Preparacion de Biosensores Enzimaticos e Inmunosensores Basados en Elctrodos Modificados Con Nanoparticulas de Oro

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

Departamento de Qumica Analtica
PREPARACIN DE BIOSENSORES ENZIMTICOS E

INMUNOSENSORES BASADOS EN ELECTRODOS
MODIFICADOS CON NANOPARTCULAS DE ORO
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR
Vernica Carralero Sanz
Bajo la direccin de los doctores

Jos Manuel Pingarrn Carrazn, Paloma Ynez-Sedeo Orive y
Araceli Gonzlez Corts
Madrid, 2009
ISBN: 978-84-692-2774-9
Vernica Carralero Sanz, 2008
PREPARACIN DE BIOSENSORES ENZIMTICOS

E INMUNOSENSORES BASADOS EN ELECTRODOS
MODIFICADOS CON NANOPARTCULAS DE ORO
TESIS DOCTORAL PRESENTADA POR:

Vernica Carralero Sanz
Madrid, 2008
Universidad
Complutense
de Madrid
Departamento
de Qumica
Analtica
Facultad
de Ciencias
Qumicas
Todocomenzhaceseisaos,allporel2002,cuandoenquintodecarrera
decidcogerlaasignaturaProyecto,enaquellosmomentossentalacuriosidadde
conocerloqueeratrabajarenunlaboratoriodeInvestigacin.Lorecuerdocomo
sifueraayercuandoAracelimefuepresentandoacadaunadelaspersonasque
en este laboratorio trabajaban, explicndome en todo momento que hacia cada
unoyquetcnicaempleaba.Todomesonabararsimo,peroasuvezmesupona
ungranreto,debaaprendercadaunadeesastcnicasqueseempleaban,utilizar
cadaunodeesosaparatosqueparecantandistintos,ydisearunosdispositivos
que fueran capaces de medir concentraciones muy bajas con el fin de obtener
buenosresultados,queenunfuturopodranpublicarse.Eracomounjuego,enel
que si llegabas al final tenas la posibilidad de volverte ms o menos famoso
dependiendodeuntalndicedeimpacto.
En estos momentos parece como si el juego que comenc hace seis aos
llegar a su final, sintiendo por un lado una gran alegra porque por fin veo
reflejado todo el esfuerzo realizado durante este tiempo, y por otro miedo e
incertidumbreporlasdecisionesqueahorahedetomar.
Duranteestetiempohansidomuchoslosmomentosbuenosquehevivido,
perotambinhahabidomomentosdedesesperacinydeagobio,sintindomeen
ocasiones como en un tiovivo con los altibajos que ello conlleva. An as, me
quedo con un buen recuerdo, porque tanto en los buenos como en los malos
momentossiemprehepodidocontarcondiferentespersonas,capacesdealegrarse
conmigo y dispuestos a ayudarme e intentar encontrar soluciones a problemas
queparecanimposibles.Porestemotivo,megustaraagradeceratodoslosque
deunamanerauotrahanestadoamiladoduranteestetiempoysinloscuales
no hubiera sido posible encontrarme en estos momentos escribiendo estas
palabras.
Por ello, me gustara agradecer a mis directores de Tesis la Dra. Araceli

Gonzlez, la Dra Paloma Ynez y. el Dr. J.M. Pingarrn, toda su ayuda y su
dedicacin durante este tiempo, sin la cual no hubiera sido posible sacar esta
Tesisadelante.
Tambin me gustara mencionar a todas aquellas personas que durante
este tiempo han pasado o an se encuentran en el laboratorio, especialmente a
Ana, Bea, Loli, Susana, Mara, Javi, Vane, Oscar y Marcos, por toda vuestra
ayudaycomprensinporquesindudasoislosquemejorentendislosaltibajos
que una Tesis conlleva, y sobretodo por haberme demostrado que no slo sois
compaerosdetrabajo,sinoamigosconlosquesiemprepodrcontar.Muchas
graciasatodos!!
A Lourdes, por aportar sus toques de creatividad a esta Tesis, por sus
nimos en los momentos de desesperacin y por estar siempre dispuesta a
ayudarme.
A Jess, por el toque de humor que da cuando llega al laboratorio, por
sacarmesiempreunasonrisayporhacermeverlopositivodelascosas.
A Gema y a Vanesa, las orgnicas, compaeras y amigas desde que
empezamoslacarrera.Lastreshemosseguidocaminosidnticos,porloquecasi
noshemosvueltoinseparables.Juntashemoscompartidomomentosinolvidables
yseguiremoscompartiendoyaquedesdehaceapenasunosmesessoistestigosde
todosmispasos,ggg.
Amisamigosdelpueblo,especialmenteaDavid(elchirri),Asun,Alberto
(tamayito), Esther (ricillos) y a Juanje (mi cuaooo) por todos los buenos
momentos que hemos compartido, por haber crecido juntos y poder contar
siempreconvosotros.
Amispadresyhermana,portodosuapoyoycarioalolargodemivida,
por estar siempre a mi lado, ayudarme, comprenderme y aguantarme en los
momentosdeagobioenlosquemevuelvoinsoportable.Osquiero!
Muyespecialmentea Javi,por su ayuda ypaciencia, por estar siemprea
mi lado, por hacerme sonreir incluso en los malos momentos y por la vida que
juntosvamosacompartir(Twop).
Yporltimo,agradeceralMinisteriodeEducacinyCiencialaconcesin
delabecaPredoctoraldeFormacindePersonalInvestigadoryalafinanciacin
delProyectoBQU:200300365.
A mis padres y hermana
NDICE
ndice
Pgina
I.INTRODUCCIN
I.1. OBJETIVOYPLANDETRABAJO ......................................................3
I.2. CARACTERSTICASGENERALESDELAS
NANOPARTCULASDEORO .............................................................7
I.3. ELECTRODOSMODIFICADOSCON
NANOPARTCULASDEORO .............................................................13
I.4.BIOSENSORESELECTROQUMICOSBASADOSENEL
EMPLEODENANOPARTCULASDEORO(nAu).........................19
I.4.1. Biosensoresenzimticos .......................................................19
I.4.2. Inmunosensoreselectroqumicos ........................................35
I.5.ANALITOSYANTECEDENTESBIBLIOGRFICOS......................48
I.5.1. Compuestosfenlicos ...........................................................48
I.5.2. Antecedentesbibliogrficossobrela
determinacindecompuestosfenlicoscon
biosensoresamperomtricos..................................................50
I.5.3. Progesterona.............................................................................61
determinacindeprogesteronaempleando
inmunosensoreselectroqumicos .........................................62
I.5.5. Inmunoglobulinas ...................................................................64
ndice
Pgina
determinacindeinmunoglobulinas
empleandoinmunosensoreselectroqumicos .....................66
II.PROCEDIMIENTOSEXPERIMENTALES
II.1.
BIOSENSORDETIROSINASABASADOENUN
ELECTRODODECARBONOVITRIFICADO
MODIFICADOCONNANOPARTCULASDEORO ..................75
II.1.1. Preparacindelelectrododecarbonovitrificado
modificadoconnanopartculasdeoroyTirosinasa ....................75
II.1.2. Caracterizacindelrecubrimientoelectrdico .............................78
II.1.2.1.Determinacindelrecubrimiento....................................................79
II.1.2.2.Espectroscopiadeimpedanciaelectroqumica(EIS) .................... 79
II.1.2.3.Microscopiaelectrnicadebarrido .................................................83
II.1.3 Medidadelndicebioelectroqumicode
polifenolesenvinoempleandounbiosensorde
TirnAuGCE .......................................................................................85
II.1.4. Medidadelndicedepolifenolesenvinomediante
elmtodoespectrofotomtricoFolinCiocalteau..........................85
II
ndice
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II.2.
PREPARACINDEUNBIOSENSORCOMPSITO
DEGRAFITOTEFLNMODIFICADOCONORO
COLOIDALYTIROSINASAPARALA
DETERMINACINDELCONTENIDODE
POLIFENOLESENMUESTRASAMBIENTALES.........................87
II.2.1. PreparacindelbiosensorcompsitoTirAucol
grafitoTefln........................................................................................ 87
II.2.2. Clculodelaactividadenzimtica ................................................... 89
II.2.3. Clculodelreaelectroqumicadeloselectrodos
grafitoTeflnygrafitoTeflnorocoloidalmediante
mediantevoltamperometracclicay
cronoamperometra .............................................................................90
II.2.4. Clculodelcoeficientededifusindelfenol...................................92
II.2.5. Clculodelcoeficientedetransferenciaelectrnica
paraelfenol ..........................................................................................92
II.2.6. Estimacindelcontenidototaldecompuestos
fenlicosenaguas................................................................................92
II.2.7. Estimacindelcontenidototaldecompuestos
fenlicosenmuestrasdealpechn....................................................96
III
ndice
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II.3.
DESARROLLODEINMUNOSENSORES
COMPSITOSGRAFITOTEFLN
MODIFICADOSCONOROCOLOIDALPARALA
DETERMINACINDEPROGESTERONAEN
MUESTRASDELECHE.......................................................................96
II.3.1. Preparacindelinmunosensorbasadoenun
electrodoAucolgrafitoTefln ..........................................................97
II.3.2. Realizacindelinmunoensayocompetitivo
simultneo ............................................................................................98
II.3.3. Clculodelcoeficientededifusindelnaftol .................................99
II.3.4. Clculodelcoeficientedetransferenciaelectrnico
delnaftol ...............................................................................................99
II.3.5. Preparacindelinmunosensorbasadoenelempleo
deunbiosensordeTirAucolgrafitoTeflncomo
transductor............................................................................................101
II.3.6. Determinacindeprogesteronaenleche.........................................102
II.4. INMUNOSENSORAMPEROMTRICOPARA
INMUNOGLOBULINAGUTILIZANDOCOMO
TRANSDUCTORUNBIOSENSORDE
TIROSINASAOROCOLOIDALGRAFITO
TEFLN................................................................................................104
II.4.1. Preparacindelinmunosensor ..........................................................104
IV
ndice
Pgina
II.4.2. Realizacindelinmunoensayotiposndwich...............................105
II.4.3. DeterminacindeinmunoglobulinaGensueros ........................... 105
III.RESULTADOSYDISCUSININTEGRADA
III.1.
BIOSENSORESDETIROSINASABASADOS
ENELEMPLEODEDIFERENTES
SUPERFICIESELECTRDICAS
MODIFICADASCONNANOPARTCULASDE
ORO .........................................................................................................109
III.1.1.Biosensordetirosinasabasadoenelempleodeun
electrododecarbonovitrificadomodificadocon
nanopartculasdeoroelectrodepositadas......................................111
III.1.1.1.Caracterizacinmediantetcnicaselectroqumicas ..................... 111
III.1.1.2.AspectosmsrelevantesdelbiosensorTirnAu
GCE........................................................................................................117
III.1.2.Biosensordetirosinasabasadoenunelectrodo
compsitodegrafitoteflnmodificadocon
nanopartculasdeoro.........................................................................123
III.1.2.1.Caracterizacindelasuperficieelectrdica
mediantetcnicaselectroqumicas.................................................123
ndice
Pgina
III.1.2.2.AspectosmsrelevantesdelbiosensorTirAucolGT................... 132
III.1.3.ComparacindelosbiosensoresTirnAuGCEyTir
AucolGT ...............................................................................................143
III.2
DESARROLLODEINMUNOSENSORES
BASADOSENSUPERFICIESCOMPSITAS
NANOESTRUCTURADAS .............................................................146
III.2.1. INMUNOSENSORESCOMPSITOSPARALA
DETERMINACINDEPROGESTERONA .................................147
III.2.1.1.Inmunosensorbasadoenelempleodeun
electrodocompsitodegrafitoTefln
modificadaconnanopartculasdeoro.........................................147
III.2.1.1.1.Estudiosdelaoxidacinelectroqumicadel
naftolsobreloselectrodosgrafitoTeflnygrafito
Teflnmodificadoconnanopartculasdeoro..............................147
III.2.1.1.2.Aspectosmsrelevantesdelinmunosensor
basadoenunelectrododeAucolgrafitoTefln........................... 151
III.2.1.2.Inmunosensorbasadoenunasuperficiede
grafitoTeflnmodificadaconnanopartculasde
oroyTirosinasa................................................................................154
VI
ndice
Pgina
III.2.1.2.1.Caracterizacindelassuperficieselectrdicas
medianteespectroscopiadeimpedancia
electroqumica ...................................................................................154
III.2.1.2.2.Aspectosmsrelevantesdelinmunosensor
basadoenunelectrodoTirAucolgrafitoTefln ........................156
III.2.1.3.Comparacindelosinmunosensoresbasadosen
unasuperficieelectrdicaAucolgrafitoTeflny
TirAucolgrafitoTefln.....................................................................159
III.2.2. INMUNOSENSORCOMPSITOPARALA
DETERMINACINDEINMUNOGLOBULINAG
ENSUERO ...........................................................................................161
III.2.2.1.Aspectosmsrelevantesdelinmunosensor
basadoenunbiosensorTirAucolgrafitoTefln
comotransductor .............................................................................161
III.3.PUBLICACIONES ......................................................................................165
IV.CONCLUSIONES .................................................................. 233

V.BIBLIOGRAFA ....................................................................... 239
VI.GLOSARIODEABREVIATURAS ...........................................259
VII
INTRODUCCIN

Introduccin
I.1.OBJETIVOYPLANDETRABAJO
ElOBJETIVOprincipaldeestetrabajohasidoaprovecharlasventajasdel
empleo de superficies electrdicas nanoestructuradas para el desarrollo de
biosensores electroqumicos con caractersticas analticas mejoradas con
respecto a otros diseos y la aplicacin de los mismos a muestras reales de
inters.
Dicho objetivo se encuadra dentro de los previstos en los siguientes
ProyectosdeInvestigacinsubvencionados:Desarrollodenuevosbiosensores
para la deteccin rpida de microorganismos patgenos en alimentos,
BQU200300365;Desarrollodebiosensoresbasadosenelectrodosdesuperficie
nanoestructurada para la determinacin de parmetros de calidad en
alimentos, PR27/0513860 y Diseo de superficies nanoestructuradas para la
deteccindemolculasbioactivasenalimentos,CTQ200602905/BQU.
ElPLANDETRABAJOdesarrolladoparaalcanzarelobjetivomarcado,
constadelassiguientesetapas:
1.
Estudio del comportamiento electroqumico de los biosensores
enzimticos e inmunosensores empleando superficies nanoestructuradas con

nanopartculasdeoro.
Con objeto de evaluar el efecto de las nanopartculas de oro sobre el
comportamiento electroqumico de los biosensores, se utilizarn diferentes
tcnicas electroqumicas como voltamperometra cclica o amperometra en
disolucinagitada,comparndoselosresultadosconlosobtenidosempleando
biosensores preparados en idnticas condiciones pero en ausencia de
nanopartculas. Lasmejoras obtenidasen sensibilidad,reproducibilidad delas
medidas,ascomoenlaestabilidaddelosdispositivospreparados,permitirn
3

Introduccin
demostrar las excelentes propiedades conductoras y catalticas de este
nanomaterial,ascomosuadecuacinparainmovilizarmolculasbiolgicassin
producirseprdidasapreciablesdesubioactividad.
2.
Desarrollo de biosensores enzimticos y amperomtricos para la
determinacindecompuestosfenlicos.
Con el fin de preparar biosensores enzimticos amperomtricos para la

determinacin de compuestos fenlicos, se emplearn diferentes superficies
electrdicas y distintas estrategias de modificacin de las mismas, empleando
siempre nanopartculas de oro. As, se preparar un biosensor basado en un
electrodo
de
carbono
vitrificado
modificado
con
nanopartculas
electrodepositadas,yseconstruirnbiosensoresenzimticoscompsitos,donde
las nanopartculas se incluirn dentro de la propia matriz electrdica
tridimensional.
Enamboscasosseoptimizarnlasvariablesexperimentalesqueafecten
tanto a la modificacin de la superficie electrdica, como a las respuestas
amperomtricas. Asimismo, se calcularn los parmetros cinticos de la
reaccin enzimtica sobre las superficies de los biosensores para varios
compuestos fenlicos, y se evaluarn las caractersticas analticas de los
mtodos desarrollados con ellos, lo que implica establecer los intervalos de
linealidad de los calibrados, la evaluacin de la precisin y el clculo de los
lmitesdedeteccinycuantificacinparaloscompuestosestudiados.
Adems, se caracterizarn las superficies mediante mtodos
electroqumicosynoelectroqumicos.

Introduccin
3.
Desarrollo de inmunosensores amperomtricos basados en una matriz
compsitananoestructurada.
Los electrodos compsitos son adecuados para la preparacin de una

granvariedaddeconfiguracioneselectrdicas,presentandoventajastalescomo
la obtencin de una mayor relacin seal/ruido, la posibilidad de incorporar
especiesparamejorarlaselectividadosensibilidaddelmaterialelectrdico,as
como la regeneracin de su superficie por simple pulido. Por otro lado, la
presencia de las nanopartculas de oro en la superficie del electrodo permite
inmovilizar material biolgico sin prdida de su bioactividad, mejorando las
caractersticasanalticasascomoeltiempodevidatildelosinmunosensores.
En esta parte del trabajo se prepararn varios inmunosensores basados
enelempleodeelectrodoscompsitosconteniendonanopartculasdeoro,con
elfindeaprovecharlasventajasdeestenanomaterial,estudindoseparacada
uno de ellos la influencia que ejercen las distintas variables experimentales
sobre la respuesta amperomtrica. En cada caso, se llevar a cabo un
seguimiento,medianteespectroscopiadeimpedanciafaradaica,decadaunade
las etapas implicadas en la preparacin del inmunosensor, as como de las
relacionadasconlarealizacindelinmunoensayocorrespondiente.Finalmente
se estudiar la estabilidad y las caractersticas analticas de los diferentes
inmunosensores.
4.
Aplicacin de los biosensores enzimticos e inmunosensores
desarrolladosalanlisisdemuestrasreales.
Tanto los biosensores como los inmunosensores desarrollados se

aplicarnaladeterminacindeanalitosdeintersenmuestrasreales.

Introduccin
Por lo que se refiere a los biosensores enzimticos, se llevar a cabo la
estimacin del contenido de compuestos fenlicos en diferentes tipos de
muestras,conelfindeproporcionarunndicedelcontenidototaldefenoles,
quepermitaestimardeunaformarpidayfiablesidichocontenidoessuperior
al valor establecido en la legislacin y, si es as, poder tomar decisiones
oportunasenelmenortiempoposible.
El biosensor basado en la modificacin de un electrodo de carbono
vitrificado,seaplicaraladeterminacindepolifenolesenvinos,mientrasque
el biosensor compsito se aplicar a muestras de aguas procedentes de una
refinera de petrleo y a muestras de alpechn. La validez de la metodologa
empleada se verificar mediante comparacin de los resultados obtenidos con
losproporcionadosporunmtododereferencia.
En cuanto a los inmunosensores, stos se emplearn para la
determinacin de analitos de inters en la industria ganadera y en anlisis
clnico. As, se llevar a cabo la determinacin de progesterona en leche y de
inmunoglobulina G en suero. En ambos casos las muestras ensayadas sern
previamenteenriquecidasconloscompuestosestudiados,conelfindeevaluar
laexactituddelosmtodos,ascomolaexistenciadeefectomatriz.

Introduccin
1.2.
CARACTERSTICAS
GENERALES
DE
LAS
NANOPARTCULASDEORO
Las nanopartculas de metales nobles, especialmente las de oro, han
despertadoungranintersdebidoalasinteresantespropiedadesestructurales,
electrnicas, magnticas, pticas, y catalticas de estos materiales. Estas
propiedadesdependenengranmedidadesutamaoydesuforma,loscuales
vienen determinados por las condiciones experimentales empleadas en su
obtencin. As, se producen cambios considerables en las propiedades pticas
del material al disminuir el tamao de partcula a escala nanomtrica. Por
ejemplo, las disoluciones coloidales de nanopartculas de oro presentan un
color rojo caracterstico, color rub, derivado de las dimensiones de las
partculasdelmetal.
Cuandounhazderadiacinincidesobrenanopartculasdemetalescomo
el oro se produce una oscilacin colectiva de los electrones de conduccin del
metal,loquesetraduceenlaabsorcinderadiacinelectromagnticaporparte
de las nanopartculas en una determinada zona del espectro visible, dando
lugar a espectros con bandas de resonancia conocidas como plasmones. Este
fenmeno, conocido como absorbancia de plasmn superficial, es una
propiedad caracterstica de superficies de un tamao determinado; as, no se
observa en partculasde tamao inferior a12 nm(dimensionesquantum),ya
que sus electrones estn en niveles de energa discretos; por otra parte, el oro
metlicopresentaunaabsorcincontinuaenlareginUV/Vis/IR.Enelcasode
lasnanopartculasdeoro,estaabsorcincontinuadecaedrsticamente,excepto
enunazonaconcretadenominadabandadeabsorcindelplasmn.

Introduccin
Elcomportamientoplasmnicodelasnanopartculasdeorovienetambin
determinado por su funcionalizacin, pudiendo emplearse la medida de la
absorbanciadelplasmnparacaracterizarlasnanopartculas.
Unodelosproblemasasociadosalasnanopartculasdeoroeslaelevada
tendencia que presentan a flocular en presencia de electrolitos. Por tanto, es
necesario tomar las precauciones necesarias en su preparacin, con el fin de
evitarlaformacindeagregadososuprecipitacin.
La preparacin de nanopartculas de oro generalmente implica la
reduccinqumicadeunasaldeoroenmedioacuosouorgnico,enpresencia
deunagenteestabilizanteoprotectoradecuado,elcualseunealasuperficiede
las nanopartculas aumentando su estabilidad y neutralizando las fuerzas
electrostticas.Lasdispersionesdelasnanopartculaspreparadasenpresencia
deunestabilizadorsonestablesatemperaturaambientedurantelargotiempo,
noobservndoseprecipitacindelcoloidealcabodevariosmeses.
Se han empleado una gran variedad de agentes estabilizantes. Sin
embargo, el procedimiento de obtencin de nanopartculas ms utilizado,
probablementedebidoasusencillezylosbuenosresultadosqueproporciona,
es el basado en el uso de citrato como reductor, que a su vez acta de
estabilizante,impidiendolaformacindeagregados[Cai,2001].Adems,esde
gran importancia destacar que las partculas sintetizadas por reduccin con
citrato pueden considerarse esferas monodispersas, cuyo tamao puede ser
controlado fijando la concentracin de citrato empleada. As, en la Tabla 1 se
recoge el tamao de nanopartcula obtenido para diferentes volmenes de
disolucindecitratoal1%adicionadoenlasntesis.

Introduccin
Tabla1.Variacin del dimetro de las nanopartculas en funcin del volumen de

citratosdicoadicionado.
Volumendedisolucinde
citratosdicoal1%,mL
1.0
0.75
0.5
0.3
0.21
0.16
Dimetro,nm
(medidosporSEM)
16
25
41
72
98
147
SEM:microscopiaelectrnicadebarrido
En la Figura 1 se esquematiza el proceso de reduccin del oro inico que

tienelugarcuandoseaadeelreductor.
Nucleacin
Sobresaturacin
Crecimiento de partculas
Adicin del reductor
Tiempo
Figura1Reduccindeoroinicoparaformarpartculasdeoro
Antes de aadir el reductor, slo hay iones oro en la disolucin.
Inmediatamente despus de adicionar el reductor, se produce un crecimiento
brusco en el nmero de tomos de oro en disolucin, hasta alcanzar una
situacindesobresaturacin.Despusdeesteprocesotienelugarelcrecimiento

Introduccin
de las partculas formadas en el proceso de nucleacin, dando lugar a la
aparicindeagregados.
La cantidad de reductor adicionada determina el nmero y el tamao de
laspartculasdeoroobtenidas.As,unacantidadelevadadereductordalugar
a la formacin de un gran nmero de tomos de oro (ncleos) iniciales y, por
tanto, a la obtencin de un mayor nmero de partculas de oro de menor
tamao.
Las condiciones de preparacin ptimas implican la formacin rpida y
simultnea de las partculas iniciales, de modo que su crecimiento es
exactamente el mismo, obtenindose as nanopartculas de oro del mismo
tamao(monodispersas).
Elcolordelasuspensinobtenida,rojorub,essealdelacalidaddelas
partculas obtenidas en cuanto a forma esfrica y tamao nanomtrico
reproducible, de la suspensin de oro coloidal obtenida. Una suspensin de
color prpura es seal de que se ha producido la agregacin de partculas,
obtenindose partculas de forma y tamao irreproducible. Como veremos, la
uniformidadeneltamaoesesencialenlafabricacindedispositivosbasados
en el empleo de nanopartculas de oro que proporcionen medidas estables y
reproducibles.
Lasnanopartculasaspreparadasposeencargasuperficialnegativacomo
consecuenciadeladbiluninalcitrato,empleadocomoreductor.Debidoala
carga, las partculas se repelen entre s, mantenindose en suspensin
indefinidamente.
Comoyasehacomentado,lalongituddeondadelmximodeabsorcin
delplasmndependetantodeltamaocomodelaformadelananopartcula.
10

Introduccin
Porotraparte,laposicindelabandadelplasmnvaraconlafuncionalizacin
de las nanopartculas. Este fenmeno puede aprovecharse para la
caracterizacin de las nanopartculas sintetizadas. As, por ejemplo, las
partculasde15nmdedimetropresentanunmximoa520nm.
Otrosprocedimientosparalaobtencindenanopartculasdeoroimplican
el empleo de derivados de tioles, que permiten la preparacin de
nanopartculasfuncionalizadasconunagranvariedaddeligandosorgnicosy
biomolculas sin prdidas de su actividad. En presencia de estas molculas
protectoras, tiene lugar un recubrimiento de la superficie del agregado
incipiente, evitando su excesivo crecimiento y la prdida de sus propiedades
coloidales.EstaadsorcinocurreporlaformacindeenlacescovalentesAuS,
segnlareaccin:
Au+RSHAuSR+H2
La fortaleza de estos enlaces viene determinada por la alta afinidad
qumicadelgrupotiolporlostomosdeoro.
Otras posibilidades implican la encapsulacin de las nanopartculas en
faseacuosa,enelinteriordemicelasinversaspresentesenmicroemulsionesola
dispersindelasmismasenmatricespolimricas.
Apesardelosgrandesprogresosenlasntesisdenanopartculasdeoro,
anseestndiseandonuevosprocedimientosquepermitanunmayorcontrol
del tamao, forma y reactividad qumica de las nanopartculas preparadas,
habidacuentadesusnumerosasaplicacionesencampostanimportantescomo
laobtencindelosnanosensores,biosensores,catlisisynanoelectroqumica.
Por otra parte, cabe destacar el inters creciente que han recibido la
preparacindebioconjugados,basadosenlamodificacindelasnanopartculas
11

Introduccin
de oro por unin a molculas biolgicas, ya que en estos materiales hbridos
pueden conjugarse las propiedades inherentes a las partculas metlicas
coloidales con las de reconocimiento molecular propias de este tipo de
molculas. As, se han desarrollado procedimientos de sntesis de
nanopartculasdeorodetamaoyformacontroladosque,adems,puedenser
funcionalizadas fcilmente con biomolculas como pptidos, enzimas,
anticuerpos,ADN,etc.
12

Introduccin
I.3. ELECTRODOS MODIFICADOS CON NANOPARTCULAS

DEORO
Lapreparacinyelempleodesuperficieselectrdicasnanoestructuradas
constituye una lnea de investigacin de gran inters y actividad en
electroanlisis. De los diferentes tipos de nanomateriales existentes, cabe
destacar el empleo de nanotubos de carbono y nanopartculas de oro para la
preparacin de sensores y biosensores electroqumicos. En la naturaleza
podemos encontrar materiales nanoestructurados metlicos, xidos y
semiconductores. En cuanto a las nanopartculas metlicas, stas poseen
excelentes propiedades conductoras y catalticas, permitiendo la construccin
de nanoarrays, con una relacin seal/ruido varios rdenes de magnitud
superioraladeloselectrodosconvencionales,yconlaventajadequepueden
obtenerseseriesordenadasdenanoelectrodosenunaovariasdimensiones.
El empleo de nanopartculas de oro para la modificacin de superficies
electrdicasesaplicabletantoalaconstruccindesensoresqumicoscomode
biosensores.Enelprimercaso,lasnanopartculas,funcionalizadasono,actan
como fase sensora, catalizando los procesos redox de algunas molculas de
inters, como perxido de hidrgeno, oxgeno o NADH, que participan en
reacciones bioqumicas tiles desde el punto de vista analtico, y que adems
puedenmonitorizarseempleandotcnicaselectroqumicas[HernndezSantos,
2002 y Rashid, 2006]. En el caso de los biosensores, el acoplamiento de
nanopartculasdeoroconloselementosdereconocimientobiolgico,permiten
construirfasessensorasconpropiedadesmejoradas.
En la bibliografa se han encontrado diversas estrategias para la
modificacin de diferentes superficies electrdicas con nanopartculas de oro,
entre las que cabe destacar: a) la unin de las nanopartculas a los grupos
13

Introduccin
activos de monocapas autoensambladas (SAMs), b) la adsorcin de las
nanopartculas de oro sobre la superficie electrdica por inmersin del
electrodoenunadisolucindeorocoloidalduranteuntiempodeterminado,c)
la inmovilizacin directa de las nanopartculas sobre la superficie electrdica
mediante electrodeposicin del nanomaterial, para lo cual se sumerge el
electrodo en una disolucin de cido tetracloroarico y se aplica un potencial
durante un tiempo determinado. La variacin del potencial aplicado y del
tiempo de aplicacin permiten controlar el tamao de las partculas
electrodepositadas y d) la incorporacin a la matriz en el caso de emplear
electrodoscompsitos.
En los ltimos aos, los diseos electrdicos basados en nanopartculas
metlicas, especialmente de oro, estn siendo ampliamente utilizados por sus
atractivascaractersticasfsicoqumicas.Adems,lafacilidaddepreparaciny
laposibilidad defuncionalizacin,lashacemuy apropiadas para el desarrollo
de electrodos modificados para la determinacin tanto de macromolculas
como protenas, cidos nucleicos o carbohidratos [HernndezSantos, 2002],
comodesustanciastxicas[Renedo,2007].
Como
consecuencia
de
esto,
son
numerosos
los
sensores
nanoestructuradosencontradosenlabibliografa,dondeseaprovechaelefecto
electrocataltico que ejercen las nanopartculas de oro, disminuyendo el
potencial de deteccin de los analitos de inters, as como, las mejoras que se
presentanencuantoalascaractersticasanalticasdelsensor[Cai,2001].
As, por ejemplo, en nuestro grupo de investigacin se ha desarrollado
unsensorparaladeterminacindemetionina,enelquelasnanopartculasde
oro son inmovilizadas sobre un electrodo de pasta de carbono previamente
modificadoconunamonocapadecisteamina.Lamodificacindelasuperficie
electrdica con este nanomaterial permite obtener unbajo lmite de deteccin,
14

Introduccin
0.59 M, y llevar a cabo un mtodo selectivo de deteccin de metionina en
presenciadeotrosaminocidosovitaminas[Ag,2004].
Otros autores han preparado un electrodo de carbono vitrificado
modificado con una pelcula de metiltrimetoxisilano y nanopartculas de oro,
paralaobtencindeunsensordeperxidodehidrgeno.Esdedestacarelbajo
lmite de deteccin, 3.15 nM, sin el empleo de mediador ni de enzimas
inmovilizadas[Maduraiveeran,2007].
OtrodiseoreportadoporJenaycolaboradoresparaladeterminacinde
glucosa,sebasaenelempleodenanopartculasdeoroautoensambladasalos
grupos tioles de una matriz tridimensional solgel. Las propiedades catalticas
de las nanopartculas de oro han hecho posible la medida de la seal de
oxidacin de la glucosa a potenciales tan bajos como 0.16 V, obtenindose al
mismo tiempo una excelente sensibilidad y un lmite de deteccin de 50 nM
[Jena,2006].
Recientemente el grupo de Li M. ha preparado un sensor para la
determinacin de dopamina empleando un electrodo de oro modificado con
ditiocarbamato sobre el que se electrodepositan nanopartculas de oro. Es de
destacar la gran estabilidad de la superficie sensora, as como la elevada
eficiencia cataltica hacia la oxidacin de la dopamina, lo que da lugar a un
aumentodelasensibilidad,reproducibilidadytiempodevidatilconrespecto
aotrasconfiguracionesencontradasenlabibliografa[LiM.,2008].
Uno de los principales problemas que presenta la determinacin de
dopamina es la interferencia de sustancias como el cido ascrbico, presente
comnmente en concentraciones elevadas en la mayor parte de las muestras
biolgicas. El empleo de superficies electrdicas modificadas con
nanopartculas de oro ha permitido llevar a cabo la deteccin selectiva de
dopamina en presencia de cido ascrbico, basndose en el efecto
15

