de
contaminao. Microrganismos presentes no ar podem contaminar
a cerveja na sala de envasamento durante o transporte das garrafas
vazias, desde a lavadora de garrafas at a enchedora e a partir da
enchedora at o local onde a garrafa tampada (VAUGHAN etal.,
2005).
No mundo todo, considerveis esforos tm sido realizados
para desenvolver mtodos de deteco e identificao de microrganismos deteriorantes da cerveja. Contudo, o mtodo mais utilizado
na atualidade continua sendo a tradicional incubao em meios de
cultura (MARCH et al., 2005). Usualmente, esse mtodo demora
uma semana ou mais para que as bactrias formem colnias visveis
nas placas ou para que aumentem a turbidez nos caldos nutritivos.
Conseqentemente, muitas vezes os produtos so vendidos antes
que os resultados microbiolgicos estejam disponveis. No caso
de alguma bactria deteriorante ser detectada e identificada no
produto, este precisar ser recolhido do mercado, causando srios
prejuzos comerciais s cervejarias. Por este motivo, as pesquisas
tm se concentrado no desenvolvimento de mtodos rpidos e
especficos para a deteco dos microrganismos contaminantes da
cerveja (SAKAMOTO e KONINGS, 2003).
Nos ltimos anos, a indstria cervejeira tem presenciado
o desenvolvimento de vrios mtodos rpidos para deteco dos
microrganismos deteriorantes da cerveja. Esses mtodos incluem
tcnicas de bioluminescncia, tcnicas de filtro com epifluorescncia
direta (DEFT), imunoanlises, uso de turbidimetria automatizada,
medidas de impedncia ou condutncia, citometria de fluxo,
eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), assim como diversos
mtodos incluindo tecnologias de DNA, tais como a reao em
cadeia da polimerase (PCR) e tcnicas de hibridao do DNA (PRIEST,
2006; RUSSELL e DOWHANICK, 1999). Entretanto, esses mtodos
ainda no foram adotados pela maioria das cervejarias por diferentes
motivos, principalmente devido falta de sensibilidade e especificidade, ou necessidade de custosos equipamentos e reagentes e
de pessoal qualificado (HUHTAMELLA et al., 2007).

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

com baixas concentraes de oxignio, e com o aprimoramento

das tcnicas microbiolgicas, novos microrganismos tm sido
isolados a partir de cervejas contaminadas (PRIEST, 1996). Felizmente, os microrganismos que so patognicos para os humanos,
tais como Salmonellae e Listeria, no sobrevivem na cerveja devido
s desfavorveis condies de multiplicao citadas anteriormente
(HOLLEROV e KUBIZNIAKOV, 2001). Como resultado disso, o
conjunto de microrganismos geralmente encontrado numa cervejaria relativamente menor quando comparado ao conjunto de
microrganismos encontrados nas indstrias farmacutica, ambiental,
de cosmticos ou de alimentos (RUSSELL e DOWHANICK, 1999).
As bactrias encontradas no processo de elaborao da
cerveja podem ser classificadas de acordo com sua forma, presena
ou no de flagelos, aspectos estruturais e caractersticas bioqumicas,
ou ainda atravs de tcnicas de colorao (BRIGGS et al., 2004;
HOUGH et al., 1982). Dentre estas tcnicas, uma das mais importantes e mais amplamente utilizadas em microbiologia o mtodo
de Gram, em que as bactrias so coradas e ento classificadas em
dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas (BOULTON e QUAIN,
2006; PELCZAR et al., 1980). A Tabela 1 lista diversas espcies de
bactrias Gram-positivas e Gram-negativas que tm sido encontradas nas cervejarias.
Alm da deteco de uma determinada espcie bacteriana
no processo de produo de cerveja, tambm necessrio identificar
se esse microrganismo ou no deteriorante do produto final. Vrias
cepas bacterianas tm mostrado manter suas viabilidades na cerveja
por longos perodos, mas por serem incapazes de se multiplicar no
produto no so prejudiciais e no devem ser consideradas como
deteriorantes da cerveja (VIZOSO PINTO et al., 2004).

O presente trabalho mostra uma reviso de literatura sobre

os principais microrganismos deteriorantes da cerveja, as causas que
favorecem a multiplicao destas espcies e os meios de cultura que
podem ser utilizados para deteco destes microrganismos.

Antes de 1990, o nico mtodo disponvel para avaliar o

potencial de deteriorao da cerveja por uma bactria era o denominado teste forado (forcing test), o qual consistia em reinocular
a bactria na cerveja ou em uma cerveja enriquecida com meio
nutriente concentrado. Este teste pouco prtico, pois requer
alguns meses para se obter resultados conclusivos. Alguns procedimentos mais rpidos tm sido ento desenvolvidos, e atualmente
a identificao de uma determinada cepa j pode ser realizada a
partir da anlise do genoma. Nesses mtodos, o gentipo de uma
nova cepa detectada comparado com o gentipo de cada cepa
deteriorante da cerveja, este previamente registrado em uma base
de dados. Atravs destas tcnicas so obtidas importantes informaes (SAKAMOTO e KONINGS, 2003), porm no conclusivas,
sendo necessrio realizar tambm o teste forado.

2. BACTRIAS DETERIORANTES DA CERVEJA

2.1 Bactrias Gram-positivas

Durante a fermentao do mosto cervejeiro, observa-se

que o pH do meio reduzido de aproximadamente 5,3 para cerca
de 4,1, j as concentraes de acares, aminocidos e vitaminas
diminuem substancialmente, e a concentrao de etanol produzido
aumenta at atingir 3,8 a 5,1% (v/v). Estas caractersticas fazem
da cerveja um meio pouco adequado para o desenvolvimento de
bactrias (HOUGH, 1990). Mesmo assim, desde o final do sculo
XIX as bactrias so reconhecidas como importantes agentes de
contaminao das cervejas. Uma comparao das descries das
bactrias presentes nas cervejarias e cervejas daquela poca com
as da atualidade revela que o conjunto de bactrias encontradas
permanece praticamente constante, embora alguns nomes tenham
mudado no decorrer dos anos. Recentemente, com a utilizao
de novos processos, em particular o engarrafamento de cervejas

As principais bactrias Gram-positivas causadoras de deteriorao da cerveja so as bactrias cido lcticas pertencentes aos
gneros Lactobacillus e Pediococcus (GIL et al., 2004; VENTURINI
FILHO e CEREDA, 2001), as quais so microrganismos imveis
com complexos requerimentos nutricionais e capacidades respiratrias limitadas, sendo sua multiplicao favorecida em condies
microaeroflicas e ocasionalmente anaerbias. A multiplicao de
algumas espcies estimulada pela presena de dixido de carbono
(PRIEST, 2006; HOUGH et al., 1982). Aproximadamente 70% dos
problemas por contaminao da cerveja so causados por bactrias
cido lcticas (IIJIMA et al., 2007; SUZUKI et al., 2006a; SUZUKI
etal., 2006b).

