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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

OBSERVACIN DE EXTENDIDOS CROMOSMICOS


RESUMEN
El presente trabajo muestra los resultados de la observacin de un extendido cromosmico, a partir de un previo cultivo
celular. Los extendidos cromosmicos son un mtodo sencillo para identificar una lnea de clulas y relacionarla con la
especie a la que pertenece, permitiendo tambin distinguir entre clulas normales o aquellas que presentan aberraciones
cromosmicas, mediante la determinacin del nmero de cromosomas, tamao y ubicacin del centrmero. La
observacin se realiz directamente a una placa ya preparada, previamente se le hizo una tincin homognea con Giemsa.
El extendido revelado con la tincin homognea mostro los cromosomas en metafase y ncleos tanto activos como
inactivos, y se logr identificar por observacin directa al microscopio el nmero de cromosomas y diferenciar aspectos
generales de ellos como morfologa y estructura. Se encontr que la placa estudiada corresponde a clulas somticas
(diploides) de la especie Homo Sapiens ya que presenta en promedio 46 cromosomas. El clculo del ndice mittico fue
del 5,3 % indicando la baja proliferacin de las clulas al momento de realizar el extendido.
Palabras Clave: Tincin homognea, extendido cromosmico, nmero de cromosomas, mitosis, ndice mittico.

________________________________________________________________________________________
Introduccin
La obtencin de un extendido cromosmico y su
respectivo
anlisis
requieren
de
clulas
provenientes de
un cultivo primario o un
subcultivo de una lnea celular ya establecida
(Navarro y Carlos, 2011).

Es importante resaltar que el ADN es la molcula


que contiene toda la informacin gentica de un
individuo que al expresarse determina las
caractersticas fenotpicas y genotpicas que
identifica a cada especie en la naturaleza (Tamar
Silva, C.; Contreras N.; Fonseca D, 2008)
Las clulas de los organismos eucariotas realizan la
divisin celular como estrategia para conservar la
informacin gentica, duplican y distribuyen en
partes iguales su material gentico para dar origen
a dos clulas hijas con el mismo nmero de
material gentico en el caso de la mitosis o cuatro
clulas hijas con la mitad de la informacin
gentica en el caso de la meiosis. Durante estas
divisiones se forman los cromosomas constituidos
por ADN (Tamar et al., 2008), en algunas
circunstancias en estas divisiones se presentan
aberraciones cromosmicas de tipo numrico o
estructural, que pueden resultar inadvertidas o
fatales.
El estudio del estado de los cromosomas es una
til herramienta para la identificacin de gnero y
anomalas genticas que se determinan fcilmente

por medio de la observacin de una serie de


caractersticas como morfologa, estructura, bandeo
y nmero que es particular para las distintas
especies (Freshney, R. 2009)
Para realizar un estudio cromosmico de clulas
mamferas se prefiere que estn tengan alta
capacidad de proliferacin si se estimulan con
agentes inductores de la divisin celular (Lpez; Juan.
Mrquez; Mara. 2002)
En este informe se presentan los resultados de la
observacin de un extendido cromosmico , el cual
se obtuvo a
partir de ciertas pautas que
consistieron principalmente en estimular y detener
la divisin celular de las clulas en metafase,
debido a que en esta fase mittica los cromosomas
se encuentran perfectamente individualizados ,
organizados en el plano ecuatorial de la clula y
adquieren mayor grado de compactacin , lo cual
facilita la observacin al microscopio (Campuzano;
German. 2008) .
Para favorecer el anlisis cromosmico se realizan
tinciones, como la coloracin homognea con
Giemsa al 5%, que presenta una afinidad por los
cidos nucleicos, en adicin se pueden implementar
otras tcnicas de tincin, como la diferencial que
permite realizar un anlisis ms a fondo del estado
de los cromosomas, ya que estas tcnicas permiten
la observacin de bandas a lo largo de los
cromosomas