Introduccin
electrocataltico que ejercen las nanopartculas de oro sobre el proceso de
oxidacin del cido ascrbico. Las nanopartculas de oro han sido
inmovilizadas sobre un electrodo de oro previamente modificado con una
monocapadecisteamina.Losresultadosobtenidosmediantevoltamperometra
cclica y voltamperometra de onda cuadrada ponen de manifiesto la buena
sensibilidadyselectividadobtenidaparaambasespeciesconrespectoalempleo
de un electrodo de oro sin modificar, alcanzndose un lmite de deteccin de
0.13M.[Raj,2003].
El empleo de un electrodo de carbono vitrificado modificado con una
pelculapolimricadepoli(3,4etilendioxitiofeno)(PEDOT)ynanopartculasde
oro constituye una nueva estrategia para la determinacin de dopamina en
presenciadecidoascrbico.Enestedispositivo,ladopamina,mshidrofbica,
interaccionapreferentementeconlareginnoconductoradelpolmero(forma
reducida),mientrasqueelcidoascrbico,mshidroflico,interaccionaconla
regin conductora (forma oxidada), dando lugar a un notable desplazamiento
de la seal de oxidacin del cido ascrbico hacia valores de potencial menos
positivos, observndose as una separacin de 230 mV entre los picos de
oxidacin de ambos compuestos. Por otra parte, la adsorcin de la dopamina
sobrelasnanopartculasdeoro,atravsdeldbilenlacedelosgruposamino,
dalugaraunsignificativoaumentodelacorrientedeoxidacin,obtenindose
unmarcadoaumentodelasensibilidaddeladeterminacin[Kumar,2005].
Otroejemplodesensornanoestructuradoparaladeterminacindeeste
compuesto, desarrollado por Wang P. y colaboradores, consiste en la
inmovilizacin covalente de las nanopartculas de oro sobre un electrodo de
carbono vitrificado modificado con una monocapa de colina. El efecto
electrocatalticodiferenciadorqueejercelamonocapadecolinamodificadacon
nanopartculas de oro sobre las seales de oxidacin de dopamina, cido
16

Introduccin
ascrbicoycidorico,permite,porunaparte,unaumentodelasensibilidad
de las seales de oxidacin y, por otra, la resolucin de mezclas de los tres
componentes permitiendo su determinacin conjunta en una misma muestra
[WangP.,2007].
Un ejemplo de sensor nanoestructurado para la determinacin de
biomolculas de inters clnico es el desarrollado por Goyal y col. La
preparacindelsensorimplicaelempleodeunasuperficieelectrdicadexido
detitanioeindio(ITO)modificadaconnanopartculasdeoroquimisorbidas.El
sensor ha sido aplicado a la determinacin de un corticoide sinttico con
propiedades antiinflamatorias en muestras de orina y sangre. Las medidas se
llevanacaboporvoltamperometradiferencialdeimpulsos,comparndoselos
resultados obtenidos con los conseguidos con un electrodo de oro y un
electrodo de ITO sin modificar con las nanopartculas de oro. Los
voltamperogramas registrados ponen de manifiesto la ventaja del empleo de
superficiesnanoestructuradas,yaqueelefectoelectrocatalticoejercidoporlas
nanopartculas de oro da lugar a una disminucin del potencial del pico de
oxidacin del analito, as como a un aumento de la sensibilidad de la seal
[Goyal,2007].
Jinycolaboradoreshandesarrolladounsensorparaladeterminacinde
epinefrina en presencia de cido ascrbico. Para ello, han empleado como
superficie electrdica un electrodo de carbono vitrificado sobre el que se han
electrodepositadonanopartculasdeoro.Elefectoelectrocatalticoejercidopor
el nanomaterial sobre la corriente de oxidacin del cido ascrbico, ha
permitidollevaracaboladeterminacindeambasespeciesdeformaselectiva,
observndoseunaseparacinde183.5mVentreambospicosdeoxidacin[Jin,
2002].
17

Introduccin
Sehanencontradoenlabibliografadiferentessensoresmodificadoscon
nanopartculas de oro para la determinacin de sustancias txicas de inters.
As,loselectrodosserigrafiados(screenprinted),carbonovitrificado,platino,
ydegrafitohansidoampliamenteempleadosparaladeterminacindeespecies
talescomoarsnico[Song,2006],antimonio[Renedo,2007],xidodenitrgeno
ehidrazina.
Como ejemplo de sensor nanoestructurado para la determinacin de
xido ntrico, el grupo de Zhu M. y col. ha desarrollado un microsensor,
empleando microelectrodos de platino modificados con una monocapa de
cistenasobrelaqueseunencovalentementelasnanopartculasdeoro.Eneste
caso se observa el efecto electrocataltico que ejerce el nanomaterial sobre la
oxidacin del xido de nitrgeno, disminuyendo el potencial de deteccin en
250mVrespectodelasealobtenidasobreelmicroelectrodosinmodificar.La
interferencia de nitrito y nitrato en la determinacin del xido ntrico se evita
recubriendolasuperficiesensoraconunapelculadeNafion[ZhuM.,2002].
En otro trabajo realizado por Jena y colaboradores se ha empleado una
superficietridimensionalsolgel modificadacon nanopartculasdeoro para la
determinacin de hidrazina. En este caso se obtiene una disminucin del
potencialdeoxidacindelahidrazinadeaproximadamente800mV,ascomo
un aumento en la corriente de pico con respecto a la seal obtenida sobre un
electrodo de oro convencional, lo que permite alcanzar un lmite de deteccin
de200pM[Jena,2007].
18

Introduccin
I.4. BIOSENSORES ELECTROQUMICOS BASADOS EN EL

EMPLEODENANOPARTCULASDEORO(nAu)
I.4.1.Biosensoresenzimticos
Como ya se ha dicho, la importancia de los sistemas electroanalticos
basados en nanopartculas de oro se debe a las propiedades superficiales,
electrnicas y catalticas nicas de este material [Liu S., 2003a y Katz, 2004].
Adems presentan la ventaja de que las enzimas adsorbidas retienen su
actividadbiolgica,loquenoocurresobreotrosmaterialeselectrdicos,como
superficies metlicas pulidas, debido probablemente a la mayor libertad de
orientacinqueposeenlasbiomolculasinmovilizadassobrelasnanopartculas
[LiuS.,2003b].
Por otra parte, las nanopartculas actan como medio de conduccin
electrnicoentreelgrupoprostticodelasenzimasylasuperficiedelelectrodo,
facilitando la transferencia electrnica. Esta ventaja se ha aprovechado para la
preparacin de biosensores enzimticos sin necesidad de mediador, tambin
llamadosdetercerageneracin,enlosquelasnanopartculasdeoroposibilitan
la transferencia de carga directa entre el grupo redox de la protena y la
superficie del electrodo, alcanzndose elevados niveles de estabilidad y
sensibilidad[YnezSedeo,2005yLiuS.,2003a].
En la Tabla 2 se recogen los biosensores enzimticos encontrados en la
bibliografa basados en el empleo de nanopartculas de oro, mostrndose el
procedimiento de inmovilizacin empleado, as como las caractersticas de
funcionamientoylascaractersticasanalticasobtenidasencadacaso.
Unodelosdiseosmssimplesconsisteenladeposicindirectadelas
nanopartculas sobre la superficie electrdica. Esta configuracin permite
obtener biosensores estables, de respuesta rpida y elevada sensibilidad. As,
19

Introduccin
por ejemplo, Zhang y col. prepararon un biosensor para la determinacin de
glucosa en el que la enzima glucosa oxidasa (GOx) se inmoviliza por unin
covalente sobre un electrodo de oro previamente modificado con
nanopartculas de oro [Zhang S., 2005]. En otro trabajo, Shulga y col.
demuestran que la electrodeposicin de nanopartculas de oro sobre un
electrodo de oro proporciona una superficie electrdica adecuada para la
inmovilizacindelaenzimaacetilcolinesterasa.Elbiosensorobtenidoseutiliz
para la determinacin de carbofuran a muy bajos niveles de concentracin
[Shulga,2007].
Enuntrabajorealizadoennuestrogrupodeinvestigacin,seinmoviliza
laenzimaxantinaoxidasa(XOD)porentrecruzamientoconglutaraldehdo.La
preparacindelbiosensorimplicalaelectrodeposicinpreviadenanopartculas
de oro sobre la superficie de un electrodo de pasta de carbono y posterior
inmovilizacindelaenzimaporentrecruzamientoconglutaraldehdoyBSA.El
biosensor se emple para la determinacin de hipoxantina (Hx) en sardinas y
carne de pollo [Ag, 2006]. La deteccin de Hx se lleva a cabo a +0.6 V
aproximadamente, sobre electrodos convencionales. Sin embargo con la
configuracin del biosensor desarrollado con las nanopartculas de oro, es
posible realizar dicha deteccin a un potencial de 0 V, minimizando
interferenciascomoelcidoascrbico.Ellmitededeteccinobtenidoalaplicar
estepotencialesde0.22M,siendodelmismoordenquelosencontradosenla
bibliografa,conbiosensoresqueoperanapotencialesmuchomselevados.
El empleo de superficies electrdicas modificadas con monocapas
autoensambladas de tioles permite la incorporacin de enzimas, mediadores,
agentes de entrecruzamiento o nanopartculas metlicas. Esta posibilidad de
modificacin, junto con la variedad de cadenas hidrocarbonadas de diferente
longitud de que se dispone, permite una gran versatilidad en el diseo del
20

Introduccin
sensor para diferentes aplicaciones. Adems, los dispositivos basados en el
empleodemonocapasautoensambladasproporcionan,engeneral,unaelevada
relacinseal/ruidoyunabuenareproducibilidaddelasmedidasrealizadas,
ascomodelosprocedimientosdefabricacin.
Comoejemplos, cabedestacar lapreparacindebiosensoresdeglucosa
oxidasa empleando distintas configuraciones basadas en el empleo de
monocapas autoensambladas sobre un electrodo de oro. De entre ellas, la
obtenidaincorporandoorocoloidalyGOxsobreunamonocapadecisteamina
es la que proporciona una mayor sensibilidad y un mayor tiempo de vida
operacional [Mena, 2005a]. Otro ejemplo de un diseo de este tipo, es la
preparacin de un biosensor de peroxidasa basado tambin en el empleo de
monocapas de cisteamina y nanopartculas de oro para el estudio de la
transferencia electrdica directa de la enzima inmovilizada, observndose la
aparicin de un par de picos en el voltamperograma cclico correspondiente
atribuidos a la reaccin enzimtica. El biosensor muestra una excelente
respuestaelectrocatalticaparalareduccindeH2O2sinnecesidaddemediador
[Yi,2000].Recientemente,Linycol.hanpreparadounbiosensoramperomtrico
de peroxidasa basado en la modificacin de un electrodo de oxido de indio
titanio (ITO) con una monocapa de (3mercaptopropil) trimetoxisilano y
nanopartculasdeoroyposteriorcoinmovilizacindelaenzimaperoxidasayel
mediadortetrametilbencidina[Lin,2007b].
Es de destacar otra configuracin basada en la unin de las
nanopartculasdeoroananoesferasporosasfuncionalizadascongrupostioles
depoli(divinilbencenococidoacrlico)paralapreparacindeunbiosensorde
peroxidasa,consiguindosebuenascaractersticasanalticas[XuS.,2007].
La incorporacin de nanomateriales a matrices compsitas constituye
una estrategia muy til para la preparacin de biosensores con excelentes
caractersticas analticas. Los dispositivos obtenidos no solo presentan las
21

Introduccin
ventajas propias de los nanomateriales, sino tambin las derivadas de los
electrodos compsitos, tales como baja corriente de fondo y gran versatilidad
como consecuencia de la posibilidad de incorporar diferentes sustancias a la
matrizelectrdicasinnecesidaddeenlacescovalentes.Adems,constituyenun
depsitotridimensionaldeenzimacuyasuperficiepuederenovarseporsimple
pulido.
Como ejemplo de este diseo cabe citar la incorporacin de
nanopartculas de oro a una mezcla compsita de grafito en polvo y aceite de
parafina utilizada para fabricar electrodos de pasta de carbono, as como de
distintasenzimas.Conestediseosehaconstruidounbiosensordeglucosade
elevadasensibilidadsinnecesidaddemediador[LiuS.,2003b],unbiosensorde
peroxidasa [Liu S., 2002] y uno de tirosinasa para la monitorizacin de fenol
[Liu S., 2003a], todos ellos preparados mezclando la enzima, el oro coloidal y
los componentes de la pasta de carbono. Un diseo similar se obtiene
modificandomicropartculasdecarbonovitrificadoconnanopartculasdeoroy
laenzimaXODparaladeteccindexantinaehipoxantina.Estedispositivose
empleparaladeterminacindehipoxantinaenatn[ubuku,2007].
Unatendencianovedosaparalapreparacindebiosensoreseselempleo
desuperficiesnanoestructuradasdenanotubosdecarbono(CNT)modificadas
con nanopartculas de oro, ya que se obtienen dispositivos que mejoran su
capacidad para la inmovilizacin estable de biomolculas. De este modo, se
obtienen materiales hbridos con una elevada estabilidad y capacidad de
biosensorizacin. Los electrodos modificados con nanotubos de carbono
exhibenefectoselectrocatalticosintensoshacialaoxidacindemolculastales
como NADH yperxidodehidrgeno.En estecontexto, ennuestrogrupode
investigacin, se ha preparado un biosensor compsito oro coloidalCNT
empleando Tefln como aislante, que proporciona una respuesta ms sensible
22

Introduccin
hacia el perxido de hidrgeno que la obtenida empleando otros electrodos
compsitos, incluyendo los basados en CNT solamente. La incorporacin de
glucosa oxidasa a esta matriz permite preparar un biosensor de glucosa sin
necesidad de mediador, alcanzndose una sensibilidad muy superior a la de
otros biosensores de glucosa encontrados en la bibliografa. El valor de la
constante de MichaelisMenten, 14.9 mM, pone de manifiesto la elevada
afinidadenzimasustratodebidoaladecuadomicroambientequeproporcionan
lasnanopartculasdeoro [Manso,2007].Otra configuracinsemejante sebasa
enlainclusindelaenzimaalcoholdeshidrogenasa(ADH)enlamismamatriz
compsita,observndoseunmarcadoincrementoenlarespuestadeoxidacin
de NADH comparada con la de otros biosensores. As, la incorporacin de
ADH en el material electrdico permite la obtencin de un biosensor para la
determinacindeetanolconunlmitededeteccinde4.7M[Manso,2008].
Otraposibilidadesinmovilizarselectivamentelasnanopartculasdeoro
a la superficie de nanotubos previamente funcionalizados. Por ejemplo, el
empleo de agentes dispersantes, bien catinicos, como polietilenamina, bien
aninicos, como el citrato, cambia las propiedades cidas o bsicas de la
superficie[Jiang,2003].Deestemodo,lasnanopartculasdeoropuedenunirse
a los nanotubos por atraccin electrosttica. Un nanohbrido de este tipo fue
empleado por Liu y col. [Liu Y., 2005] para la inmovilizacin covalente de
microperoxidasa (MP11). La modificacin de un electrodo de carbono
vitrificado con una pelcula del nanomaterial permite la transferencia
electrnicadirectaentrelaenzimayelelectrodo,sinobservarseprdidadesu
actividad biolgica, proporcionando una respuesta electrocataltica para la
reduccin de perxido de hidrgeno. Otra configuracin consiste en la unin
covalente denanotubosdecarbonoy nanopartculasdeoroaunelectrodo de
carbono vitrificado modificado con poli(tionina). El efecto sinrgico del
23

Introduccin
nanomaterial hbrido, unido a la excelente capacidad mediadora del polmero
redox, permite el diseo de biosensores que proporcionan una rpida
transferencia electrnica, adems de una inmovilizacin ms eficiente de la
enzima en comparacin con otras configuraciones basadas en el empleo de
nanotubos de carbono o nanopartculas de oro de forma individual [Feng,
2007].
La tecnologa solgel permite la preparacin de redes tridimensionales
adecuadas para la encapsulacin de una gran variedad de biomolculas. Los
materialessolgelinorgnicossonparticularmenteatractivosparalafabricacin
de biosensores enzimticos debido a las adecuadas condiciones ambientales
empleadas en su preparacin, su porosidad, alta estabilidad trmica e inercia
qumica, y a que este tipo de material, a diferencia de muchos otros, no se
hincha apreciablemente en disolucin acuosa. Los materiales hbridos solgel
obtenidos por encapsulamiento de nanopartculas de oro en la matriz son
ampliamente utilizados para la preparacin de biosensores. Como ejemplo,
cabe citar la preparacin de un biosensor de acetilcolinesterasa basado en un
solgel tridimensional de silicato y nanopartculas de oro que proporciona un
microambiente biocompatible, de forma que la enzima mantiene su actividad
biolgica, y se garantiza la inmovilizacin estable en la matriz. Este biosensor
ha permitido la determinacin sensible de pesticidas como metilparation y
carbaril. Otras caractersticas de inters de este diseo es la exactitud de las
medidas,lasencillezdelprocedimientoempleado,ascomosubajocoste[Du,
2008].
Otra posibilidad consiste en combinar la tecnologa solgel y las
monocapas autoensambladas empleando alcxidos de silicio tiolados. De esta
forma, las nanopartculas pueden ensamblarse en el interior y en la superficie
del solgel, incrementndose, de esta forma, el rea activa del electrodo. Las
24

Introduccin
nanopartculas pueden actuar como centros de conduccin y facilitar la
transferencia electrnica [Jia, 2002]. Un diseo de biosensor nanoestructurado,
quepermitedeterminacionesdegransensibilidadbasadoenelempleodeuna
configuracin similar, es el que consiste en inmovilizar una enzima
deshidrogenasa y nanopartculas de oro en una matriz solgel funcionalizada
conunamonocapa.Lasnanopartculasdeoroseunenalamatrizatravsdelos
grupos tioles terminales de la monocapa, constituyendo una serie de
nanoelectrodosautoensambladosaunaredtridimensional.Lasnanopartculas
deorocatalizanlaoxidacindelNADH,loquehapermitidolaobtencindeun
lmitededeteccinde5nMenausenciademediador.Elelectrodomuestrauna
excelenteestabilidadoperacionalyseaplicaladeteccindelactatoyetanola
un potencial de 5 mV [Jena, 2006]. Otro ejemplo es el biosensor de glucosa
desarrollado por Zhong y col. que se basa en la formacin de una doble capa
bidimensional de mercaptopropiltrimetoxisilano (MPS) sobre un electrodo de
oro. Para su preparacin se sumerge el electrodo de oro en una disolucin de
MPS en etanol, formndose una monocapa sobre la superficie electrdica;
seguidamente se sumerge en una disolucin de NaOH, teniendo lugar la
polimerizacin de las unidades silano dando lugar a la formacin de una red
bidimensional. Una segunda capa silano se forma sumergiendo la superficie
nuevamenteenunadisolucindeMPSduranteunanoche.Lasnanopartculas
de oro fueron posteriormente quimisorbidas sobre los grupos silano de la
segunda capa y finalmente la glucosa oxidasa se adsorbe sobre las
nanopartculas de oro. El biosensor proporciona una excelente respuesta
electrocataltica para la glucosa empleando Co( byp) 33+ como mediador,
obtenindoseunintervalolinealde4.0x1010a5.3x108M[Zhong,2005].
La tcnica layerbylayer (LBL) resulta ser muy atractiva para la
obtencin de biosensores enzimticos, habindose encontrado diseos muy
25

Introduccin
reproducibles, estables y muy sensibles. As, Wu y colaboradores prepararon

unbiosensoramperomtricodeglucosabasadosenlaformacindemulticapas
deglucosaoxidasa,chitosanynanopartculasdeoroempleandolatcnicaLBL.
El dispositivo obtenido proporcion una excelente actividad cataltica hacia la
glucosa,demostrndosequelasnanopartculasdeoromejorannotablementela
eficiencia del proceso de transferencia de carga entre el analito y la superficie
delelectrodo[Wu,B.Y.,2007].OtrodiseosimilarqueemplealatcnicaLBLse
basaenlaformacindemulticapasdeglucosaoxidasa/nanopartculasdeoro
sobreunasuperficiedeoromodificadaconcisteamina.Enestecasoseobserv
una correlacin directa entre la respuesta bioelectrocataltica y el nmero de
bicapas depositadas, relacionado ste con la cantidad de enzima activa
inmovilizadasobreelelectrodo[Yang,2006a].
Empleando la tcnica LBL se ha preparado bicapas formadas por capas
de dendrmeros de poli(amidoamina) (PAMAM) con nanopartculas de oro
modificadas con hexacianoferrato de cobalto, alternadas con capas de cido
polivinilsulfnico sobre electrodos de xido de indiotitanio (ITO).
Seguidamente se inmoviliz la enzima glucosa oxidasa en presencia de
albmina de suero bovino y glutaraldehdo como agente entrecruzante. La
deteccinamperomtricadeglucosasellevacaboaplicandounpotencialde0
Vvs.SCE[Crespillo,2006].Sunycololaboradoresmodificaronunelectrodode
oroconmulticapasdesulfonatomodificadasconnanopartculasdeoro/tionina
basndose en interacciones de tipo electrosttico y covalente. Estas
superestructurasproporcionanunamatrizidealparalafabricacindesensores
bienzimticos, donde las molculas de tionina actan como mediador para la
transferenciaelectrnica.Lasenzimasglucosaoxidasaoxidadaconperiodatoy
peroxidasa se inmovilizaron covalentemente a la multicapa, obtenindose un
26

Introduccin
biosensor con excelente respuesta electrocataltica hacia la glucosa, que

aumentaconformeaumentaelnmerodecapasdetionina[Sun,2007].
Acontinuacinsedescribendeformaesquemticaalgunasaplicaciones
de biosensores que emplean superficies electrdicas modificadas con
nanopartculasdeoro.
27
Introduccin
Tabla2.Biosensoresenzimticosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
ENZIMA/
ELECTRODO
TCNICA
INMOVILIZACIN
GOx / Oro
Inmov. covalente.
de GOx
oxidada-IO4 y nAu y
entrecruz. con cisteamina
mediante la tcnica LBL
DETECCIN
CARACTERSTICAS DE
FUNCIONAMIENTO
ANALITO/
MUESTRA
-5
Amperom.
(Eap: +0.25 V
vs. SCE)
Reg. Fosfato 0.1 M, pH 6.8

+ ferrocenometano 0.25
mM
trespuesta = 4s
Glucosa
GOx / Oro
Adsorc. de GOx sobre

multicapas de
Amperom.
(PDDA/nAus)n/PDDA
(Eap: +0.3 V)
depositadas sobre superf. de
Au mediante la tcnica LBL
Glucosa
GOx / Oro
Inmov. covalente de GOx

a superf. mod. con nAu
GOx / Oro
Inmov. nAu y GOx sobre

MPTS
GOx / Oro
Dep. electroqumica de
biocompsito: ChitosanGOx-nAu
GOx / Oro
GOx / Oro
Inmov. covalente de GOx

modif. con peryodato
(IO4-GOx) y HRP sobre
multicapas de nAu/Thi
CV y EIS
m
Amperom.
K app
= 4.3 mM
(Eap: 0.3V vs Reg. Fosfato pH 7.0
SCE)
Reg. Fosfato 0.05 M + 1
EIS y CV vs.
mM Co(byp) 33+ como
SCE
mediador
Amperom.
(Eap: 0.7 V)
Reg. fosfato 0.1M pH 7.4
Amperom.
m
K app
= 1.21mM
(Eap:0.18 V)
Tcnica LBL para prep.

multicapas de
Amperom. K m = 10.6 mM
nAu/MWNT/GOx unidas
app
(E
ap: -0.2 V)
por atraccin electrosttica a
capas intercaladas de PDDA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
Glucosa
Glucosa
REF.
-2
Inter. Lineal: 1.0x10 -1.3x10 M

-1
-2
Sensibilidad: 5.72 A mM cm
[Yang.,
LD: 8 M
2006a]
Tiempo de vida til: 4 semanas
(85% respuesta inicial)
Au/(PDDA/nAu)3/PDDA/GOx
-1
-2
[Zhang S.,
-1
-2
2006]
-1
-2
-5
-3
Inter. lineal: 2.0x10 5.7x10 M
Sensibilidad:8.8 A mM-1 cm-2
[Zhang S.,
LD: 8.2 M
2005]
Tiempo de vida til: 1 mes
-10
-8
-10
[Zhong, 2005]
LD: 1x10 M
Tiempo de vida til: 21 das
Glucosa /
Suero
Inter. lineal: 0.005 - 2.4 mM

LD.: 2.7 M
[Luo, 2004]
Glucosa y
H2O2
H2O2:
Inter. lineal : 6.0106 - 1.1103M
Sensibilidad:22.8 A mM1 cm2
LD: 58 M
Glucosa:
Inter. lineal : < 3 mM
Sensibilidad:3.8 A mM1 cm2
LD: 35 M
[Sun, 2007]
Glucosa
Inter. Lineal: < 9.9 mM

LD: 128 M
[Liu Y., 2007]
28
Introduccin
ENZIMA/
ELECTRODO
GOx / ITO
GOx / ITO
GOx / GCE
GOx / GCE
GOx / GCE
GOx / GCE
TCNICA
INMOVILIZACIN
Inmov. de GOx por
entrecruzm. con GA y BSA
sobre superf. mod. con nAu
mod. con dendrimeros de
PANAM con hexacianoferrato de Co alternando
capas de PVS
Inmov. de GOx por
entrecruzam. con GA
sobre superf. mod. con
PVS y dendrimeros de
PAMAM con hexacianoferrato de cobalto como
mediador
Inmov. de GOx y TTF
(mediador) por
entrecruzamiento con GA
cisteamina MPA y nAu.
Inmov. mezcla de GOxChitosan-nAu sobre
superf. mod. con pelcula
de azul de prusia.
DETECCIN
CARACTERSTICAS DE
FUNCIONAMIENTO
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
Amperom.
(Eap: 0.0 V
vs. SCE)
m
K app
= 2.03mM
Reg. Fosfato 0.1 M + NaCl
0.05 M, pH 7.0
Glucosa

-2
Sensibilid.: 33.6 0.2 nA mM cm
LD: 17 M
[Crespilho,
2006]
Glucosa
Inter. lineal : Hasta 1.5 mM

-2
Sensibilidad:33.6 0.2 nA mMcm
LD: 17 M
[Brett, 2006]
Inter. lineal : 0.01 10 Mm

Sensibilidad: 1.02 0.06 mA/M
LD.: 0.7 x 10-5M
[Mena, 2005a]
Amperom.
m
(Eap: 0.0 V vs. K app = 2.03 mM
SCE)
Amperom.
(Eap: 0.2 V)
Reg. fosfato 0.05 M pH 7.4
Glucosa
Amperom.
(Eap: -0.05 V)
Repetib.: 8.3% (RSD)

Reg. fosfato 0.05 M pH
7.0+ 0.1 M KCl
Glucosa /
Suero humano
m
K app
= 4.6 mM
CV
Inmov. de GOx sobre superf.
Amperom. Reg. fosfato 0.1 M pH 6.82
mod. con nAu. y
+ 0.25 mM
(E
ap: 0.27 V
recubrimiento con Nf.
vs. Ag/AgCl) ferrocenometanol (como
mediador)
Inmov. de GOx mediante
Amperom. Repet.= 4.8 % (n=7)
composito de nAu y nfibras conductoras de
(Eap: +0.5 V) Reg. fosfato 0.1 M pH 6.9
polyanilina.
Inter. lineal : 1.0x10-6 - 1.6x10-3 M

Sensibilidad: 69.26 A mM-1 cm2
LD: 6.9x10-7 M
[Xue, 2006]
Glucosa
Inter. lineal : 6 mM
Sensibilidad: 6.5 A mM1 cm2
LD. 3.4105 M
[Zhao, 2006]
Glucosa/
Suero y
sangre
Inter. Lineal: 1.0x10-6-8.0x10-4 M

Sensibilidad: 2.3 mA/M
LD: 5.0x10-7 M
[Xian, 2006]
29
Introduccin
ENZIMA/
CARACTERSTICAS DE
TCNICA
DETECCIN
FUNCIONAMIENTO
INMOVILIZACIN
ELECTRODO
GOx /Electrodo Co-inmov. de GOx y nAu
Amperom.
microporoso de sobre superf. mod. con
(E : +0.45 V)
Au
DL-Tiorfan/1,8octanoditiol ap
Const. de transferencia de
Adsor. de GOx sobre superf.
carga: (38.95.3)/s
GOx / PC
CV
mod. con Au col.
Reg. fosfato 0.1M pH 5
GOx / CNTTeflon
compsito/
Incorp. de GOx y Au col.

en la matriz compsita
GOx / Pt
Inmov. de GOx sobre Au

dep. sobre
polivinilferroceno (PVF)
GOx / Pt
HRP / Oro
m
K app
= 14.9 mM
Amperom.
(Eap:+ 0.5 V) Reg. fosfato 0.05 M pH
7.4
Rep. = < 5% (RSD)
Amperom.
m
K app
(PVF-Au-GOx)=
(Eap: +0.5 V
30.40 mM
vs. SCE)
Inmov. de GOx sobre

Amperom.
capas de chitosan y nAu
dep. sobre superf. mod.
(Eap: +0.6 V
con polianilina mediante la vs. Ag/AgCl)
tcnica LBL
CV y EIS
Inmov. de HRP sobre
Amperom.
superf. mod. con pelc. de
chitosan electrodep. y nAu (Eap = -0.25V)
m
= 10.5 mM
K app

Mediador: Azul de
metileno.
HRP / Oro
Inmov. de HRP sobre

superf. mod. con Au col. y
cisteamina
m
K app
= 2.3 mM.
Amperom.
(Eap: -0.3 V) RSD: 3% (n=10)
Reg. fosfato 0.1 M pH 7
HRP / Oro
Inmov. de HRP sobre

superf. mod. con Au col.
inmov. sobre cisteaminaGA-cisteamina
Amperom.
(Eap: - 0.1V
vs SCE)
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
Glucosa
[Zhang F.H.,
2006]
Glucosa /
Suero
Glucosa/
Bebidas
isotnica
[Liu S.,
2003b]
[Manso, 2007]
Glucosa/
Suero
Inter. Lineal: < 36 mM

-1
-2
Sensibilidad: 4.17 mA M cm
[Sulak, 2006]
Glucosa/
Suero
humano
Inter. Lineal: 0.5-32 mM

Tiempo de vida til. 1 mes
[Wu B.Y.,
2007]
H2O2
Inter. lineal: 0.008 - 15 mM

LD: 2.4 M
[Luo, 2005]
H2O2
Inter. lineal: 0.0014 - 2.8 mM

LD.: 0.58 M
[Yi, 2000]
H2O2
Inter. lineal: 0.39 M-0.33 mM

LD.: 0.15 M
[Xiao, 1999]
m
K app
decrece cuando
disminuye el diametro de
Au col/
Inter. Linel : 0.04-0.28 mM

Sensibilidad: 8.4 A/mM
LD: 0.01 mM
Inter. Linel: 0.051 mM
LD.: 17 M
Tiempo de vida til: 3 meses
30
Introduccin
ENZIMA/
ELECTRODO
HRP / Oro
HRP / Oro
HRP / Pt
HRP / Oro
TCNICA
INMOVILIZACIN
Inmv. HRP sobre nAu
quimisorbidas sobre
nanoesferas tioladas
funcionarizadas con
poli(estireno-co-cido
acrilico)
Adsorc. de HRP sobre nAu
enlazadas a grupos tiol de
pelcula sol-gel
Politionina embebida en
pelcula de Nf sobre
superf. de Pt. HRP inmov.
sobre nAu y gelatin sobre
Nf.
Inmov. de HRP sobre nAu
quimisorbidas sobre
superf. mod. con
nanoesferas
funcionarizadas
poly(DVB-co-AA)
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
H2O2
Inter. Lineal: 8.0 M-7.0 mM

LD: 4 M
[Xu S., 2006]
Amperom.
RSD: 2.1 % (n=9)
(Eap= -0.25 V)
H2O2
Inter. lineal: 5 M-10 mM

LD: 2 M
Tiempo de vida til 120 das.
[Jia, 2002]
Cronoamper. RSD: 2.2% (n=5)
H2O2
Inter. lineal: 0.05-30.6 mM

LD: 0.02 mM
[Zhu, 2006]
Repetib.: 1.8 % (n=9)

Amperom. Reprod.: 4.7 %
(Eap: -0.15 V) Reg. fosfato 0.1 M, pH 7.0
H2O2
Inter. Lineal: 1.0 M- 8.0 mM

LD: 0.5 M
[Xu S., 2007]
H2O2
Inter. lineal : 0.01-0.5 mM

LD: 5 M
(almacenamiento)
[Lin J., 2007a]
H2O2
Inter. lineal: 5 M- 1.4 mM

-4
Sensibilidad: 6.24 x10 A/M
LD: 0.401 M
[Xu Q., 2006]
H2O2
Inter. Linel : 0.48-50 M

LD.: 0.21 M
(almacenamiento)
[Liu S., 2002]
DETECCIN
Amperom. Repetib.= 1.7 % (n=9)

(Eap: -0.1 V Reprod.: 4.0 %
vs. SCE)
HRP / ITO
Atrapam. de HRP sobre

Amperom.
superf. mod. con chitosan
(Eap: -0.51 V)
Au col.
HRP / GCE
Inmvo. HRP sobre superf.

mod. con matriz sol-gel que Amperom.
contiene nanocomposito de (Eap: +0.4 V
carboximetil chitosan y
vs. SCE)
nAu
HRP / PC
Inmov. HRP sobre superf.

mod. con Au col.
CARACTERSTICAS DE
FUNCIONAMIENTO
Amperom.
(Eap:-0.4 V
vs. SCE)
Repetib.: 1% (RSD)
(n=34)
m
K app
= 0.57 mM
Repetib.: 1.87% (n=6)

Reproducib.: 6.8% (n=6)
Const. velocidad transf. de
carga: 6.04 0.18s-1
m
K app
=(3.70.7) mM
31
Introduccin
ELECTRODO/
ENZIMA
TCNICA
INMOVILIZACIN
DETECCIN
HRP / Screen
Printed-grafito
Incorp. de nAu y HRP en

matriz de chitosan e inmov.
sobre SPCE
HRP / ITO
Inmov. de HRP sobre superf.