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

Em termos do efeito deteriorante causado nas cervejas,

sabe-se que as bactrias cido lcticas causam turbidez, acidez e

242

DRAGONE, G. et al.

odores desagradveis devido formao de vrios produtos metablicos. O odor desagradvel mais importante associado com as
bactrias cido lcticas a caracterstica doce, manteigosa ou de
mel, fornecida pelo diacetil (2,3-butanodiona) e/ou pela dicetona
vicinal relacionada (2,3-pentanodiona). Algumas cepas so capazes
ainda de produzir um composto glutinoso, formado por um heteropolmero complexo contendo unidades de glicose, manose e
cidos nuclicos, que tornam a cerveja viscosa (BRIGGS et al.,
2004; HOUGH et al., 1982).
Nas bactrias cido lcticas ocorrem duas vias principais
de fermentao de hexoses, a homofermentao e a heterofermentao, as quais diferem na maneira de clivagem do esqueleto
de 6 carbonos, rendendo diferentes produtos finais (Figura 2).
A homofermentao, caracterstica dos Pediococcus e de alguns
Lactobacillus, envolve a clivagem da frutose-1,6-difosfato pela
enzima aldolase, formando duas triose-fosfato, que so convertidas
em lactato via piruvato. Na heterofermentao, praticada pelos
Leuconostoc e alguns Lactobacillus, ocorre a oxidao da glicose6-fosfato formando gluconato-6-fosfato, que descarboxilado a
xilulose-5-fosfato. Este composto posteriormente clivado por uma
fosfocetolase rendendo triose-fosfato e acetil-fosfato. A triose-fosfato
convertida a lactato via piruvato, enquanto que o acetil-fosfato
pode ser precursor tanto do etanol quanto do acetato, dependendo
do potencial de oxidao reduo do sistema. Portanto, a partir
da glicose so formadas quantidades equimolares de CO2, lactato
e etanol ou acetato (PRIEST, 1996).

Glicose

Frutose 1,6P

Glicose 6P

Gluconato 6P
Aldolase
CO2
Xilulose 5P

2 Triose 3P

Fosfocetolase
Triose 3P + Acetil P

2 Piruvato

Piruvato

Lactato

2 Lactato
Homofermentao:
via glicoltica

Acetato/Etanol

Heterofermentao:
via glutamato 6P

FIGURA 2. P rincipais vias de fermentao de hexoses nas bactrias

cido lcticas (modificado de PRIEST, 1996).

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

2.1.1 Lactobacillus
Os Lactobacillus so microrganismos pleomrficos na
aparncia, podendo variar sua forma de longos e delgados bacilos
at pequenos cocobacilos (STEWART e RUSSELL, 1998). O gnero
Lactobacillus o mais abundante das bactrias cido lcticas,
incluindo numerosas espcies que so amplamente empregadas
em vrios processos fermentativos, tais como na elaborao de
vinho, iogurte e picles (SAKAMOTO e KONINGS, 2003). Apesar
de ser possvel detectar cepas de pelo menos nove espcies de
Lactobacillus em cervejas e cervejarias, a viso tradicional de que
todos os Lactobacillus so organismos deteriorantes incorreta,
pois alguns desses organismos so incapazes de se multiplicar no
produto final (PRIEST, 1996).

Lb. brevis a espcie mais importante de Lactobacillus

deteriorante da cerveja, uma bactria heterofermentativa estrita
que apresenta um crescimento timo a 30 C e pH entre 4 e 5, e
que pode causar superatenuao na cerveja devido capacidade de
fermentar dextrinas e amido (VAUGHAN et al., 2005; PRIEST, 1996).
Essa espcie utiliza citrato, piruvato, malato, arginina e tirosina da
cerveja como substrato para a produo de ATP (SUZUKI et al.,
2005). Algumas cepas deste microrganismo apresentam resistncia
s substncias amargas do lpulo, dentre elas as isohumulonas (iso
-cidos), o que possibilita sua multiplicao na cerveja (SAKAMOTO
et al., 2001). At alguns anos atrs foi proposto que componentes
da parede celular (polissacardeos e cidos teicicos) poderiam
atuar como barreiras a essas isohumulonas (YASUI et al., 1995).
Mais recentemente, tem sido demonstrada a existncia de dois
genes, horA e horC, responsveis pela resistncia das bactrias
cido lcticas aos compostos do lpulo. O gene horA codifica um
transportador dependente de ATP que excreta os iso -cidos do
lpulo para fora da clula da bactria. Por outro lado, o produto
do gene horC confere resistncia ao lpulo, atuando como um
transportador dependente da fora prton motora. A demonstrao
desses genes como os mediadores dos mecanismos de resistncia
ao lpulo muito importante, pois seria possvel usar esses marcadores genticos para determinar a capacidade de contaminao
da cerveja por qualquer bactria cido lctica (IIJIMA et al., 2007;
SUZUKI et al., 2006a).
O segundo mais importante Lactobacillus deteriorante da
cerveja o Lb. lindneri, que responsvel por 15 a 25% dos casos
de contaminao bacteriana (BACK, 1994b). Este microrganismo
tambm altamente resistente aos compostos do lpulo e seu crescimento timo ocorre de 19 a 23 C (BACK et al., 1996). As cepas
dessa espcie, encontradas no inculo de leveduras e durante a
fermentao do mosto e maturao da cerveja, so difceis de serem
detectadas com os mesmos meios de cultura utilizados para outras
espcies de bactrias cido lcticas, tal como o MRS gar (SUZUKI
etal., 2006b). De acordo com esses autores, o Lb. lindneri cultivado
repetidamente em cervejas desgaseificadas torna-se cada vez mais
difcil de ser detectado com o meio MRS gar, medida que aumenta
sua adaptao cerveja ou quando submetido a tratamento trmico
(60 C por 10 min). Essa espcie constitui, portanto, uma ameaa
grave para a indstria cervejeira, pois se ela consegue sobreviver
ao processo de pasteurizao poder contaminar a cerveja sem ser
detectada com meios de cultura.
Nos ltimos anos, algumas novas espcies de Lactobacillus
descobertas tm sido acrescentadas lista de microrganismos deteriorantes da cerveja. Dentre essas espcies, o Lb. paracollinoides,
inicialmente denominado Lactobacillus sp. LA2, apresenta elevada

243

DRAGONE, G. et al.

capacidade de deteriorao da cerveja, comparvel a das cepas de

Lb.brevis (SUZUKI et al., 2004a). Os microrganismos dessa espcie
so capazes de se multiplicar a 15 C e so heterofermentativos
obrigatrios, convertendo 1 mol de glicose em 1 mol de cido
lctico e 1mol de etanol com produo de gs (CO2). As clulas de
Lb. paracollinoides possuem dimetro de 0,5 a 1 m, comprimento
de 1,5 a 5m e crescem isoladamente ou formando cadeias curtas
(SUZUKI et al., 2004b; FUNAHASHI et al., 1998). Outra nova espcie
de Lactobacillus reconhecida recentemente o Lb. backi (BOHAK
et al., 2006). Algumas cepas dessa espcie isoladas do ambiente
cervejeiro foram caracterizadas como fortes deteriorantes da cerveja,
capazes de se multiplicar no produto final com pH 4,2. As cepas de
Lb. backi e as de Lb. paracollinoides apresentam tambm os genes
horA e/ou horC, responsveis pela elevada resistncia de algumas
bactrias cido lcticas s substncias amargas do lpulo (IIJIMA
et al., 2007).
2.1.2 Pediococcus