La tincin de ncleos con Giemsa revela en una


tonalidad de rosados el estado de ellos, los
estimulados de color rosado claro, los no
estimulados morado oscuro y los cromosomas en
la mitosis se observan teidos de morado ( Alzate;
Mnika. Lpez; Juan. Mrquez; Mara. 2006).
La prctica realizada tiene como propsito observar
detalladamente un extendido cromosmico
obtenido a partir de tcnicas de cultivo celular,
para identificar caractersticas visuales de la
morfologa y estructura de los cromosomas, y
determinar el nmero de cromosomas de las
mitosis y de esta manera la especie a la que
pertenece , mediante pautas de reconocimiento
adecuadas. Tambin es objetivo calcular el indicie
mittico y evaluar la presencia o no de anomalas
cromosmicas relacionadas con patologas.
2. Metodologa
Cultivo con mitgeno y sincronizador
Las clulas son tomadas de un cultivo primarios en
condiciones de asepsia usando heparina como
anticoagulante, (Lpez et al., 2002). El sembrado se
realiz en medio RPMI 1640 (ampliamente usado
para cultivos primarios,con SFB el cual aporta los
factores de crecimiento y las hormonas;
fitohemaglutinina (mitgeno) para estimular el
crecimiento de los linfocitos; antibitico penicilina
y estreptomicina.La fitohemaglutinina, hormona de
origen vegetal, fue extrada de extracto de frijol
cargamanto. Para la cosecha de las clulas se
agrega Colcemid 10 ug/ml (agente sincronizador)
(Lpez et al., 2002), este qumico detiene la divisin
celular en la etapa de metafase (Zon; Mar., 2004). Se
homogenizo el cultivo por agitacin suave y se
incubo.
Tratamiento hipotnico
Las clulas se pasaron tubos Falcon, se centrifugo
se descart el sobrenadante. se re suspendi la
solucin con KCl 0.075M. La solucin de KCL es
hipotnica fuerte que provoca un movimiento neto
de agua hacia dentro de la clula y esta explota por
turgencia.
Fijacin
Se centrifuga y al pellet se agrega una solucin
fijadora con metanol y cido actico glacial en
proporcin 3:1 tambin llamado fijador Carnoy
este fijador modifica la clula mediante la
estabilizacin de las protenas de modo que hace la
clula resistente a los cambios posteriores. Carnoy
es un fijador tipo coagulante que transforma las
protenas en estructuras insolubles manteniendo la

morfologa de las estructuras celulares a nivel de


microscopa de luz [7].
La muestra se mantuvo expuesta al fijador por un
tiempo de 10 min a temperatura ambiente. Luego
se centrifugo a 1000 g por 7 minutos, se descarto el
sobrenadante y se resuspendi el pellet en fijador
,se centrifugo nuevamente. Este paso se realiz 3
veces hasta que se logr obtener una solucin
translucida. La muestra se almaceno a -20 C hasta
el da del goteo.
Dispersin sobre portaobjetos
Para el goteo, los portaobjetos o lminas son
limpiados exhaustivamente con etanol al 70 %,
introducido en agua destilada con hielo con el fin
de generar un choque trmico en el goteo, el cual se
realiz desde una altura de 45- 60 cm. Es
importante tener en cuenta que la altura es clave
para realizar un adecuado choque mecnico, pues
permite que las clulas estallen y as se puedan
liberar los cromosomas. Se flameo cuidadosamente
hasta lograr que se elimine toda la humedad de la
placa.
Coloracin homognea:
El colorante Giemsa se agreg directamente a las
placas y se dej por 5 min, luego se lav con
abundante agua destilada, se fij nuevamente con
flameo, y posteriormente de sellaron las placas con
xilol usando cubreobjetos.
Observacin al microscopio y conteo:
Se observ directamente al microscopio, Anexo 6.
y se procedi a contar el nmero de ncleos
estimulados, no estimulados y mitosis en metafase,
para esto se hizo un barrido de forma ordenada en
40x, y posteriormente con los resultados se
determin el ndice mittico, Ecuacin (1).

*Ncleos Totales = Ncleos Estimulados + Mitosis


Ecuacin (1)
3. Resultados
3.1
MMorfologa estructura de los cromosomas
Como se observa en el Anexo 7, se logr identificar
algunas partes que constituyen el cromosoma,
como lo son los telmeros, el centrmero y sus
brazos.

3.2.
ndice mittico:

Ncleos
No de
Ncleos
Ncleos
en
placa
Estimulados
totales
metafase
66-14-1-18
1911
108
2019
Tabla 1. Conteo de ncleos activos y ncleos en
metafase.
Con los datos de la Tabla 1 y con la Ecuacin 1 se
calcul el valor del ndice mittico que es igual a
5,3%.
3.3
Nmero de cromosomas de la especie estudiada:
A partir de las fotografas de los Anexos 1-5 se
realiz el conteo de cromosomas. Tabla 2.
Numero de
cromosomas
1
46
2
46
3
45
4
46
5
46
Promedio
45,8
Especie
Homo sapiens
Tabla 2. Nmero de cromosomas promedio
presentes en metafase de la especie estudiada.
Metafase

4. Discusin
El valor obtenido del ndice mittico 5,3%, indica
que hay una gran cantidad de ncleos en interface
con respecto a los que alcanzaron metafase en
mitosis, es decir slo el 5,3% de los ncleos que
haba en interface alcanzaron la metafase en la
placa analizada. Este parmetro en trminos de
tiempo est definido como la duracin relativa de
la mitosis en relacin a la duracin total del ciclo.
Indicando de esta manera que la mitosis de estas
clulas en los ncleos ocurre en un tiempo
demasiado corto, comparado con el resto de su
ciclo celular. Si el ciclo celular mittico de unas
clulas mamferas en promedio tiene una duracin
entre 48 a 72 horas, la mitosis solo dura entre 7,3 a
11 horas.
El ndice mittico bajo puede un indicativo directo
de evidencia de problemas patolgicos ( Lpez et al.,
2002).
La presencia de este porcentaje de mitosis en el
extendido se debi principalmente al papel que
juega el Colcemid o sincronizador, que inhibe que
el huso cromtico se adhiera a los cromosomas y de
esta manera no tenga lugar la anafase y se puedan

obtener los cromosomas en metafase (Lpez


2002).