mod con APTMS y Au col.
Amperom.
(Eap: -0.25 V)
HRP / ITO
Inmov. de HRP y TMB

(mediador) sobre superf. mod.
con MPTS y nAu
CV
Amperom.
(Eap:-0.7 V)
HRP / GCE
HRP / GCE
Inmov. de HRP sobre superf.

mod. con nanocompsito
L-cisteinanAu sobre
membrana de Nf.
Unin covalente de CNTs y
nAu sobre pelcula de
politionina electropolim. sobre
GCE. Inmov. de la enzima por
incub. en disolucin 15 mg/mL
de HRP durante 12 h. a 4 C.
Amperom.
(Eap: -0.4 V)
CV
CARACTERSTICAS
DE FUNCIONAMIENTO
m
K app
= 1.3 mM
Reprod.: 4.9 % (n=30)

Reg. citrato 0.1 M, pH 6.5
(n=8)
m
K app
= 2.2 mM

(n=8)
(n=5)
Amperom.
(Eap:+0.4 V vs. Reg. Fosfato 0.1 M, pH 7.0
SCE)
HRP / GCE
Electropolim. de p-ABSA
Cronoamperom. Repet.: 2.8 %
sobre GCE. Adsor. de tionina y
Reproducib.: 3.9 %
(Eap: -0.45 V) Regulador acetato pH 7
nAu e inmov. de HRP
LDH / Oro
ADH / Oro
nAu enlazada a grupos tiol de

MPTS sol-gel. e inmov. de
biocomposito de MPTS sol gel
HRP sobre superf.
m
K app
(Lactato) = 0.91 mM
m
Amperom.
K app (Etanol)= 2 mM
(Eap: -0.05 V)
Reg. Fosfato 0.1 M pH 7.2
ANALITO/
MUESTRA
H2O2
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
Inter. lineal: 0.01-11.3 mM
Sensib.: 0.176 nA/ M
LD: 0.65 m
REF.
[Tangkuaram,
2007]
H2O2
Inter. lineal : 0.020 - 8 mM

LD: 8.0 M
[Wang L. 2004]
H2O2
Inter. lineal : 0.005 - 1.5 mM

LD: 1 M
[Lin, J., 2007b]
H2O2
Inter. lineal : 1.60105 1.10103 M

LD: 5.50106 M
[Li X., 2006a]
H2O2
Inter. lineal: 5M-7.0 mM

LD: 3 M
[Feng, 2007]
H2O2
Inter. lineal: 2.6 M-8.8 mM

LD: 0.64 M
[Gao, 2007]
Lactato,
etanol
Lactato: Sensib.: 446.8 nA/mM

LD.: 0.1 M
Etanol: Sensib.: 47 nA/mM
LD: 20 M
[Jena, 2006]
32
Introduccin
ELECTRODO/
ENZIMA
AChE / GCE
TCNICA
INMOVILIZACIN
Inmov. de AChE sobre superf.
mod. sobre compsito de silica
solgel con nAu ensambladas.
DETECCIN
CV
CARACTERSTICAS DE
FUNCIONAMIENTO
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
RSD: 1.7 2.3 %
Pesticidas:
monocrotophos,
metilparation y
carbaril)
[Du, 2008]
Fenol: Inter. Lineal: 1.0 20 M

Immov. de Cit. C, GOx Tyr
LD: 3108 M
Amperom.
Reg. fosf. 0.1 M pH 6.5
Fenol y
GOx,Cit.C Tyr
sobre nanocompsito de Au mod. Tyr: Eap: -0.15V
Glucosa:
m
glucosa
/ GCE
K app
(GOx) = 43 M
GOx: Eap: +0.7V
con polipirrol
Inter. Lineal: (0.05 0.6) mM
Sensibilidad: 1.089mA/M
Reg. fosf. 0.1 M pH 7.4
LD: 2106 M
m
Inter. lineal: 10135 nM
= 0.18 0.02 mM
K app
Amperom.
Adsorc.de AChE sobre superf.
Tiocolina
AChE / Oro
LD: 33 nM
mod. con Au col. electrodep.
Carbofuran
(Eap: +0.68V)
Etanol
Inter. Lineal: 0.02-1.0 mM
m
Amperom.
Etanol/
ADH / CNT- Incorp. de ADH y Au col en la
= 4.95 mM
K app
Sensibilidad: 2.27 A/mM
Cerveza
teflon compsito matriz compsita
(Eap:+ 0.3 V)
LD: 4.7 M
Tiempo de vida til: 1 mes (almac.)
Hipoxantina X: Inter. Lineal: 5.0107 -1.0105M
Rep. (X): 6.31% (RSD)
Atrapam. de XO en superf.
(Hx) y
CV y Cronoamp. 5 M (n = 5)
Sensibilidad: 0.24 A / M
XOD/GCPE-nAu compsita GCPE (80:20 % w/w)
+0.7V
Rep.(Hx): 3.57% (RSD)
Xantina (X)/ Hx: Inter. Lin.: 5.0106 - 1.5104M
mod. con nAu
Sensibilidad: 0.14 A / M
80 M (n=5)
Atn
m
K app
(Tyr) = 48 A
ADH / Oro
Inmov. de ADH sobre superf.

mod. con Au col. adsorb. sobre
monocapas de 1,6-hexanoditiol
XOD / PC
Inmov. de XOD por entrecruzam.

con GA y BSA sobre superf.
mod. con nAu.
PCQ
CV
EIS
Amperom.
(Eap: +0.6 y 0.00 V
vs. Ag/AgCl)
m
K app
=6.03 104 M

+ 0.1 M NaCl
m
K app
= 18106 M
-5
-2
[Nagy,
2007]
[Shulga,
2007]
[Manso,
2008]
[ubuk
u, 2007]
Etanol

-6
LD: 8.0x10 M
[Liu Y.,
2003]
Hipoxantina /
Sardina y
pollo
Inter. Lineal: 0.510 mol L1

Sensib.: (2.29 0.03)104 A / M
LD: 2.2107 M
[Ag,
2006]
33
Introduccin
ELECTRODO
/ENZIMA
XOD / Oro
Tir / PC
TCNICA
INMOVILIZACIN
Atrapam. de XOD en pPy por
electrooxidacin y adsorc. de
nAu sobre superf. mod. Azul de
Immov. de Tyr sobre superf.
mod. con Au col.
DETECCIN
Amperom.
(Eap: -0.15 V)
CV y
Amperom.
(Eap:-0.15 V)
CARACTERSTICAS DE
FUNCIONAMIENTO
m
K app
=43.2 M
Mediador: Azul de Prusia

m
= (54 3) M
K app
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
Xantina
Inter. Lineal: 1-20 M
[Liu, Y.,
2004]
Fenol
Inter. Lineal : 4 - 48 M
Sensibilidad:12..3 A cm-2 M-1
LD: 6.1 nM
[Liu S.
2003a]
Abreviaturas:AChE:acetilcolinesterasa,ADH:alcoholdeshidrogenasa,ASV:voltamperometradestrippingandico,CitC:citocromoC,
CNT: nanotubo de carbono, CPE: electrodo pasta de carbono, CV: Voltamperometra cclica, DPV: Voltamperometra diferencial de
impulsos, EIS: espectroscopia de impedancia electroqumica, GA: glutaraldehdo, GC: carbono vitrificado, GCE: electrodo de carbon
vitrificado,GCPE:electrodopastadecarbonovitrificado,GA:glutaraldehdo,Hb:hemoglobina,HRP:peroxidasa,ITO:xidodeindioy
m
titanio, K app
: constante aparente de MichaelisMenten, LBL: layerbylayer, LD: limite deteccin, MPTS: (3
mercaptopropil)trimetoxisilano,MWNT:nanotubosdecarbonodeparedmltiple,nAu:nanopartculasdeoro,pABSA:paminobenzene
sulfonicacid,PCQ:piezoelectricquartzcristal,PDDA:clorurodepoli(dialildimetilammonio),pPy:polipirrol,PVB:polivinilbutiral,PVS:
cidopoli(vinilsulfonico),SCE:electrodosaturadodecalomelanos,TMB:tetrametilbencidina,TTF:tetratiafulvaleno;Tir:tirosinasa,XOD:
xantinaoxidasa.
34
Introduccin
I.4.2.Inmunosensoreselectroqumicos
Hoy en da, los inmunosensores electroqumicos constituyen una
importanteherramientaanalticaendiferentescampos,talescomoelanlisisde
alimentos,clnicoymedioambiental[Lei,2003].Lasdiversasconfiguracionesde
inmunosensoreselectroqumicosconstituyenexcelentesalternativasporsualta
sensibilidad,bajocosteyfacilidaddeminiaturizacin.
El desarrollo de inmunosensores se basa en la inmovilizacin del
biomaterial anticuerpo o antgeno sobre una superficie transductora, siendo
esta la etapa crucial a la hora de llevar a cabo su preparacin. Los materiales
electrdicos empleados ms comnmente para la fabricacin de los
inmunosensores son platino, oro, carbono vitrificado, pasta de carbono, as
comoelectrodosserigrafiados(screenprinted).Encuantoalainmovilizacin
de las biomolculas, los procedimientos ms utilizados implican unin
covalente,adsorcinoelatrapamientodelbiomaterialenlamatriz.
Generalmente la adsorcin directa de biomolculas sobre superficies
electrdicas genera su desnaturalizacin o prdida de su bioactividad. Sin
embargo, se ha demostrado que macromolculas, tales como anticuerpos,
antgenos y enzimas, retienen su actividad cuando son inmovilizadas sobre
superficies modificadas con nanopartculas, ya que stas proporcionan un
ambientesimilarasuentornonatural.Ademslaspartculasmetlicasactan
comomediodeconduccinelectrnico,facilitandolatransferenciaelectrnica,
permitiendo alcanzar elevados niveles de estabilidad y sensibilidad [Luo,
2004a].
Se han encontrado en la literatura reciente numerosos ejemplos de
inmunosensores electroqumicos basados en el empleo de nanopartculas de
oro. Un ejemplo significativo es el inmunosensor amperomtrico desarrollado
para la deteccin del virus de la hepatitis B. Para su preparacin, Tang y col.
35
Introduccin
inmovilizaron el anticuerpo HBsAb sobre un electrodo de platino modificado

conorocoloidalypolivinilbutiral[Tang,2004b].Estudiosrealizadosmediante
la tcnica de espectroscopia electroqumica de impedancias (EIS), permitieron
demostrar que el empleo de nanopartculas de oro dio lugar a una mayor
superficieespecficadelbiosensor,consiguindosemejoreslmitesdedeteccin.
LadeterminacindeestemismoantgenofuellevadaacaboporWangycol.,
conuninmunosensorbasadoenelempleodeunasuperficiedeoromodificada
conunamonocapade4aminotiofenolyorocoloidal.Lacinticadelprocesode
reconocimiento antgenoanticuerpo fue tambin monitorizada por EIS [Wang
M.,2004].
Ms recientemente, Tang y col. utilizaron diferentes superficies
electrdicas y disearon nuevas estrategias para la preparacin de
inmunosensoresparaladeteccindelantgenodelaHepatitisB.Enlaprimera
de ellas, el anticuerpo fue adsorbido electrostticamente sobre multicapas de
nanopartculas de oro y Co(bpy ) 33+ consiguindose buenos lmites de deteccin
tanto por amperometra como por potenciometra [Tang, 2005b]. Cuando el
anticuerpo de la Hepatitis B se inmoviliz sobre una superficie de oro,
modificadaconnanopartculasdeorounidasalosgrupostiolesdeunapelcula
solgelpreviamentemodificada,seobtuvieronmejorescaractersticasanalticas
[Tang, 2006a]. Este ltimo diseo est basado en un inmunosensor
amperomtricopreviamentepreparadoporelgrupodeLiangycol.enelcual
las nanopartculas de oro fueron quimisorbidas sobre una superficie de oro
previamente modificada con un solgel de mercaptopropiltrimetilsilano,
obtenindoseuninmunosensorconuntiempodevidade30dassinobservarse
prdida apreciable de sensibilidad. El mismo inmunosensor, preparado en
ausencia del material nanoestructurado, muestra una disminucin de la seal
del 30%, por lo que la buena estabilidad se atribuy a la presencia de las
nanopartculas[Liang,2005].Otrodiseoencontradoenlabibliografaparala
36
Introduccin
preparacin de un inmunosensor de Hepatitis B, se basa en la inmovilizacin

delanticuerposobreunelectrododeoromodificadoconnanopartculasdeoro
yperoxidasa(HRP)[Zhuo,2005a].EsteinmunosensorempleaHRPenlugarde
albmina de suero bovino (BSA) como bloqueante de los sitios activos de la
superficieelectrdica,consiguindosedeestemodo,ademsdeevitarposibles
adsorciones inespecficas, la amplificacin de la respuesta de la reaccin
antgenoanticuerpo.
La tcnica de autoensamblaje y la metodologa de la adsorcin se han
combinadoparalainmovilizacindelanticuerpodeladifteriaylapreparacin
de un inmunosensor para la determinacin del antgeno correspondiente. El
anticuerpo antidifteria se inmoviliz sobre una mezcla de nanopartculas de
oro y nanopartculas de slice depositadas sobre una superficie de platino
previamente modificada con polivinilbutiral. La deteccin se basa en la
diferencia de la respuesta potenciomtrica antes y despus de la reaccin
antgenoanticuerpo,poniendodemanifiestoqueelinmunosensorbasadoenel
empleo de nanopartculas de oro y nanopartculas de slice exhibe una mayor
sensibilidad, mejor reproducibilidad, as como una mayor estabilidad que los
preparadosempleandounslonanomaterial[Tang,2005a].
Se han diseado inmunosensores para la determinacin de 1
fetoprotena (AFP). La importancia de la determinacin de este compuesto se
debe a su inters en diagnsticos clnicos, ya que es empleado comnmente
comomarcadordeclulastumorales.Enlaprimeradelaestrategiasutilizada,
el anticuerpo 1fetoprotena se inmoviliza sobre una superficie de oro
modificadaconuna mezclacompsitadetioninay Nafionconnanopartculas
de oro. Seguidamente, el inmunosensor se incuba en una disolucin de AFP,
midindose, la disminucin de corriente al aumentar la concentracin de AFP
mediante voltamperometra cclica. Empleando esta configuracin se alcanz
37
Introduccin
un lmite de deteccin del orden de nanomolar [Zhuo, 2005b]. Ms

recientemente, estos mismos autores disearon un nuevo inmunosensor
amperomtricobasadoenelempleodemulticapasdenanopartculasdeoroy
tionina para la inmovilizacin de los anticuerpos sobre una superficie de oro
previamente modificada con Nafion. En esta configuracin, se emplea HRP
como agente bloqueante de la superficie electrdica para evitar adsorciones
inespecficas[Zhuo,2006].
Los electrodos de carbono vitrificado han sido extensamente utilizados
para la preparacin de inmunosensores amperomtricos. Su modificacin con
nanopartculas de oro proporciona una superficie adecuada para la
inmovilizacin de anticuerpos sin producirse prdida de su actividad. As, la
modificacin de la superficie electrdica con cido polisulfanlico y azul de
toluidina permite la unin de nanopartculas de oro y la posterior
inmovilizacindelanticuerpo,parallevaracaboladeterminacindelantgeno
carcinoembrinico[LiX.,2006b].
Otro ejemplo de inmunosensor preparado con un electrodo de carbono
vitrificado modificado con nanopartculas, es el empleado para la
determinacin del antgeno carcinoma 125. En este caso, el anticuerpo se
inmoviliza sobre oro coloidal estabilizado con una membrana de acetato de
celulosa.Lacombinacindelasnanopartculasdeoroylamembranadeacetato
de celulosa hace posible la inmovilizacin del anticuerpo, obtenindose un
inmunosensorsensibleyselectivoparaestetipodeantgeno[WuL.,2006].Este
mismoanticuerpohasidoinmovilizadoporelgrupodeTangycol.sobreuna
interfase de pasta de carbono modificada con nanopartculas de oro y tionina
obtenindosebuenosresultados.[Tang,2006b].
Entre los materiales inorgnicos empleados para la fabricacin de
inmunosensores,cabedestacarlosderivadossolgel.Lasventajasquepresentan
38
Introduccin
estetipodesuperficiesestnrelacionadasconsuporosidad,sualtaestabilidad
trmica y baja reactividad qumica, as como la prctica ausencia de
hinchamiento en medios acuosos. El empleo de estas matrices electrdicas
permiteelatrapamientodelosbiomateriales,peropresentaelinconvenientede
una mayor prdida de su bioactividad. En estos casos es particularmente
atractivo el empleo de nanopartculas de oro, ya que, como se ha comentado
anteriormente,supresenciaproporcionaunambientesimilaralestadonatural
delamolculabiolgica,mantenindosesuspropiedades.Adems,lapresencia
de las nanopartculas proporciona una mayor rea activa, lo que conlleva una
mayordensidaddeanticuerposinmovilizados,yunamayorsensibilidad.Esta
estrategia ha sido empleada por Wu y col. para la preparacin de un
inmunosensor de inmunoglobulina G y su determinacin en suero humano,
consiguindose un amplio intervalo lineal y una buena selectividad [Wu Z.S,
2005].
Un ejemplo en el que se combina el empleo de nanopartculas de oro
para la inmovilizacin de biomolculas y su utilidad como marcador
electroqumico, es el inmunosensor desarrollado por Chen H. y col. para la
determinacin de inmunoglobulina G humana. La tcnica de deteccin
empleada fue la espectroscopia de impedancia electroqumica (EIS),
consiguindose una amplificacin de la seal por deposicin secuencial de
inmunoglobulina G e inmunoglobulina G marcada con nanopartculas de oro.
Para la preparacin del inmunosensor los anticuerpos fueron inmovilizados
sobreunasuperficiedeoropreviamentemodificadaconunamonocapade1,6
hexanoditiol (HDT) y con nanopartculas de oro alcanzndose un lmite de
deteccinde4ngmL1[ChenH,2006].
En la Tabla 3 se recogen los ejemplos ms significativos de diseos de
inmunosensores basados en el empleo de nanopartculas de oro, mostrndose
39
Introduccin
deformaesquemticaaspectosrelevantescomosupreparacinysuaplicacin
aladeterminacindediferentesanalitosdeinters.
40

Introduccin
Tabla3.Inmunosensoreselectroqumicosbasadosenelempleodenanopartculasdeoro.
ELECTRODO
Platino
Platino
Platino
Platino
Platino
Platino
Platino
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Inmov. del Ab de difteria
sobre Pt mod. con Au col.
y PVB y bloqueo con BSA
Inmov. de antisuero de
encefalitis Japanese B
sobre Pt mod. con PDA y
nAu y azul de Prusia
(mediador). Bloqueo con
BSA
Inmov. del Ab de la
difteria sobre Pt mod. con
Au col. y. PVB
Inmov. del Ab de difteria
sobre Pt mod. con Au col.
y PVB
Inmov. del Ab de Hepatitis
B sobre superf. mod. con
nAu, Nf y gelatina
Adsorc. de Ab sobre
mezcla de nAu-nSiO2 y
atrapam. en PVB sol-gel
Inmov.del Ab de Hepatitis
B sobre superf. mod, con
(Co(bpy) 3 + ) , nAu y Nf
3
DETECCIN
PARAMETROS
EXPERIMENTALES
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS ANALTICAS
REF.
CV y EIS
Potenciom.
Reg. fosfato pH 7 + KCl

0.1 M
Antgeno
Difteria
Interv. concentrac.: 24-1280 ng mL -1

LD: 7.8 ng mL -1
[Tang
2005a]
Amperom.
Ensayo directo/ Reg.

fosfato 25 mM pH 7.4
Japanese B
encephalitis
vaccine
Interv. concentrac.: (1.1-190) x 10-8

lg pfu mL-1
LD: 6 x 10-9 lg pfu mL-1
[Yuan,
2005]
CV y EIS
Potenciom.
Reg. fosfato pH 7.0 +

KCl 0.1 M
CV y EIS
Fe(CN)64 / 3 en reg.
fosfato pH 7.4
Antgeno
Difteria/ Suero
humano
Antgeno
Hepatitis B/
Suero humano
Interv. concentrac.:4.4-960 ng / mL
LD: 2.4 ng mL-1
Interv. concentrac.: 20-160 ng mL-1
LD: 7.8 ng mL-1
[Tang,
2004b]
Potenciom.
Ensayo directo/ Reg.

fosfato 0.1 M pH 7.4
Hepatitis B/
Suero humano

LD: 1.3 ng mL-1
[Tang,
2004c]
Potenciom.
Reg. fosfato, pH 7.0
Toxina de la
diphteria
Potenciom.
Amperom.
Reg. fosfato pH 7.0
Hepatitis B/
Suero humano
-3
[Tang,
2004a]
-1
Interv. concentr.: 5.0x10 -1.2 g mL

-3
-1
LD: 1.1x10 g mL
[Tang
2005a]
Interv. concentrac.: 0.05-4.5 g mL1

LD (Amperom.): 0.005 g mL-1
LD (Potenciom.): 0.015 g mL-1
[Tang
2005b]
41

Introduccin
ELECTRODO
Platino
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Inmov. del Ab sobre
superf. mod. con DTSP,
poli(amido-amina)
dendrimero y nAu
nanopartculas de slica
SiO2/nAu
Adorc. del Ab de difteria
sobre mezcla de nAu-SiO2
y atrapam. en sol-gel de
PVB
Inmov.del Ab de Hepatitis
B sobre superf. mod. con
MPS-sol gel y Au coloidal
Inmov. anti-IgG sobre
superf. mod. con
mercaptoetilamina y nAu
Inmov. anti-AFP sobre
superf. mod. con n-Au
membrana de Nf y Thi.
Bloqueo de super. con BSA
DETECCIN
PARAMETROS
EXPERIMENTALES
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
CV
Reg. fosfato10 mM pH
7.0
IgG / Suero
humano
Interv. concentrac.:
5.0-9600 g mL-1
LD: 0.8 ng mL-1
[Tang 2005d]
Potenciom.
Reg. Fosfato, pH 7.0
Difiero toxina
Potenciom.
-1
Interv. concentrac.: 4.4-960 ng mL

-3
-1
LD: 1.1x10 g mL
[Tang y Ren,
2005]
Reg. fosfato pH 7.4
Antgeno Hepatitis
B/ Suero humano

LD:1.9 ng mL-1
[Tang, 2006a]
Potenciom.
Repet.: 5.9 %
Reg. Fosfato pH 7
IgG/ Suero

LD: 3.4 ng mL-1
[Fu, 2005]
CV y
Amperom.
HAc-NaAc 0.1 M
pH 5.5 + KCl 0.1 M
-fetoprotena/
Suero humano
Interv. concentrac.: 5.0-200 ng mL-1

LD: 2.4 ng mL-1
[Zhuo,
2005a]
Oro
Inmov. del Ab de Hepatitis

sobre superf. mod. con Au
col. Thi y Nf. Bloqueo
superf. con BSA HRP
Amperom.
Repet.: 3.8 % (n=50)

HAc-NaAc 0.1 M
pH 6.5 + 0.27 mM H2O2
Hepatitis B
Oro
Adsor. electrost. de n-Au y

Thi sobre membrana de Nf
y HRP
Amperom.
HAc-NaAc 0.1 M
pH 5.5 + 0.1 M KCl
-1-fetoprotena/
Suero Humano
Platino
Oro
Oro
Oro
Interv. concentrac. (con BSA):

5.12 512 ng mL-1
Interv. concentrac. (con HRP):
2.6-563 ng mL-1
LD: 0.85 ng mL-1
LD: 0.56 ng mL-1
[Zhuo,
2005b]
[Zhuo, 2006]
42

Introduccin
ELECTRODO
Oro
Oro
Oro
Oro
Oro
Oro
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Inmov. del Ab sobre
Au modif. con Au col.
y 1,6-hexaneditiol.
Bloqueo de superf. con
BSA
Inmov.del Ab de
Hepatitis B sobre
superf. mod. con MPS
sol-gel y nAu
quimisorbido
Anti-CEA inmov.
sobre nAu-MPTS solgel
Inmov. de Ab de
Hepatitis sobre sup.
mod. con 4-aminotiofenol y Au col.
Inmov. de Ab de IgG
humano sobre superf.
mod con MPTS sol-gel
y nAu. Bloqueo con
BSA
Inmov. anti-PSA sobre
superf. mod. con
pelicula de Al2O3 solgel y nAu
PARAMETROS
EXPERIMENTALES
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
Ensayo tipo sndwich/

20mM PBS + 0.1M KCl,
5 mM K3[Fe(CN)6]
/K4[Fe(CN)6], pH 7.4
IgG humana
Interv. concentrac.:15.3-328.3 ng L-1

LD: 4.1 ng L-1
[Chen H,
2006]
DPV y
Amperom.
K3Fe(CN)6 5 mM+ KCl

0.1 M + Reg. Fosfato
0.05 M
Antgeno
Hepatitis B/
Suero humano

LD: 0.2 ng mL-1
[Liang, 2005]
Potenciom.
Reg. fosfato pH 7.4
Antgeno
Carcinoembrio
nico (CEA)
Interv. concentrac.: 4.4-85.7 ng mL

-1
LD: 1.2 ng mL
[An, 2007]
Hepatitis B
Interv. concentrac.: 0.5-200 g L-1

LD: 50 ng L-1
[Wang M.,
2004]

LD: 3.3 ng mL-1
[Wu Z.S,
2005]
DETECCIN
EIS
Amplific. seal
por dep.
secuenc. de IgG
y antiIgG-Au
CV y EIS
Fe(CN)64 / 3 2.5 mM+
Reg. fosfato 0.02 M

pH 7.4
CV y
EIS
Ensayo directo / Reg.

Fosfato 10 mM pH 7.4 +
Fe(CN)64 / 3 5mM
IgG/ Suero
humano
Potenciom.
Ensayo directo / Reg

fosfato pH 7.4
PSA/ Suero
humano
-1

-1
LD: 3.4 ng mL
-1
[Liu Y., 2008]
43

Introduccin
ELECTRODO
MODIFICACIN
ELECTRDICA
DETECCIN
PARAMETROS
EXPERIMENTALES
ANALITO/
MUESTRA
Inmov. anti-AFP sobre

Ensayo tipo sndwich
superf. Au mod. con Cys Cronoamperom
Microelectrodos
-fetoprotena (AFP) /
.
Reg. fosfato 10 mM pH
/ 1,6-Hexaneditiol y Au
Au
Suero
7.4
col. Bloqueo superf. con
(Eap: -0.4 V)
BSA
Incub. anti-CEA sobre
Antgeno
superf. mod. con MPA,
QCM
Superficie de Oro
Carcinoembri-nico
hidroxil-amina y nAu, e
7.0
(CEA) / Suero
incub. en BSA
Inmov.CA125 sobre Au
Ensayo competitivo/
Carbono
Carcinoma 125/
col. estabilizado con
DPV
Reg. Fosfato 0.1 M pH
vitrificado
Suero humano
membrana de acetato de
5.5
celulosa
Incub. de anti-IgG sobre
Ensayo tipo sndwich
Carbono
sup. mod. con pelcula de
IgG
EIS
/ Fe(CN)64 / 3 10 mM en
vitrificado
Au electrodep. e incub en
KCl
0.1
M
BSA
Inmov. del Ab de
Directa/ Reg. fosfato
Carbono
CV
paraoxon sobre GCE
0.01 M pH 7 + NaCl
Paraoxon/ Aguas
vitrificado
mod. con Au col y
Potenciom.
0.05 M
pelcula de Nf
Carbono
vitrificado
Atrapamiento de HRPanti-hCG/nAu en
membrana sol-gel
DPV
EIS
Carbono
vitrificado
Adsorc. de Ag de Sj
sobre pocillo de
poliestireno e inmov. de
Ab de Sj
Det. de Ag
mediante ASV
sobre GCE
Reg. fosfato 0.1 M

pH 7.1
Gonadotropina
corinica humana
(hCG) / Suero
Directo / 0.6 M KNO3 +

0.1 M HNO3
Schistosoma
japonicum (Sj) /
Suero conejo
REF.

LD: 5 ng mL-1
[Xu Y,
2006]
Interv. concentrac.: 3-50 ng mL

-1
LD: 1.5 ng mL
-1
[Tang,
2006c]
Interv. concentrac.: 0-30 U mL-1

LD: 1.73 U mL-1
[Wu L.,
2006]
-1
[Chen Z.,
2005]

LD: 0.009 ng mL-1
-1
[Hu,
2003]
Interv. concentrac.: 24-1920g L

LD: 12 g L
-1
-1
Interv. concentrac.: 0.5-5.0 mIU mL

-1
5.0-30 mIU mL
[Chen J.,
2006]
-1
LD:0.3 mIU mL
-1
-1
Interv. concentr.: 6.4 ng mL -100 g mL

-1
LD: 3 ng mL
[Chu,
2005a]
44

Introduccin
ELECTRODO
Carbono
vitrificado
Carbono
vitrificado
Carbono
vitrificado
Carbono
vitrificado
y oro
Carbono
vitrificado
Carbono
vitrificado
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Adsorc. de anti-IgG
sobre pocillo
(microwell) de
poliestireno
Incub de anti-CEA,
sobre GCE mod. con
PSAA, TB y nAu col.
Bloqueo con HRP
BSA
Inmov. del Ag de los
alergnicos de los
caros del polvo sobre
superf. mod. con nAu
electrodepositadas.
Dep. del Ab modific.
con sales de diazonio
Inmov de anti-CA15-3
nAu, RBC y pelcula
de Au
Inmov. del Ab de
CA125 sobre superf.
mod. con microesferas
porosas y PTH
DETECCIN
PARAMETROS
EXPERIMENTALES
Ensayo tipo Sndwich:

Det. de Ag+
incub. IgG+anti-IgGnAu
mediante ASV
Ads. de Ag+ sobre nAu,
sobre GCE
redisol.
Amperom.
EIS
Cronoamp.
(Eap:0V)
CV
Amperom.
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
-1
IgG/ Suero
humano
Interv. concen.:1.7 ng mL -27.2 g

-1
mL
LD: 1 ng mL
-1
Interv. concentrac. (con BSA):

0.5-5.0 ng mL-1 y 5.0-120 ngmL-1
Reg. fosfato 0.1 M pH 6.5 +
CEA
Interv. concentrac. (con HRP):
0.1 M KCl
(analito modelo)
-1
-1
0.5-5.0 ng mL y 5.0-120 ng mL
-1
LD: 0.2 ng mL
Inc. en el anticuerpo murine y
Alergnicos de
medida de EIS en 2.5 mM
los caros del
K4[Fe(CN)6] + 2.5 mM
K3[Fe(CN)6] +0.1 M KCl en
polvo
20 mM pH 7.4 PBS.
Ensayo tipo sndwich / Dep.
de citosina y del Ab
biotinilado. Inc. en
cytokine
ExtraAvidina-HRP Empleo
LD.: 46 pg mL-1
de 3,3,5,5-tetrametibencidina
como mediador
Ensayo Competitivo/ Reg.
fosfato pH 7.4 + 1.0 mM
H2O2
2.5 mM de Fe(CN)64 / 3
+ 0.1 M KCl en 20 mM de
reg. fosfato de pH 7.4
CA15-3/ Suero
humano
Antgeno
Carbohidrato
CA 125
Interv. concentrac.: 2.5-120 U mL

-1
LD: 0.5 U mL
-1
Interv. de concentr.: 4.5-36.5 U mL-1

LD: 1.3 U mL-1
[Chu,
2005b]
[Li X,
2006b]
[Huang,
2007]
[Polsky,
2008]
[Tang, 2007]
[Fu, 2007]
45

Introduccin
ELECTRODO
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Adsorc. Ab sobre sup. e

Pasta de carbono incub. en BSA
Au col. como marcador
Atrapam. de nAu en
matriz de chitosan sobre
Pasta de carbono
el electrodo y mod. con
SjAb
DETECCIN
PARAMETROS
EXPERIMENTALES
ANALITO/
MUESTRA
ASV
Ensayo tipo Sndwich/ Reg.

fosfato 0.05 M pH 7.4
hIgG/ Suero
humano
Amperom.
(Eap : -0.3 V)
Ensayo Competitivo
secuencial/ Reg. fosfato
0.067M pH 6.98
Incorp. de Ab y nAu a la
Pasta de carbono
CV, EIS y DPV
matriz
Medida disminucin
CA19-9/ Suero
corriente de pico por la
humano
interac. Ag-Ab/ PBS pH 7.0
Ensayo tipo Sndwich /
antiIgG secundario marcado
con dethiobiotina. Post.
hIgG
reaccin con biotina modif.
con partculas magnticas
sobre Avidina-nAu
Dis. del Au en HBr/Br2
ASV para
determinar el
contenido de
oro
Incub. de anti-AFB1
Microelectrodo sobre superf. mod. con
Au (digitalizado) nAu y AET, bloqueo
superf. con HRP
Conductim.
Reg. Fosfato 0.02M pH 7.0

+ 0.05 M KI, 80 M H2O2
+ 0.15 M NaCl
AFB1
CV
Ensayo tipo sndwich / Ab

secundario marcado con
nAu. Oxidacin electroq.
del oro con HBr/Br2
Mioglobina,
troponina y
creatina quinasa
Ab inmov. sobre un
pocillo de una placa
REF.
Interv. concentrac.: 10-500 ng mL