Pediococcus so bactrias homofermentativas que crescem

em pares ou ttrades. Originalmente estas bactrias eram conhecidas como sarcinas, pois sua organizao de clulas era confundida
com aquela das verdadeiras sarcinas. Por este motivo, a deteriorao
da cerveja causada por estes microrganismos era denominada
doena da sarcina (SAKAMOTO e KONINGS, 2003).
Cepas de Pediococcus so comuns em cervejarias que
praticam baixa fermentao (produo de cervejas tipo lager) e
pouco freqentes em cervejarias que produzem cervejas de alta
fermentao. Isto pode ser conseqncia de que sua temperatura
tima de crescimento mais baixa em relao temperatura tima
de crescimento dos Lactobacillus. A deteriorao causada por
Pediococcus muito similar quela causada por outras bactrias
cido lcticas, provocando aumento de acidez e turbidez, sabores e
aromas desagradveis (amanteigados, devido formao de diacetil)
(HARTNETT et al., 2002; HOUGH et al., 1982).
P. damnosus certamente a espcie deteriorante da cerveja
mais comum e perigosa, sendo responsvel por cerca de 90% dos
casos de contaminao de cervejas por Pediococcus. Esta bactria se
multiplica bem durante a fermentao, na maturao e no produto
acabado, mas raramente no inculo de leveduras. Em contraste,
P. inopinatus freqentemente detectado nas leveduras para
inoculao, mas raramente nas outras etapas da fermentao. No
entanto, as espcies P. inopinatus e P. dextrinicus podem se multiplicar na cerveja em presena de baixas concentraes de etanol e
de lpulo e com valores de pH acima de 4,2. Valores mais baixos de
pH inibem essas espcies, que tambm se tornam menos tolerantes
ao lpulo do que P. damnosus, o qual particularmente resistente
ao anti-sptica deste produto (PRIEST, 1996). Estudos recentes
demonstraram a presena dos genes horA e horC em P.damnosus,
responsveis pela elevada resistncia dessa espcie aos compostos
do lpulo (IIJIMA et al., 2007; SUZUKI et al., 2006a). Uma nova
espcie caracterizada recentemente, P. claussenii, tambm provoca
deteriorao da cerveja (PRIEST, 2006). As bactrias dessa espcie
possuem dimetro de 0,6 a 1 m e crescem isoladamente, em pares
ou em ttrades (DOBSON et al., 2002).
2.1.3 Outras bactrias Gram-positivas
Alm das espcies de Lactobacillus e Pediococcus, uma
espcie do gnero Micrococcus (M. kristinae) tambm tem sido

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

relatada como deteriorante da cerveja. Esta bactria capaz de se

multiplicar em cervejas com baixa concentrao de etanol e componentes do lpulo e com valores de pH acima de 4,5, produzindo um
aroma de frutas atpico em cervejas (BACK, 1981). Os Micrococcus
so usualmente aerbios estritos, mas M. kristinae pode se multiplicar tambm sob condies anaerbias (VAUGHAN et al., 2005;
SAKAMOTO e KONINGS, 2003).
2.2 Bactrias Gram-negativas
Os microrganismos Gram-negativos deteriorantes da
cerveja abrangem diversas espcies de bactrias pertencentes a
vrios gneros. Dentre estes, os mais importantes incluem as bactrias dos gneros Pectinatus, Megasphaera, Zymomonas e certos
membros da famlia Enterobacteriaceae (Tabela 1).
2.2.1 Pectinatus
So bacilos anaerbios, mveis, no formadores de esporos
e com flagelos laterais ligados ao lado cncavo do corpo da clula.
Quando as clulas so jovens elas nadam ativamente, enquanto
que as clulas mais velhas desenvolvem um movimento tipo cobra
(LEWIS e YOUNG, 1995; HOUGH et al., 1982). Estas bactrias
podem se multiplicar em temperaturas de 15 a 40 C (tima de
32 C), pH 3,5 a 6 (timo de 4,5) e em meios contendo at 4,5%
p/p (aproximadamente 5,6% v/v) de etanol (CHELAK e INGLEDEW,
1987).
As espcies do gnero Pectinatus, P. cerevisiiphilus e
P.frisingensis esto entre as principais bactrias deteriorantes da
cerveja, sendo responsveis por 20 a 30% dos incidentes por contaminao bacteriana, principalmente em cervejas no pasteurizadas
(VAUGHAN et al., 2005; BACK, 1994b). Durante a multiplicao
destas bactrias so produzidas quantidades considerveis dos
cidos propinico, actico, lctico e succnico e tambm de
acetona (HAIKARA et al., 1981). Em temperaturas acima de 15C,
P. cerevisiiphilus, por exemplo, produz uma elevada quantidade
dos cidos propinico (33 mmol.L1) e actico (27 mmol.L1), os
quais inibem a multiplicao da levedura cervejeira S. cerevisiae
(CHOWDHURY etal., 1997). No entanto, o principal efeito de deteriorao causado pelas espcies de Pectinatus uma forte turbidez
e um repulsivo cheiro de ovo podre resultante da combinao de
diferentes cidos graxos, sulfeto de hidrognio e metil mercaptano
(LEE et al., 1980). Nas indstrias cervejeiras j tem sido detectada a
presena destas bactrias no esgoto, no leo de lubrificao misturado com cerveja, em canos com gua, no ar e no cho da sala de
enchimento, nas enchedoras, na gua condensada no teto e na
gua de macerao do malte antes da moagem (HELANDER et al.,
2004). Nos ltimos anos foi isolada uma nova espcie de Pectinatus
associada deteriorao de cervejas, o P. portalensis. A cepa B6
dessa espcie, capaz de se multiplicar em cervejas com concentraes de etanol de at 15%v/v, apresenta uma temperatura tima
de crescimento (37 C) mais elevada e o dobro da velocidade de
crescimento quando comparada com P.cerevisiiphilus e P. frisingensis
(GONZALEZ et al., 2004).
2.2.2 Megasphaera

Megasphaera uma bactria do tipo coco Gram-negativo,

imvel e anaerbia estrita (LEWIS e YOUNG, 1995). Este gnero
inclui duas espcies, M. elsdeni e M. cerevisiae. Porm, somente
M.cerevisiae tem sido considerada responsvel pela deteriorao de

244

DRAGONE, G. et al.

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

TABELA 1. Principais espcies de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas encontradas nas cervejarias (BOULTON e QUAIN, 2006; PRIEST,
2006; BRIGGS et al., 2004; SAKAMOTO e KONINGS, 2003).
Gram-positivas
B. coagulans

Bacillus
Lactobacillus

Leuconostoc
Micrococcus
Pediococcus

Lb. brevis
Lb. brevisimilis
Lb. buchneri
Lb. casei
Lb. collinoides
Lb. coryneformis
Lb. curvatus
Lb. delbrueckii
Lb. lindneri
Lb. malefermentans
Lb. parabuchneri
Lb. paracasei
Lb. plantarum

Acetobacter

Gram-negativas
A. aceti
A. liquefaciens
A. pastorianus
A. hansenii

Citrobacter

C. freundii

Enterobacter (Rahnella)

E. aerogenes
E. agglomerans (R. aquatilis)
E. cloacae

Gluconobacter

G. oxydans

Klebsiella

K. aerogenes
K. pneumoniae
K. terrigena

Megasphaera

M. cerevisiae

Obesumbacterium (Hafnia)
Pectinatus

O. proteus (H. protea)

P. cerevisiiphilus
P. frisingensis
P. sp. DSM20764

Selenomonas
Zymomonas
Zymophilus

S. lacticifex
Z. mobilis
Z. paucivorans
Z. raffinosivorans

Leuc. mesenteroides
M. kristinae
M. varians
P. clausennii
P. damnosus
P. dextrinicus
P. inopinatus

cervejas (SAKAMOTO e KONINGS, 2003; SATOKARI et al., 1998). As

clulas de M. cerevisiae no formadoras de esporos so cocos levemente alongados de 1,3a 1,6 m de dimetro. Sua multiplicao
ocorre entre 15 e 37 C (timo em 28 C) e em valores de pH acima
de 4,1, sendo inibidas em cervejas com uma concentrao de etanol
acima de 2,8% (p/v) (aproximadamente 3,5% v/v). A contaminao
da cerveja causada por esse microrganismo resulta na produo
de considerveis quantidades de cido butrico, juntamente com
baixas concentraes dos cidos actico, isovalrico, valrico
e caprico, e de acetona. No mosto, so produzidas grandes
quantidades de cidos butrico e caprico, baixas concentraes
de cido actico, isovalrico e valrico, e no ocorre a produo
de acetona (VAN VUUREN, 1996). Semelhante ao Pectinatus, a
produo de sulfeto de hidrognio por M. cerevisiae provoca odor
fecal na cerveja, o que faz dessa bactria um dos microrganismos
mais temidos pelos cervejeiros (LEE, 1994).
2.2.3 Outras bactrias Gram-negativas
Alm dos dois gneros descritos anteriormente, existem
tambm outras bactrias Gram-negativas reconhecidas como causadoras de problemas na indstria cervejeira. Zymomonas mobilis, por
exemplo, uma bactria anaerbia tolerante ao oxignio, resistente

