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FUNDAMENTO DE LA TCNICA
Como es sabido, las tcnicas espectroscpicas se basan en la interaccin de la
radiacin electromagntica con la materia. A travs de esta interaccin las molculas
pueden pasar de un estado energtico, m, a otro estado energtico distinto, l, absorbiendo
una cantidad de energa radiante igual a la diferencia energtica existente entre los dos
niveles:
tal que:
E l Em .
hc
E = h=
El
-34
Em
= Frecuencia de la radiacin=
10
c = velocidad de la luz=3.10
= longitud de onda
J.s
cm.s
-1
Estos trnsitos energticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva,
no son mas que el registro de las distintas o a las que se producen estos trnsitos
energticos.
Debido a la existencia de diferentes tipos de energa: de los electrones en si, de los
movimientos vibracionales de las molculas, de la rotacin de las mismas...etc, las
molculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnticas de un rango muy amplio
de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopas segn las diferentes
regiones. Un esquema podra ser el siguiente:
/ nm
10
Rayos Rayos x
electrones
Transitos
internos
nucleares
400
10 10
10
10
10
10
UV VIS INFRARROJO MICROONDAS ONDAS RADI O
electrones
externos
500
600
Vibraciones
Rotaciones
RMN
700
Espectrofotometra
pgina 2
LEY DE LAMBERT-BEER
Si se hace incidir radiacin monocromtica sobre una muestra con una
concentracin C de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda , la intensidad
I I 0 10l
c
aplicando logaritmos:
log I log I0 l c
reordenando trminos:
log I 0 log I l c
pudindose escribir :
I0
log I l c
I
Habitualmente, el cociente I0 se denomina trI ansmitancia de la muestra y se
suele
expresar como porcentaje de luz transmitida:
I0 100 . Por otra parte, se define la
A l c
donde es la absortividad molar (una medida de la radiacin absorbida), que es un valor
constante para cada sustancia a cada longitud de onda y en unas condiciones
experimentales determinadas; tambin se denomina coeficiente de extincin molar si,
como es frecuente, la concentracin se expresa en moles por litro.
Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un
determinado espesor, l , la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a la
concentracin molar de la muestra, c, lo que constituye el fundamento del anlisis
espectrofotomtrico cuantitativo.
Existen, sin embargo, distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de
Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al
anlisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de
concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona
las absorbancias con las concentraciones.
A A1 A2 1 l c1 2 l c2
Supongamos, entonces, que nuestro problema es el anlisis de una mezcla de dos
sustancias. En primer lugar se habr de registrar el espectro de absorcin de cada una de
ellas por separado, con lo que nos podremos encontrarnos en una de las dos situaciones
siguientes:
a) Ambos espectros no presentan solapamiento en el margen de longitudes de onda
de trabajo. El problema se reduce, entonces, a sendos anlisis por separado, cada
uno en la zona del espectro en donde cada componente de la mezcla se presenta
como nico absorbente.
b) Ambos espectros presentan solapamiento en una zona determinada de longitudes de
onda. En este caso se han de seleccionar dos longitudes de onda diferentes, 1 y
1
1
las
2, y obtener, con disoluciones de las sustancias
respectivas
2
, 2 ,puras,
,
absortividades molares a cada longitud de onda:
1
2
2 . Con estos datos
1
se pueden determinar las concentraciones de los dos componentes de la mezcla a
partir de las medidas de la absorbancia de la misma a las longitudes de onda de
trabajo seleccionadas, A y A . El clculo se realiza resolviendo el siguiente
sistema de 2 ecuaciones con 2 incgnitas:
1
1 1
Al c
l c
1
2
l c
l c
CARACTERSTICAS DE UN ESPECTROFOTMETRO
UV-VISIBLE
Lmpara
Lente
Fototubo
Rendija de entrada
Objetivo
Pa n
Rendija de salida
Prisma
Filtro
Cubeta
APLICACIONES DE LA TCNICA
Una de las aplicaciones prcticas de mayor inters de la espectrofotometra de
absorcin UV-Visible es la del anlisis cuantitativo, basada en la aplicacin de la ecuacin de
Lambert-Beer
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Se trata de analizar la composicin de una disolucin que contiene una mezcla del indicador
Azul de Bromotimol en su forma molecular HA (cida) y disociada A (bsica), las cuales
presentan absorcin en
la
regin VISIBLE del espectro. Las propiedades
espectrofotomtricas del Azul de Bromotimol en ambas formas son diferentes, lo que
permite su cuantificacin en disoluciones en las que aparecen mezcladas. Para ello habr
que registrar los espectros de absorcin de las dos formas (cida y bsica) y obtener las
correspondientes rectas de calibrado a dos longitudes de onda seleccionadas.
MATERIALES Y REACTIVOS
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a) Preparacin de disoluciones de la forma cida del Azul de Bromotimol:
Tomando como base una disolucin de partida, facilitada por el profesor, de Azul de
-5
Bromotimol 5.00.10 M en medio cido (HCl), preprense por dilucin las siguientes
disoluciones:
Disolucin A: En un matraz de 10 mL pipetear 8 mL de disolucin de partida y
enrasar con diluyente cido (HCl).
{ Disolucin B: En un matraz de 10 mL pipetear 6 mL de disolucin de partida y
enrasar con diluyente cido.
{ Disolucin C: En un matraz de 10 mL pipetear 4 mL de disolucin de partida y
enrasar con diluyente cido.
{ Disolucin D: En un matraz de 10 mL pipetear 2 mL de disolucin de partida y
enrasar con diluyente cido.
{
HA A H
(pKa=7.30)
Nota: Como el pKa del indicador es 7.30 no hay duda de que ste se encuentra
-2
totalmente bajo su forma bsica en NaOH 10 M .
Forma
bsica
1.000
Forma cida
0.000
400
500
700
600
Longitud de onda / nm
d) Obtencin de las rectas de calibrado para las formas cida y bsica del Azul de
Bromotimol:
A la vista de los espectros de absorcin de la forma cida y bsica del
indicador, se apreciar un mximo para la forma bsica en torno a 620 nm y un
mximo para la forma cida alrededor de 440 nm. Elegidos estos valores de longitud
de onda como los mas idneos, se mide la absorbancia de cada una de las
disoluciones preparadas en el apartado a) (disoluciones de la A a la D), ajustando
previamente el cero de absorbancia a cada longitud de onda con la referencia
adecuada. Con los datos de Absorbancia se elaboran las dos
tablas
correspondientes, una para la forma cida y otra para la forma bsica, que sern del
tipo:
Disolucin
-1
C / mol L
Absorbancia a 440
Absorbancia a 620
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-5
c /10 M
Las rectas que se obtienen son del tipo y ax, de forma que al compararlas con la ley de
Lambert-Beer se deduce que:
pendiente
y
x
y2y 1
x2x 1
pendiente
de donde:
HA
HA
-1
, A
pH pKa log
HA
pKa pH log
HA
Bibliografa
CONNOR, K.A., "Curso de anlisis farmacutico", Ed. Revert. 1980.
MIONES, J., "Manual de tcnicas instrumentales", Crculo editor Universo.
1978.