-1
LD: 4.0 ng mL
-1
Schistosoma
Interv. concentrac.: 0.11-22.4 g mL-1
japonicum
LD: 0.06 g mL-1
(analito modelo)
Inmov. de anti-IgG
sobre un pocillo e inc.
Pasta de carbono en IgG durante 1 h a 37
C
Screen-Printed
de grafito
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
[Chen Z.,
2007]
[Lei, 2003]
-1
Interv. concentrac.: 2-30 U mL

-1
LD: 1.37 U mL
Tiempo de vida: 10 das

-1
LD: 0.1 ng mL
[Dan, 2007]
-1

-1
LD:0.1 ng mL
-1
[Mao, 2007]
[Liu Y.,
2006]
[Piras, 2005]
46

Introduccin
ELECTRODO
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Inmov. de anti-IgG
sobre un pocillo, incub.
Scren-Printed de
en IgG, y unin del
grafito
conjugado anti-goat-IgG
marcado con Au col.
Electrodos de Ag
Inmov. cov. de antiserigrafiados sobre
HSA sobre superf. mod.
nitrocelulosa mod.
con nAu con polianilina
con polianilina
DETECCIN
ASV
Conductim.
PARAMETROS
EXPERIMENTALES
Ensayo tipo Sndwich/
Ab secundario marcado
con nAu. Oxidacin
electroq. del oro con
HBr/Br2
Ensayo tipo sndwich / Ab
secundario marcado con
Au. Cuantif. del oro
ANALITO/
MUESTRA
IgG de cabra
Albmina suero
humano
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
Interv. concetrac.: 0.5-100 ng mL

LD: 3 pM
REF.
-1
[Dequaire,
2000]
[Kim, 2000]
Abreviaturas: BSA: albmina de suero bovino, CPE: electrodo pasta de carbono, DTSP: 33Ditiobis(cido propionioco/N
hidroxisuccinimida), FcCHO: ferrocenocaraldehdo, GCE: electrodo carbono vitrificado, HAsAb: Anticuerpo Hepatitis B., HbsAg:
antgeno del Hepatitis B., MPS: mercaptopropiltrimetoxilano, MPTS: mercaptopropiltrietoxisilano, Nf: nafion, nAu: nanoparticulas de
oro, PDA: ofenilenidiamina, PSA: antgeno especfico de la prstata, PTH: politionina, PVB: polivinilbutiral, SAM: monocapa
autoensamblada,TRIS:tris(hidroximetil)aminometano,Thi:tionina
47

Introduccin
I.5ANALITOSYANTECEDENTESBIBLIOGRFICOS
I.5.1 Compuestosfenlicos
Losfenolessoncompuestosaromticosquesecaracterizanporteneruno
o varios grupos hidroxilo unidos directamente al anillo aromtico.
Generalmente se nombran como derivados del miembro ms sencillo de la
familia,elfenol[Serra,2002].
Son compuestos altamente txicos, carcinognicos y alergnicos. Su
toxicidad vara con el nmero de sustituyentes y su posicin en el anillo
aromtico. Debido a su alta toxicidad y persistencia en el medio ambiente, el
fenol y especialmente sus derivados clorados, nitrados y alquilados se han
definido como contaminantes peligrosos y estn incluidos en la lista de
sustancias peligrosas y contaminantes prioritarios de la Comunidad Europea
(CE)ydelaAgenciadeProteccinAmbientalNorteamericana(EPA)
La presencia de fenoles en el medio ambiente es consecuencia tanto de
acciones naturales como del aporte antropognico, generalmente de carcter
industrial.Desdeelpuntodevistadelacontaminacin,esdegranimportancia
la presencia de estos compuestos en aguas y sedimentos, debido a su elevada
toxicidad, siendo empleados en diferentes tipos de industrias, como textiles,
plsticos,colorantes,tintas,medicamentos,antioxidantes,polmerossintticos,
resinas, pesticidas, detergentes, etc. [SoaresRosatto, 2001]. Por tanto, es
necesario prestar inters al origen, migracin y distribucin de estos
compuestosenelmedioambiente,ascomocontarconmtodosfiablesparasu
determinacinenmatricescomplejas[Wang,1994].
48

Introduccin
Porloqueserefierealospolifenoles,soncompuestosconstituidosporal
menosunanilloaromticoconunoomsgruposhidroxilocomosustituyentes.
Enelserhumano,trassuingesta,partedelaactividadbiolgicadelos
polifenoles se debe a su capacidad de formar parte del sistema antioxidante
celular, proporcionando importantes beneficios para la salud. Entre sus
propiedadesmsrelevantescabedestacarsucapacidadparainhibirlosprocesos
oxidativos de lipoprotenas de baja densidad (LDL) reduciendo los riesgos de
enfermedades cardiovasculares, su actividad antioxidante, protegiendo los
tejidos del dao oxidativo y del envejecimiento celular, su accin
antiinflamatoria, reduciendo la actividad de la enzima hialuronidasa, y sus
propiedades anticancergenas. Todo ello, hace que los polifenoles sean

consideradoscomounsubproductodealtovaloraadido[Mello,2003].
De hecho, actualmente se estn realizando numerosas investigaciones a
nivelmundialconelfindeconocerlacantidadyeltipodepolifenolespresentes
en los alimentos, ya que muchos de los efectos saludables de los mismos, se
deben en realidad a su alto contenido en polifenol, tal es el caso de las fibras
dietticas.
Por otro lado, las propiedades organolpticas de ciertas frutas, y
consecuentemente, la calidad de algunos alimentos y bebidas, dependen de la
concentracin y tipo de compuesto polifenlico presente [Freire, 2003]. Un
ejemplo, lo encontramos en el aceite de oliva. Los polifenoles al tratarse de
antioxidantesnaturales,ralentizanoprevienenlosprocesosdedescomposicin
de aceites y grasas. De ah que la determinacin de estos compuestos sea
importantealahora deevaluarlacalidad delaceite,yaquesonparcialmente
responsables de su estabilidad a la autooxidacin y de sus caractersticas
organolpticas[Capannesi,2000].
49

Introduccin
I.5.2 Antecedentes bibliogrficos sobre la determinacin de

compuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricos
Lanecesidaddehacerfrentealosproblemasanalticosqueseplantean
hoy en da, requiere disponer de tcnicas rpidas y fiables que permitan la
deteccin in situ de sustancias contaminantes, como es el caso de los
compuestosfenlicospresentesenmuestrasambientales,yotrassustanciasde
inters,comolospolifenolesenalimentos.
Estehechohaimpulsadoeldesarrollodebiosensorescomoalternativaa
tcnicasespectrofotomtricasycromatogrficas,quegeneralmenteimplicanun
mayortiempodeanlisis.
Elempleodeenzimas,comoelementodereconocimientobiolgico,yla
deteccinamperomtricacomosistemadetransduccin,paralafabricacinde
biosensores,proporcionanumerosasventajasdesdeunpuntodevistaanaltico.
En este apartado se va a dar una visin general de los diferentes mtodos
desarrollados en los ltimos aos basados en la utilizacin de biosensores
enzimticosamperomtricosparaladeteccinydeterminacindecompuestos
fenlicos.
En la Tabla 4 se resumen las caractersticas de diferentes biosensores
electroqumicos encontrados en la bibliografa para la determinacin de
compuestos fenlicos. Los biosensores han sido agrupados atendiendo al
material enzimtico empleado, indicndose la enzima utilizada y la forma de
inmovilizacin, el potencial de medida, sus parmetros experimentales, as
como las caractersticas analticas del mtodo y el tipo de muestra a la que se
hanaplicado.
50

Introduccin
Como puede apreciarse, se han construido una amplia variedad de

biosensores enzimticos modificando electrodos de pasta de carbono y de
carbono vitrificado. La mayora de los mtodos se basan en la reduccin
electroqumica de los productos de la reaccin enzimtica. Sin embargo, en
algunos casos se utiliza una sustancia mediadora, cuya oxidacin o reduccin
sobre el electrodo sirve para monitorizar la concentracin de los fenoles en
disolucin.
Tambinsehanencontradoejemplosenlosqueseempleaunelectrodo
de Clark [Campanella, 2006]. En estos casos, la monitorizacin de los
compuestos fenlicos se lleva a cabo mediante la deteccin del consumo de
oxgeno,loqueconllevaladesventajadelanecesidaddeaplicarunpotencialde
medidabastantenegativo,aumentandoaselnmerodeinterferencias.
La inmovilizacin de las enzimas en los electrodos de oxgeno suele
realizarsecolocandolaenzimasobrelasuperficiedelamembranapermeableal
gas del electrodo de oxgeno y recubrindola con una membrana de dilisis o
deotrotipo[Streffer,2001],obieninmovilizandopreviamentelaenzimaenun
gelqueposteriormentesedepositaenlamembranadelelectrodo[Campanella,
2004].
Alahoradellevaracabolapreparacindebiosensores,hayquetener
en cuenta que la inmovilizacin de la enzima en la superficie electrdica
dependedeltipodematerialelectrdicoempleado.As,enlosbiosensoresque
utilizanmaterialescompsitos,elmtododeinmovilizacinmsutilizadoesel
atrapamiento del material proteico en la matriz electrdica [Serra, 2002],
aunqueenocasioneslaenzimaseinmovilizadespusdehabersemezcladocon
otraspartculas[LiuS.,2003a].Otraalternativaeselempleodeunafinacapade
solgelparalainmovilizacindelaenzimasobrelasuperficiedelelectrodo.
51

Introduccin
Una gran parte de los diseos que utilizan electrodos de carbono

vitrificado llevan a cabo la inmovilizacin de la enzima por encapsulamiento
conunamembrana[Rajesh,2004a],poratrapamientoenunamatrizpolimrica
depositadaenlasuperficiedelelectrodo[Vdrine,2003],medianteelempleode
unhidrogel[WangB.,2000a],oporunincovalenteconcarbodiimida[Freire,
2002a]. En algunos casos, se emplean conjuntamente dos mtodos de
inmovilizacin, por ejemplo, unin covalente con glutaraldehdo en la
superficie del electrodo y posterior encapsulamiento con una membrana de
dilisis,ounincovalenteaunhidrogelqueposteriormentesedepositasobrela
superficiedelelectrodo[Freire,2002b].
Enelcasodeemplearunelectrododegrafitoslidolainmovilizacinde
laenzimaessimilaraladeloselectrodosdecarbonovitrificado,sibienesms
frecuente la adsorcin, debido a la ventaja de que este material posee una
superficierugosa[Haghighi,2003;JarrosWilkolazka,2004].
El medio de trabajo de estos biosensores es comnmente acuoso o
predominantementeacuoso,emplendoseenlamayoradeloscasosregulador
fosfatoapHsentre5.0y7.4.Enalgunoscasos,seaadeunciertoporcentajede
metanol,[Narvez,1996],etanol[Gomes,2004]oacetonitrilo[Rogers,1999].
A pesar del gran nmero de sensores enzimticos amperomtricos
existentes,muypocoshansidoaplicadosamuestrasreales.Noobstante,sehan
desarrolladoaplicacionesenaguas,suelos,filtrosdecigarrillo,aceites,cervezas,
vinosypesticidas.Laescasaaplicacindelosbiosensoresdesarrolladospuede
atribuirsealadificultaddellevaracabomedidasenmatricescomplejas,enlas
cualesellmitededeteccinpuedeaumentarconsiderablemente,laestabilidad
de la enzima suele disminuir y la pasivacin electrdica es habitualmente
muchomsacusada.
52
Introduccin
Tabla4.Antecedentesbibliogrficossobreladeterminacindecompuestosfenlicosconbiosensoresamperomtricosenzimticos.
ELECTRODO
TCNICA
INMOVILIZACIN
TCNICA
DETECCIN
PARMETROS
EXPERIMENTALES
Pasta de
Carbono
Atrapam. fsico de Tir en la Amperom.

matriz compsita
(Eap: -0.15 V) 6.5
Pasta de
carbono
Incorp. de Tir en la matriz

Amperom.
junto al grafito y
(Eap: -0.2 V vs.
7.0 + NaClO4 0.1 M
monmero de polipirrol
SCE)
Pasta de
carbono
Inmov. de Tir junto con Ru

en la matriz electrdica
Amperom. Reg. fosfato 10 mM,

(Eap.: -0.1 V pH 7.4
vs. Ag/AgCl) Reprod.: < 5%
Pasta de
carbono
Incorporacin de Tir en la
matriz electrnica con
copolmero PS 086
Amperom.
Reg. fosfato 50 mM, pH
(Eap: -0.2 V
6.5
vs. Ag/AgCl)
Pasta carbono
vitrificado
Inmov. de Tir por

atrapamiento fsico en la
matriz electrdica
Amperom. Reg. fosfato 0.05 M, pH

(Eap: -0.1 V) 7.4
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
Interv. lineal : 0.1-12 M

Sensib.:138 A mM1
[Mita, 2007]
LD: 0.02 M
Fenol Interv. lineal : 0-7 M
-1
-2
Sensib.:24.02 A M cm
Fenol, catecol y
Catecol Interv. lineal : 0-10M
[Tingry,
p-cresol/
-1
-2
2006]
Sensib.: 18.6 A M cm
Salmn
p-Cresol Interv. lineal : 0-12M
-1
-2
Bisfenol A/
Agua
-1
Interv. Lineal: 1-60 mg L

-1
LD: 0.1 mg L
Tiempo de vida til: 3-4 horas
[Jewell,
2001]
Fenol, catecol
Inter.. lineal: 0-100 M

-1
Catecol Sensib.: 0.093 AM
-1
Fenol
Sensib.: 0.077 A M
[Rogers,
2000]
Polifenoles /
Vinos y te
Catecol Interv. lineal: <35M

-1
Sensib.: 2.4x107 nA M
LD: 0.41 M
Fenol Interv. lineal: <70 M
-1
Sensib.: 9x106 nA M
LD: 1.7 M
(90% de la respuesta inicial)
c. glico/
Vinos
[Rodrguez,
2002]
53
Introduccin
ELECTRODO
Carbono
vitrificado
TCNICA
PARMETROS
DETECCIN
INMOVILIZACIN
EXPERIMENTALES
Inmov. de Tir sobre
Amperom. Reprod.: < 4.0% (RSD)
superf. de bioreactor
modif. con 3(Eap.: -0.15 V Reg. fosfato 0.1 M pH
aminopropilo,
vs. Ag/AgCl) 7.0
entrecruz. con GA.
Dopamina
Carbono
vitrificado
Mezcla de Tir con

polimeros de agarosa
y guar e inmov. sobre
superf. de GCE
Carbono
vitrificado
Inmov. de Tir y
chitosan sobre superf.
GCE
Amperom.
Reg. fosfato 0.05 M
(Eap.: -0.15 V
pH: 6.52
vs. Ag/AgCl)
Carbono
vitrificado
Inmov. en pelcula de
polipirrol modif. con
p-toluensulfonato
Amperom.
Reg. fosfato 0.1 M
(Eap.: +0.05 V
Tiempo de resp.: 40-75 s
vs. Ag/AgCl)
Carbono
vitrificado
Polimerizacin de Tir
y matriz de sol-gel
sobre superf. del
electrodo
DPV
m
= 200 M
K app
4-Metil catecol
m
K app
= 2.28x10-3 M
Fosfato 0.1 M pH 6.0
Amperom.
(Eap.: -0.2 V
vs. SCE)
Reg. fosfato 0.02 M,

pH 6.0
Tiempo de respuesta <
10 s
ANALITO/
MUESTRA
REF.
Penicilina / Suero
humano y frmacos
Interv. lineal : 0.02 80 M

Sensib.:3.8 A mM1 cm2
LD: 7 nM
[Torriero,
2006]
L-Dopa, DL Dopa,
Dopamian, 4-metil
catecol/ Suero
Dopamina Interv. lineal: 2-10 M

LD.: 0.9 M
4-metilcatecol
Interv. lineal: 30-1200M
LD.: 17 M
[Tembe,
2006]
DOPAC
Fenol, catecol, pcresol/ Medios

acuosos
Fenol
Interv. Lineal: 6 nM-0.2-1mM

Sensib.: 40 A mM
LD: 3 nM
Fenol Interv. lineal: 3.3-220.3
M
-1,
Sensib.: 17.1 A mM LD: 0.8 M
Catecol Interv. lineal: 5.6-74.3
M
-1
Sensib.: 70.2 A mM , LD: 1.5 M
p-clorofenol Interv. lineal:
3.8-85.6M
-1
Sensib.: 24.3 A mM , LD: 2.4 M
(almacenamiento 4C)
-8
-6
Interv.. lineal: 7.5x10 -6x10 M
Sensib.: 15.78 A M-1 cm-2
LD: 1x10-8 M
[Liu A.,
2005]
[Rajesh,
2004a]
[Zhang T.,
2003]
54
Introduccin
ELECTRODO
TCNICA
INMOVILIZACIN
DETECCIN
PARMETROS
EXPERIMENTALES
ANALITO/
MUESTRA
-7
Carbono
vitrificado
Atrapamiento de Tir en
matriz de sol-gel de titanio

Tiempo de respuesta:< 5s
(Eap.: -0.15 V) m
K app =(0.29 0.02)mM
Reg. fosfato 0.05 M, pH
7.0
pelcula de slice/Nf sobre
superf. del electrodo
Amperom.
m
: 75 mM
Catecol K app
(Eap: -0.2 V
vs. Ag/AgCl) Fenol K m : 65 mM
app
Carbono
vitrificado
polmero conductor poli-3,4etiledioxitiofenol

(Eap.: -0.2 V Tiempo de respuesta: 2040 s
vs. SCE)
Carbono
vitrificado
Coinmov. de Tir y tionina

(mediador) sobre superf.
modif. con poli-dicarbazol
Amperom.
(Eap: -0.2 V Reg. fosfato 0.1 M pH 7
vs. SCE)
Carbono
vitrificado
Fenol
Catecol, fenol
Tiempo de respuesta: 15 s
Screen printed
Inmov. de Tir sobre superf.

y entrecruz. con GA y BSA
Screen Printed
Inmov. de Tir sobre superf.

modif. con GA
Amperom.
(Eap.: -0.2 V)
Inhibicin competitiva
6.5
Amperom.
(Eap.: -0.4 V Reg. fosfato pH 7.0
vs. Ag/AgCl)
Compuestos
fenlicos y
herbicidas
Catecol
Pesticidas /
Agua de rio
BSA,HSA/
Suero humano
REF.
-4
Inter. lineal: 1.2 x10 -1-2.6x10 M

Sensib.: 103 A mM
LD: 0.1 M
Tiempo de vida til: 80 das (94% de
respuesta inicial, almacenado a 4 C)
Catecol Interv. lineal: 1-100 M
-1
Sensib.: 200 mA M , LD.: 0.35 mM
Fenol
Interv. Lineal: 5-100 M
-1
Sensib.: 46 mA M , LD: 1 M
Tiempo de vida til: 2 semanas (74%
respuesta inicial, almacenamiento)
Catecol Interv.. lineal: < 25 M
-1
-2
Sensib.: 1999 mA M cm
Fenol
Interv.. lineal: < 25 M
-1
-2
Sensib.: 608 mA M cm , LD.: 50 nM
[Kim, 2003]
Interv. Lineal: < 10-1mM -2

Sensib.: 14.57 mA M cm
[Cosnier,
2001]
Interv. lineal:
Metilparatin: 6-100 ppb
Diazinona: 19-50 ppb
Carbofuran: 5-90 ppb
Carbaril: 10-50 ppb
-1
BSA Interv. lineal: 0.2-0.5 mg mL
-1
Sensib.: 2523.1 nA mL mg
-1
HSA Interv. lineal: 0.1-0.4 mg mL
-1
Sensib.: 1995.3 nA mL mg
[Yu, 2003]
[Vdrine,
2003]
[Albuquerque,
2007]
[Chuang,
2006]
55
Introduccin
ELECTRODO
TCNICA
INMOVILIZACIN
DETECCIN
PARMETROS
EXPERIMENTALES
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
-1
Screen-Printed
Inmov. de Tir con BSA y

ref. fosfato sobre superf. y
entrecruzam. con GA
Screen-Printed:
Au [1]
Grafito+Au [2]
Carbopack
CAu[3]
Inmov. de Tir por

entrecruzam. con polmero
PV13-dmeOs sobre dif.
superficies
p-aminofenol
m
K app
= 80 M
p-cresol
Amperom.
m
K app
= 71M
(Eap.: -0.1 V vs.
m
Fenol K app = 121 M
Ag/AgCl)
p-clorofenol:
m
K app
=89 M
m
= 284 M
Catecol K app
Amperom.
(Eap: -0.05 V
vs. Ag/AgCl)
Reg. fosfato 0.02 M

pH 7.0 + KCl 0.1 M
Screen-Printed
Reg. fosfato 50 mM, pH

Inmov. Tir+copolmero
Amperom.
7.0
PCS sobre superf. de HRP- (Eap.: -0.05 V vs.
Tiempo de respuesta: 2.4
SPCE
Ag/AgCl)
min
Screen-Printed
matriz polimrica sobre
screen-printed de grafito
Screen-Printed
pirrol sobre la superf. del
electrodo
Amperom.
(Eap.: -0.2 V Reg. fosfato 0.1 M, pH 7.0
vs. SCE)
Amperom.
(Eap.: -0.20V vs. Reg. fosfato 0.1 M, pH 7.0
Ag/AgCl)
p-aminofenol,pcresol, fenol,pclorofenol,
catecol / Aguas
residuales
Catecol
Fenoles/ Aguas
Catecol/
Cerveza
Catecol,
flavonoides/
Cerveza
p-aminofenol Sensib.:1.3 mA M
LD: 2.4 M
-1
p-cresol
Sensib.: 9.3 mA M
LD: 0.33 M
-1
Fenol
Sensib.: 9.7 mA M
LD:0.41 M
-1
p-clorofenol: Sensib.: 16 mA M
LD: 0.19 M
-1
Catecol
Sensib.: 6.9 mA M
LD: 0.43 M
[1] Interv. lineal: 0.5-30 M
LD: 0.18 M
LD: 0.14 M
LD: 0.16 M
Tiempo de via til: 6 meses
Fenol Interv. lineal: 0.025-45 M
-1
-2
LD: 25 nM
Catecol Interv. Lineal: 0.120-43 M
-1
-2
Sensib.; 1.85 A M cm
LD: 5 nM
Interv. Lineal: 0.025-14 M
Sensib.: 5740 mA mol cm-2
Catecol
Interv. lineal: 0.5- 20 M

-1
Sensib.: 409 mA M
[Soln, 2005b]
[Sapelnikova,
2003]
[Chang, 2002]
[Cumming,
2001a]
[Cumming,
2001b]
56
Introduccin
ELECTRODO
TCNICA
INMOVILIZACIN
Inmov. de Tir, con

Screen Printed PEGDGE y PV13(Carbopack Pt) dmeOs
sobre superf.
Grafito-Tefln
Grafito-Tefln
Atrapam. de enzima en
la matriz compsita
Atrapam. de enzima en
la matriz compsita
Grafito Tefln
Atrapam. fsico en la
matriz electrdica
Grafito-Tefln
Atrapamiento fsico de
Tir en matriz
electrdica
DETECCIN
Amperom.
(Eap: -0.05 V
vs. Ag/AgCl)
PARMETROS
EXPERIMENTALES
7 + KCl 0.1 M
Reprod. (n=10): 9.7 %

Repetib. (n=10): 4.0 %
Micelas inversas
formadas con etilacetato
+ 5% de reg. fosfato pH
7.4
En Reg. fosfato En Reg. fosfato 0.05 M
pH 6.5
Amperom.
m
(Eap: -0.1 V)
= 50 M
K app
En ACN-Tris
En Acetonitrilo-Tris
Amperom.
3
m
(Eap.: -0.2 V) K app =0 2.8 x10 M
Amperom.
(Eap: -0.1 V vs.
Ag/AgCl)
Amperom.
(Eap: -0.15 V vs.
pH 6.5
Ag/AgCl)
Amperom.
(Eap.: -0.15 V
Vs. Ag/AgCl)

pH 6.5
ANALITO/
MUESTRA
Fenol, catecol/
Aguas
residuales
PG/ Manteca
PG/ aceite de
oliva
Carbopack
Catecol (En discontinuo) LD: 0.35 M
(En FIA): LD: 1.7 A
Fenol (En discontinuo) LD: 1.5 M
Pt
Catecol LD: 0.38 M
Fenol
LD: 1.6 M
Interv. lineal: 8-200 M
-1
Sensib.: 2.10x103 AM
LD: 1.3 M
En fosfato Interv. lineal: 2-100M
Sensib.: 15.2 A M-1
LD: 0.9 M
En ACN-Tris Interv. lineal:8-200M
Sensib.:6.5A M-1
LD: 1.1 M
Fenol, catecol,
-8
-5
2.clorofenol,4Interv. Lineal:1.0x10 -4.0x10 M
clorofenol,4-Cl4
-1
Sensib.: 8.5 x10 A M
2MPh/ Aguas
-8
LD: 1.0 x 10 M
residuales de
refinera
Fenol Interv. Lineal: 0.1-25 M
-1
Sensib.: 0.28 A M , LD: 0.1 M
Catecol Interv. Lineal: 0.1-15M
Fenoles
-1
Sensib.: 0.30AM , LD: 0.1 M
REF.
[Soln, 2005a]
[Morales,
2005a]
[Morales,
2005b]
[Serra, 2003]
[Serra, 2002]
57
Introduccin
ELECTRODO
TCNICA
INMOVILIZACIN
Grafito- EPD
Atrapamiento fsico de
Tir en la matriz
electrdica
Diamante
Inmov. covalente de Tir

sobre superf. modif.
con B y con pelcula de
4-nitrobencenodiazonio
tetrafluorborato
aminofenilo
Platino
Dep. de Tir ,GDH y

HRP homogeneizadas
en agar-agar sobre
superf. de Pt modif.con
membrana de dilisis
Electrodo de
oxgeno Clark
(Oro)
Atrapam. de Tir y SH
en membrana de TAC.
Dep. sobre membrana
de dialisis e inmov.
sobre superf. de Au
DETECCIN
PARMETROS
EXPERIMENTALES
Amperom.
(Eap: -0.15 V vs.
pH 6.5
Ag/AgCl)
CV y
Amperom.
(Eap: -0.15 vs.
SCE)
Reg. fosfato 0.1 M ,pH

6.5
Reg. fosfato 0.1 M +

LiClO4 0.1 M
m
Tyr: K app
=10 mM
Amperom.
Tyr+HRP:
m
= 55mM
(Eap: -0.05 V vs. K app
Tyr+GOx
SCE)
m
K app
= 14 mM
Tiempo de respuesta: 1
2 min.
ANALITO/
MUESTRA
Fenoles
Fenol
p-cresol
4-clorofenol
Fenol,
1,2 DHB,
1,3-DHB,
1,4-DHB,
4 clorofenol
Fenol
Interv. Lineal: 0.05-6 M
-1
Sensib.: 0.62 A M , LD: 0.026 M
Catecol Interv. lineal: 0.05- 8 M
-1
Sensib.: 0.66 A M , LD: 0.028 M
Fenol Interv. lineal: 1-200 M
-2
Sensib.: 232.5 mA M 1cm LD:0.2 M
p-cresol Interv. lineal: 1-200 M
-2
Sensib.: 636.7 mA M 1cm LD: 0.1 M
4-Clorofenol Interv.lineal:1-250 M
-2
Sensib.: 385.8 mA M 1cm LD: 0.1 M
L-Tirosina
-1
Tyr
Sensib.: 0.01 mA M
-1
Tyr + HRP Sensib.:0.326 mA M
-1
Tir-GOx
Sensib.: 0.741 mA M
-6
Amperom.
Rep.: < 7% (RSD)

6.6
REF.
[Serra, 2002]
[Zhou, 2006]
[Stanca, 2003]
-4
Fenol Interv. lineal : 2x10 - 1.5x10 M

-6
-4
Fenol y c.
c. Salic.: Interv. lineal : 4x10 - 1x10 M
saliclico/ Orina LD: 0.5 M
Tiempo de vida: 5 das
[Campanella,
2006]
58
Introduccin
ELECTRODO
TCNICA
INMOVILIZACIN
DETECCIN
PARMETROS
EXPERIMENTALES
ANALITO/
MUESTRA
Electrodo Clark
Inmov. de Tir junto con

BSA y GA sobre
membrana pre-activada
y dep. sobre superf. del
electrodo
Amperom.
Medio n-Hexano
Medidas en discontinuo
y FIA
Oleuropenia, fenol y
catecol/ Aceite oliva
Electrodo Clark
Inmov. de Tir junto con

BSA y GA sobre
membrana pre-activada
y dep. sobre superf. del
electrodo
Amperom.
Medio n-Hexano
Medidas en discontinuo
y FIA
Oleuropenia, fenol y
catecol/ Aceite oliva
Carbono vitreo
reticulado

con 1-ciclohexil-3-(2morfolinoetil)
carbodiimida meta-ptoluensulfonato
Amperom.
(Eap: -0.2 V
vs. Ag/AgCl)

