Para que um mtodo de teste de toxicidade de cosmticos seja tido
como alternativo experimentao em animais, preciso que ele atenda a, no mnimo, um dos trs Rs (Reduction, Refinement e Replacement) propostos por Russel e Burch em seu livro The Principles of Humane Experimental Technique, de 1959 que foi a primeira grande prublicao interessada pela questo tica do uso de animais cientificamente. Reduzir significa diminuir o nmero de animais usados nas pesquisas sem prejudicar os resultados por nmero insuficiente de cobais. Refinar significa modificar as tcnicas de experimentao para que se reduzam o nmero de animais usados e/ou a dor e o estresse que esses possam sentir durante as experincias. O uso correto de analgsicos e anestesias e abordagens menos invasivas so exemplos de refinamento. O terceiro R, melhor traduzido para substituio, prev a substituio do uso de animais por estudos alternativos que cheguem a resultados satisfatrios essa a forma mais difcil de ser atingida, porm a que previne totalmente o uso de animais. Esse captulo se extende sobre mtodos alternativos que atendam substituio dos animais nos estudos de toxicidade. Para que uma substncia seja dada como segura, ela precisa passar por uma srie de testes como toxicidade aguda, irritao e corroo drmica e ocular, sensibilizao e absoro drmica, toxicidade repetida (crnica), genotoxicidade (toxicidade de mutao) e cancerogenicidade. A principal alternativa ao teste desses riscos em animais a tcnica in vitro, que utilizam clulas, tecidos ou rgos como receptores das substncias. Esse mtodo, apesar de ser muito confivel em seus resultados, muito restritivo, o que demanda testes diversos para cada um dos riscos para se descobrir a toxicidade total de uma substncia h de ser feita uma bateria de testes, e no poucos testes porm mais abrangentes como em animais. Testes de toxicidade aguda buscam determinar a quantidade letal de uma substncia, por via oral, drmica ou inalatria. Esse estudo em animais causava dor e sofrimento e morriam aproximadamente 50% das cobaias aps a administrao de apeas uma dose. A alternativa atual mais aceta atravs de testes de citotoxicidade em diferentes linhas celulares e se medindo
diferentes parmetros de toxicidade como o contedo de protenas produzidas
por uma clula aps a receber a substncia. Tambm, tem se desenvolvido diversos softwares e mtodos in silico baseados na anlise estatstica relao entre a atividade qumica e estrutura de compostos. Os ensaios de irritao ocular seguem o mtodo de Draize (de meados dos anos 40), que consiste em aplicar a substncia diretamente na crnea de coelhos (animal eleito para o teste) e verificar o grau de leso que causa na crnea, iris e no tecido conjuntivo. Esse teste, alm de ser agressivo e causar a efeitos irreversveis nos animais, tem resultados muito subjetivos e pouco relacionados com o efeito em humanos. Existem algumas alternativas ao uso de animais como aplicar a substncia em crneas extradas de bovinos e coelhos (no retiradas em vida), na membrana corioalantide de ovos de galinha e em tecido humano reconstitudo e na observao da mudana da funo celular em microfisimetro de silicone. O ensaio de irritao drmica tambm se baseia no mtodo de Draizer, aplicao da substncia na pele de coelhos e verificao do grau de leso que tambm tem resultados muito subjetivos. Mtodos alternativos so o uso de pele humana reconstituda e kits comerciais que imitam a pele humana como Episkin, Epiderm, SkinEthic e Irritection que aps receberem substncias irritantes demonstram alterao na matriz por diferena de cor (alguns at especificam se houve alterao na derme, epiderme, tecidos mais internos). O risco de sensibilizao um dos mais adversos dos cosmticos, logo tratado como um dos mais importantes. O mtodo tradicional envolve o uso de ratos que tem a substncia injetada intradermicamente diversas vezes durante quase um ms. Esse mtodo necessita de diversas cobaias mas tem resultados mais objetivos. Alguns estudos alternativos j foram desenvolvidos como a aplicao em protenas que contm lisina e cistena, se a substncia reagir porque ele sensibilizante. Estudos de absoro drmica buscam identificar a margem de segurana de uma substncia entendendo o quanto essa pode passar ao sangue em condies normais de uso. O mtodo atual usa pele humana, que colocada em uma cmara com compartimentos separados, em um fica a epiderme e no outro o produto aplicado. A partir da passagem da substncia de um para outro se calcula a taxa de absoro.
Estudos de toxidade repetida (crnica) buscam identificar os riscos da
exposio contnua na vida dos animais por longos perodos (mais de um ms). Atualmente, no existem mtodos alternativos aos in vivo aceitos, porm h grande pesquisa para que se encontrem sadas como em clulas de fgado e rim e o estabelecimento de um sistema baseado na deteo de biomarcadores neurotxicos. Para se identificar a toxicidade na reproduo de substncias in vitro necessria uma bateria de testes. Alguns deles so colocar embries de ratos em um ambiente com a substncia e ver como reagem e o cultivo primrio de clulas neuronais e dos membros de embries de rato, observar o crescimento, a migrao e a segregao deles aps a aplicao da substncia pode indicar toxicidade. Uma substncia cancerigena se, ao ser inalada, ingerida, exposta sobre a pele ou injetada, induz tumores (benignos ou malignos). O mtodo in vivo utiliza animais trangnicos para reduzir o tempo de apario de tumores. A alternativa in vitro encontrada foi a utilizao de linhas celulares de embries de hamsters srios e de obtidas da prstata.