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

ao lpulo e capaz de se multiplicar em cervejas com pH acima de 3,4

e concentraes de etanol de at 10% (v/v). Sua temperatura tima
de crescimento 30 C, mas pode se desenvolver rapidamente a
15C nas cervejas mantidas em tonis (HOUGH et al., 1982).
Outros exemplos de bactrias Gram-negativas deteriorantes das cervejas so as bactrias anaerbias estritas dos
gneros Zymophilus e Selenomonas, dentre as quais, duas espcies, Z.raffinosivorans e S. lacticifex, j foram isoladas a partir
de inculos de leveduras cervejeiras (VAUGHAN et al., 2005;
VANVUUREN, 1996). Semelhantes a Pectinatus spp., as bactrias
de Z.raffinosivorans podem se multiplicar em cervejas com valores
de pH acima de 4,3 e concentraes de etanol inferiores a 5% (p/v)
(aproximadamente 6,3% v/v). A deteriorao causada por esses
microrganismos inclui, alm da turbidez, a produo dos cidos
propinico, actico e succnico, metil mercaptano, dimetil sulfeto
e sulfeto de hidrognio (JESPERSEN e JAKOBSEN, 1996).
A indstria cervejeira tambm tem dado grande ateno
s bactrias Gram-negativas aerbias, principalmente s bactrias
cido acticas Gluconobacter e Acetobacter, as quais so capazes
de converter etanol em cido actico, resultando conseqentemente em um desagradvel odor de vinagre (SAKAMOTO e
KONINGS, 2003; JESPERSEN e JAKOBSEN, 1996). Essas bactrias

245

DRAGONE, G. et al.

so resistentes aos compostos amargos do lpulo, cidos e etanol, e

podem contaminar a cerveja com a presena de ar no espao vazio
(headspace) de garrafas e latas, como resultado de envasamento
imperfeito (VAUGHAN et al., 2005). Similar ateno tem sido dada
s Enterobacteriaceae, pois diversas espcies destas bactrias j
foram encontradas nas cervejarias, incluindo Hafnia protea, Hafnia
alvei, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter
aerogenes e Enterobacter agglomerans, atualmente reconhecida
como Rahnella aquatilis (JESPERSEN e JAKOBSEN, 1996). Esses
microrganismos tm sido considerados deteriorantes do mosto, uma
vez que so incapazes de se desenvolver na cerveja. Dentre estes,
as espcies Hafnia protea (antigamente chamada Obesumbacterium
proteus) e Rahnella aquatilis tm sido encontradas principalmente
no inculo de leveduras, podendo, portanto, retardar o processo
fermentativo. Nas cervejas produzidas a partir de mostos contaminados com R. aquatilis, so observados elevados nveis de
diacetil (0,7 mg.L1) e dimetil sulfeto (142,8 g.L1), enquanto que
em mostos contaminados com H. protea ocorre um aumento das
concentraes de dimetil sulfeto, dimetil disulfeto, n-propanol,
isobutanol, isopentanol, 2,3-butanodiol e diacetil. Por este motivo,
a cerveja produzida utilizando leveduras contaminadas com essa
bactria apresenta odores de ervas ou de frutas (VAUGHAN et al.,
2005; VAN VUUREN, 1996).

3. LEVEDURAS SELVAGENS
Qualquer levedura diferente da levedura cervejeira utilizada
como inculo considerada uma levedura selvagem (MIDDLEKAUFF,
1994). Geralmente as leveduras selvagens so difceis de serem
detectadas e, ao contrrio das bactrias, no so susceptveis
lavagem com cido, sendo, portanto, impossvel erradic-las do
inculo de leveduras utilizando um tratamento cido. De fato, a
nica forma prtica de assegurar um inculo de leveduras livre das
leveduras selvagens a introduo regular de cultivos puros da
levedura cervejeira no processo (LEWIS e YOUNG, 1995).
Tradicionalmente, as leveduras selvagens so divididas em
Saccharomyces e no-Saccharomyces, sendo as Saccharomyces
spp. consideradas as mais perigosas (BOULTON e QUAIN, 2006;
BRIGGS et al., 2004; JESPERSEN et al., 2000; VAN DER AA KHLE
e JESPERSEN, 1998). Embora a maioria das Saccharomyces selvagens detectadas compreenda as S. cerevisiae, outras espcies de
S accharomyces tambm tm sido relatadas, dentre as quais se
destacam: S. diastaticus, S. pastorianus, S. ellipsoideus e S. willianus.
A contaminao com esse tipo de levedura pode causar odores
fenlicos cerveja devido capacidade destes microrganismos
de descarboxilar cidos fenlicos, tais como os cidos ferlico e
trans-cinmico. Outro efeito da contaminao de cervejas com
estas leveduras a superatenuao do produto final, devido
produo e secreo de glucoamilases, permitindo que as leveduras selvagens utilizem as dextrinas, que normalmente no so
fermentadas pelas leveduras de cultivo (JESPERSEN e JAKOBSEN,
1996). Algumas cepas de S. cerevisiae tm desenvolvido ainda a
capacidade de secreo de protenas (zimocidas), as quais num
determinado intervalo de valores de pH so letais para as leveduras
de cultivo (PRIEST, 2006; HOUGH et al., 1982). A manuteno do
pH baixo, indefinidamente, durante uma fermentao contnua, por
exemplo, propicia o desenvolvimento da levedura assassina (killer),
que pode eliminar completamente a levedura de cultivo e produzir
sabor desagradvel, descrito como erva-fenlico (VENTURINI FILHO
e CEREDA, 2001).

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

As leveduras selvagens no-Saccharomyces incluem diversos

gneros, tais como Brettanomyces , Candida , Cryptococcus ,
Debaryomyces, Dekkera, Endomyces, Filobasidium, H
anseniaspora,
Hansenula , Kloeckera , Kluyveromyces , Pichia , Rhodotorula ,
Schizosaccharomyces, Torulaspora, Torulopsis e Zygosaccharomyces
(BARSZCZEWSKI e ROBAK, 2004; VAN DER AA KHLE e JESPERSEN,
1998). Algumas destas leveduras apresentam formas diferentes
quando comparadas com as leveduras cervejeiras, podendo ser
alongadas ou em forma de limo (LEWIS e YOUNG, 1995).
Diversos tipos de deteriorao da cerveja podem ser
causados pelas leveduras selvagens no-Saccharomyces. As leveduras dos gneros Debaryomyces e Pichia e algumas espcies de
Candida, por exemplo, so responsveis pelo aumento da turbidez,
produo de odores anormais descritos como de steres (banana e
abacaxi) e formao de uma pelcula na superfcie da cerveja. J as
leveduras selvagens dos gneros Dekkera e Brettanomyces, encontradas na elaborao de cervejas especiais (ale, lambic, porter e
Berliner Weisse) e que contribuem com o sabor caracterstico desses
produtos, tambm so consideradas microrganismos deteriorantes
de cerveja. Essas leveduras, alm de competir com a levedura
cervejeira durante a fermentao, conseguem se multiplicar muito
bem na cerveja filtrada, proporcionando um desagradvel sabor de
cido actico (HAYASHI, et al., 2007).