6.5
Tiempo de respuesta <
10 s
Oro
Inmov. de Tir sobre

superf. modif. con MPA
y entrecruzam. con GA
Amperom.
(Eap: -0.1 V
vs. Ag/AgCl)
Reg. fosfato 0.05 M

pH 7.0
Fenol (En discontinuo)
Interv. lineal: 0.5-6 ppm
Sensib.: 0.2 ppm/ A.U. %, LD: 0.04
ppm
(En FIA)
Interv. lineal:10-500 ppm, LD: 4 ppm
Catecol (En discontinuo)
Interv. lineal:0.5-5 ppm
Sensib.: 0.1 ppm/ A.U. %
Fenol (En discontinuo)
Interv. lineal: 0.5-6 ppm
Sensib.: 0.2 ppm/ A.U. %, LD: 0.04
ppm
(En FIA)
Interv. lineal:10-500 ppm, LD: 4 ppm
Catecol (En discontinuo)
Interv. lineal:0.5-5 ppm
Sensib.: 0.1 ppm/ A.U. %
REF.
[Capannesi,
2000]
[Capannesi,
2000]
Fenol,
2,4-dimetilfenol,
Fenol Interv.. lineal: 0.5-30 M
3-Clorofenol,
-1
Sensib.: 8.2 nA M , LD: 0.26 M [Pea, 2001]
4-Clorofenol,
4-Cloro-3-metilfenol,
2-aminofenol
Fenol lInterv. lineal: 0.2-200 M
-2
-1
Fenol, 3,4Sensib.: 1.39x10 A M , LD: 0.88 nM
dimetilfenol,
3,4-DMP Inter. lineal:0.44-20 M
[Campuzano,
2,4- dimetilfenol/ Sensib.: 4.5 x10-2 A M-1, LD: 0.18 M
2003]
Aguas residuales de 2,4-DMP Interv. lineal: 1-1000 M
-4
-1
refineras
Sensib: 7.31x10 A M , LD: 0.65 M
59
Introduccin
ELECTRODO
ITO
TCNICA
INMOVILIZACIN
DETECCIN

sobre PAPCP
Amperom.
(Eap: -0.2 V
vs. Ag/AgCl)
PARMETROS
EXPERIMENTALES
Reg. fosfato pH 7.2
ANALITO/
MUESTRA
Fenol, catecol, pcresol
Fenol Interv. Lineal: 1.35-222.3 M
Catecol Interv. Lineal: 5.6-74.3 M
p-cresol: Interv. Lineal: 3.8-85.6 M
Tiempo de vida: 4 meses (80% de la
actividad enzimtica)
REF.
[Rajesh,
b
2004 ]
Abreviaturas: ACN: acetonitrilo, B: boro, DOPAC: 3,4dihidroxifenilacetico, DHB: dihidroxibenceno, DMP: dimetilfenol,
EPD:etilenpropilendieno, GA: glutaraldehdo, GDH: glucosa deshidrogenasa, MPA: cido mercaptopropionico, PAPCP: poly (N3
aminopropyl pyrrolecopyrrole), PCS: poli(carbamoilsulfonato), PEGDGE: poli(etilenglicol) diglicidil ter, PVI13dmeOs: {poly[(1
vinilimidazol)osmio (1,4dimethilbipiridina)2Cl]}_/2_, Ph: fenol, PS 086: copolimero de polimetilsiloxano (85%) y difenilsiloxano (15%),
Ru:rutenio,SH:salicilatohidroxilasa,SPCE:electrododecarbonoserigrafiado,TAC:triacetatedecelulosa,Tir:tirosinasa
60
Introduccin
I.5.3.Progesterona
Laprogesteronaesunahormonaesteroideaqueseencuentraendiferentes
tejidos y fluidos biolgicos. Esta hormona es producida principalmente en el
cuerpo lteo de los ovarios, en el perodo posterior a la ovulacin, aunque
tambinpuedesersintetizadaenlasglndulasadrenalesyelhgado.
La progesterona presenta una estructura (Figura 2) derivada del ncleo
ciclopentanoperhidrofenantreno,tambinllamadoesterano.Estecompuestoes
un hidrocarburo policclico que se puede considerar un producto de la
saturacindelfenantrenoasociadoaunanillodeciclopentano.Posee17tomos
decarbono.Deestabaseestructuralderivanlosesteroides,quesonlamolcula
base para multitud de molculas de origen lipdico, como los esteroles
(colesterol),cidosbiliaresyhormonasesteroideas.
Figura2.EstructuradelaProgesterona
Su determinacin se lleva a cabo principalmente en suero, sangre o en

leche.
En el ganado vacuno, para el que se utilizan tcnicas de inseminacin
artificial,lamonitorizacindelosnivelesdeprogesteronaenlecheconstituyeel
mtodo ms eficaz para predecir los perodos de ovulacin y de gestacin
[VelascoGarca, 2001]. Su determinacin en leche, implica el trabajar con una
matrizcompleja,debidoprincipalmentealapresenciadeprotenasygrasas.
61
Introduccin
I.5.4. Antecedentes bibliogrficos sobre la determinacin de

progesteronaempleandoinmunosensoreselectroqumicos
Es sobradamente conocido el inters que presenta la determinacin de
progesterona en ganado, para predecir los periodos de ovulacin y, as
determinar los periodos de fertilidad y llevar a cabo la inseminacin en el
momento adecuado. De ah la necesidad de dispositivos sencillos y de fcil
manejoqueproporcionenresultadosrpidosyfiables.
A pesar de que los inmunosensores constituyen una poderosa
herramientaquepuedeserempleadaparafinesdediagnsticoclnico,control
de la presencia de contaminantes, y monitorizacin de una gran variedad de
compuestos biolgicos, son an escasas las configuraciones encontradas en la
bibliografaparaladeterminacindeestahormona.
Lamayorpartedelosinmunosensoressebasanenlainmovilizacindel
anticuerpodelaprogesteronasobrelasuperficieelectrdicay,posteriormente
larealizacindeuninmunoensayodetipocompetitivoentrelaprogesteronade
la muestra, normalmente leche, y la progesterona marcada con fosfatasa
alcalina. As, Xu y colaboradores prepararon un inmunosensor basado en el
empleodeunelectrododecarbonoserigrafiado(screenprinted)modificado
conunrecubrimientodeinmunoglobulinaG,sobreelcualseinmovilizalaanti
Progesterona. Tras realizar el inmunoensayo competitivo se adiciona p
nitrofenilfosfato como sustrato de la enzima fosfatasa alcalina, llevndose a
cabo la deteccin amperomtrica del pnitrofenol producido en la reaccin
enzimtica[XuY.F.,2005].
Pemberton y colaboradores desarrollaron un inmunosensor similar al
anterior, empleando dos sustratos diferentes, 4aminofenilfosfato y 1
62
Introduccin
naftilfosfato, de la enzima fosfatasa alcalina. Es de destacar que, en ambos

casos, las curvas de calibrado muestran una curvatura o meseta a bajas
concentracionesdeprogesterona,impidiendoladeterminacindelahormonaa
niveles de concentracin inferiores a 5 ng/mL [Pemberton, 1998 y 1999].
Posteriormente este grupo de trabajo prepar un inmunosensor que opera en
un sistema de flujo. El mayor inconveniente de este sistema es la elevada
corrientedefondoqueseobtienedebidoalaconcentracinelevadadesustrato
quehayqueintroducirenelsistemadeflujo[Pemberton2001].
Velasco y colaboradores desarrollaron un sistema automatizado para
predecir la ovulacin del ganado. Este dispositivo incluye un inmunosensor
para la determinacin de progesterona, as como un sistema de muestreo
automtico y un sistema de recogida y comparacin de datos. De esta forma
puede monitorizarse diariamente la concentracin de progesterona en leche
fresca en el intervalo de concentraciones comprendido entre 3 y 20 ng/mL, lo
que permite un control del ciclo de ovulacin y determinar el momento de la
preez[Velasco,2001].
Otro ejemplo de inmunosensor, basado en un inmunoensayo
competitivoindirectoeseldesarrolladoporKreuzerycol.Enestecaso,sobrela
superficie electrdica se deposita 5 L de Progesterona conjugada con BSA,
seguidamentesetrataconantiProgesteronayfinalmenteconinmunoglobulina
marcadaconfosfatasaalcalina.Elproductoobtenidodelareaccinenzimtica
empleando paminofenilfosfato como sustrato, da lugar a una respuesta en
voltamperometra diferencial de impulsos que es proporcional a la
concentracindelanalito,obtenindoseunintervalolinealde16a256ngmL1
yunlmitededeteccinparaprogesteronade3ngmL1[Kreuzer,2004].
63
Introduccin
I.5.5. Inmunoglobulinas
El conjunto de glucoprotenas del suero elaboradas por las clulas
plasmticas en respuesta a una estimulacin antignica, constituyen las
denominadas inmunoglobulinas. Todas las inmunoglobulinas poseen una
estructura bsica similar formada por cuatro cadenas polipeptdicas, dos de
ellas denominadas cadenas pesadas (cadenas H, heavy) y dos cadenas ligeras
(cadenas L, light). Las cadenas estn unidas entre s por puentes disulfuro
adoptandolaformadeYquesemuestraenlaFigura3.
2
NH
NH
2
S-
S-S
VH
S-
OH
CO
SS
S-
Fab
CL
CL
CO
OH
CH1
S
S-S
H2
2 N
NH
VL
VL
VH
S-S
S-S
S-S
S-S
CH2
Fc
S-S
S-S
CH3
COOH
COOH
Figura3.Estructurabsicadeunainmunoglobulina
Cada cadena polipeptdica est compuesta por dominios o secuencias

peptdicasdetamaouniforme,unidosentresporpuentesdisulfurodentrode
lapropiacadena.Enlaestructuradelainmunoglobulinapuedendiferenciarse
dosregiones.Lareginvariable(V),siendosteeldominioNterminalositio
decombinacindelanticuerpo,cuyasecuenciadeaminocidosesmsvariada
queelrestodelacadenapolipeptdica,ylasllamadasregionesconstantes(C),
64
Introduccin
compuestaspordominiossimilaresentodaslasinmunoglobulinasdelamisma
especie. Las cadenas ligeras estn compuestas por una regin variable y una
regin constante (VL y CL). Sin embargo, las cadenas pesadas constan de una
regin variable y tres o cuatro regiones constantes (VH y CH1H4).Dependiendo
de las regiones constantes encontradas en las cadenas pesadas y ligeras
podemos clasificar los anticuerpos en diferentes clases y subclases. En el ser
humanohaydostiposdecadenasLycincodecadenasHquedanlugaralas
diferentesinmunoglobulinas:IgG,IgA,IgM,IgDeIgE.
En suero humano normal la inmunoglobulina G es la inmunoglobulina
mayoritaria y constituye aproximadamente un 74% del total. Tiene un peso
molecularaproximado de 1.5 x105 Da y es la nica clase de inmunoglobulina
capazdeatravesarlaplacenta.Porestemotivo,losvaloresdeinmunoglobulina
G (IgG) son muy importantes sobretodo en neonatos, ya que contienen la
inmunoglobulina G transferida por la madre a travs de la placenta. Cabe
destacar, que durante los 3 ltimos meses del embarazo la IgG transferida al
fetoaumentaysusnivelesvuelvenadisminuirdurantelostresprimerosmeses
devida.
Porotrolado,cuandosellevaacabolaingestadeunalimentoalrgico
para un individuo, puede ocurrir que la reaccin alrgica se manifieste de
formainmediata,cuyareaccinespecficavendradadaporlaparticipacinde
lainmunoglobulinaE,ocasionandorespuestastalescomo,erupciones,catarroo
hinchazn,oqueaparezcapasadountiempodelaingestadedichoalimento,
en este caso, la reaccin estara mediada por la inmunoglobulina G, y los
sntomas son trastornos de sueo, infeccionese irritabilidad. La nica manera
de detectar alergias mediadas por IgG es a travs de pruebas sanguneas,
65
Introduccin
conocindose la presencia y la fase en la que se encuentra una determinada

infeccin.
I.5.6. Antecedentes bibliogrficos sobre la determinacin de

inmunoglobulinasempleandoinmunosensoreselectroqumicos
Lapreparacindeinmunosensoreselectroqumicos,ysuaplicacinala
determinacin de inmunoglobulinas se han resumido en la Tabla 5 donde se
muestraslasdiferentesestrategiasencontradasenlabibliografa.
Elempleodeelectrodosserigrafiados(screenprinted)esfrecuenteen
la preparacin de inmunosensores. As, Darain y col. han diseado un
inmunosensor amperomtrico basado en este tipo de superficies electrdicas
paraladeterminacindeinmunoglobulinaGdeconejo,alcanzndoseunlmite
dedeteccinde330ngmL1.Delmismomodo,DazGonzlezycol.disearon
otro inmunosensor para la determinacin de esta misma inmunoglobulina
obteniendo un menor lmite de deteccin, siendo en este caso de 7 ng mL1,
empleandoparasudeteccinvoltamperometradeondacuadrada.
Wilsonycol.,utilizaronunamatrizdeiridioparalaconstruccindeun
inmunosensor amperomtrico con el fin de determinar inmunoglobulina G
humana, basado en un inmunoensayo tipo sndwich [Wilson, 2004]. Por otro
lado,WangZ.ycol.emplearonunelectrododecarbonovitrificadomodificado
con un compsito de ZnO/Chitosan, consiguiendo disminuir el lmite de
deteccinhasta1.2ngmL1[Wang,2006].
Actualmente, el empleo de nanomateriales, tales como nanotubos de
carbonoynanopartculasmetlicas,suponeunaimportanteherramientaparala
66
Introduccin
preparacindeinmunosensores,consiguindoseimportantesmejorasencuanto
asuscaractersticasanalticas.
As, Snchez y col. llevaron a cabo la modificacin de una superficie
serigrafiada con una mezcla de nanotubos de carbono y polisulfona (pSf),
incorporando posteriormente inmunoglobulina G. Una vez preparado el
inmunosensoramperomtrico,llevaronacabounensayocompetitivo,conelfin
de determinar inmunoglobulina G humana. Este mismo inmunosensor fue
preparado de un modo similar pero modificando la superficie electrdica con
una mezcla de grafito y polisulfona, obtenindose una sensibilidad inferior y
peorescaractersticasanalticas[Snchez,2007].Otroinmunosensorenelquese
ha aprovechado las ventajas del empleo de nanotubos de carbono, es el
desarrollado por Yun y col. para la determinacin de inmunoglobulina G de
ratnmedianteespectroscopiadeimpedanciafaradaica(EIS)[Yun,2007].
Encuantoalempleodenanopartculasdeoro,cabedestacareldiseode
Fuycol.basadoenlamodificacindeunelectrododeoroconunamonocapa
de mercaptoetilamina modificada con nanopartculas de oro. La deteccin se
basa en la medida potenciomtrica en presencia de diferentes concentraciones
delcorrespondienteantgeno[Fu,2005].ChenH.ycolaboradoresemplearonun
novedosoprocedimientoparaamplificarlasealimpedimtricaobtenidapara
diferentes concentraciones del analito, inmunoglobulina G humana, que
implicaelempleodenanopartculasdeorofuncionalizadascadaunaconvarias
molculas de un anticuerpo determinado. As, tras la inmovilizacin del
anticuerpo (Ab primario) sobre la superficie de un electrodo de pasta de
carbono y la unin del correspondiente antgeno (hIgG), se incuba en primer
lugarenunadisolucindeorocoloidalmarcadoconelanticuerpoprimarioy
ensegundolugarenotradisolucindeorocoloidalmarcadaconunanticuerpo
67
Introduccin
secundario que se enlaza al anterior. El papel del oro coloidal es aumentar la

cantidad de anticuerpo inmovilizado sobre la superficie electrdica, lo que da
lugar a un mayor valor de la resistencia a la transferencia de carga a medida
queaumentalaconcentracindelanalito[ChenH.,2006].
OtraestrategiaseguidaparaladeterminacindeinmunoglobulinaGfue
ladesarrolladaporChenZycol.,enestecasoseinmovilizaelanalitosobreun
electrododepastadecarbono,yposteriormenteseincubaenunadisolucinde
anticuerpomarcadoconorocoloidal.Trasaplicaraldispositivounpotencialde
oxidacin de +1.3 V se mide la respuesta voltamperomtrica de reduccin
[ChenZ,2007].
Es posible emplear nanopartculas magnticas (CdFe2O4SiO2)
modificadas con 3aminopropiltrietoxisilano (APTS), proporcionando grupos
amino en su superficie, para modificar la superficie electrdica. La
inmovilizacin del anticuerpo, antiIgG sobre dicha superficie se realiza por
entrecruzamiento con glutaraldehdo. Este diseo se basa en un ensayo tipo
sndwich, y la posterior deteccin amperomtrica de la inmunoglobulina G
humana[Liu,2006].
68
Introduccin
Tabla 5.- InmunosensoreselectroqumicosaplicadosaladeterminacindeInmunoglobulinas

MATERIAL
MODIFICACIN
ELECTRDICO ELECTRDICA
Screen-Printed de
grafito
Screen-Printed
Screen-Printed
Screen-Printed
Screen-Printed
Inmov. de anti-IgG
sobre un pocillo,
incub. en IgG, y
unin del conjugado
anti-goat-IgG
marcado con Au
col.
Inmov. de Ab sobre
Prot A G
TCNICA
ENSAYO/MEDIO
ANALITO/
MUESTRA
ASV
Sndwich/
Ab
secundario
marcado con nAu.
Oxidacin
electroq.
del oro con HBr/Br2
IgG de cabra
LSV
Unin cov. de HRP

Amperom.
y estreptavidina
(Eap: -0.35 V
sobre TCAP,
vs. Ag/AgCl)
inmov. de anti-IgG
Adsorc. de
estreptavidina sobre
SPCE pre-oxidado,
CV,. SWV
e inmov. de antiIgG biotinilado
Incorp. de IgG a una
momembrana
Amperom.
composita de
(Eap :-0.1 V)
CNTs-pSf
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
-1
Rango concen.: 0.5-100 ng mL

LD: 3 pM
[Dequaire,
2000]
a) Inmov. de rIgG
sobre superf. modif.
con Prot. A, b)unin
de goat-anti-rIgG
biotinilado c)
posterior unin de
GOx marcado con
avidina-
IgG ratn e IgG

conejo
LD (mIgG2a): 0.02 g mL-1

LD ( rIgG): 0.2 g mL-1
[Valat,
2000]
Competitivo/ IgGGox, deteccin de

H2O2
IgG conejo
(analito modelo)
Rango concen.:500-2000 ngmL-1

LD: 330 ng mL-1
[Darain, 2003]
Competitivo, IgGAP ; 3-indoxil-fosfato

como sustrato de AP
IgG de conejo
Rango concen.: 4-140 ng mL

-1
LD: 7 ng mL
Competitivo/
Hidroquinona como
mediador
IgG humana
Rango concen.: 2 a 5 g mL
-1
LD: 1.66 g mL
-1
-1
[Daz-Gonzlez,
2005]
[Snchez, 2007]
69
Introduccin
Tabla5.InmunosensoreselectroqumicosaplicadosaladeterminacindeInmunoglobulinas
MATERIAL
ELECTRDICO
Pasta de Carbono
Pasta de Carbono
Pasta de Carbono
Grafito-epoxi
Grafito-epoxi
Nanotubos de
carbono (CNT)
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Inmov. de hIgG
sobre PC y bloqueo
superf. con BSA.
Inmov. anti-IgG por
entrecruzam. con
GA sobre APTESpartculas de
CdFe2O4-SiO2.
sobre CPE
Adsorc. de antihIgG sobre
superf.de CPE
oxidada e incub. en
BSA. Au col. como
marcador
Inmov de IgG. sobre
Prot A incorporada
en la matriz de
grafito-epoxi
Modif. de superficie
con membrana de
pSf/DMF e inmov.
de rIgG
Activacin de CNT
e inmov. cov. de
anti-IgG con
EDC/NHS
TCNICA
ENSAYO/MEDIO
AC Voltamp.
Directo
Amperom.
(Eap= -0.3 V)
Sndwich, anti-hIgG-HRP,
deteccin H2O2; usando
hidroquinona como mediador
ANALITO/
MUESTRA
CARCTERSTICAS
ANALTICAS
IgG humana
Rango concen.:10-10-10- [Fernndez8

Snchez,
M
-1
2000]
LD: 12.5 g L
REF.
IgG humana
Rango conc.: 510-1

30170 ng mL
(i vs. Log C)
-1
LD: 180 ng mL
[Liu Z.M.,
2006]
ASV
Sndwich/ a) Incub. en hIgG, b)

Incub. en anti-hIgG-Au col y oxid.
a + 1.3 V
hIgG/ Suero
humano
Rango concen.: 10-500

-1
ng mL
-1
LD: 4.0 ng mL
[Chen Z.,
2007]
Amperom.
(Eap=-0.1 V vs.
Ag/AgCl)
Competitivo/ a) Inmov. rIgG, b)

inmunoensayo competitivo antirIgG y anti-rIgG-biotina c)
Estreptavidina-HRP;H2O2 como
sustrato, Hidroquinona como
mediador
anti-IgG
[Zacco E.,
2004]
Amperom.
(Eap= -0.1 V vs
SCE)
Competitivo/ Reg. Fosfato pH 7.0
anti-rIgG
(analito
modelo)
Rango concen.: 1-6 g

mL-1
LD: 0.77 g mL-1
[SnchezOrdoez
2007]
CV y EIS
Directo
IgG ratn
Rango concen.: < 100

g mL -1
LD: 200 ng mL -1
[Yun,
2007]
70
Introduccin
MATERIAL
ELECTRDICO
xido de iridio
Carbono
vitrificado
Carbono
vitrificado
Carbono
vitrificado
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Inmov. de Ab en la matriz
del xido
Atrapam. de Ab en
membrana de polipirrol
sobre GCE
Incub. de anti-IgG sobre
sup. mod. con pelcula de
Au electrodep. e incub en
BSA
TCNICA
ENSAYO/MEDIO
ANALITO/
MUESTRA
Amperom.
(Eap= +0.420 V)
No competitivo
IgG
PED
IgG conejo/ Suero
EIS
10
Sndwich / Fe(CN)6
mM en KCl 0.1 M
4 / 3
[Gooding
2004]
Rango concen.: 0.011-11 ng mL

-1
LD: 0.009 ng mL
-1
[Chen Z.,
2005]
IgG humana
Rango concen.:2.5-500 ng mL-1

LD: 1.2 ng L-1
[Wang Z,
2006]
No competitivo y
competitivo
IgM humana
Rango conen.:7.5x10-11-1x10-9 M
LD: 2.8x10-11 M
[EscosuraMuiz A.,
2006]
IgG/ Suero
Rango concen.:12-800 ng mL-1

LD: 3.4 ng mL-1
[Fu Y.,
2005]
IgG humana
Rango concen.:15.3-328.3 ng L-1

LD: 4.1 ng L-1
[Chen H,
2006]
IgG conejo
Rango concen.:200-1000 ng mL-1

LD: 200 ng mL-1
[Hou,
2004]
Inmov. de anti-hIgG sobre

GCE modif. con
ZnO/chitosan
Amperom.
(Eap= -0.15 V vs
SCE)
Carbono
vitrificado
Inmoviliz. de IgM por

adsorcin
ASV
Plata
Rango concen.:50-200 g mL-1
Sndwich/ Hidroquinona
como mediador
Carbono
vitrificado
Oro
[Wilson,
2004]
[Messina,
2005]
Sndwich/Medidas del
cambio de potencial en
presencia de IgG
EIS
Sndwich/
a) Inmov. hIgG, b)
Inmov. de anti-hIgG sobre
Amplific.
seal
por
gota
anti-hIgG-Aucol.
superf. de Au modif. con deposic. secuenc.
20mM PBS + 0.1M KCl, 5
Au col. y HDT Bloqueo de
de
IgG
y
antiIgGmM K3[Fe(CN)6]
superf. con BSA
/K4[Fe(CN)6], pH 7.4
Au
Inmov. de IgG sobre
EIS
superf. de Ag modif. con
ODT
Potenciom.
Rango conc.(IgG):10-200 ng mL-1

LD (IgG): 8 ng mL-1
IgG humano/ Suero
Inmov. anti-IgG sobre

superf. mod. con AET y
nAu
REF.
Rango concen.:0-100 UmL-1

LD: 0.6 U mL-1
Sensibilidad: 0.033 A/ U mL
Amperom.
(Eap=-0.15 V)
Oro
IgG
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
71
Introduccin
MATERIAL
ELECTRDICO
Platino
MODIFICACIN
ELECTRDICA
Inmov. del Ab sobre
superf. mod. con DTSP,
poli(amido-amina)
dendrimero y nAu
nanopartculas de slica
SiO2/nAu
TCNICA
ENSAYO/MEDIO
ANALITO/
MUESTRA
CARACTERSTICAS
ANALTICAS
REF.
CV
Reg. fosfato10 mM pH 7.0
IgG / Suero humano
Rango concen.:
5.0-9600 g mL-1
LD: 0.8 ng mL-1
[Tang 2005d]
Abreviaturas:AET:mercaptoetilamina,Ag:antgeno, AP:fosfatasa alcalina, APTES:3aminopropiltrietoxisilano,BSA:albmina desuero

bovino,CNT:nanotubodecarbono,CPE:electrodopastadecarbono,DMF:dimetilformamida,DTSP:33Ditiobis(cidopropionioco/N
hidroxisuccinimida), EDC: Netil3[3(dimetilamino)propil]carbodiimida,EIS: espectroscopia de impedancia electroqumica, GA:
glutaraldehdo, GCE: electrodo carbono vitrificado, GOx: glucosa oxidasa, HDT:1,6hexanoditiol, HRP: peroxidasa de rbano, IgG:
inmunoglobulina G, LD: lmite de deteccin, MPS: mercaptopropiltrimetoxilano, MPTS: mercaptopropiltrietoxisilano, nAu:
nanoparticulas de oro, ODT: octadecanotiol, PBS: disolucin reguladora fosfato, NHS: Nhidroxisuccinimida, pSf: polisulfona, SAM:
monocapaautoensamblada,SPCE:electrodoscreenprinteddecarbono,TCAP:polmerocido5,2:52tertiofen3carboxilico,.
72
PROCEDIMIENTOS
EXPERIMENTALES
Procedimientosexperimentales
En este apartado se lleva a cabo una descripcin detallada de los

procedimientosexperimentalesempleadosenestetrabajo,agrupadosencuatro
grandes grupos correspondientes a cada uno de los tipos de biosensores
desarrolladosenestaTesisDoctoral.
II.1. BIOSENSOR DE TIROSINASA BASADO EN UN ELECTRODO DE
CARBONO
VITRIFICADO
MODIFICADO
CON
NANOPARTCULASDEORO
A continuacin se describen detalladamente cada una de las etapas

implicadas en la preparacin de los biosensores. Asimismo, se comentan las
tcnicas empleadas para la caracterizacin de los bioelectrodos. Finalmente se
describe el procedimiento de medida en las muestras de vino, as como el
mtododereferenciaempleadoparasuvalidacin.
II.1.1. Preparacin del electrodo de carbono vitrificado modificado con
nanopartculasdeoroyTirosinasa
Pretratamientodelelectrododecarbonovitrificado
Antes de llevar a cabo la modificacin de la superficie electrdica, es
necesario aplicar un pretratamiento de limpieza para obtener una superficie

limpiayreproducible.Paraello,sepuleelelectrodo[Metrohm6.084.010de3
mm de de dimetro] con una suspensin acuosa de almina de 0.3 m
[Metrohm] durante 1 minuto, seguidamente se lava con agua destilada, y se
introduceenunbaodeultrasonidosdurante30segundosenetanolyenagua,
alternativamente,repitiendoestaltimaetapadelavadotresveces.Porltimo,
sesecadichasuperficiehaciendopasarunacorrientedenitrgeno.
75
PreparacindelelectrododeTirnAuGCE
Unavezaplicadoalelectrodoelpretratamientodelimpiezaanterior,se
procedealamodificacindelasuperficieelectrdica,siguiendolasetapasque
sedescribenacontinuacin:
1) Electrodeposicin de las nanopartculas de oro sobre el electrodo de
carbonovitrificadopretratado.
SesumergeelelectrodoenunadisolucindeHAuCl4(Sigma)de100mgL1,
preparadamediantepesadadirectadelacantidadadecuadadelproductoy
disolucinenAguaMilliQfiltradaatravsdefiltrosdeNylonde0.45m
(Whatman),yseaplicaunpotencialde200mVdurante1minuto.
2) Inmovilizacin de Tirosinasa (Sigma, EC 1.14.18.1 procedente de
champin,conunaactividadde2590unidadespormgdeslido)sobrela
superficieelectrdicamodificada.
Sedepositansobreelelectrodo5Ldeunadisolucindetirosinasade91.5
UL1preparadadisolviendolacantidadadecuadadeenzimaenregulador
fosfato 0.1 M de pH 7.4. Despus de dejar secar al aire, se introduce el
electrodo en una disolucin de glutaraldehdo al 25% (Aldrich) durante 30
minutosatemperaturaambiente.Finalmente,seaclaraconaguadestilada.
Conelfindecomprobarelfuncionamientodelbiosensoryverificarquela
respuestaobtenidaesreproducible,stesesumergeenlaclulademedidaque
contiene 10 mL de una disolucin reguladora de fosfato 0.1 mol L1 de pH 7.4
agitndoseconayudadeunagitadormagnticoaunavelocidadconstante.Se
aplica un potencial de 0.1 V y se mide la intensidad de corriente en estado
estacionariocuandoseadicionan10Ldeunadisolucindecatecol1.0x102
76
mol L1 (Sigma, 99%). La medida de esta seal es utilizada como valor de

referencia.
Elbiosensorsealmacenaenelfrigorficoa4C.Antesdellevaracabolas
medidas, es necesario esperar un tiempo a que el biosensor alcance la
temperatura ambiente. Una vez alcanzada la temperatura de trabajo, antes de
de su utilizacin, siempre se realiza la medida amperomtrica de referencia
paracomprobarsucorrectofuncionamiento.
Las medidas amperomtricas han sido realizadas utilizando un
potenciostatoAutolabPGSTAT12equipadoconunsoftwareGPES4.7(General
PurposeElectrochemicalSystem)(Figura4).
Figura4.PotenciostatoautolabPGSTAT12
El montaje potenciosttico de tres electrodos utilizado se compone de un

electrodo de trabajo, un electrodo de referencia de Ag/AgCl/KCl 3M modelo
BAS MF 2063 y un electrodo auxiliar de alambre de platino. En la Figura 5 se
muestraeldispositivodescrito.
77
Electrodo
Auxiliar
Electrodo de
Referencia
Electrodo de
Trabajo
Figura5.ClulaelectroqumicaBASmodeloVC2
Todaslasmedidassehanrealizadoenreguladorfosfato0.1molL1depH
7.4atemperaturaambiente.
II.1.2. Caracterizacindelrecubrimientoelectrdico
Los estudios realizados en este apartado estn encaminados a

caracterizar el recubrimiento de la superficie del electrodo de carbono
vitrificadomodificadoconnanopartculasdeoro(nAuGCE)ydelbiosensorde
tirosinasa (TirnAuGCE). Para ello se han empleado diferentes tcnicas
electroqumicasymicroscopiaelectrnicadebarrido(SEM).
78
II.1.2.1.Determinacindelrecubrimiento
Ladeterminacindelacantidaddeorodepositadasobrelasuperficiedel
electrodo de carbono vitrificado se lleva a cabo a partir del registro del
voltamperograma cclico obtenido a 100 mV s1 en el intervalo de potencial
comprendidoentre0.35y+1.50Venunadisolucindecidosulfrico0.1M
(Sharlab,9597%).Lareduccindelosxidosdeoroformadosenelbarridode
oxidacin da lugar a la aparicin de un pico en el barrido catdico, cuya
integracinpermitecalcularlacargaimplicadaendichoprocesodereduccin.
La comparacin de la carga obtenida experimentalmente con el valor
tericode482 C/cm2paralacargaasociadaalareduccindeunamonocapa
de oxgeno divalente [Finot, 1999], permite calcular la superficie que est
recubiertapornanopartculasdeorodepositadassobreelelectrododecarbono
vitrificado.
II.1.2.2. Espectroscopiadeimpedanciaelectroqumica(EIS)
Para poder estudiar el comportamiento de una clula electroqumica

medianteestatcnica,serepresentaelsistemaenestudiomedianteunmodelo
o circuito equivalente. De esta forma, un sistema electroqumico simple se
puede representar por una resistencia, Rct, en serie con un elemento Zw y en
paraleloconuncondensador,Cdl,quesimulalainterfaseelectrodo/disoluciny
estasuvezenserieconunasegundaresistencia,RS,talcomosemuestraenla
Figura6.
79
Cdl
Rs
Rct
Zw
Figura6.CircuitoequivalentedeRancles
Este circuito propuesto por Randles, explica satisfactoriamente un gran

nmerodesistemaselectroqumicos.RSrepresentalaresistenciahmicaentreel
electrodo de trabajo y el electrodo de referencia y engloba la resistencia del
electrolito,laresistenciadeloshilosutilizadosparaconectarlaclulaalsistema
de medida, etc. La doble capa elctrica electrododisolucin es como un
condensador, y se representa en el circuito equivalente como Cdl. Rct es la
resistencia a la transferencia de carga ion/electrn y, por tanto, de su valor
depende la velocidad de transferencia electrnica entre el electrodo y la
disolucin.
Laresistenciaalatransferenciadecargavaracuandosobreelelectrodo
sedepositanoadsorbensustanciasdiferentes.
LascomponentesRSyZwrepresentanlas propiedadesdeladisolucin
delelectrolitoyladifusindelaespecieredoxenladisolucinrespectivamente.
Estos parmetros no se ven afectados por las transformaciones qumicas que
ocurrenenlasuperficiedelelectrodo.
PorotroladolascomponentesCdlyRct,dependendelascaractersticas
de la interfase electrodo/electrolito, proporcionando informacin sobre la
80
existencia de cambios en las propiedades de la superficie del electrodo al

inmovilizaroacoplarmaterialessobrelainterfaseestudiada.
La representacin ms empleada en espectroscopia de impedancia se
denomina diagrama de Nyquist, y en l se representan los valores de
impedanciaZfrenteaZobtenidosparacadavalordefrecuenciaaplicada.En
laFigura7semuestraestarepresentacinparaelcircuitodeRandles.
4000
-Z,
3000
Z=
RsolRs
++
RCT
2-2C
Z=
R-CT
2 dl2 Cdl
2000
1000
Pte = 1
0
0
1000
2000
3000
4000
5000
Z,
6000
Figura7.DiagramadeNyquist
Comopuedeobservarse,larepresentacindeNyquistmuestraunazona
semicircular a altas frecuencias, correspondiente a un proceso limitado por
transferencia electrnica, mientras que a bajas frecuencias aparece un tramo
linealdependienteuno,querepresentaelprocesodetransferenciaelectrnica
limitado por difusin. En el caso en el que el proceso de transferencia
electrnica sea muy rpido, el grfico de Nyquist muestra slo la parte lineal,
mientras que si la transferencia de carga es lenta, se observa nicamente la
reginsemicircular.
Cuandolasuperficieelectrdicaesmodificadaconalgnmaterial,puede
producirse un bloqueo de dicha superficie, impidiendo que las especies redox
penetrenatravsdelmodificadorhacialasuperficieconductoradelelectrodo,
observndoseunaumentodeldimetrodelazonasemicircular.
81
A partir del semicrculo se pueden determinar los valores de los

elementos del circuito. As, RS vendr dado por el punto de corte a altas
frecuencias del diagrama de impedancia con el eje real; Rct coincidir con el
dimetro del semicrculo y, por ltimo Cdl se puede determinar a partir de la
siguienteexpresin:
Cd l =
1
max R ct
Ecuacin[1]
AdiferenciadeRctyCdl,quesonindependientesdelafrecuencia,Zwes
inversamenteproporcionalalarazcuadradade:
Zw =
w
(1 j )
1 / 2
Ecuacin[2]
siendoWelcoeficientedeWarburg:
w =
RT
1
1
1/ 2 + 1/ 2
2
D R C R
n F A 2 DO Co
2
Ecuacin[3]
donde CO y C*R son las concentraciones en el seno de la disolucin de las

especiesoxidadayreducida,respectivamente.DOyDRsonsuscoeficientesde
difusin,Rlaconstanteuniversaldelosgasesperfectos(R=8.314JK1mol1),T
latemperaturaengradosKelvin,nelnmerodeelectronesqueintervienenen
elprocesoyFlaconstantedeFaraday(96487Cmol1).
Paralaobtencindelosespectrosdeimpedanciasesumergeelelectrodo
detrabajo,eldereferenciayelauxiliarenunaclulaquecontieneunamezcla
deK4Fe(CN)6yK3Fe(CN)61mM(Sigma)decadaunodeellosenmediocloruro
potsico 1 M (Scharlab). Las medidas se han realizado, como es habitual,
superponiendo una onda sinusoidal de pequea amplitud, 5 mV, al potencial
82
de equilibrio. La impedancia se ha medido a 100 valores de frecuencias en el

intervalo comprendido entre 100 mHz y 10 KHz (20 frecuencias por dcada),
tomndoseparacadafrecuenciaelvalormediodecincomedidasrealizadasde
laimpedancia.
As, con fines comparativos se han obtenido los espectros de impedancia
del electrodo de carbono vitrificado, as como de las superficies modificadas
connanopartculasdeoroyconnanopartculasdeoroytirosinasa.
Losexperimentosdeespectroscopiadeimpedanciaelectroqumicasehan
realizadoempleandounpotenciostatoAutolabTypeIIIconunsoftwareFRA
2(Ecochemie)(Figura8).
Figura 8.- Potenciostato Autolab TypeIII

