PRTICA I

1.

PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA E TCNICAS DE

MANUTENO DE CULTURA (REPIQUES)

1.1 OBJETIVOS DAS PRTICAS

-

Aprender os procedimentos de esterilizao de meios de cultura e de vidrarias.

Aprender a trabalhar de forma assptica visando evitar a contaminao das clulas e do
ambiente.
Preparar meios de cultura visando concentrao de culturas e os procedimentos para
iniciar um processo fermentativo.
Repicar as culturas visando sua manuteno e isolamento.
Aprender a diferenciar os meios de culturas para as bactrias, fungos filamentosos e
leveduras.

1.2 PREPARAO DOS MEIOS DE CULTURA

Meios de cultura so, em microbiologia, o nome que se d a associao, quali e
quantitativamente equilibrada, de substncias que, por natureza, permitem o cultivo dos
microrganismos fora de seu habitat, ou meio natural.
A possibilidade do cultivo artificial, e portanto, em condies previamente fixadas e sempre
reprodutveis, integra, junto com a esterilizao e a prtica assptica, o fundamento cientfico da
tcnica microbiolgica e possibilita a aplicao industrial dos microrganismos visando a
produo de bioprodutos.
Classificao dos meios de culturas:
- Quanto apresentao, podem ser lquidos e slidos. Os lquidos so usados quando se
deseja um grande nmero de clulas, sendo muito usado principalmente para iniciar uma
fermentao ou como p de cuba para grandes escalas. Os meios slidos so usados
principalmente para o isolamento de espcies microbianas, para conservao de cultura e
para o esgotamento. Para fazer o meio slido utiliza-se o polissacardeo Agar-agar.
- Quanto origem dos constituintes, naturais e sintticos.
- Quanto natureza dos constituintes, meios minerais (todos os constituintes so minerais),
meios orgnicos (fontes de carbono so acar, protenas ou aminocidos), meios mistos
(fonte de carbono orgnico e demais componentes minerais) e meios complexos (alm de
fontes de carbono, nitrognio e enxofre tm-se fatores de crescimento como vitaminas).
- Quanto finalidade eles podem ser: meios de cultivo, meios de enriquecimento, meios de
identificao, meios diferenciais, meios especiais e meios para conservao. Para as
bactrias os meios mais indicados so o caldo simples ou gelose nutriente e o meio de
Huddlesom. Para leveduras as geloses Sabourand ou YED e para os bolores as geloses
Czapeck e Sabourand.
1.2.1 Procedimento Experimental
Preparao dos meios de cultura
A solubilizao dos componentes muito importante para a produo de meios claros,
proporcionando melhor observao de crescimento dos microrganismos nele cultivados e a
presena de contaminantes no mesmo.
a) OS sais minerais devem ser pesados de acordo com a formulao de cada meio, dissolvidos
em um bquer contendo quantidade suficiente de gua destilada.

b) Os acares, a peptona, o extrato de carne e de levedura devem ser pesados e a seguir

dissolvidos separadamente em um bquer contendo gua destilada. Se houver dificuldade de
dissolver os dois ltimos deve-se aquec-los levemente.
c) O agar-agar (para meios slidos) deve ser pesado e a seguir dissolvido em presena de gua
e aquecido para dissoluo e posteriormente reunidos os demais componentes.
Juntar em erlenmeyer as solues obtidas na seguinte ordem: peptona, extratos, sais minerais,
acares, outros componentes se houver e Agar-agar. Ajustar o pH com soluo 0,1 N de cido
clordrico ou 0,1 N de hidrxido de sdio dependendo do pH do meio. Se o meio apresentar
proceder a clarificao com a filtrao vcuo do mesmo utilizando funil de Buchner e filtro de
papel em meio sem gelose e filtro d algodo hidrfilo para meio com gelose (neste caso o
mesmo deve estar aquecido de 80 a 90C). Enquanto alguns alunos preparam os meios de cultura
outros preparam as rolhas de algodo e gases para os recipientes que receberam os meio.
A DISTRIBUIO DOS MEIOS EM ERLENMEYER E GARRAFAS DE VIDRO QUE
POSSAM SER AUTOCLAVADAS PARA SER UTILIZADO EM EXPERIMNTOS DE
QUANTIFICAO DE MICRORGANISMOS E EM TUBOS DE ENSAIO para a manuteno
de cultura. Esses recipientes devem estar tampados com rolhas feitas de algodo e gases.
Para a distribuio utiliza-se funil de vidro, adaptado com uma mangueira de borracha
vedada por uma pina na ponta. Deixar a gelose escorrer sem molhar a boca dos recipientes,
seno a rolha de algodo pode aderir as paredes do tubo de ensaio ou do erlenmeyer. Em tubos
de ensaios deve-se adicionar de 5 a 20 mL dependendo do dimetro do tubo.
Terminada a distribuio, os tubos de ensaios, garrafas de vidro e erlenmeyer de vidro so
arrolhadas com rolhas de algodo e gases, condicionadas em cestas e recobertas com papel
impermevel e levados esterilizao. Para meios com glicose e lactose utilizar 110 0C por 15
minutos para os meios sem essas substncias utilizar 121 0C e 20 minutos.
Aps a esterilizao os meios em tubos de ensaios que sero utilizados para conservao de
cultura devem ser colocados inclinados visando solidificar a gelose de forma escorrida at a
metade do tubo de ensaio, com a finalidade de aumentar a rea para o esfregao da cultura.
Frmulas dos meios de cultura:
Caldo Nutriente (Simples) Para cultivo e contagem em placa de bactrias aerbias totais.
Extrato de carne de boa fabricao (por exemplo: Difco e BBL) (3 g); peptona (10g); fosfato de
potssio dibsico (1 g); cloreto de sdio (5g); agar-agar (30 g); gua destilada (1 L). Ajustar o
pH para 7,4 a 7,6. Esterilizar a 121 0C/ 20 minutos.
Meio YMA Tambm para o cultivo e a contagem em placa de bactrias aerbias totais.
Glicose 10 g, Extrato de levedura (3,0 g); Peptona (5,0 g); agar-agar (18-19 g); gua destilada
(1L). Ajustar pH para 6,0. Esterilizar a 120 0C/ 20 minutos.
Gelose Sabouranddextrose - Para cultivo e contagem em placa de leveduras e fungos no
filamentosos.
Peptona (10g); dextrose (40g); agar-agar (20 g) e gua destilada (1L). Ajustar o pH em 5,5.
Esterilizar a 110 0C por 15 minutos.
Gelose Czapeck - Para cultivo e contagem em placa de fungos filamentosos.
Glicose (20 g); nitrato de sdio (2g); fosfato dibsico de potssio (1g); sulfato de magnsio (0,5
g); cloreto de potssio (0,5 g); sulfato ferroso (0,01 g); sulfato de amnio (1g); agar-agar (20 g)
e gua destilada (1L). Ajustar o pH em 5,5 e esterilizar a 110 0C por 15 minutos.