4. MTODOS PARA DETECO DOS

MICRORGANISMOS DETERIORANTES
DA CERVEJA
A deteco dos microrganismos deteriorantes da cerveja
normalmente realizada por cultivo em meios de laboratrio. Apesar
de esta metodologia nem sempre proporcionar a especificidade e
a sensibilidade requeridas, o uso de meios seletivos e condies
de incubao ainda o mtodo preferido pelas cervejarias, sendo
amplamente utilizado at os dias atuais.
4.1 Incubao em meios seletivos de cultivo
4.1.1 Meios para a deteco de bactrias
Conforme apresentado na Tabela 2, diversos meios seletivos de cultivo para bactrias deteriorantes da cerveja tm sido
desenvolvidos e recomendados por vrias organizaes cervejeiras.
Embora nenhum desses meios seja apropriado para a deteco de
todas as cepas de Lactobacillus e Pediococcus, a combinao de
alguns deles tem proporcionado bons resultados (SAKAMOTO e
KONINGS, 2003).
A suplementao adicional de nutrientes a estes meios
tambm tem sido uma alternativa interessante, pois possibilita a
deteco de um maior nmero de espcies de microrganismos
em menor tempo (GILLET et al., 2003). Alguns exemplos de meios
seletivos de cultivo suplementados com nutrientes, utilizados para
a deteco dos microrganismos contaminantes da cerveja esto
apresentados na Tabela 3.
O emprego do mtodo de deteco baseado no cultivo dos
microrganismos em meios seletivos apresenta a desvantagem de ser
muito demorado, sendo necessria uma semana ou mais para se
obter colnias visveis nas placas ou visualizar turbidez nos caldos.
Conseqentemente, os produtos so muitas vezes vendidos antes

246

DRAGONE, G. et al.

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

TABELA 2. Meios seletivos de cultivo recomendados por organizaes cervejeiras para a deteco de bactrias deteriorantes da cerveja
(SAKAMOTO e KONINGS, 2003).
Meio
MRS (de Man, Rogosa and Sharpe)
Raka-Ray
VLB S7-S (Versuchs-und Lehranstalt fr Brauerei in Berlin)
HLP (Meio Hsus Lactobacillus e Pediococcus)
WLD (Wallerstein Differential)
Nakagawa
DAS (Schwarz Differential Agar)
MRS concentrado
PYF (Peptone, Yeasts extract and Fructose)
Meio Thioglycolate
LL-Agar
UBA (Universal Beer Agar)
NBB (Nachweismedium fr bierschdliche Bakterin)
Meio Brewers Tomato Juice
LMDA (Lees Multi-Differential Agar)
BMB (Meio Barney-Miller Brewery)
SMMP (Meio seletivo para Megasphaera e Pectinatus)

Bactria
BALb
BAL, G(-) c
BAL
BAL
BAL
BAL
BAL
G(-)
G(-)
G(-)
G(-)
BAL, G(-)
BAL, G(-)
BAL, G(-)
BAL
BAL
G(-)

Recomendado por a
EBC, ASBC, BCOJ
EBC, ASBC, BCOJ
EBC, BCOJ
EBC, BCOJ
EBC, BCOJ
EBC, BCOJ
EBC, BCOJ
EBC, BCOJ
EBC, BCOJ
EBC
EBC, BCOJ
EBC, ASBC, BCOJ
EBC, BCOJ
ASBC
ASBC
ASBC
ASBC, BCOJ

EBC, European Brewery Convention; ASBC, American Society of Brewing Chemists; BCOJ, Brewery Convention of Japan.
BAL, Bactrias cido lcticas.
G(-), Bactrias Gram-negativas.

b
c

TABELA 3. Meios seletivos de cultivo NBB suplementados com nutrientes para deteco de microrganismos contaminantes da cerveja
(DLHER, 2001).
Tipos de amostra
Amostras de levedura
Inculo (fermento de carga)

Mtodo mais recomendado

Deteco
Lactobacillus, Pediococcus, Pectinatus, Megasphaera,
NBB-Boullion (NBB-B)
Lactococcus, Leuconostoc e Zymomonas.

Cultura pura de levedura

Recolha (fermento de propagao)
Sedimentos de levedura
Cerveja no filtrada

NBB-Concentrado (NBB-C)

Sala de fermentao
Cerveja no maturada
Cerveja de trigo
Amostras de cerveja filtrada e gua
gua de enxge

Todas as bactrias contaminantes de cerveja,

especialmente lactobacilos (Lb. brevis, Lb. lindneri e
Lb. brevisimilis), Pediococcus (P. damnosus), Pectinatus
e Megasphaera.

(NBB-A)

Tambm indicador de germes (Acetobacter).

Todas as bactrias contaminantes de cerveja,
especialmente lactobacilos (Lb. brevis, Lb. lindneri e
Lb. brevisimilis), Pediococcus (P. damnosus), Pectinatus
e Megasphaera.

NBB-Boullion-AM

Todas as bactrias contaminantes de cerveja.

(NBB-B-AM)

Germes indicadores: biofilmes.

NBB-gar

Cerveja aps filtrao

Cerveja de tanques de presso
Cerveja de envasamento
Cerveja engarrafada
Chope
Pontos de contaminao
Produo (exemplos: bombas, linhas de cerveja,
juntas de vedao, by-passes e outros)

Microrganismos formadores de muco/placa

(Acetobacter, Enterobacteriaceae, etc.).

rea de envasamento (exemplos: envasador,

estrelas, vlvulas, ajustamentos, lacrador,
lavador, inspetor de garrafas)

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

247

DRAGONE, G. et al.