II.1.2.3. Microscopiaelectrnicadebarrido
La microscopia electrnica de barrido (SEM) proporciona informacin

sobrelamorfologaytopografadelasuperficiedelosslidos.
Para obtener una imagen por microscopia de barrido electrnico de la
superficie de un material, se focaliza sobre la muestra (de espesor suficiente
para que sea opaca a los electrones) un haz de electrones acelerados por
83
aplicacindeunaltovoltaje,realizandounbarridodelamismasiguiendouna
trayectoriadelneasparalelas.
En microscopia electrnica se trabaja siempre a vaco para que la
trayectoria de los electrones no sea desviada por la presencia de tomos o
molculasquenoseandelamuestraaanalizar.Estoseconsigueconpotentes
bombasdevaco,quetrabajanapresionesqueoscilanentre107y1010bares.
Silamuestranoesbuenaconductoraseacostumbraarecubrirlaconuna
pelcula conductora metlica o de carbono para evitar que sta se cargue
cuandoseairradiada.
De todas las formas de radiacin resultantes de la interaccin del haz
incidente y la muestra, hay dos realmente fundamentales en microscopia de
barrido: los electrones secundarios y los electrones retrodispersados. Los primeros
son electrones de baja energa (decenas de eV) que resultan de la emisin por
parte de los tomos constituyentes de la muestra (los ms cercanos a la
superficie) debido a la colisin con el haz incidente. Los electrones
retrodispersados son electrones del haz incidente que han interaccionado
(colisionado)conlostomosdelamuestrayhansidoreflejados.Laintensidad
deambasemisionesvaraenfuncindelnguloqueformaelhazincidentecon
lasuperficiedelmaterial,esdecirdependedelatopografadelamuestra.Dela
seal producida por los electrones secundarios se obtiene una imagen de
aparienciatridimensionaldelamuestra.
Para la caracterizacin de la superficie de los electrodos mediante esta
tcnica, es necesario que dicha superficie, una vez modificada, se encuentre
totalmenteseca,esdecir,exentadeagua.Adems,cuntomsconductoraseala
superficie ms fcilmente se obtendrn las micrografas. Por ello, previamente
se introduce el electrodo en una cmara de vaco, donde se cubre con una
84
pelcula de grafito de un grosor adecuado para hacer suficientemente

conductoralacarcasadeTefln.Acontinuacin,serecubrenloslateralesdela
carcasa de Tefln, con cinta adhesiva conductora para evitar interferencias
procedentes de cargas electrostticas sobre el cuerpo de Tefln no conductor.
Finalmente, el electrodo se sita en el compartimento para muestras del
microscopioyseobtienenlasmicrografascorrespondientes.
II.1.3 Medida del ndice bioelectroqumico de polifenoles en vino
empleandounbiosensordeTirnAuGCE
Laestimacindelndicedepolifenolesenvinossellevaacabomediante
amperometra en disoluciones agitadas empleando el biosensor de Tirosinasa.
Dado que en todas las muestras de vino analizadas se comprob la existencia
deefectomatriz,seutilizelmtododeadicionesestndarparalaestimacin
del contenido de polifenoles en las muestras. Para ello se registran las seales
amperomtricas obtenidas cuando se adicionan 270 L de vino a la clula de
medidaquecontiene10mLdeladisolucinreguladorafosfato0.1MapH7.4y
serealizansucesivasadicionesde20Ldeunadisolucinpatrndefenol2.5x
103molL1Lasmedidasamperomtricasserealizanaunpotencialde0.1Ven
disolucionesagitadasmecnicamenteaunavelocidadconstante.
Elcontenidodecompuestosfenlicosobtenido,hasidoexpresadocomo
mgL1decidocafeico.
II.1.4. Medida del ndice de polifenoles en vino mediante el mtodo
espectrofotomtricoFolinCiocalteau
El mtodo espectrofotomtrico de FolinCiocalteau, permite determinar

el contenido total de compuestos fenlicos en muestras de vino. Este mtodo
utiliza como reactivo una mezcla de cidos fosfowolfrmico y fosfomolbdico
85
(reactivo de FolinCiocalteau) en medio bsico, que se reducen al oxidar los

compuestosfenlicos,originandoxidosazulesdewolframioymolibdeno.
Laaplicacindeestemtodoimplicaseguirelsiguienteprocedimiento:
seadicionan4.2mLdeaguadesionizaday0.5mLdelreactivoFolinCiocalteau
(Sigma)a0.5mLdemuestra(enelcasodevinotintoesnecesariorealizaruna
dilucindelamuestra1:8).Lamezclaesagitadadurante1minutoavelocidad
constante. Seguidamente, se adiciona 1 mL de una disolucin de carbonato
sdicoal80%(Panreac)y4.2mLdeaguadesionizada.Ladisolucinresultante
sedejaenlaoscuridaddurante2horas,conelfindeconseguirlaestabilizacin
delareaccin.Losproductosobtenidosdelareaccinsemidenaunalongitud
de onda de 730 nm. Para la obtencin de una curva de calibrado se aplica el
mismo procedimiento empleando disoluciones patrn de diferentes
concentracionesdecidocafeico(Sigma,99%).
Las medidas espectrofotomtricas se han realizado empleando un
espectrofotmetroUVvisibleHP8453.
86
II.2. PREPARACIN DE UN BIOS
ENSOR COMPSITO DE GRAFI
TO-
TEFLN MODIFICADO CON ORO CO LOIDAL Y TIROSINASA P ARA

LA DE TERMINACIN DEL CON TENIDO DE POLIFENOLES EN
MUESTRAS AMBIENTALES
En este apartado se describen los procedimientos seguidos para la

preparacindelbiosensor,incluyendolapreparacindelorocoloidal;ascomo
el mtodo empleado para calcular la actividad enzimtica del biosensor.
Seguidamente se describen los procedimientos utilizados para calcular el rea
electroqumica del electrodo, as como las experiencias realizadas para el
clculo del coeficiente de difusin del fenol y del coeficiente de transferencia
electrnica. Por ltimo, se describen los procedimientos aplicados a la
estimacindelcontenidototaldecompuestosfenlicosenmuestrasdeaguasy
dealpechn.
II.2.1. PreparacindelbiosensorcompsitoTirAucolgrafitoTefln
Con el fin de preparar un biosensor compsito de grafitoTefln

modificadoconorocoloidalyTirosinasa,esnecesarioenprimerlugarpreparar
una disolucindeorocoloidal. Para ello es necesario que el material de vidrio a
utilizar se haya limpiado previamente con agua regia, aclarando varias veces
conaguaMilliQpreviamentefiltradaavacoempleandounfiltrodeNylonde
tamaodeporode0.1m(Scharlab).Despuselmaterialsedejasecaralaire
durante48horasantesdesuutilizacin.
Seguidamente se preparan las disoluciones de cido tetracloroaurico
(Sigma,99%)al1%ydecitratosdico(Sigma,99%)al1%ysefiltranatravsde
unamembranamicroporosade22m.
87
Acontinuacin,secalientahastaebullicinenvasodeprecipitadosuna
mezcla de 50 mL de agua Milli Q y 0.5 mL de HAuCl4 al 1%. Tras hervir
durante15minutos,seadicionan1.25mLdeladisolucindecitratosdicoal
1%(Sigma,99%),agitandovigorosamenteconunavarilladevidrio.Trasunos
minutos, la disolucin cambia de color adquiriendo finalmente un color rojo
rub caracterstico. Transcurrido este tiempo, se deja enfriar y se agita con la
varilla de vidrio durante 15 minutos ms. Finalmente la disolucin de oro
coloidalsealmacenaenunrecipientedecolortopacioa4C.
La
disolucin
de
oro
coloidal
fue
caracterizada
mediante
espectrofotometra UV, observndose en el espectro correspondiente que se

muestra en la Figura 9 la aparicin de un mximo de absorcin a 519 nm,
caractersticodenanopartculasdeoroconuntamaomediode16nm[Wang
L.,2006].
1.6
Absorbancia (AU)
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
400
500
600
700
800
900
(nm)
Figura9.Espectrodeabsorbanciadelorocoloidal
LapreparacindelaspastillasdeTirosinasaorocoloidalgrafitoTefln(70%)
se realiz aplicando el siguiente procedimiento: se mezclan 150 mg de grafito
(Ultra Carbon, BayCity, MI, USA) y 900 L de la disolucin de oro coloidal
mediante agitacin mecnica a una temperatura de 4C durante 2 horas.
88
Seguidamente, se evapora el agua mediante el paso de una corriente de

nitrgeno a travs de la mezcla y se adicionan 34.75 mg de tirosinasa de 2590
unidadesmg 1enunasuspensinde0.4mLdeunadisolucinreguladorade
fosfato 0.1 M a pH 7.4, agitando mecnicamente durante 2 horas a 4C. Por
ltimo,semezclamanualmentecon415.25mgdeTefln(Aldrich),yseprocede
alacompresinmecnicadelamezcla.Apartirdelapastillamadreobtenidase
preparanvariaspastillasmspequeas,de3.0mmdedimetroconayudade
un troquel y se colocan en el extremo de un tubo de Tefln como puede
apreciarse en la Figura 10. El contacto elctrico se establece a travs de un
tornillo de acero inoxidable con punta plana que es introducido por el otro
extremodeltubodeTefln.
Con fines comparativos, se prepararon pastillas de grafitoTeflnoro
coloidalenausenciadeenzima.
Tornillodeaceroinoxidable
PastilladeTirosinasaoro
coloidalGrafitoTefln
Tefln
Figura10.Esquemadelelectrodocompsito
II.2.2. Clculodelaactividadenzimtica
LarespuestaamperomtricadelosbiosensorescompsitosdeTirosinasa
dependedelacantidaddeenzimainmovilizadaenlasuperficiedelelectrodo.
La actividad enzimtica superficial se ha estimado midiendo el incremento de
89
absorbancia a una longitud de onda de 280 nm, que se produce cuando se

introduce el electrodo durante 10 minutos en una disolucin agitada de
regulador fosfato 0.05 M de pH 6.5 conteniendo Ltirosina (Merck) 5.0 x 104
molL1.
Cuando se realizan las medidas, los electrodos no estn sometidos a
ningnpotencialelctrico,porloqueelproductodelareaccinnoesreducido
posteriormente y por lo tanto, no se produce reciclado del sustrato. De esta
manera, la respuesta obtenida es directamente proporcional a la cantidad de
enzimaactivaenlasuperficiedelbiosensor.
Como consecuencia de lo comentado, los valores del incremento de
absorbancia obtenidos en cada caso se relacionan con la actividad enzimtica
medianteunacurvadecalibrado,enlaqueserepresentandichosincrementos
deabsorbanciaenfuncindelaactividadenzimticaqueseobtieneutilizando
disolucionesdeLtirosinaquecontienencantidadesconocidasdetirosinasaen
disolucin. En este caso el calibrado ha sido preparado con disoluciones de
tirosinasaentre0y200unidadesdeenzima.
II.2.3. Clculo del rea electroqumica de los electrodos de grafitoTefln y
grafitoTeflnoro coloidal mediante voltamperometra cclica y
cronoamperometra
El rea electroqumica o rea activa de un electrodo compsito no

corresponde en principio al rea geomtrica, puesto que la superficie est
compuesta por material aislante y material conductor. Dependiendo de la
proporcin y distribucin de ambos materiales en la superficie, el rea activa
serdiferente.
90
Elclculodelreaelectroqumicadeloselectrodossehallevadoacabo
mediante voltamperometra cclica, empleando la ecuacin de RandlesSevcik
paraunaparejaredoxreversible,quea25C,ysuponiendounelectrodoplano
yunprocesodifusivodelaespecieelectroactiva,es:
ip=(2.69x105)n3/2AD1/2Cv
Ecuacin[4]
En la ecuacin anterior, ip es la corriente de pico (A), n es el nmero de

electronestransferidosenelproceso,Aeselreaelectroqumicadelelectrodo
(cm2),Deselcoeficientededifusindelaespecieelectroactiva(cm2s1),C,es
la concentracin en disolucin de la misma especie (mol cm3), y v es la
velocidad de barrido de potencial (V s1). Para ello, se registran los
voltamperogramas cclicos sobre los electrodos de grafitoTefln y grafito
Tefln modificado con nanopartculas de oro en una disolucin acuosa de
ferrocianuropotsico5x104MenmedioKCl1M,cuyocoeficientededifusin
esde6.3x106cm2s1a25C[Bard,2001].
Asimismo, se ha calculado el rea electroqumica de los electrodos
anteriores mediante cronoamperometra, empleando una disolucin de
ferrocianuro potsico, sin agitacin y aplicando un salto de potencial de 0.3 a
0.45V.Lavariacindelacorrienteconeltiempovienedadaporlaecuacinde
Cottrell,
1/ 2
n F A DOx
C*
id (t ) =

1/ 2 t 1/ 2
Ecuacin[5]
dondeid(t)vieneexpresadaenA,elreadelelectrodoencm2,C*enmolcm3y
D en cm2 s1. El rea del electrodo se obtiene a partir de la pendiente de la
representacin de la intensidad de corriente frente a la inversa de la raz
cuadradadeltiempo.
91
II.2.4. Clculodelcoeficientededifusindelfenol
Se ha determinado el coeficiente de difusin del fenol mediante

cronoamperometra
empleando
disoluciones
de
fenol
de
diferente
concentracinycomoelectrodosdetrabajounelectrododegrafitoTeflnde
grafitoTeflnmodificadoconnanopartculasdeoro.
Lapendientedelarepresentacindelaintensidaddecorrientefrenteala
inversa de la raz cuadrada del tiempo permite, una vez conocida el rea del
electrodo,calcularelcoeficientededifusin[Zare,2006].
II.2.5. Clculodelcoeficientedetransferenciaelectrnicaparaelfenol
El clculo del coeficiente de transferencia electrnica (na) para el fenol

sehacalculadoapartirdelclculodelaspendientesdeTafel(pte=2.303RT/
naF)obtenidasadiferentesvelocidadesdebarridodepotencial.Paraello,se
representa el logaritmo de la intensidad frente al potencial, tomando medidas

de la corriente en la regin del voltamperograma en la que la intensidad es
inferior al 10% de la corriente de pico, zona donde la respuesta est afectada
nicamente por la cintica de transferencia electrnica entre la especie
electroactivaylasuperficiedelelectrodo.
Para ello se han registrado voltamperogramas cclicos para fenol 5x104
M en medio Tris 0.1 M de pH 7.0 a diferentes velocidades de barrido,
empleando como electrodo de trabajo un electrodo de grafitoTefln un
electrododegrafitoTeflnmodificadoconnanopartculasdeoro.
II.2.6. Estimacindelcontenidototaldecompuestosfenlicosenaguas
Elcontenidototaldefenoleshasidoestimadoenvariostiposdeaguas,
unasintticaenriquecidaconunamezcladecompuestosfenlicosformadapor
92
1.0 M fenol (Scharlab, 99.5%), 2.5 M de 3,4dimetilfenol (Sigma, 99%) y 1.0

Mde4cloro2metilfenol(Aldrich,99%),ytresmuestrasprocedentesdeuna
refinera, recogidas en diferentes das y en diferentes etapas del proceso de
purificacin.Ladeterminacindelcontenidofenlicoenlasdiferentesmuestras
se ha llevado a cabo mediante amperometra en disoluciones agitadas
empleando para ello el biosensor compsito desarrollado. Los resultados
obtenidos se han comparado con los proporcionados por el mtodo oficial
espectrofotomtricodela4aminoantipirina.
A continuacin se describen los procedimientos utilizados para el
anlisis de cada una de las muestras aplicando los mtodos comentados
anteriormente.
a)Determinacinmedianteamperometraendisolucionesagitadas.
Paraladeterminacindelcontenidodefenolesenlasmuestrasdeaguas
procedentes de una refinera, se sumergen el biosensor y los electrodos de
referencia y auxiliar en una clula electroqumica que contiene 10 mL de
reguladorfosfato0.1MdepH7.4yseaplicaunpotencialde0.1V.
Una vez estabilizada la corriente de fondo, se adicionan a la clula de
medida 200 L de la muestra sin diluir y se mide la corriente en estado
estacionario. Seguidamente se aplica el mtodo de adiciones estndar
realizandoadicionessucesivasdeunadisolucinpatrndefenol1.0x104M.
b)Mtodocolorimtricodela4aminoantipirina
Elmtododela4aminoantipirinaesadecuadoparaladeterminacinde
fenoles orto y meta sustituidos y, en condiciones adecuadas de pH, los
sustituidosenposicinparaporungrupocarboxido,halgeno,metoxilocido
sulfnico.Sinembargo,presentaelinconvenientedenodeterminarlosfenoles
93
enlosquelaposicin paraseencuentrasustituidaporungrupoalquilo,arilo,
nitro,nitrosoaldehdo.
Aunqueelmtodorequiereprocesospreviosdedestilacinyextraccin
y largos tiempos de anlisis, es muy sensible y se trata de un mtodo
estndarizado que est incluido en el compendio Standard Methods for the
analisis of Water and Waterwaste, [APHA, 1981], siendo oficial en EE.UU,
[APHA, 1985], y en las normas internacionales [ISO, 1990]. Los resultados
obtenidos proporcionan una precisin del 30%, una exactitud del 50 % y un
lmitededeteccinde0.5gL1
Elprocedimientoseguidoconsiste,enprimerlugar,enlarealizacinde
uncalibradoparafenolenelintervalodeconcentracincomprendidoentre0.05
y2.0mgL1.Cadadisolucindefenolsetratacon1.2mLdeunadisolucinde
hidroxilamina0.5molL1(Panreac),ajustndoseelpHa7.90.1conregulador
fosfato 0.1 M. A continuacin, se aaden 3.0 mL de disolucin de 4
aminoantipirina (Aldrich) y 3.0 mL de una disolucin de K3Fe(CN)6 de
concentracin 0.24 M, se agita la mezcla y se espera durante 3 minutos,
obteniendounadisolucindecolorligeramenteamarillento.Seguidamente,se
transfiere cada disolucin a un embudo de decantacin, realizndose la
extraccin de los compuestos fenlicos con 5 mL de cloroformo (Sharlab). La
fase orgnica se filtra a travs de un filtro embudo de filtracin de vidrio
fritado que contiene una capa de Na2SO4 anhidro. Se mide la absorbancia del
extractoclorofrmicoa460nm.Elequipoempleadopararealizarlasmedidas
espectrofotomtricasesunespectrofotmetroUVvisibleHP8453.
En el caso de las muestras, antes de llevar a cabo el mtodo de la 4
aminoantipirinaesnecesariorealizarunaetapapreviadedestilacin,conelfin
94
de separar las impurezas no voltiles de los compuestos fenlicos que

posteriormentesemedirnporespectrofotometra.
Para llevar a cabo la destilacin se toman 500 mL de muestra en un
matrazyseajustaaunpHde4.0concidofosfrico(Scharlab,ACS85%).Sila
muestra ha sido perfectamente conservada no es necesario aadir el cido
fosfrico.
A continuacin se destila hasta 450 mL, separa la destilacin y cuando
haya cesado la ebullicin se aaden 50 mL de agua caliente al matraz de
destilacin hasta recoger 500 mL. Generalmente, es suficiente con una
destilacin, pero en el caso en que el destilado presente turbidez, se debe
acidificarconcidofosfricovolvindoseadestilar.
Unavezpurificadoslosfenolessehacenreaccionarconladisolucinde
4aminoantipirina siguiendo el mismo procedimiento que el descrito para la
preparacindelcalibrado.
c) Anlisis de las muestras de agua mediante cromatografa de gases
espectrometrademasas
Con el fin de identificar los compuestos presentes en las muestras de

agua procedentes de la refinera se procedi a su anlisis mediante
cromatografa de gases (GC) acoplado a un espectrmetro de masas. Paraello
es necesario aplicar a la muestra un tratamiento previo. Se toman 250 mL del
aguayseleaade1gotadecidoortofosfrico.Estevolumensepasaatravs
deuncartuchode500mgdeC18quepreviamentesehaacondicionadocon6.0
mLdemetanol(Sharlab)y3.0mLdeaguadestilada.Loscompuestosfenlicos
retenidos en el cartucho se eluyen con 5+1 mL de diclorometano (Sharlab).
Finalmente, la disolucin obtenida se concentra hasta un volumen de 0.5 mL
95
haciendo pasar una corriente de nitrgeno. La disolucin resultante es

inyectadadirectamenteenelcromatgrafodegases.
El anlisis se ha realizado utilizando un espectrmetro de masas de
cuadrupolo HP5989A, acoplado a una columna cromatogrfica de gases
HP5890. La identificacin se realiz mediante el empleo de una librera Wily
HP59943B.
II.2.7. Estimacindelcontenidototaldecompuestosfenlicosenmuestrasde
alpechn
Ladeterminacindelndicedepolifenolesenmuestrasdealpechnseha
llevado a cabo, empleando el biosensor compsito anteriormente descrito,
mediante amperometra en disolucin agitada. Para ello, se adiciona una
alcuota de 40 L de muestra a la clula de trabajo, que contiene 10 mL de
disolucinreguladorafosfato0.1MdepH7.4.Lasmedidasamperomtricasse
realizanaplicandounpotencial de0.1V.Paralaestimacindelcontenido de
compuestos fenlicos en alpechn se emplea el mtodo de adiciones estndar.
Paraelloserealizanadicionessucesivasde20Ldeunadisolucinpatrnde
cidocafeico1.0mM(Sigma,99%).
Los resultados obtenidos se compararon con los del mtodo
espectrofotomtricoFolinCiocalteau,descritoenelapartadoII.1.4.
II.3.DESARROLLO
DE
INMUNOSENSORES
COMPSITOS
DE
GRAFITOTEFLNMODIFICADOSCONOROCOLOIDALPARALA
DETERMINACINDEPROGESTERONAENLECHE
A continuacin se describen los procedimientos experimentales

relacionados con la preparacin de los inmunosensores para la determinacin
de Progesterona, incluyendo la preparacin de los mismos, as como la
96
realizacin del inmunoensayo correspondiente. Se describe tambin el clculo

de algunos parmetros de inters para el naftol, producto de la reaccin
enzimtica del naftilfosfato con la enzima fosfatasa alcalina. Finalmente se
detallaelprocedimientoseguidoparaladeterminacindelaconcentracinde
progesteronaenmuestrasdeleche.
II.3.1. Preparacin del inmunosensor basado en un electrodo Aucolgrafito
Tefln
LaspastillasdegrafitoTeflnmodificadasconorocoloidalsepreparan
siguiendo un procedimiento anlogo al descrito en el apartado II.2.1.,
obviamente en ausencia de tirosinasa. Para construir el inmunosensor, se
depositansobrelasuperficiedelelectrodocompsito5Ldeunadisolucin0.5
g mL1 de antiProgesterona (antiProg) (Sigma), dejndose secar a
temperaturaambiente.Despussesumergeelinmunosensorenunadisolucin
de albmina de suero bovino (BSA) (Merck, 97%) al 2% preparada en un
reguladordedietanolamina(DEA)(Merck,98%)HCl0.1MdepH7.2durante5
minutos,conelfindeminimizarposiblesadsorcionesinespecficas.Finalmente,
se lava cuidadosamente el inmunosensor con una disolucin reguladora de
dietanolaminadepH10.0.
97
II.3.2. Realizacindelinmunoensayocompetitivosimultneo
Para llevar a cabo el inmunoensayo de tipo competitivo simultneo se

depositan sobre la superficie del inmunosensor 8 L de una mezcla de
Progesteronamarcadaconfosfatasaalcalina(ProgAP)(RidgewayScienceLtd)
yProgesterona(Prog)(Aldrich,98%),alniveldeconcentracindeseado,enuna
proporcin 5:3. Seguidamente se deja secar durante dos horas a temperatura
ambienteobiendurantetodalanochea4C.
Ladeteccinelectroqumicadelaprogesteronaserealizasumergiendoel
inmunosensorenlacluladetrabajoquecontiene10mLdeunadisolucinde
dietanolaminaHCl0.1MdepH10y1mMdeMgCl2(Merck,99%)yseaplica
unpotencialde+0.3Vagitandoladisolucinavelocidadconstante.Cuandola
corriente se estabiliza, se adicionan a la clula de medida 500 L de una
disolucinde1naftilfosfato(Fluka>98%)0.1M,monitorizndoselaoxidacin
delnaftol,generadoenlareaccinenzimtica,queseproduceenlasuperficie
delelectrodo.
El proceso completo, incluyendo la preparacin el inmunosensor, la
realizacindelinmunoensayo,ascomolareaccinenzimticaquetienelugar
aladicionarelsustratodelafosfatasaalcalinasemuestraenelEsquema1.
98
O
Ar-O-P-ONa
*
*
*
INMUNOSENSOR
*
*
ONa
Ar=O
Ar-OH
INMUNOENSAYO
*
Aucol-grafito-Tefln
Esquema1.
anti-Progesterona
BSA
Progesterona
Progesterona marcada
con fosfatasa alcalina (AP)
Inmunoensayo competitivo simultneo para la determinacin de

Progesterona
II.3.3. Clculodelcoeficientededifusindelnaftol
Se ha llevado a cabo el clculo del coeficiente de difusin del naftol

mediante cronoamperometra empleando disoluciones de naftol de diferente
concentracinyutilizandocomoelectrodosdetrabajounelectrododegrafito
TeflndegrafitoTeflnmodificadoconnanopartculasdeoro.
Una vez conocida el rea del electrodo y a partir de la pendiente
obtenidaalrepresentarlaintensidaddecorrientefrentealainversadelaraz
cuadradadeltiempo,secalculaelcoeficientededifusin.
II.3.4. Clculodelcoeficientedetransferenciaelectrnicodelnaftol
El clculo del coeficiente de transferencia electrnica del naftol se ha

llevado a cabo mediante el clculo de las pendientes de Tafel siguiendo el
procedimientoindicadoenelapartadoII.2.5.
99
Esteparmetrotambinpuedecalcularseapartirdelarepresentacinde
laintensidaddepicofrentealarazcuadradadelavelocidaddebarrido,que
parasistemasirreversiblesa25C,vienedadaporlaecuacin:
ip=(2.99x105)n(na)1/2AD1/2Cv
Ecuacin[6]
dondeipeslacorrientedepico(A),nelnmerodeelectronestransferidosenel
proceso,elcoeficientedetransferenciadecarga,naeselnmerodeelectrones
implicadosenlaetapadeterminantedelavelocidaddelprocesoelectrdico,A
el rea del electrodo (cm2), D el coeficiente de difusin (cm2 s1), C la
concentracinendisolucindelnaftol(molcm3)yveslavelocidaddebarrido
depotencial(Vs1).
Por ltimo, tambin es posible calcular el valor de na midiendo los
potenciales de pico y semipico correspondientes a la oxidacin del naftol,
relacionadosmediantelaecuacin:
n a =
47.7
Ep Ep/ 2
Ecuacin[7]
dondelosparmetrosynasonlosespecificadosanteriormente.
Paraellosehanregistradovoltamperogramascclicosdeunadisolucin
denaftol5x104Menmediodietanolamina0.1MdepH10.0,empleandocomo
electrodos de trabajo un electrodo de grafitoTefln de grafitoTefln
modificadoconnanopartculasdeoro.
100
II.3.5. Preparacindelinmunosensorbasadoenelempleodeunbiosensorde
TirAucolgrafitoTeflncomotransductor
Sobre la superficie del biosensor (TirAucolgrafitoTefln) se depositan 5.2

L de una disolucin de antiProgesterona 0.01 mg mL1 obtenida por
dilucin
de
la
disolucin
patrn
con
regulador
TRIS
(tris(hidroximetil)aminometano)(Sigma,99.9%)0.1MdepH7.0ysedejasecara
temperatura ambiente. Se sumerge durante 10 minutos en una disolucin de
BSAal2%yselavaconladisolucinreguladoradepH7.0.
Pararealizarunseguimientodecadaunadelasetapasdemodificacinde
la superficie electrdica mediante la tcnica de espectroscopia de impedancia
electroqumica (EIS) se sumerge el electrodo, tras cada etapa, en la clula
electroqumicaquecontieneK3(Fe(CN)6]/K4(Fe(CN)6enconcentracin5mM
decadaunodeellosenmediocloruropotsico0.1M,yseregistraelespectro
deimpedanciatalycomosedescribeenelapartadoII.1.2.2.
Unavezpreparadoelinmunosensor,sellevaacaboelinmunoensayo,en
estecasodetipocompetitivosecuencial.Paraello,sesumergeelinmunosensor
en10mLdeunadisolucindeProgesteronadeconcentracinvariabledurante
30 minutos. Seguidamente se lava y se incuba en una disolucin de
progesteronamarcadaconfosfatasaalcalinadurante40minutos.
La deteccin electroqumica se realiza mediante amperometra,
sumergiendo el inmunosensor en una clula que contiene 10 mL de una
disolucin TRIS 0.1 M de pH 7.0 que contiene 1 mM de MgCl2 y se aplica un
potencialde0.1V. Cuandolacorrienteseestabiliza,seadicionan20Ldeuna
disolucin 0.01 M de fenilfosfato (Sigma, 98%) como sustrato de la fosfatasa
alcalina. La determinacin se lleva a cabo aplicando un potencial de 0.1 V,
101
midindose la reduccin de la oquinona generada por la tirosinasa como

productodelareaccinenzimticadelfenol(Esquema2).
..
...
...
..
...
...
*
*
**
*
O
Ar-O-P- ONa
eAr=O
Ar-OH
INMUNOSENSOR
..
...
...
Ar-OH
ONa
INMUNOENSAYO
.
...
.
..
..
...
...
..
...
...
Tir
*
Tir-Aucol-grafito-Tefln
anti-Progesterona
BSA
Progesterona
Progesterona marcada
con fosfatasa alcalina (AP)
Esquema2.
Inmunoensayo competitivo secuencial para la determinacin de

Progesterona
II.3.6. Determinacindeprogesteronaenleche
InmunosensorbasadoenunbiosensorcompsitoAucolgrafitoTefln
La determinacin de Progesterona se realiza en muestras de leche

enriquecidas a un nivel de concentracin de 15 ng mL1. El procedimiento
seguidosedescribeacontinuacin.Sediluyen285Ldelecheenriquecidacon
una disolucin reguladora de dietanolamina 0.1 M hasta un volumen final de
1000 L. Seguidamente se mezcla una alcuota de 3 L de la muestra diluida
(3.5ngProg/mL)con5Ldeprogesteronamarcadaconfosfatasaalcalinayse
depositan sobre la superficie del inmunosensor. Las medidas amperomtricas
se realizan aplicando un potencial de + 0.3 V, adicionando 500 L de una
disolucinde1naftilfosfato0.1Mcomosustratodelaenzima.
Comoconsecuenciadelefectomatrizobservado,debidoprincipalmente
a la presencia de protenas, grasas y otras sustancias, se procede a realizar un
102
calibradodeprogesteronaenlecheexentadelanalito.Acontinuacin,elvalor
delaintensidaddecorrienteobtenidapara7muestrasdelecheenriquecida,se
interpol en la recta de calibrado de progesterona, obtenindose la
concentracindelanalitopresenteenlamuestra.
InmunosensorbasadoenunbiosensorcompsitodeTirAucolgrafitoTefln
El inmunosensor desarrollado empleando un biosensor de tirosinasa
nanoestructurado como transductor, se aplic a la determinacin de