et al.,

Los extendidos cromosmicos coloreados con


Giemsa al 5% , no permiten ver bandas ni
caractersticas muy particulares y especficas de los
cromosomas , por lo que se usa con el fin de
calcular el ndice mittico , la determinacin del
nmero de cromosomas y el tipo de cromosomas
dependiendo de la ubicacin del centrmero (Lpez
et al., 2002).
La calidad del extendido cromosmico influye en
la visualizacin de los cromosomas , puesto que la
longevidad
de
estas
placas
puede
ir
desnaturalizando el ADN , haciendo que los
cromosomas no sean vean bien definidos por lo que
es preferible hacer la visualizacin lo ms rpido,
en cuanto se haya fijado la placa y as obtener
resultados ms certeros.
La dotacin cromosmica que se obtuvo fue de 46
cromosomas aproximando el promedio, lo que
indica que posiblemente estos ncleos pertenecen a
clulas de la especie Homo Sapiens, o en el caso
ms particular de la especie de liebre, Lepus
europaeus que tambin tiene el mismo nmero de
cromosomas.
Por otro lado la presencia de un valor muy cercano
a 46 como 45 o 47 no indicara la dotacin
cromosmica de otra especie, sino ms bien,
anomalas cromosmicas de tipo numrico, como
lo son las aneuploidas, si es 45 podra ser un
monosoma (2n-1) o si es 47 podra ser una
trisoma (2n+1) estas mutaciones conllevan a
patologas graves en el ser humano como lo son los
sndromes de Turner , Hlinefelter , Sper Macho ,
Down entre otras que son letales (Susuki, D. 1994).
5. Conclusiones
Se logr determinar el nmero de cromosomas de
la placa estudiada, el individuo posee una dotacin
cromosmica diploide (2n) con un total de 46
cromosomas que corresponde a la dotacin
cromosmica normal de un humano sano.
El bajo valor del ndice mittico 5,3 % se debe
quiz a la naturaleza de las clulas cultivadas que
presentan problemas de divisin celular
evidenciados en mutaciones posiblemente de tipo
estructural por lo que habra que realizar un bandeo

para analizar esta hiptesis, o se asume que fueron


linfocitos obtenidos de cultivo primario de sangre
perifrica, que no fueron cultivados a las
condiciones ptimas , tiempo y temperatura , y
reactivos en buen estado como el anticoagulante ,
el mitgeno y el sincronizador .
El ndice mittico podra estar sujeto a cierta
variacin, dado que en la visualizacin del
extendido se observaron ncleos estimulados
rosados muy grandes que contenan cromosomas
morados en mitosis en su interior, que por causas
de un goteo no ptimo, no se produjo el choque
mecnico e hipotnico adecuado y homogneo para
toda la placa, por lo que no se consideraron estas
posibles mitosis, lo que hubiera aumentado en un
cierto porcentaje el valor del ndice mittico.

Anexos.
Anexo 1. Mitosis en metafase No1.

Anexo 2. Mitosis en metafase No2

Para prximas prcticas se sugiere hacer el anlisis


del extendido cromosmico con placas hechas
recientemente
para
poder
observar
ms
diferenciados y ntidos los cromosomas y de esta
manera poderlos contar adecuadamente y dar un
resultado ms fiable.
Para mejorar los resultados se sugiere usar agentes
qumicos nuevos, no antes usados o lo ms puros
posibles para obtener cromosomas con una
constitucin ms definida libres de ruido o
interferencia de suciedades o contaminantes;
Procurar no usar simultneamente los mismos
reactivos para diferentes muestras a evaluar , para
as evitar resultados alterados con muestras
distintas a la de inters.
Los
extendidos
cromosmicos
obtenidos
permitieron evaluar la forma, estructura y nmero
de cromosomas presentes en los linfocitos de
humano, lo que resalta la buena calidad de los
resultados, dado tambin, que se desarroll con
detalle el protocolo propuesto por el Laboratorio de
Gentica y Biotecnologa Animal, que es un
protocolo validado y aplicado para estudios de
carcter investigativo en el mismo laboratorio.
Para la deteccin de aberraciones estructurales en
los cromosomas como borrados, duplicaciones,
sutiles translocaciones, al igual que la
identificacin de cromosomas marcadores, es
esencial realizar una tincin diferencial usando
Giemsa que produce una alternancia de bandas
claras y oscuras a lo largo de los cromosomas que
permiten una fcil caracterizacin del extendido
pues cada cromosoma tiene un patrn de bandas
caracterstico.

Anexo 3. Mitosis en metafase No3.

Anexo 4. Mitosis en metafase No4.

Anexo 5. Mitosis en metafase No 5.

Anexo 6. Campo visual de los ncleos estimulados


(grandes rosados) y no estimulados (pequeos
violetas) y mitosis en metafase (cromosomas
dispersos).

Anexo 7. Estructura observable al microscopio de


un cromosoma.