que os resultados dos testes microbiolgicos estejam disponveis

(SAKAMOTO e KONINGS, 2003).
A deteco de Megasphaera e Pectinatus, por exemplo, pode
ser feita utilizando o meio SMMP (Tabela 2), porm, so necessrios
at 14 dias de incubao, e a deteco dificultada pelas condies
anaerbias estritas nos seus cultivos (SATOKARI et al., 1998). Outro
problema que esses meios no so especficos para cada espcie.
Um exemplo so os meios utilizados para deteco das bactrias deteriorantes cido lcticas, os quais tambm permitem a multiplicao
de espcies no deteriorantes da cerveja, tais como Lb. delbrueckii e
P. acidilactici (SAKAMOTO e KONINGS, 2003). Conclui-se, portanto,
que existe uma grande necessidade de se desenvolver mtodos mais
rpidos e especficos para a deteco dessas bactrias.
4.1.2 Meios para a deteco de leveduras selvagens
No existe um nico meio de cultivo que permita a deteco
de todas as leveduras selvagens sem detectar as leveduras do
prprio cultivo. Portanto, o mtodo mais utilizado para a deteco
de leveduras selvagens continua sendo a utilizao de vrios meios
seletivos, sendo que a combinao desses meios depender do tipo
de levedura utilizada (BARSZCZEWSKI e ROBAK, 2004). Para um uso
geral, a combinao de MYGP (Malt extract, Yeast extract, Glucose,
Peptone agar) com 200 ppm de CuSO4, um meio no seletivo
incubado a 37 C durante 4 dias, e XMACS (meio contendo xilose,
manitol, adonitol, celobiose e sorbitol), meio lisina ou meio CLEN
(contendo cadaverina, lisina, etilamina e nitrato) pode ser capaz de
detectar a maioria das leveduras selvagens Saccharomyces e noSaccharomyces nas cervejarias que produzem cervejas tipo lager.
Vale a pena lembrar que todos os meios propostos para a deteco
das leveduras selvagens esto baseados em princpios seletivos,
por isso importante ter em mente que a inibio das leveduras
de cultivo e a multiplicao das selvagens sero influenciadas pelas
condies fisiolgicas das leveduras, pela concentrao celular e
pelas condies de incubao (JESPERSEN e JAKOBSEN, 1996).
4.2 Mtodos rpidos de deteco de microrganismos
Nas ltimas duas dcadas, tm sido testados vrios mtodos
rpidos para a deteco e identificao dos microrganismos
deteriorantes da cerveja. Alguns deles encontram-se disponveis
comercialmente, e outros ainda esto em fase de pesquisa (PRIEST,
2006; HAMMOND et al., 1999). Porm, a maioria desses mtodos
tem sido desenvolvida para aplicaes clnicas. Um dos grandes
obstculos em aplicar qualquer mtodo desenvolvido para um
laboratrio clnico na indstria cervejeira contornar as diferenas
fundamentais na multiplicao dos isolados clnicos comparados
aos contaminantes da cerveja (BARNEY e KOT, 1992). Enquanto
um teste para a deteco rpida de uma espcie clnica como
Escherichiacoli, com tempo mdio de gerao de 20 a 30 min, pode
requerer apenas algumas horas, o mesmo teste rpido para bactrias
lcticas, como P. damnosus ou Lb. lindneri, com tempos mdios de
gerao superiores a 5 h, pode requerer um perodo mnimo de
vrios dias, dependendo do teste. Portanto, a deteco rpida
deve ser sempre considerada no contexto das velocidades de crescimento dos microrganismos em questo, quando comparada ao
mtodo de deteco tradicional (DOWHANICK, 1995).
Dentre os principais mtodos rpidos aplicados para a
deteco dos microrganismos deteriorantes da cerveja destacam-se:

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

Impedncia/condutncia: Mede as mudanas de impedncia

ou condutncia eltrica em um meio de cultivo como resposta
multiplicao dos microrganismos (BARNEY e KOT, 1992). As
principais vantagens no uso desta tecnologia so: a reduo
no tempo de deteco em comparao com o mtodo de
incubao em meios de cultivo, dependendo do meio empregado, a elevada seletividade para a multiplicao microbiana
e a elevada automao para avaliar um grande nmero de
amostras. As desvantagens incluem custos elevados de equipamentos e operao, e nem todos os meios so apropriados
para serem utilizados com este mtodo (DOWHANICK,
1995).
Bioluminescncia: Mede a concentrao de adenosina trifosfato (ATP) por meio de uma reao qumica que produz luz.
Os nveis de ATP podem ser diretamente correlacionados
ao nmero de microrganismos presentes. Porm, tem sido
relatado que a concentrao de ATP varia amplamente entre
diferentes espcies, assim como para uma mesma espcie
em diferentes estados fisiolgicos. Alm disso, as clulas de
leveduras contm cerca de 100 vezes mais ATP do que as
clulas das bactrias, o que dificulta a extrapolao do nmero
de microrganismos contaminantes (BRIGGS et al., 2004).
Microscopia de epifluorescncia direta (DEFT): Baseia-se em
procedimentos de colorao fluorescente para a deteco de
clulas microbianas, utilizando um microscpio fluorescente.
O mtodo requer a concentrao da amostra por filtrao
em membrana, a colorao e a contagem das colnias
(BOULTON e QUAIN, 2006). Uma das grandes desvantagens
deste mtodo que se torna muito trabalhoso quando se
deseja analisar vrias amostras (BARNEY e KOT, 1992).
Citometria de fluxo: Utiliza tecnologia laser e mtodos de
colorao para a deteco de microrganismos em lquidos
escoando atravs de um pequeno orifcio (BARNEY e KOT,
1992). A principal vantagem deste mtodo sua sensibilidade. Porm, requer longos tempos para processar grandes
volumes de amostra, e pequenas partculas podem interferir
no resultado (DOWHANICK, 1995).
Reao em cadeia da polimerase (PCR): uma das mais
novas e promissoras tcnicas e que permite rpida deteco
dos microrganismos contaminantes da cerveja (RUSSELL e
DOWHANICK, 1999). Baseia-se na duplicao de seqncias
de cido desoxirribonuclico (DNA) por meio de uma reao
exponencial em cadeia para produzir quantidades detectveis
deste cido. Utilizando essa tcnica, tem sido possvel detectar
baixas concentraes (10UFC.100 mL1) de Pectinatusspp.
e M. cerevisiae aps 2 a 4 dias e 2 a 3 dias, respectivamente.
Por outro lado, esses mesmos microrganismos so detectados
em at 14dias quando incubados em meio SMMP, enquanto
que utilizando o teste forado (forcing test) a contaminao
com Pectinatus e Megasphaera spp. pode ser detectada em
2 a 3 ou 3 a 4 semanas, respectivamente (JUVONEN et al.,
1999). A tcnica de PCR permite a deteco de Lb. brevis,
Lb. lindneri, P. damnosus, Pectinatus spp., Megasphera spp.
e Selenomonas spp. (PRIEST, 2006 SATOKARI, et al., 1997).
Tambm tem sido possvel diferenciar leveduras cervejeiras
de no cervejeiras utilizando essa tcnica (YAMAGISHI et al.,
1999)

248

DRAGONE, G. et al.

5. CONCLUSO
Nas cervejarias modernas, o risco de contaminao da
cerveja por microrganismos est associado principalmente multiplicao de cepas especficas de Lactobacillus spp. e Pediococcus spp.
Porm, o grupo das bactrias Gram-negativas anaerbias estritas
vem adquirindo uma importncia crescente devido ao aperfeioamento das tcnicas de manipulao e engarrafamento da cerveja,
que tem reduzido significativamente o contedo de oxignio no
produto final, e tambm devido ao aumento da produo de
cervejas com baixas concentraes de etanol e de lpulo. Apesar
de os principais riscos de contaminao da cerveja estarem relacionados presena de bactrias, as leveduras selvagens, em
particular Saccharomyces spp., tambm representam uma importante preocupao para as cervejarias. No entanto, a capacidade
de se multiplicar na cerveja varia de acordo com cada cepa, para
uma mesma espcie de microrganismo deteriorante.
A deteco destes microrganismos deteriorantes da cerveja
tambm no um procedimento to simples, pois muitos destes
microrganismos parecem adaptados cerveja e algumas vezes
apresentam dificuldades para se multiplicar em outros meios,
incluindo os de laboratrio. Mesmo assim, o mtodo mais comumente utilizado nas cervejarias para a deteco dos microrganismos
contaminantes da cerveja continua sendo a tradicional incubao
em meios de cultura. Entretanto, devido diversidade dos microrganismos, diferentes meios devem ser utilizados a fim de garantir
a deteco das bactrias deteriorantes Gram-positivas e Gramnegativas, assim como das leveduras selvagens Saccharomyces e
no-Saccharomyces. Apesar disso, a maior preocupao nos dias
de hoje ainda quanto elaborao de mtodos mais sensveis,
especficos e rpidos para deteco destes microrganismos contaminantes. Tais mtodos so urgentemente necessrios para poder
predizer o potencial de deteriorao da cerveja, de uma forma rpida
e eficiente, diminuindo desta forma o risco da venda de um produto
contaminado, e auxiliando as cervejarias a encontrar e controlar os
principais pontos em seus processos onde podem ocorrer contaminao microbiana. A reao em cadeia da polimerase (PCR)
atualmente uma tcnica promissora que permite uma deteco
rpida dos microrganismos deteriorantes da cerveja.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem s agncias de fomento CAPES,
FAPESP e CNPq.