Progesteronaenmuestrasdelecheenriquecidasadosnivelesdeconcentracin,
5.0y1.5ngmL1.Enestecaso,nofuenecesariorealizarningunadilucindela
muestra.
Unavezpreparadoelinmunosensor,seincubadurante30minutos,enla
muestradeleche.Acontinuacin,selavaysesumergeen10mLdedisolucin
de progesterona marcada con fosfatasa alcalina durante 40 minutos. La
concentracindeprogesteronaseanalizamidiendoa0.1Vlareduccindelao
quinonageneradaporlatirosinasaaladicionar20Ldefenilfosfato0.01M.
103
II.4. INMUNOSENSORAMPEROMTRICOPARAINMUNOGLOBULINA
G UTILIZANDO COMO TRANSDUCTOR UN BIOSENSOR DE
TIROSINASAOROCOLOIDALGRAFITOTEFLN
II.4.1. Preparacindelinmunosensor
El procedimiento seguido para la fabricacin del inmunosensor implica

seguirunaseriedeetapas.Enprimerlugarseincubaelbiosensorcompsitode
Tirosinasa (TirAucolgrafitoTefln) en una disolucin de Protena A al 2%
(Sigma)endisolucinreguladora0.1MdepH7.0,conelfindeconseguiruna
adecuada orientacin de la inmunoglobulina G sobre la superficie del
biosensor.
A continuacin se depositan 2.6 L de una disolucin de anti
inmunoglubulina G (antiIgG) (Sigma) 0.11 mg mL1 sobre la superficie del
bioelectrodoysedejasecaratemperaturaambiente[antiIgG(TirAucolgrafito
Tefln)]. La antiinmunoglobulina G comercial es previamente reconstituida
disolviendounacantidaddelslidoenelvolumenadecuadodeclorurosdico
0.135 M para obtener una concentracin de 1 mg mL1. La disolucin 0.11 mg
mL1seobtienepordilucindelaanteriorcondisolucinreguladoraTRIS0.1
MdepH7.0.
Seguidamente, la superficie electrdica, modificada con Protena A y el
anticuerpo,sesumergeen5mLdeunadisolucindealbminadesuerobovino
(BSA) al 2% durante 15 minutos, con el fin de disminuir posibles adsorciones
inespecficas que podran darse a la hora de llevar a cabo el inmunoensayo.
Transcurrido el tiempo de incubacin, se lava cuidadosamente la superficie,
empleandoparaellounadisolucinreguladoradeTRIS0.1MdepH7.0.
104
II.4.2. Realizacindelinmunoensayotiposndwich
Unavezpreparadoelinmunosensor[antiIgG(TirAucolgrafitoTefln)],
ste se incuba en una disolucin del analito (IgG), durante 35 minutos. Para
llevaracabolareconstitucindelainmunoglobulinaG(Sigma),sedisuelveel
slido en el volumen adecuado de cloruro sdico 0.150 M para obtener una
disolucinde1mgmL1.Disolucionesmsdiluidassepreparanpordilucinde
ladisolucinpatrnendisolucinreguladora.
Porltimo,elinmunosensorsesumergeen10mLdeunadisolucinde
antiinmunoglobulina G marcada con fosfatasa alcalina (antiIgGAP) (Sigma)
de1700ngmL1durante40minutos.
Para llevar a cabo la deteccin de inmunoglobulina G, se sumerge el
inmunosensoren10mLdereguladorTRIS0.1MdepH7.0y1mMdeMgCl2.
Ladeteccinamperomtricaserealizaaunpotencialde0.1V,midindosela
reduccindela oquinonageneradaporlatirosinasacuandoseadicionan20L
dedisolucin de fenilfosfato1x103M.
Al igual que anteriormente, las diferentes etapas implicadas en la
preparacin del inmunosensor, as como las realizadas para llevar a cabo el
inmunoensayo se monitorizan mediante espectroscopia de impedancia
electroqumicatalycomosedescribeenelapartadoII.1.2.2.
II.4.3. DeterminacindeinmunoglobulinaGensueros
El inmunosensor desarrollado se aplic a la determinacin de

inmunoglobulina G en dos muestras de suero diferentes. El primero de ellos
(Interchim) fue enriquecido a un nivel de concentracin de 10 ng mL1, y el
105
segundo, consisti en un suero certificado conteniendo una cantidad de

inmunoglobulinaGde3118mgdL1(Spinreact).
Unavezpreparadoelinmunosensor,seincubdurante35minutosenla
muestradesueroenriquecido.Seguidamente,selavacondisolucinreguladora
TRIS 0.1 M de pH 7.0 y se sumerge durante 40 minutos en 10 mL de anti
inmunoglobulina G marcada con fosfatasa alcalina de concentracin 1700 ng
mL1. La concentracin de IgG se determin sumergiendo el inmunosensor en
10 mL de disolucin reguladora TRIS 0.1 M de pH 7.0 que contena MgCl2 1
mM.Ladeteccinamperomtricaserealizamidiendoa0.1Vlareduccindela
oquinona generada por la tirosinasa al adicionar 20 L de una disolucin de
fenilfosfato 1x103 M. El valor de la intensidad de corriente obtenida se

interpolenlarectadecalibradoobtenidaensueroexentodeIgG,siguiendoel
procedimientodescritoenelapartadoII.4.2.
Para la determinacin de IgG en la muestra de suero certificada fue
necesario realizar dos diluciones previas de la muestra con disolucin
reguladora TRIS 0.1 M de pH 7.0 en un factor de 1:1000. El procedimiento
seguidofueelmismoqueeldescritoparaelsueroenriquecido.
106
RESULTADOS Y
DISCUSIN INTEGRADA

Resultadosydiscusinintegrada
ComoyasehapuestodemanifiestoenlaIntroduccin,lamodificacin
desuperficieselectrdicasconnanopartculasdeoropermitelainmovilizacin
estable de molculas biolgicas y por tanto constituye una estrategia atractiva
paralaconstruccindebiosensoreselectroqumicos.As,sehademostradoque
biomolculas como anticuerpos, antgenos o enzimas, retienen su actividad
biolgica cuando son inmovilizadas sobre superficies modificadas con
nanopartculas, ya que stas proporcionan un microambiente similar a su
entorno natural. Adems dichas nanopartculas actan como medio de
conduccin electrnico, facilitando la transferencia electrnica, alcanzndose
elevadosnivelesdeestabilidadysensibilidad.
Teniendo en cuenta las interesantes ventajas de las nanopartculas de
oro, en este trabajo se han desarrollado diferentes configuraciones de
biosensoresenzimticos,ascomovariosinmunosensoresbasadosenelectrodos
modificadosconestenanomaterial.Acontinuacinsediscutenlosaspectosms
relevantesdelosresultadosobtenidos,agrupndolosendospartesprincipales:
BiosensoresdeTirosinasautilizandodiferentessuperficieselectrdicas
modificadasconnanopartculasdeoro.
Inmunosensores basados en el empleo de electrodos compsitos
nanoestructurados.
109

III.1. BIOSENSORES DE TIROSINASA BASADOS EN EL

EMPLEO DE DIFERENTES SUPERFICIES ELECTRDICAS
MODIFICADASCONNANOPARTCULASDEORO
Como ya se ha comentado en el apartado de Procedimientos
Experimentales, los biosensores preparados en este trabajo se basan en el
empleodediferentesestrategiasdemodificacindelasuperficieelectrdica.
Enlaprimeradeellassellevaacabolamodificacindeunelectrodode
carbono vitrificado en dos etapas secuenciales: electrodeposicin de
nanopartculasdeoro,apartirdeunadisolucindeHAuCl4;lascaractersticas
del recubrimiento se controlan con el potencial aplicado y el tiempo de
electrodeposicin y la enzima se inmoviliza por adsorcin sobre el electrodo
modificado.
El segundo diseo se basa en el empleo de un electrodo compsito de
grafito y Tefln en el que tanto las nanopartculas de oro como la enzima
formanpartedelamatriztridimensionalmediantesimpleinclusinfsica.
Enlosapartadosqueseexponenacontinuacinsecomentanalgunosde
los aspectos ms relevantes de cada uno de los dos diseos de biosensores de
tirosinasa,ascomoalgunosresultadosexperimentalesquenoserecogieronen
laspublicacionescorrespondientes.Finalmenteseestablecerunacomparacin
entre las caractersticas operacionales de ambos tipos de biosensores
comentndoselasventajaseinconvenientesdecadaunodeellos.
110

III.1.1. BIOSENSOR DE TIROSINASA BASADO EN EL EMPLEO DE UN
ELECTRODO DE CARBONO VITRIFICADO MODIFICADO CON
NANOPARTCULASDEOROELECTRODEPOSITADAS
Sellevaronacabodiversosestudiosencaminadosalacaracterizacinde
la superficie electrdica de carbono vitrificado modificada con nanopartculas
deoro,ascomodelpropiobiosensordetirosinasa(TirnAuGCE),empleando
para ello diferentes tcnicas electroqumicas. Los resultados obtenidos se
comparan con los correspondientes a la misma superficie en ausencia del
nanomaterial, con objeto de poner de manifiesto las diferencias y las ventajas
deldiseobasadoenelempleodenanopartculasdeoro.
III.1.1.1. Caracterizacinmediantetcnicaselectroqumicas
La tcnica de espectroscopia de impedancia electroqumica se utiliza,

entre otras cosas, para reconocer la presencia de especies conductoras y/o no
conductoras sobre una superficie electrdica, lo que origina un cambio en el
valordelaresistenciaalatransferenciade carga.Estatcnicaes ampliamente
utilizadapararealizarunseguimientodecadaunadelasetapasimplicadasen
la construccin de biosensores. A continuacin, se resean los resultados
obtenidosmedianteestatcnica,quenoaparecenenlosartculospublicadosy
secomparanconlosobtenidosmediantevoltamperometracclica.
EnlaFigura11serepresentanlosgrficosdeNyquistcorrespondientesa
un electrodo de carbono vitrificado modificado con nanopartculas de oro
(nAuGCE), as como a un biosensor de tirosinasa (TirnAuGCE). Con fines
comparativossemuestratambineldiagramadeNyquistcorrespondienteaun
electrododecarbonovitrificadosinmodificar(GCE).
Como puede observarse, el grfico de Nyquist para el electrodo de
carbonovitrificadomuestraunaregincircularmayorqueenpresenciadelas
111

nanopartculasdeoro,dondeseobtieneundiagramadeNyquistsemejanteal
correspondiente a una superficie de oro convencional con un semicrculo de
pequeodimetro,loqueponedemanifiestounadisminucindelaresistencia
alatransferenciadecargaconrespectoalelectrodosinmodificar,yuntramo
lineal de pendiente prxima a la unidad (m = 0.931; r = 0.9999) en un amplio
intervalo de frecuencias, caracterstico de sistemas en los que la corriente est
controlada por difusin [Lu, 2002]. Por otro lado, el biosensor de carbono
vitrificado modificado con nanopartculas de oro y tirosinasa presenta un
semicrculodemayordimetroqueelobtenidoenausenciadelaenzimaycon
elelectrodosinmodificar.
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Z' ,
Figura11. DiagramasdeNyquistde()GCE,()nAuGCEy()TirnAuGCEen
disolucinK4Fe(CN)6/K3Fe(CN)65mMenKCl1M.
Como se describe enlos Procedimientos experimentales, a partir de las

grficasdeNyquistsepuedecalcularla resistenciaalatransferenciadecargayla
capacidaddeladoblecapa. As,elvalor de dicha resistencia para el nAuGCE es
de 259 , muy inferior al valor de 1768 obtenido para el GCE. Estos

resultados demuestran que cuando se modifica el electrodo de carbono
vitrificado con nanopartculas de oro, se facilita la transferencia electrnica.
112

ParaelbiosensorTirnAuGCE,larepresentacindeNyquistrevela,comoera
deesperar,unaresistenciaalatransferenciadecargamayorqueenausenciade
la enzima (Rct = 4338 ) dado el efecto bloqueante de la capa de biomolcula
sobrelasuperficieelectrdicamodificada.
Porotraparte,lapresenciadesemicrculosdeprimidosenlazonade
altas frecuencias de los diagramas de Nyquist implica una desviacin del
comportamiento capacitivo ideal de la interfase electrododisolucin, habitual
en electrodos slidos. Esta desviacin se compensa sustituyendo en el circuito
de Randles el condensador por un elemento de fase constante, CPE, que se
originacomoconsecuenciadelamodificacindeladistribucindecargadela
doble capa debida a la rugosidad y a la distribucin de sitios activos en la
superficieelectrdica.Estefenmenoesparticularmenteimportantecuandose
incorporaunacapadeprotenasobrelasuperficie[Katz,2003].
Laexpresinmatemticacorrespondiente alelementodefaseconstante
es:
CPE =
A ( jw )
Ecuacin[8]
donde el parmetro n refleja la desviacin del comportamiento de la interfase

delcircuitodeRandles,conunvalorcomprendidoentre0.5<n<1.Enelcaso
dequenseaigualalaunidad,lasuperficieescompletamentelisayelelemento
de fase constante es un condensador, siendo A la capacidad de la doble capa
Cdl.Amedidaqueaumentalarugosidadelvalordenseaproximaa0.5
Los valores de n obtenidos son de n= 0.69 y 0.97 para un electrodo de
GCE y nAuGCE respectivamente, por lo que en el caso del electrodo de
carbono vitrificado y en contraposicin al electrodo modificado con
113

nanopartculasdeoro,esnecesariosustituirelcondensadorporunelementode
faseconstante(CPE),comoocurreconunagranpartedeloselectrodosslidos.
SeobtuvieronvaloresdeCdlparaelnAuGCEde0.7Fyde6F(n=0.87)para
elbiosensordetirosinasa,mientrasqueparaelelectrododecarbonovitrificado
seobtuvounvalorCPEde4.2F.
Otro parmetro de especial inters es la constante de transferencia
electrnica,ko,quepuedecalcularseapartirdelamedidadelaresistenciaala
transferencia de carga y del rea del electrodo, empleando las siguientes

expresiones,
Rct =
RT
Ecuacin[9]
nFi0
i0 = nFAk C* Ecuacin[10]
dondeAeslasuperficiedelelectrodoencm2,C*laconcentracindelaespecie
enmolcm3,Rctlaresistenciaalatransferenciadecargaen,iolacorrientede
intercambio en A, R la constante de los gases ideales 8.31 J/ K mol, T
temperatura en grados Kelvin, n el nmero de electrones transferidos en la
reaccinyFlaconstantedeFaraday96487J/Kmol.
ApartirdelosvaloresdeRctmencionadosanteriormenteyaplicandolas
ecuaciones [9] y [10], se obtuvieron valores de la constante de transferencia
electrnica de 4.24 x 104 y de 2.89 x 103 cm/s, para una disolucin de
ferrocianuro/ferricianuro potsico 5 mM en KCl 1 M, con el electrodo de
carbono vitrificado sin modificar y con el electrodo modificado con las
nanopartculas de oro electrodepositadas, respectivamente. Como era de
esperar,elvalordedichaconstanteesaproximadamente7vecessuperiorconel
electrodo modificado, que en ausencia de las nanopartculas de oro, lo que
114

prueba la aceleracin del proceso de transferencia de carga en la reaccin

electroqumica que implica el par redox ferrocianuro potsico/ ferricianuro
potsicosobreunsustratoelectrdicomodificadoconnanopartculasdeoro.
Las conclusiones extradas mediante espectroscopia electroqumica de
impedancia concuerdan cualitativamente con las observadas utilizando
voltamperometra cclica. En las Figura 12 se recogen los voltamperogramas
cclicos correspondientes al electrodo de carbono vitrificado (GCE), al mismo
electrodo modificado con nanopartculas de oro (nAuGCE) y al biosensor de
tirosinasa(TirnAuGCE).
25 A
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
E, V
Figura12. Voltamperogramascclicos(v=25mVs1)sobre GCE, nAuGCEy

TirnAuGCEenK4Fe(CN)6/K3Fe(CN)65mMenKCl1M.
Como puede observarse, la modificacin del electrodo de GCE con

nanopartculasdeoro,produceunaumentonotabledelascorrientesdepicoen
el voltamperograma cclico correspondiente, as como una disminucin de la
separacinentrelospotencialesdepicoandicoycatdico,loquenuevamente
pone de manifiesto que la modificacin con nanopartculas de oro da lugar a
una mejor transferencia de carga. Con respecto al biosensor TirnAuGCE, el
voltamperograma obtenido muestra menores corrientes de pico, as como una
menor reversibilidad que con el electrodo de carbono vitrificado modificado
115

con nanopartculas de oro. Sin embargo, aunque las corrientes de pico son
semejantes a las observadas sobre un electrodo sin modificar, la separacin
entrelospotencialesdepicoandicoycatdicoesmenorquesobreGCE.Por
tanto, nuevamente se deduce que el biosensor TirnAuGCE presenta un
comportamiento cintico intermedio entre el GCE y el mismo electrodo
modificadoconnanopartculasdeoro(nAuGCE).
ElcoeficientedeWarburgpuedecalcularsemedianteextrapolacindela
reginlinealdebajasfrecuenciasdelgrficodeNyquist(Z=RS+Rct W2 Cdl).
Sin embargo, dado que la regin circular en el caso del electrodo modificado
con nanopartculas de oro es muy pequea, se ha preferido determinar este
parmetro a partir de la pendiente de la porcin lineal que aparece a bajas
frecuencias en la representacin de Z en funcin de f1/2 (Figura 13). No fue
posible calcular el coeficiente de Warburg para del biosensor de tirosinasa, ya
que el grfico de Nyquist no presenta un tramo lineal difusivo a bajas
frecuencias,siendolapendienteobtenida,de0.555,inferioralaunidad.
8000
7000
GCE
pte= 1288 s
r=0.9999
6000
-1/2
Z ',
5000
4000
nAu-GCE
3000
pte= 1665 s
r= 1
-1/2
2000
1000
0
0.0
2.0
4.0
6.0
f
-1/2
, s -1/2
8.0
10.0
Figura13. Representacionesdelaimpedanciafaradaicaenfuncindef1/2paranAu
GCEyGCE.
116

A partir de los coeficientes de Warburg obtenidos para los electrodos

nAuGCEyGCEpuedencalcularseloscoeficientesdedifusinparaelparredox
encuestin.Comoeradeesperar,losvaloresdeloscoeficientesdedifusinson,
en ambos casos, del mismo orden, 4.1x107 y 6.8x107 cm2 s1, respectivamente,
dadalaausenciadeenzimaenambassuperficies.
III.1.1.2. AspectosmsrelevantesdelbiosensorTirnAuGCE
La inmovilizacin de tirosinasa por entrecruzamiento sobre el electrodo

decarbonovitrificadomodificadoconnanopartculasdeoroelectrodepositadas
ha permitido construir un biosensor con importantes caractersticas analticas,
como son, una buena repetibilidad de las medidas (R.S.D. =3.6%, n=6) sin
necesidaddeaplicarunpretratamientodelimpieza,unabuenaestabilidadenel
tiempo (vida til 35 das), as como una excelente sensibilidad para la
determinacin de compuestos fenlicos y una buena reproducibilidad en su
fabricacin (R.S.D.=4.8%, n=5). Adems el empleo de este biosensor permite
determinar de una manera rpida el contenido de compuestos fenlicos en
vinos,empleandounprocedimientoextremadamentesimple.
Seguidamente se establece una comparacin entre la sensibilidad del
biosensor desarrollado con la conseguida empleando otras configuraciones de
biosensoresdetirosinasaqueimplican,bienlaausenciadenanopartculasdeoro
sobre la superficie electrdica o bien el empleo de un electrodo de oro como
sustrato.
En la Tabla 6 se recogen los valores de las pendientes de los calibrados
paracatecolenunintervalodeconcentracinde1x105a5x105M,obtenidoscon
cada uno de los diseos de biosensores, as como los procedimientos seguidos
paralapreparacindecadaunodeellos.
117

Tabla6. Comparacin de las respuestas obtenidas con diferentes biosensores de

Tirosinasa.
CONFIGURACIN
ELECTRDICA
TirnAuGCE
TirGCE
TirAuE
PREPARACINDELBIOSENSOR
1)Electrodep:E=0.2Vt=1min
2)5LdeTirde91.3UL1
3)30minenGA
1)5LdeTirde91.3UL1
2)30minenGA
1)5LdeTirde91.3UL1
2)30minenGA
*PENDIENTE,AM1
0.1022
0.0012
0.0568
*Intervalodeconcentracin1x1055x105Mcatecol
Si se compara la sensibilidad obtenida con el biosensor de tirosinasa
desarrollado con la del mismo dispositivo en ausencia del nanomaterial, se
observa que la pendiente es dos rdenes de magnitud mayor en presencia de
lasnanopartculasdeoro,yaproximadamenteeldoblequelaobtenidacuando
seinmovilizalatirosinasadirectamentesobreunelectrododeoroconvencional.
Esteaumentodesensibilidadpuedeatribuirseaquelasnanopartculasdeoro
distribudas sobre la superficie del electrodo permite una mayor libertad de
movimientodelaenzimainmovilizadadebidoaunaciertadistanciaentreellas,
mientras que la inmovilizacin directa sobre la superficie de un electrodo de
oro convencional da lugar a que las molculas de enzima estn ms prximas
entres,loqueconfiereunamayorrigidez.Esteltimohechoesconsistentecon
la disminucin de sensibilidad (menor pendiente del calibrado del catecol)
observadacuandosemodificalasuperficiedelelectrododecarbonovitrificado
empleando potenciales de electrodeposicin ms negativos, ya que, en estos
casos,unamayorcantidaddeoroelectrodepositadaseasemejacadavezmsa
unelectrododeoroconvencional.
Dada la importancia de la aplicacin de los biosensores a la
determinacin de analitos de inters en muestras reales, el biosensor
118

desarrollado se ha utilizado para estimar el contenido total de polifenoles en

vinos.
Estaestimacinesdegranintersdadalacorrelacinqueexisteentrela
capacidadantioxidanteyelcontenidodepolifenoles.
Tanto los vinos tintos como los blancos han sido analizados llevando a
caboelprocedimientodescritoenelapartadoII.1.3,queimplicanicamentela
adicindeunaalcuotadevinoalaclulaelectroqumicaysucesivasadiciones
deunadisolucinpatrndefenolaplicndoseelmtododeadicionesestndar.
El contenido de polifenoles ha sido expresado como mg L1 de cido cafeico
[Campanella, 2004]. La estimacin de estos compuestos ha de considerarse
como un ndice del contenido de polifenoles bioelectroqumico, debido a la
diferentesensibilidadobservadasobreelbiosensorTirnAuGCEparacadauno
deloscompuestosfenlicos.
Para validar la metodologa puesta a punto empleando este biosensor,
los resultados se han comparado con los obtenidos mediante el mtodo
espectrofomtrico de FolinCiocalteau, que es el mtodo recomendado para
llevaracabounaestimacindelcontenido totaldepolifenolesenestetipo de
muestras.Lapreparacindelasmuestrasylarealizacindelcalibradodecido
cafeicosehanllevadoacabotalcomosedescribeenelapartadoII.1.4.
Los resultados obtenidos por ambos mtodos para las diferentes
muestras se resumen en la Tabla 7. Estos valores se corresponden con el valor
medio obtenido para 5 determinaciones de cada uno de los vinos, estando el
intervalo de confianza definido para un nivel de significacin de 0.05. Como
puede apreciarse, los vinos tintos poseen un mayor contenido de polifenoles
que los blancos, lo que, se debe principalmente al diferente proceso de
obtencindeambostiposdevino.
119

Tabla7. Estimacindelcontenidodecompuestospolifenlicosenvinosempleando
unbiosensordeTirnAuGCE
Vino
Biosensor*
Mtodo
Espectrofotomtrico*
BlancoAlvear
183
31415
BlancoSeoro
171
3254
BlancoYuntero
9.50.2
20910
BlancoAranda
61
29727
BlancoSequeral
122
21713
Dulce
3.50.5
775
TintoAadas
474
179060
TintoSotillo
352
111080
TintoBlasn
30.60.6
122020
TintoSequeral
403
134020
*expresadocomomgL1decidocafeico
Como puede observarse, los resultados que proporcionan ambas
metodologas son diferentes, lo que se debe a la distinta sensibilidad que
presentanambosmtodosparaladeterminacindelosdiferentescompuestos
polifenlicos. Mientras que el biosensor de tirosinasa est limitado a la
determinacindecompuestosfenlicosycatecolescon,almenos,unaposicin
orto del anillo aromtico libre, el mtodo de FolinCiocalteau presenta el
inconvenientedequeelreactivoempleadopuedereaccionartambinconotros
compuestosdenaturalezanopolifenlica,queinterfierenalahoradellevara
cabo la determinacin de polifenoles. Algunos de estos compuestos, como el
cido ascrbico y la glucosa, se encuentran presentes en el vino [Mello, 2003],
porloquesehanensayadocomoposiblesinterferentesconelbiosensordeTir
nAuGCE, comprobndose que para las concentraciones medias esperadas no
se observa respuesta alguna de corriente en las condiciones experimentales
utilizadas.
120

A modo de ejemplo, en la Figura 14, se recogen los amperogramas

correspondientesadosdelasmuestrasanalizadas,unadevinotintoyotrade
vinoblanco,trasaplicarelmtododeadicionesestndar.
(B)
(A)
+20Lfenol 2.5mM
+10Lfenol 1mM
+270Lvino blanco
+270Lvino tinto
1min
0,02A
0.2A
100s
Figura14. RegistrosdeintensidadtiempoobtenidosconelbiosensorTirnAuGCEen
disolucinreguladoradefosfato0.1M,pH7.4(A)enunamuestradevino
tintoSotillo, (B) en muestra de vino blanco Dulce por el mtodo de las
adicionesestndar.Eap.:0.1V.
Asimismo, en la Figura 15 se muestra la representacin grfica

correspondiente a la correlacin entre los resultados obtenidos para la
estimacindelcontenidodeloscompuestosfenlicosporambosmtodos.
121

60
Tir-nAu-GCE (mg/L ac. cafeico)
50
40
30
20
10
0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Folin-C iocalteau (m g/L ac. cafeico)
Figura 15.Correlacinentrelosresultadosobtenidosparalaestimacinelcontenido
de compuestos fenlicos en muestras de vino empleando el biosensor Tir
nAuGCEyelmtododeFolinCiocalteau.
A pesar de la diferencia entre los resultados obtenidos por ambos

mtodos, puede verse que se consigue una buena correlacin entre ellos
(r=0.990),loqueponedemanifiestolaaplicabilidaddelbiosensordesarrollado
para proporcionar una estimacin de tipo electroqumico del contenido de
polifenolesenvinos.
122

III.1.2.BIOSENSORDETIROSINASABASADOENUNELECTRODOCOMPSITO
DEGRAFITOTEFLNMODIFICADOCONNANOPARTCULASDEORO
El empleo de electrodos compsitos ofrece importantes ventajas en

comparacin con los electrodos convencionales formados por una sola fase
conductora. Los electrodos compsitos pueden fabricarse con una gran
flexibilidad en lo que se refiere a su forma y tamao; adems presentan una
mayor relacin seal/ruido, lo que generalmente se traduce en una mejora de
loslmitesdedeteccin,constituyendostaunadelasprincipalesventajasdel
empleodeestosmateriales.Asimismo,altratarsedeunamatriztridimensional,
es posible incorporar en el seno de la matriz por simple inclusin fsica otros
componentes y sustancias, como nanopartculas de oro, enzimas, mediadores
etc, que son capaces de mejorar la sensibilidad y/o la selectividad de las
metodologas analticas implicadas, y que permiten la regeneracin de la
superficieelectrdicaporsimplepulido.
Aprovechando estas ventajas se ha preparado por primera vez un
biosensorcompsitodetirosinasmodificadoconorocoloidal,capazdeestimar
el contenido total de fenoles de una forma rpida y sencilla en aguas y
alpechines.
III.1.2.1. Caracterizacin de la superficie electrdica mediante tcnicas
electroqumicas
Al igual que para el biosensor de carbono vitrificado, la superficie

electrdica se ha caracterizado mediante espectroscopia de impedancia
electroqumica. En la Figura 16 se muestran los diagramas de Nyquist
correspondientes a un electrodo de grafitoTefln modificado con
nanopartculas de oro (AucolGT) y sin modificar. Asimismo se muestran los
123

diagramas para biosensores de tirosinasa constituidos con electrodos

modificadosysinmodificarconlasnanopartculas(TirAucolGTyTirGT).
2500
2300
23
x1 02
2000
20
x1 02
Z,
1800
18
x1 02
1500
15
x1 02
1300
13
x1 02
1000
10
x1 02
800
8 x1
02
500
5 x1
02
300
3 x1
02
0. x1002
-0. x102 5 x1 0 2 10 x1 02 15 x1 02 20 x1 02 25 x1 02 30 x1 02 35 x1 0
0
500
1000
1500
Z' / o h m2000 2500
3000
3500
Z,
Figura 16.- DiagramasdeNyquistde()GT,()AucolGT,()TirAucolGT,()Tir

GT,endisolucinK4Fe(CN)6/K3Fe(CN)65mMenKCl0.1M.
Enla Tabla8serecogenlosvaloresdelaresistenciaala transferenciade

carga,Rct,calculadosapartirdeldimetrodelsemicrculodelosdiagramasde
Nyquist. Como puede observarse, el valor de dicha resistencia disminuye en

presenciadenanopartculasdeoroloqueponedemanifiesto,unavezms,que
lamodificacinconorocoloidalfacilitalatransferenciaelectrnica.
En cuanto a los biosensores de tirosinasa, como era de esperar la
resistenciaalatransferenciadecargaesmayorqueenausenciadeenzima,lo
que se atribuye al efecto bloqueante de la biomolcula inmovilizada sobre la
superficiedelelectrodo.Asimismo,laresistenciaalatransferenciadecargadel
biosensorcompsitopreparadoenausenciadelnanomaterialessuperioraldel
mismobiosensormodificadoconnanopartculasdeoro.
124

Tabla8.
Resultados obtenidos mediante EIS para un electrodo de GT, AucolGT y

losbiosensoresTirGTyTirAucolGT
ELECTRODO
Rct,
GT
4500600
AucolGT
TirGT
TirAucolGT
79080
150080
107090
kcm/s
1.69x104
4.21x104
CPE,F
(58090)
n
(0.710.06)
(257)
(0.710.08)
(1283)
(273)
(0.570.06)
(0.630.04)
Niveldesiginificacin:0.05
ComopuedeobservarseenlaFigura16,enningncasollegaaapreciarse
a bajas frecuencias el tramo recto de pendiente unidad correspondiente a un
controldifusivo.
Porotraparte,sehacalculadola constantedetransferenciaelectrnica,ko,a
partirdelaresistenciaalatransferenciadecargamedidaenlaregindealtas
frecuenciasdelosdiagramasdeNyquist,haciendousodelasecuaciones[9]y
[10].EnlaTabla8semuestranlosvaloresdekoobtenidos,paraloselectrodosde
grafitoTefln y AucolgrafitoTefln, observndose como la presencia de las
nanopartculas de oro favorecen la cintica de la transferencia electrnica
obtenindoseunmayorvalordedichaconstante.
En cuanto a los valores de n obtenidos para los diferentes electrodos
compsitos,entodosloscasosdichovalorsealejadelaunidad,porloqueenel
circuitodeRandlesdebetenerseunelementodefaseconstanteenlugardeun
condensador. Como puede observarse en la Tabla 8, los valores de n para los
biosensoresdetirosinasasealejananmsdelaunidad,aproximndosea0.5
msqueenelcasodelospropioselectrodosenausenciadelaenzima,loquese
atribuye a la presencia de la biomolcula en la superficie del electrodo [Katz,
2003].
125

Elclculodelreaactivadeloselectrodosnecesariaparaelclculodela
constante de transferencia electrnica, se realiz mediante voltamperometra
cclica y cronoamperometra siguiendo los procedimientos descritos en el
apartado II.2.3. En la Tabla 9 se muestran los valores obtenidos para ambos
electrodosporlasdiferentestcnicas.
Tabla9.ClculodelreaactivadeloselectrodosAucolGTyGT.
ELECTRODO
AucolGT
GT
VOLTAMPEROMETRA
CCLICA(cm2)
CRONOAMPEROMETRA(cm2)
0.170.04
0.160.02
0.07270.007
0.0700.008
Como puede observarse, ambas tcnicas proporcionan valores del rea

muy similares, obtenindose, como era de esperar, un mayor valor del rea
activa en la superficie modificada con oro coloidal. A modo de ejemplo en la
Figura 17, se muestran los voltamperogramas cclicos realizados con ambos
biosensoresparaunadisolucindeferrocianuropotsico5x104MenKCl1M.
25 A
-0.30
-0.05
0.20
E/V
0.45
0.70
Figura17. Voltamperogramascclicosdeferrocianuropotsico5x104MenKCl1M
a0.3V/s..()grafitoTeflny()AucolgrafitoTefln.
126

En los voltamperogramas cclicos obtenidos se puede apreciar como la

presenciadelasnanopartculasdeoroenlamatrizproduceunaumentoenlas
intensidades de pico del voltamperograma correspondiente, lo que
probablementeesdebidoadichoaumentodelreasuperficialactiva.
Se han calculado tambin los coeficientes de difusin y de transferencia
electrnicaparaelfenol()sobreelelectrodocompsitodegrafitoTeflnysobre
esteelectrodomodificadoconnanopartculasdeoro.Paraellosehanempleado
las tcnicas de cronoamperometra y voltamperometra cclica aplicando los
procedimientosdescritosenlosapartadosII.2.4yII.2.5.
La tcnica cronoamperomtrica implica la aplicacin de un salto de
potencialdesdeunvaloralcualnotienelugarelectrolisis(i=0)hastaunvaloral
cualelprocesoestcontroladopordifusin.Laeleccindedichospotenciales
se realiz a partir del registro de los voltamperogramas cclicos
correspondientes,quesemuestranenlaFigura18dondesehansealadodichos
valoresdepotencial(0.5y0.8V).
(a)
0.300x10
-4
0.250x10
-4
0.200x10
-4
0.150x10
-4
0.100x10
-4
0.050x10
-4
0.4
(b)
0.350x10 -4
0.6
0.8
1.0
E/V
-4
1.2 0
-0.050x1 0
5A
-4
-0.100x1 0 -4
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6 0.7
E/V
0.8
0.9
1.0
1.
Figura18 Voltamperogramascclicosparaunadisolucindefenol0.5mM( )y
unadisolucindefondo().MedioTRIS0.1MapH7.0;v=50mV/s
(a)grafitoTeflny(b)AucolgrafitoTefln.
127

En las Figuras 19 y 20 se recogen los cronoamperogramas

correspondientesadisolucionesdefenoldediferenteconcentracinempleando
un electrodo de grafitoTefln y AucolgrafitoTefln respectivamente.
Asimismo, se muestran las representaciones de la corriente en funcin de la
inversa de la raz cuadrada del tiempo. Los coeficientes de difusin se han
calculadoapartirdelarepresentacindelaspendientesdelasrectasanteriores
enfuncindelaconcentracindefenolutilizandolaecuacindeCottrell[Zare,
2006].
y = 19.875x + 0.937
r = 0.999
y = 13.363x + 0.894
r = 0.998
y = 10.297x + 0.638
r = 0.999
12
(b)
8
i, A
(a)
10
2.5A
6
4
2
y = 7.572x + 0.416
r = 0.987
0
0
0.2
1/ t 1/2
0.6
0.8
8.0 13.0 18.0 23.0 28.0 33.0 38.0 43

t/s
Sensibilidad, A s
1/2
(c)
0.4
30
y = 1.683E+01x + 2.757E-06
r= 0.96
20
10
0
0.E+00 2.E07 4.E07 6.E07 8.E07 1.E06
[Fenol], m ol/cm 3
Figura19. (a) Respuesta cronoamperomtrica del electrodo grafitoTefln en medio

reguladorTRIS0.1MdepH7.0a0.8Vparadiferentesconcentraciones
defenol.Losnmeros14correspondenafenol0.2,0.5,0.7y0.9mM.(b)
Representacindeivs.1/t1/2obtenidasapartirdeloscronoamperogramas.
(c)Representacindelaspendientesvs.concentracindefenol.
128