REFERNCIAS
BACK, W. Beer spoilage bacteria: taxonomy of beer spoilage bacteria:
gram positive species. Monatsschrift fr Brauerei, Berlin, v. 34,
p.267-276, 1981.
BACK, W. Farbatlas und Handbuch der Getrnkebiologie. Teil 1.
Nrnberg: Verlag Hans Carl, 1994a. 165 p.
BACK, W. Secondary contamination in the filling area. Brauwelt
International, Nrnberg, v. 4, p. 326-328, 1994b.
BACK, W.; BOHAK, I.; EHRMANN, M.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K.
H. Revival of the species Lactobacillus lindneri and the design of
a species specific oligonucleotide probe. Systematic and Applied
Microbiology, Stuttgart, v. 19, n. 3, p. 322-325, 1996.
BARNEY, M.; KOT, E. A comparison of rapid microbiological methods
for detecting beer spoilage microorganisms. MBAA Technical
Quarterly, Madison, v. 29, n. 3, p. 91-95, 1992.

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

BARSZCZEWSKI, W.; ROBAK, M. Differentiation of contaminating

yeasts in brewery by PCR-based techniques. Food Microbiology,
London, v. 21, n. 2, p. 227-231, 2004.
BOHAK, I.; THELEN, K.; BEIMFOHR, C. Description of Lactobacillus
backi sp. nov., an obligate beer-spoiling bacterium. Monatsschrift
fr Brauwissenschaft, Nrnberg, v. 59, n. 3/4, p. 78-82, 2006.
BOULTON, C.; QUAIN, D. Brewing Yeast & Fermentation. London:
Blackwell Publishing, 2006. p. 510-585.
BRIGGS, D. E.; BOULTON, C. A.; BROOKES, P. A.; STEVENS, R.
Brewing: Science and Practice. Boca Raton: CRC Press, 2004.
p.606-649.
CHELAK, B. J.; INGLEDEW, W. M. Anaerobic Gram-negative bacteria
in brewing a review. Journal of the American Society of Brewing
Chemists, St. Paul, v. 45, p. 123-127, 1987.
CHIHIB, N. E.; THOLOZAN, J. L. Effect of rapid cooling and acidic
pH on cellular homeostasis of Pectinatus frisingensis, a strictly
anaerobic beer-spoilage bacterium. International Journal of Food
Microbiology, Amsterdam, v. 48, n. 3, p. 191-202, 1999.
CHOWDHURY, I.; WATIER, D.; LEGUERINEL, I.; HORNEZ, J. P.
Effect of Pectinatus cerevisiiphilus on Saccharomyces cerevisiae
concerning its growth and alcohol production in wort medium.
Food Microbiology, London, v. 14, n. 3, p. 265-272, 1997.
DOBSON, C. M.;. DENEER, P. H.; LEE, S.; HEMMINGSEN, S.; GLAZE,
S.; ZIOLA, B. Phylogenetic analysis of the genus Pediococcus,
including Pediococcus claussenii sp. a novel lactic acid bacterium
isolated from beer. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, Reading, v. 52, n. 6, p. 2003-2010,
2002.
DHLER. NBB e suas aplicaes. Elaborado por Steffen Amon.
Disponvel em: <http://www.dohler.com>. Acesso em: 5 set.
2001.
DOWHANICK, T. M. Advances in yeast and contaminant
determination: the future of the so called rapid methods. Cerevisia
Belgian Journal of Brewing and Biotechnology, Bruxelles, v.20,
n. 4, p. 40-50, 1995.
FUNAHASHI, W.; SUZUKI, K.; OHTAKE, Y.; YAMASHITA, H. Two
novel beer-spoilage Lactobacillus species isolated from breweries.
Journal of the American Society of Brewing Chemists, St. Paul,
v. 56, n. 2, p. 64-69, 1998.
GIL, G.; del MNACO, S.; CERRUTTI, P.; GALVAGNO, M. Selective
antimicrobial activity of chitosan on beer spoilage bacteria and
brewing yeast. Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 26, n. 7,
p.569-574, 2004.
GILLET, A.; DUPUCHE, M. H.; VELINGS, N. Supplementation to
the MRS medium for the cultivation of fastidious beer spoilage
bacteria. Monatsschrift fr Brauwissenschaft, Nrnberg, v. 56,
n. 1-2, p.10-14, 2003.
GONZALEZ, J. M.; JURADO, V.; LAIZ, L.; ZIMMERMANN, J.;
HERMOSIN, B.; SAIZ-JIMENEZ, C. Pectinatus portalensis nov. sp., a
relatively fast-growing, coccoidal, novel Pectinatus species isolated
from a wastewater treatment plant. Antonie van Leeuwenhoek,
Amsterdam, v. 86, n. 3, p. 241-248, 2004.
HAIKARA, A.; PENTTIL, L.; ENARI, T. M.; LOUNATMAA,
K . Microbiological, biochemical, and electron microscopic
characterization of a Pectinatus strain. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, v.41, n. 2, p. 511-517, 1981.

249

DRAGONE, G. et al.

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

HAMMOND, J.; BRENNAN, M.; PRICE, A. The control of microbial

spoilage of beer. Journal of the Institute of Brewing, London,
v.105, n. 2, p. 113-120, 1999.

acid bacteria using a monoclonal chemiluminescence enzyme

immunoassay and a CCD camera. Journal of Immunological
Methods, Amsterdam, v. 303, n. 1-2, p. 92-104, 2005.

HARTNETT, D. J.; VAUGHAN, A.; VAN SINDEREN, D. Antimicrobialproducing lactic acid bacteria isolated from raw barley and
sorghum. Journal of the Institute of Brewing, London, v. 108,
n. 2, p.169-177, 2002.

MIDDLEKAUFF, J. E. Microbiological aspects. In: HARDWICK, W.

A. Handbook of Brewing. New York: Marcel Dekker, 1994. v. 2.
p. 480-499.

HAYASHI, N.; ARAI, R.; TADA, S.; TAGUCHI, H.; OGAWA, Y. Detection
and identification of Brettanomyces/Dekkera sp. yeasts with a loopmediated isothermal amplification method. Food Microbiology,
London, v. 24, n. 7-8, p. 778-785, 2007.
HELANDER, I. M.; HAIKARA, A.; SADOVSKAYA, I.; VINOGRADOV, E.;
SALKINOJA-SALONEN, M. S. Lipopolysaccharides of anaerobic beer
spoilage bacteria of the genus Pectinatus lipopolysaccharides of a
Gram-positive genus. FEMS Microbiology Reviews, Amsterdam,
v. 28, n. 5, p. 543-552, 2004.
HOLLEROV, I.; KUBIZNIAKOV, P. Monitoring gram positive
bacterial contamination in Czech breweries. Journal of the Institute
of Brewing, London, v. 107, n. 6, p. 355-358, 2001.
HOUGH, J. S. Biotecnologa de la Cerveza y de la Malta. Zaragoza:
Acribia, 1990. 194p.
HOUGH, J. S.; BRIGGS, D. E.; STEVENS, R.; YOUNG, T. W. Malting
and Brewing Science: volume II hopped wort and beer. 2 ed.
London: Chapman e Hall, 1982. p. 389-914.
HUHTAMELLA, S.; LEINONEN, M.; NIEMINEN, T.; FAHNERT, B.;
MYLLYKOSKI, L.; BREITENSTEIN, A.; NEUBAUER, P. RNA-based
sandwich hybridisation method for detection of lactic acid bacteria
in brewery samples. Journal of Microbiological Methods,
Amsterdam, v. 68, n. 3, p. 543-553, 2007.
IIJIMA, K.; SUZUKI, K.; ASANO,S.; KURIYAMA, H.; KITAGAWA, Y.
Isolation and identification of potential beer-spoilage Pediococcus
inopinatus and beer-spoilage Lactobacillus backi strains carrying the
horA and horC gene clusters. Journal of the Institute of Brewing,
London, v. 113, n. 1, p. 96-101, 2007.
JESPERSEN, L.; JAKOBSEN, M. Specific spoilage organisms in
breweries and laboratory media for their detection. International
Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v.33, n. 1, p. 139-155,
1996.
JESPERSEN, L.; van der AA KHLE, A.; PETERSEN, K. M. Phenotypic
and genetic diversity of Saccharomyces contaminants isolated from
breweries and their phylogenetic relationship with brewing yeasts.
International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 60,
n. 1, p. 43-53, 2000.
JUVONEN, R.; SATOKARI, R. Detection of spoilage bacteria in beer
by polymerase chain reaction. Journal of the American Society of
Brewing Chemists, St. Paul, v. 57, n. 3, p.99-103, 1999.
LEE, S. Y.; MABEE, M. S.; JANGAARD, N. O.; HORIUCHI, E. K.
Pectinatus, a new genus of bacteria capable of growth in hopped
beer. Journal of the Institute of Brewing, London, v. 86, p.28-30,
1980.
LEE, S. Y. SMMP a medium for selective isolation for Megasphaera
and Pectinatus from the brewery. Journal of the American Society
of Brewing Chemists, St. Paul, v. 52, n. 3, p.115-119, 1994.
LEWIS, M. J.; YOUNG, T. W. Brewing. London: Chapman e Hall,
1995. 260 p.
MARCH, C.; MANCLUS, J. J.; ABAD, A.; NAVARRO, A.; MONTOYA,
A. Rapid detection and counting of viable beer-spoilage lactic

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

PELCZAR, M. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia. So

Paulo: McGraw-Hill do Brasil, 1980. 566 p.
PRIEST, F. G. Gram-positive brewery bacteria. In: PRIEST, F. G.;
CAMPBELL, I. (Ed.). Brewing Microbiology. 2 ed. London: Chapman
e Hall, 1996. p. 127-161.
PRIEST, F. G. Microbiology and microbiological control in the
brewery. In: PRIEST, F. G.; STEWART, G. G. (Ed.). Handbook of
Brewing. Boca Raton: CRC Press, 2006. p.607-627.
RUSSELL, I.; DOWHANICK, T. M. Rapid detection of microbial spoilage.
In: PRIEST, F. G.; CAMPBELL, I. (Ed.). Brewing Microbiology. 2 ed.
London: Chapman e Hall, 1999. p. 209-235.
SAKAMOTO, K.; MARGOLLES, A.; VAN VEEN, H. W.; KONINGS, W.
N. Hop resistance in the beer spoilage bacterium Lactobacillus brevis
is mediated by the ATP-binding cassette multidrug transporter horA.
Journal of Bacteriology, Washington, v. 183, n. 18, p.53715375,
2001.
SAKAMOTO, K.; KONINGS, W. N. Beer spoilage bacteria and
hop resistance. International Journal of Food Microbiology,
Amsterdam, v. 89, n. 2-3, p. 105-124, 2003.
SATOKARI, R.; JUVONEN, R.; VON WRIGHT, A.; HAIKARA, A.
Detection of Pectinatus beer spoilage bacteria by using the
polymerase chain reaction. Journal of Food Protection, Des
Moines, v. 60, n. 12, p. 1571-1573, 1997.
SATOKARI, R.; JUVONEN, R.; MALLISON, K.; VON WRIGHT, A.;
HAIKARA, A. Detection of beer spoilage bacteria Megasphaera and
Pectinatus by polymerase chain reaction and colorimetric microplate
hybridization. International Journal of Food Microbiology,
Amsterdam, v. 45, n. 2, p. 119-127, 1998.
STEWART, G. G.; RUSSELL, I. An Introduction to Brewing Science
e Technology: series III: brewers yeast. London: The Institute of
Brewing, 1998. 108p.
SUZUKI, K.; KOYANAGI, M.; YAMASHITA, H. Genetic characterization
and specific detection of beer-spoilage Lactobacillus sp. LA2 and
related strains. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v. 96,
n. 4, p. 677-683, 2004a.
SUZUKI, K.; FUNAHASHI, W.; KOYANAGI, M.; YAMASHITA, H .
Lactobacillus paracollinoides sp. nov., isolated from brewery
environments. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, Reading, v. 54, n. 1, p. 115-117,
2004b.
SUZUKI, K.; IIJIMA, K.; OZAKI, K.; YAMASHITA, H. Study on ATP
production of lactic acid bacteria in beer and development of a rapid
pre-screening method for beer-spoilage bacteria. Journal of the
Institute of Brewing, London, v. 111, n. 3, p. 328-335, 2005.
SUZUKI, K.; IIJIMA, K.; SAKAMOTO, K.; SAMI, M.; YAMASHITA, H. A
review of hop resistance in beer spoilage lactic acid bacteria. Journal
of the Institute of Brewing, London, v. 112, n. 2, p.173-191,
2006a.
SUZUKI, K.; IIJIMA, K.; ASANO, S.; KURIYAMA, H.; KITAGAWA, Y.
Induction of viable but nonculturable state in beer spoilage lactic

250

DRAGONE, G. et al.

acid bacteria. Journal of the Institute of Brewing, London, v. 112,

n. 4, p. 295-301, 2006b.
VAN DER AA KHLE, A.; JESPERSEN, L. Detection and identification
of wild yeast in lager breweries. International Journal of Food
Microbiology, Amsterdam, v. 43, n. 3, p. 205-213, 1998.
VAN VUUREN, H. J. J. Gram-negative spoilage bacteria. In: PRIEST,
F. G.; CAMPBELL, I. (Ed.). Brewing Microbiology. 2 ed. London:
Chapman e Hall, 1996. p. 163-191.
VAUGHAN, A.; OSULLIVAN, T.; VAN SINDEREN, D. Enhancing the
microbiological stability of malt and beer A review. Journal of the
Institute of Brewing, London, v. 111, n. 4, p. 355-371, 2005.

VIZOSO PINTO, M. G.; PASTERIS, S. E.; STRASSER DE SAAD, A. M.

Glycerol catabolism by Pediococcus pentosaceus isolated from beer.
Food Microbiology, London, v. 21, n. 1, p. 111-118, 2004.
YAMAGISHI, H.; OTSUTA, Y.; FUNAHASHI, W.; OGATA, T.; SAKAI, K.
Differentiation between brewing and non-brewing yeasts using a
combination of PCR and RFLP. Journal of Applied Microbiology,
Oxford, v. 86, n. 3, p. 505-513, 1999.
YASUI, T.; YODA, K.; KAMIYA, T. Analysis of S-layer proteins of
Lactobacillus brevis. FEMS Microbiology Letters, Amsterdam,
v.133, n. 1-2, p. 181-186, 1995.

VENTURINI FILHO, W. G.; CEREDA, M. P. Cerveja. In: LIMA, U. A.

et al. Biotecnologia Industrial: biotecnologia na produo de
alimentos. So Paulo: Edgar Blcher, 2001. p. 91-144. v.4.

Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 10, n. 4, p. 240-251, out./dez. 2007

Reviso: Produo de Cerveja:

Microrganismos Deteriorantes
e Mtodos de Deteco

251