(a)
(b)
22
y = 37.78x + 2.1063
r=0.995
i, A
17
12
y = 29.521x + 2.1714
r=0.995
5A
y = 19.617x + 1.0124
r=0.998
2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
(c)
10
15
20
25
t /s
30
35
40
Pe ndie nte , A s 1/2
1/ t 1/2
35
30
25
20
15
10
4.E-07
y = 3.30E+07x + 2.87E+00
r=1
6.E-07
8.E-07
1.E-06
[F
en o l], mo
l /cm 3
[Fenol],
m ol/cm
Figura20. (a) Respuesta cronoamperomtrica del electrodo AucolgrafitoTefln en

medio regulador TRIS 0.1 M de pH 7.0 a 0.8 V para diferentes
concentracionesdefenol.Losnmeros13correspondenafenol0.5,0.7y
0.9 mM. (b) Representacin de i vs. 1/t1/2 obtenidas a partir de los
cronoamperogramas. (c) Representacin de las pendientes vs.
concentracindefenol.
Losvaloresdeloscoeficientesdedifusin obtenidos hansidode2.95x

106yde4.52x106cm2/sempleandoelelectrododegrafitoTeflnyelelectrodo
modificado con nanopartculas de oro respectivamente. Los valores obtenidos
conamboselectrodossonmuysimilarescomoeradeesperar,dadalaausencia
de recubrimientos de molculas bloqueantes como enzimas, etc., que puedan
dificultarelaccesodelanalitoalasuperficiedelelectrodo.
Severificlainfluenciadelavelocidaddebarridodepotencialsobrela
intensidad yel potencialde pico obtenidos mediante voltamperometra cclica
con los electrodos de grafitoTefln y grafitoTefln modificado con
nanopartculas de oro. En la Figura 21 se muestran los voltamperogramas
correspondientes.
129

(a)
(b)
-4
10 A
-4
-4
0.x10-4
-4
0.x10-4
-4
0x10-4
-4
-0.x10-4
-4
-4
0 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

-0.x10
1.10.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
E/V
E/V
Figura 21.Voltamperogramascclicosobtenidosparaunadisolucindefenol5x104
MenmedioTRIS0.1MdepH7.0sobreunelectrododegrafitoTefln(a)
yAucolgrafitoTefln(b)a diferentesvelocidades debarrido, 5, 20,
50,100,200,300mV/s.
Losvaloresdelaintensidaddecorrientedepicoydelospotencialesde
picoparaunadisolucindefenol5x104MserecogenenlaTabla10.
Tabla10. Influencia de la velocidad de barrido de potencial sobre laintensidad y el
potencialdepicoparafenol5x104Mempleandounelectrododegrafito
Tefln y un electrodo de grafitoTefln modificado con nanopartculas de
oro.
v,
mV/s
10
20
25
50
100
200
300
500
750
ip,A
Ep,mV
GT AucolGT
GT AucolGT
1.18
2.23
2.43
4.86
7.85
12.2
17.1
23.4
27.7
674
691
693
682
700
724
735
739
741
1.81
2.79
3.66
6.69
9.92
16.1
20.9
23.7
35.2
620
630
632
644
671
674
693
720
744
130

Como puede observarse, el potencial de pico aumenta ligeramente a

medida que aumenta la velocidad de barrido de potencial utilizando ambas
superficies electrdicas, siendo estos valores siempre ligeramente menos
positivos con el electrodo nanoestructurado que los correspondientes al
electrododegrafitoTefln.
Encuantoalaintensidaddecorriente,seapreciaunaumentodesuvalor
conlavelocidaddebarridoconamboselectrodos,siendolamagnituddedicha
corrientemayorenelcasodelelectrodomodificadoconnanopartculasdeoro,
dadoelconocidoefectocatalticoqueejercenlasnanopartculasdelmetal.Enla
Figura 22 se muestran las representaciones del logaritmo de la intensidad de
pico frente al logaritmo de la velocidad de barrido para ambas superficies

electrdicas, observndose en ambos casos una lnea recta, de pendiente
comprendidaentre0.5y1.0,loqueindicaquesetratadeunsistemaquenoest
totalmente controlado por difusin, sino que presenta una cierta contribucin
deadsorcin[Xiao,2008].
-6
-5.8
log ip = 0.7286 log v - 4.4194

R2 = 0.9946
-5.6
log ip
-5.4
-5.2
-5
log ip = 0.6681 log v - 4.3548
R2 = 0.9901
-4.8
-4.6
-4.4
-4.2
-4
0
-0.5
-1
-1.5
-2
log v
-2.5
Figura22. Representacin del logaritmo de la intensidad de pico vs. logaritmo de la

velocidaddebarridoparaunadisolucindefenol5x104MenTRIS0.1
M de pH 7.0, empleando un electrodo de grafitoTefln () y Aucol
grafitoTefln( ).
131

A partir del clculo de las pendientes de Tafel, se ha obtenido el

parmetro naparaelfenolsobreambostiposdeelectrodos.Laspendientesde
Tafel se obtuvieron representando el logaritmo de la corriente frente al
potencial a diferentes velocidades de barrido, midiendo en la regin del
voltamperograma en la que la intensidad es inferior al 10% de la corriente de
pico, zona en la que la respuesta est afectada nicamente por la cintica de
transferencia electrnica entre la especie electroactiva y la superficie del
electrodo[Banks,2005].Paraello,esnecesariolaeliminacindelacontribucin
del electrolito soporte por extrapolacin lineal de la respuesta obtenida a
potencialespreviosalaoxidacindelfenol.Deestaforma,losvaloresmedios
(n=10) de na empleando un electrodo de grafitoTefln y grafitoTefln
modificadoconnanopartculasdeorohansidode0.43y0.48respectivamente.
Estosvaloresponendemanifiestoqueelnmerodeelectronesintercambiados
en la etapa limitante de la velocidad es la unidad, siendo estos resultados
consistentes con los obtenidos por otros autores empleando otros materiales
electrdicos[Hart,1997].
III.1.2.2. AspectosmsrelevantesdelbiosensorTirAucolGT
Lasventajasdecombinarelempleodeunamatrizcompsitacomoesla
de grafitoTefln para la inmovilizacin de enzimas y la incorporacin de
nanopartculas de oro en dicha matriz tridimensional, ha permitido el
desarrollo de un biosensor de tirosinasa con caractersticas analticas que
mejoranlasobtenidasconotrosbiosensoresdetirosinasayaexistentes.Porotra
parte,laregeneracindelasuperficiedelbiosensoryportantodesuactividad,
mediante un simple pulido, junto con las ventajas que proporcionan las
nanopartculas de oro reteniendo la actividad biolgica de la protena, ha
permitido construir un biosensor reutilizable y reproducible con una alta
estabilidadytiempodevidatil.
132

A modo de comparacin, en la Tabla 11 se recogen las caractersticas

analticas obtenidas con distintos biosensores electroqumicos de tirosinasa
encontradosenlabibliografa,incluyendolasproporcionadasporelbiosensor
compsitoTirAucolGTdesarrolladoenestaMemoria.
Tabla11. Caractersticas analticas de diferentes biosensores electroqumicos de
tirosinasautilizandofenolcomosustrato.
Electrodo
Sensibilidad*
LD,M
TirPEDTGCE 608mAM cm
0.05
TirsolgelTiO2
103mAM
0.1
TirsolgelSiO2
23.1mAM
TirMPAAuE
KMapp,M
Ref.
Retiene 30% de la
actividad despus [Verdne,2003]
de12das
2.9x10
Tiempode
vidatil
Retiene 94% de la
actividad despus
de80das
[Yu,2003]
Retiene 73% de la
actividad despus [Wang,2000]
de3semanas
0.1
13.9mAM1
0.088
1.5x104
5das
[Campuzano,
2003]
Tir/GDHClark
6.6mAM1
0.01
[Streffer,2001
TirRVC
8.2mAM1
0.26
20das
[Pea,2001]
TirHRPSPCE
1300mAM1cm2
62.3mAM1
0.0025
Retiene 92% de la
actividad despus [Chang,2002]
de60das
TirGT
280mAM1
0.09
7.76x105
30das
[Serra,2002]
TirCepoxy
0.794mAM1
1.0
30das
[nnerfjord
1995]
TirCPE
0.810mAM1
15
[Wang,1994]
TirAucolCPE
23mAM1
0.0061
5.36x105
2semanas
[Liu,2003c]
TirnAuGCE
82mAM1
0.21
1.4x104
18das
[Carralero
Sanz,2005]
0.02
8.9x106
39das
Estetrabajo
TirAucolGT
540mAM1
7643mAM1cm2
*Expresadacomopendientedelcalibrado;GCE:electrododecarbonovitrificado;PEDT:
poli(3,4etilendioxitiofeno); MPA: cido 3mercaptopropionico; GDH. Glucosa
deshidrogenasa; RVC: carbono vtreo reticulado; SPCE: electrodo de carbono
serigrafiado;CPE:electrododepastadecarbono;GT:grafitoTefln.
133

EsdedestacarcomoelbiosensordeTirAucolGTpermiteconseguiruna
mejorasignificativaenlasensibilidadparaladeteccindelfenol,talycomose
deducedelvalorobtenidoparalapendientedelcalibradodedichocompuesto,
que es, como mnimo, un orden de magnitud ms elevada que las reportadas
para otros biosensores de tirosinasa. Es interesante sealar que el segundo
biosensor ms sensible es el de TirGT. Si se comparan estas configuraciones
electrdicasmssensibles,puedededucirsequelapresenciadelorocoloidalen
lamatrizcompsitaeselresponsabledelmarcadoincrementoqueseproduce
enlasensibilidad.
Encuantoallmitededeteccin,slodosdelosbiosensoresrecogidosen
laTablaposeenunvaloralgoinferioralobtenidoconelelectrodoTirAucolGT
desarrollado,apesardeposeerambosunasensibilidadmuyinferior(62.3y23
mAM1frentea540mAM1).
Por otra parte, si se comparan los valores de la constante aparente de
MichaelisMenten calculados para cada uno de los biosensores de tirosinasa
recogidos en la Tabla, el obtenido con el biosensor TirAucolGT es
aproximadamenteunorden de magnitudmenorqueloscalculadosparaotras
configuraciones,loqueindicaunamayorafinidaddelaenzimaporelsustrato
utilizando esta configuracin y, por tanto, una mayor sensibilidad. Este hecho
pone de manifiesto la existencia de una mayor cantidad de enzima activa
inmovilizada sobre la superficie electrdica, como consecuencia de la mejor
inmovilizacindelabiomolculasobrelasnanopartculasdeoro.
Otroparmetrodegran relevancia queaparecereflejadoenla Tabla 11,
es el tiempo de vida til del biosensor. Como puede observarse, el tiempo de
vidadelosdistintosbiosensoresqueaparecenenla Tablavaramuchodeunas
configuraciones a otras, siendo el biosensor de TirAucolGT uno de los que
134

mayortiempodevida tilpresenta. Esto puede atribuirse, por una parte, a la

posibilidadderegenerarlasuperficieelectrdicaporsimplepulidoy,porotra,
a laincorporacin delasnanopartculas de oroa la matriz tridimensional que
mejora la inmovilizacin de la enzima reteniendo su actividad biolgica [Pan,
2003].
Con el fin de verificar el efecto cataltico que ejercen las nanopartculas
de oro en la respuesta del biosensor, se han comparado las medidas de la
intensidad de corriente en estado estacionario obtenidas empleando el
biosensor compsito desarrollado (TirAucolGT), con las correspondientes al
biosensor preparado de forma anloga pero en ausencia del nanomaterial
[Serra, 2002]. En la Tabla 12 se muestran los resultados obtenidos para tres de
loscompuestosfenlicosestudiadosconambosbiosensores.
Tabla12. Caractersticas analticas obtenidas para diferentes compuestos fenlicos

conlosbiosensorescompsitosdeTirosinasaenpresenciayausenciadeoro
coloidal.
Biosensor
TirAucolGT
TirGT
TirAucolGT
TirGT
TirAucolGT
TirGT
Intervalo
Lmitede
Sensibilidad(mA/M)
Lineal(M)
Deteccin(M)
Fenol
0.0254.0
540
0.02
0.125
280
0.099
3,4Dimetilfenol
0.052.0
563
0.011
0.16
520
4Cloro2Metilfenol
10275
9
0.1
50100
23
3.3
Comopuedeapreciarse,lamodificacindelbiosensorcompsitoconlas
nanopartculas de oro mejora las caractersticas analticas alcanzadas con el
135

biosensordeTirGT,consiguindoseunamayorsensibilidadymenoreslmitesde
deteccinparaladeterminacindelosdiferentescompuestosfenlicos.
Una vez comprobado el efecto cataltico de las nanopartculas de oro y

con el fin de conocer si la catlisis afecta a la reaccin electroqumica de
reduccindelaquinonaenlasuperficieelectrdicay/oalareaccinenzimtica
deoxidacindelcatecolaquinona,sehanrealizadomedidasdelaintensidad
decorrienteenestadoestacionarioparaunadisolucinde2,4benzoquinona5
M empleando un electrodo de grafitoTefln en presencia y en ausencia de
nanopartculasdeoro.Asimismo,sehanrealizadomedidascorrespondientesa
disoluciones de fenol de concentracin 5 M empleando un biosensor de
grafitoTefln modificado con oro coloidal y sobre otro en ausencia de las
nanopartculas metlicas. En la Tabla 13 se recogen los valores obtenidos para
lasintensidadesencadacaso.
Tabla13. Efecto de la presencia de nanopartculas de oro sobre la intensidad de
corrientede2,4benzoquinonayfenol.
ELECTRODO
GT
AucolGT
TirGT
TirAucolGT
2,4BENZOQUINONA
5M,A
(0.04640.002)
(0.1060.008)
FENOL
5M,A
(0.940.10)
(2.10.3)
Como puede observarse, la intensidad de corriente en presencia de oro

coloidal es superior a la obtenida en ausencia del nanomaterial, tanto para el
electrododegrafitoTeflncomoconelbiosensordetirosinasa.Larespuestadel
biosensor es aproximadamente 2.5 veces mayor con el biosensor que contiene
las nanopartculas de oro que con el que no las contiene. Estos resultados
permiten deducir que la presencia de oro coloidal en la matriz compsita de
grafitoTefln es responsable del aumento tanto de la cintica de la reaccin
136

enzimtica de los sustratos fenlicos, como de la cintica de la reaccin de

reduccinelectroqumicadelacorrespondienteoquinona[LiuY.,2003].
En cuanto a la aplicacin del biosensor desarrollado al anlisis de
muestras reales, la sencillez en el procedimiento de medida y el poco tiempo
requerido para el anlisis ha permitido la determinacin de compuestos
fenlicos en distintos tipos de aguas, as como en muestras de alpechn. En
ambos casos, los resultados obtenidos se compararon con los proporcionados
porotrosmtodosanalticosdeusocomn.
Con el fin de comprobar si la metodologa desarrollada poda ser
utilizada para proporcionar la informacin necesaria acerca del contenido de
compuestos fenlicos, se analizaron varias muestras de agua de diferentes
caractersticas.Laprimeradeellasconsistienunamuestrasintticapreparada
enellaboratorio,quefueenriquecidacontrescompuestosfenlicosdiferentes,
fenol en concentracin 1 M, 3,4dimetilfenol 2.5 M y 4cloro2metilfenol 1
M.Estoscompuestosseeligierondebidoaladistintasensibilidadconlaque
sondetectadosconelbiosensordetirosinasa,yporsudiferentepolaridad.Las
otras tres muestras de agua analizadas proceden de una refinera y han sido
tomadasendiferentesdasyendistintasetapasdelprocesodepurificacin.El
procedimiento llevado a cabo para la determinacin amperomtrica del
contenido fenlico se describe en el apartado II.2.6, aplicndose el mtodo de
adicionesestndaryexpresndoseelndicefenlicocomomol/Ldefenol.
Losresultadoscorrespondientesalasdiferentesmuestrassecompararon
con los obtenidos al aplicar el mtodo espectrofotomtrico de la 4
aminoantipirina. En la Tabla 14 puede observarse como el ndice de fenoles
obtenido por ambos mtodos para una misma muestra proporciona un valor
numrico diferente, lo que se debe a la diferente sensibilidad que presentan
137

estosmtodoshacialosdiferentescompuestosfenlicos.Enelcasodelmtodo
espectrofotomtrico,ladiferenciaenlarespuestasedebeaquelaestructuradel
compuestofenlicoinfluyeenlainteraccinconla4aminoantipirina.As,por
ejemplo, compuestos fenlicos sustituidos en posicin para como 3,4
dimetilfenol y 4cloro2metilfenol, no dan prcticamente respuesta, por tener
impedida la posicin ms activa para la interaccin con el reactivo
derivatizante. Tampoco reaccionan los fenoles muy desactivados como los
cloro o nitrofenoles muy sustituidos. Este hecho puede explicar la baja
concentracin de fenol obtenida por el mtodo espectrofotomtrico para las
muestras que contienen estos compuestos. Por otro lado, las muestras que
contienen compuestos fenlicos con la posicin orto sustituda presentan una
menor sensibilidad cuando se emplea el biosensor, debido, como se ha
comentado anteriormente, a que la enzima tirosinasa no responde a los
compuestosfenlicosquepresentanocupadalaposicinorto.
Tabla14. Estimacin del contenido de compuestso fenlicos en muestras de aguas
procedentesdeunarefinera.
MUESTRA
TirAucolGT
Mtodoespectrofotomtrico
(molL1fenol) 4aminoantipirina(molL1fenol)
Enriquecida (3.90.4)x106
M1
(102)x106
(1.10.2)x106
(1.50.4)x106
M2
(61)x106
(1.200.04)x106
M3
(1.10.2)x104
(5.50.4)x106
Apesardelasdiferenciasenlosvaloresnumricosqueseobtienenpor
ambos mtodos, se observa una buena correlacin (r2=0.9997) entre ambas
metodologascuandoserepresentandichosvalores,loqueponedemanifiesto
la aplicabilidad del biosensor desarrollado para la estimacin del contenido
138

fenlico en este tipo de muestras, con la ventaja adicional de un tiempo de

anlisisconsiderablementemenorrespectoalmtodoespectrofotomtrico.
Como ya se ha comentado, el biosensor compsito se ha aplicado a la
determinacin del contenido total de fenoles en muestras de alpechn. El
alpechnesunlquidonegruzcooriginadoenlasalmazarascomosubproducto
en la obtencin del aceite de oliva, que se caracteriza por ser altamente
contaminante debido al elevado contenido de materia orgnica (polifenoles
entreotroscompuestos)yalagrancantidaddesustanciasdisueltasqueposee.
Sudegradacinenlanaturalezaoenplantasdepuradorasesdifcil,porloque
su efecto medioambiental puede ser muy daino. Al tratarse de un producto
natural,sucomposicinnoesconstante,variandosegneltipodeaceituna,la
estacin,tipoderecogidaysobretodoconelprocesoindustrialempleadoenla
obtencindelaceite.
Con respecto a las muestras analizadas, las denominadas Martos 2 y
Martos2a,bycprocedendeunaalmazaraenlaquelaobtencindeaceitede
oliva se realiza empleando un sistema por presin, siendo el contenido de
compuestosfenlicossuperiorqueenlasmuestrasresultantesdelempleodeun
sistema por centrifugacin. El resto de las muestras, Martos 1, Almendralejo
(Badajoz) y Villarejo de Salvans (Madrid), proceden de un sistema de
extraccinporcentrifugacin,dedosfasesenlaprimeraydetresfasesenlas
dosltimasmuestras.
En la Tabla 15 se muestra la estimacin del contenido fenlico de estas
muestras empleando el biosensor compsito de tirosinasa desarrollado.

Asimismo, se muestran los resultados obtenidos con un biosensor de lacasa
preparadoenellaboratorio[Mena,2005b],ascomolosproporcionadosporel
mtodo espectrofotomtrico de FolinCiocalteau. En todos los casos el
139

contenido fenlico se expresa como g/L de cido cafeico. Cada uno de los
valorescorresponden alvalor medio de 5 determinaciones de cada una de las
muestras, indicndose el intervalo de confianza para un nivel de significacin
de0.05.
Tabla15.Estimacindelcontenidodecompuestosfenlicosenalpechn
BIOSENSOR
MUESTRA
(gL1c.Cafeico)
MTODO
ESPECTROFOTOMTRICO
FOLINCIOCALTEAU
TirAucolGTLacNSTPAuE
(gL1c.Cafeico)
Badajoz
0.2550.002
0.0630.008
0.2700.009
Martos1
Martos2
Villarejo
Martos2a
Martos2b
Martos2c
0.4160.002
3.50.7
0.220.03
1.50.1
1.70.3
0.70.1
0.130.01
1.70.2
0.0830.005
0.770.04
0.560.07
0.500.03
0.3520.005
7.20.5
0.580.02
3.60.2
2.40.2
1.80.1
Elempleodelbiosensordetirosinasadesarrolladoimplicalamedidade
la corriente tras adicionar una alcuota de la muestra a 10 mL de disolucin

reguladoradefosfato0.1MdepH7.4aplicandounpotencialdemedidade0.1
V.Enelcasodelbiosensordelacasaseemplereguladorcitrato0.1MdepH
5.0aplicndoseunpotencialde0.0V[Mena,2005b].Enamboscasosseaplicel
mtododeadicionesestndar.
EnlaFigura23semuestralarepresentacingrficacorrespondientealos
resultadosobtenidosutilizandoambosbiosensores.
140

1.8
Lac-NSTP-AuE (g/L ac. cafeico)
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Tir-Au col-GT (g/L ac. cafeico)
Figura23.Correlacinentrelosresultadosobtenidosparalaestimacindelcontenido
decompuestosfenlicosenmuestrasdealpechnempleandolosbiosensores
deTirAucolGTydeLacNSTPAuE.
Se observa una correlacin aceptable empleando ambos tipos de

biosensores,obtenindoseunaordenadaenelorigenqueincluyeelcero,loque
indica la no existencia de errores sistemticos. Sin embargo, el valor de la
pendiente, 0.44 0.04, difiere significativamente de la unidad. Esto se debe
principalmente a la distinta sensibilidad que presentan los biosensores
enzimticosempleados,porlosdiferentescompuestosfenlicos.Dehecho,hay
que tener en cuenta que la Tirosinasa presenta una especificidad limitada a
compuestos monofenlicos y catecoles con una posicin orto del anillo
aromtico libre o bien ocupada por un grupo OH. Adems, no muestra
actividad para la oxidacin de los para y los meta bencenodioles ni sus
derivados sustituidos, ni para los clorofenoles multisustituidos y nitrofenoles.
Sin embargo, el biosensor de Lacasa presenta una mayor sensibilidad para
compuestos fenlicos sustituidos por grupos dadores de electrones y grupos
con dobles enlaces conjugados como es el caso del cido cafeico. Este hecho
141

justifica el valor de la pendiente obtenida cuando se comparan los resultados

obtenidosconambosbiosensores.
Porotraparteenla Figura24serepresentanlosvaloresobtenidosconel
biosensor compsito de tirosinasa desarrollado frente a los resultados
proporcionadosporelmtododeFolinCiocalteau.
4.0
Tir-Aucol-GT (g/L ac. cafeico)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
Folin-Ciocalteau (g/L ac. cafeico)
Figura24.Correlacinentrelosresultadosobtenidosparalaestimacindelcontenido
de compuestos fenlicos en muestras de alpechn empleando el biosensor
TirAucolGTyelmtodoespectofotomtricodeFolinCiocalteau.
Como puede observarse, no existen errores sistemticos dado que la

ordenada de la recta pasa por el origen de coordenadas. En cuanto a la
pendiente, su valor diferente de la unidad (0.54 0.09) es, de nuevo,
consecuenciadeladistintasensibilidadexistenteentreambasmetodologas.
Finalmentecabedestacarlabuenacorrelacin(r=0.996)entreelbiosensor
detirosinasayelmtodoespectrofotomtricodeFolinCiocalteau,loquepone
demanifiestolaaplicabilidaddelmtododesarrollado.
142

III.1.3. COMPARACIN DE LOS BIOSENSORES TirnAuGCE Y TirAucol

GT
EnestaMemoriasehanpreparadodosbiosensoresbasadosenlaenzima
tirosinasaparaladeterminacindecompuestosfenlicosendiferentestiposde
muestras.Comoyasehacomentado,encadaunodeellossehaempleadoun
procedimiento diferente de inmovilizacin de las nanopartculas de oro
dependiendodelamatrizelectrdicaempleada,quepresentanalgunasventajas
ascomotambinalgunosinconvenientes.
Encuantoalbiosensordetirosinasaqueutilizaunelectrododecarbono
vitrificado, la incorporacin de las nanopartculas de oro en la superficie
electrdicasehallevadoacabomedianteelectrodeposicin.Esteprocedimiento
demodificacindelasuperficieconelnanomaterialresultaserbastantesimple
yrpido,comparadoconotrosprocedimientosquerequierenlapreparacinde
unadisolucindeorocoloidal,enlosquelasnanopartculasmetlicasforman
parte de la matriz electrdica o bien se adsorben sobre su superficie tras
sumergir el electrodo durante un periodo de tiempo, siempre superior al
necesarioenlaelectrodeposicin.Unadelasprincipalesventajasquepresenta
este procedimiento de modificacin es que basta con fijar el potencial y el
tiempo necesario de aplicacin para controlar el tamao deseado de las
nanopartculas, obtenindose resultados muy reproducibles. La principal
desventaja frente al biosensor de tirosinasa basado en la inclusin de las
nanopartculasdeorojuntoconlaenzimaenelinteriordelamatrizelectrdica
es un menor tiempo de vida til, adems de no existir la posibilidad de
regenerarlasuperficieelectrdicaporsimplepulido.
A continuacin se comparan las caractersticas analticas para la

deteccin de dos compuestos fenlico, fenol y catecol, empleando los dos
143

biosensores desarrollados en esta Memoria. La eleccin de estos dos

compuestos se debe a que son los ms empleados en la realizacin de los
diferentesestudiosdeoptimizacin.EnlaTabla16serecogenelintervalolineal,
lapendientedelcalibrado,ascomoloslmitesdedeteccinobtenidosencada
caso.
Tabla16. Comparacin de las caractersticas analticas para la deteccin
amperomtrica de fenol y de catecol empleando los biosensores
desarrollados.
TirnAuGCE TirAucolGT
ELECTRODO
Fenol
Intervalolineal,M
140
0.0254.0
Sensibilidad,A/M
0.082
0.540
Lmitededeteccin,M
0.21
0.020
Catecol
Intervalolineal,M
0.550
0.0108.0
Sensibilidad,A/M
0.107
0.746
Lmitededeteccin,M
0.15
0.003
Los resultados obtenidos, tanto para el fenol como para el catecol,

empleando el biosensor compsito revelan una mayor sensibilidad que la
obtenida con el biosensor basado en el electrodo de carbono vitrificado
modificado con nanopartculas electrodepositadas. Esta alta sensibilidad se
debe fundamentalmente a dos factores. Por un lado, a la rpida cintica de la
reaccin enzimtica, obtenindose con el biosensor compsito valores de la
constante de MichaelisMenten un orden de magnitud menor que con el
biosensor que emplea el electrodo de carbono vitrificado. Esta cintica
enzimtica ms rpida lo es tambin cuando se compara el biosensor
144

compsito, con otros diseos de biosensores encontrados en la bibliografa,

como ya se ha comentado. Por otro lado, la presencia del oro coloidal en la
matriz compsita aumenta tambin la cintica de la reaccin de reduccin
electroqumica de la correspondiente oquinona. En cuanto a los lmites de
deteccin obtenidos con el biosensor compsito stos son, como mnimo, un
orden de magnitud inferior que los alcanzados con el biosensor basado en el
empleo del electrodo de carbono vitrificado modificado con nanopartculas
electrodepositadas.
Finalmente destacar que ambos biosensores presentan una elevada
estabilidad operacional, as como proporcionan una excelente repetibilidad de
lasmedidasyunaelevadareproducibilidadensufabricacin.
Todas estas caractersticas operacionales favorables han permitido
aplicar ambos biosensores a la determinacin de compuestos fenlicos en
muestrasrealesconresultadossatisfactorios.
145

III.2. DESARROLLO DE INMUNOSENSORES BASADOS EN

SUPERFICIESCOMPSITASNANOESTRUCTURADAS
El empleo de inmunosensores electroqumicos como herramienta
analtica constituye una excelente alternativa para el anlisis de alimentos,
clnico y medioambiental. El empleo de anticuerpos proporciona la
especificidadnecesariaparaestetipodeanlisis,mientrasqueelprocedimiento
de medida electroqumica permite una alta sensibilidad en la deteccin y un
bajocostedelainstrumentacinyenlafabricacindelosbiosensores.
En este trabajo se ha hecho uso de un electrodo compsito de grafito y
Tefln estructurado con nanopartculas de oro, AucolgrafitoTefln, como
matriz electrdica para la preparacin de diferentes inmunosensores. De esta
forma se combinan las ventajas conocidas del empleo de un electrodo
compsito y la incorporacin de nanopartculas de oro en la matriz para la
inmovilizacin de las biomolculas, proporcionando unas excelentes
caractersticas,desensibilidad,selectividadydeestabilidadoperacional.
Se han preparado tres inmunosensores haciendo uso de electrodos
compsitos de grafitoTefln modificados con nanopartculas de oro, dos de
ellos para la determinacin de progesterona y uno para la determinacin de
inmunoglobulina G, habindose aplicado al anlisis de leche y suero,
respectivamente.
146

III.2.1. INMUNOSENSORES COMPSITOS PARA LA DETERMINACIN
DEPROGESTERONA
Laimportanciadeldesarrollodedispositivosquepermitanobtenerbajos
lmites de deteccin para la monitorizacin diaria de progesterona en leche se
debe principalmente al gran inters existente en la prediccin de los perodos
defertilidaddelasvacas,yaquetraslaovulacinlosnivelesdeprogesterona
decaen bruscamente a concentraciones comprendidas entre 1 y 5 ng mL1. La
necesidad de mejorar los mtodos existentes implica la disminucin de los
lmites de deteccin, as como el aumento de la sensibilidad. Con el fin de
alcanzar estos objetivos, se han desarrollado dos inmunosensores
electroqumicosparaladeterminacindeestahormona,unodeellosbasadoen
elempleodelelectrodocompsitoAucolgrafitoTeflnyelotroenlautilizacin
deunbiosensordeTirAucolgrafitoTeflncomotransductoramperomtrico.
A continuacin se comentan los aspectos que se han considerado ms
relevantes de cada uno de estos inmunosensores, as como los resultados de
algunos otros estudios que no aparecen recogidos en las publicaciones
correspondientes.
III.2.1.1. INMUNOSENSOR BASADO EN EL EMPLEO DE UN ELECTRODO
COMPSITO
DE
GRAFITOTEFLN
MODIFICADO
CON
NANOPARTCULASDEORO
III.2.1.1.1. Estudio de la oxidacin electroqumica del naftol sobre

electrodos de grafitoTefln y grafitoTefln modificado con
nanopartculasdeoro
Elnaftilfosfatofueescogidocomosustratodelaenzimafosfatasaalcalina
empleada en el marcaje de los anticuerpos utilizados en el desarrollo del
inmunosensordeprogesterona.Dadoqueelproductodelareaccinenzimtica
147

es el naftol, se consider conveniente realizar estudios sobre la oxidacin

electroqumicadelnaftolsobrelassuperficieselectrdicasempleadas.
Con objeto de comprobar el efecto cataltico que ejercen las
nanopartculas de oro sobre la oxidacin de dicho compuesto, se evalu la
influencia de la velocidad de barrido de potencial sobre la intensidad y el
potencial de pico mediante voltamperometra cclica empleando un electrodo
de grafitoTefln modificado con nanopartculas de oro. Con fines
comparativos,sellevacaboelmismoestudiosobreunelectrodosinmodificar
conelnanomaterial.
En la Figura 24 se muestran los voltamperogramas cclicos a diferentes
velocidades de barrido para una disolucin de naftol 5 x 10 4 M en medio
dietanolamina0.1MdepH10.0sobreambassuperficieselectrdicas.
(a)
00x10
-4
00x10
-4
00x10
-4
00x10
-4
0.300x10
0.300x10 -4
0.200x10
0.200x10 -4
i/A
10A
0
0x10
-4
0x10
-4
(b)
0.400x10 -4
10A
i/A
00x10
-4
0
-0.100x10
-0.100x10
-4
-4
0.400x10 -4-0.200x10
-4
-0.3 -0.2 -0.1 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

E/V
0.300x10
0.200x10
-4
-4
-4
-0.3 -0.2
-0.2 -0.1
-0.1
-0.3
00
0.1 0.2
0.2 0.3
0.3 0.4
0.4 0.5
0.5 0.6
0.6
0.1
E/V
Figura 24. Voltamperogramas cclicos para una disolucin de naftol 5 x 104 M en

medioDEA0.1MdepH10.0,sobreunelectrododegrafitoTefln(a)y
unelectrododeAucolgrafitoTefln(b)adiferentesvelocidadesdebarrido,
5,20,50,100,200,300mV/s.
Como puede observarse, el potencial de pico aumenta ligeramente a

medida que aumenta la velocidad de barrido de potencial sobre ambos
148

electrodos. Adems, sobre el electrodo modificado con nanopartculas de oro

los picos de oxidacin del naftol son ms estrechos y aparecen a potenciales
menospositivosqueenausenciadelnanomaterial,loqueseatribuyealefecto
cataltico que ejercen las nanopartculas de oro en la oxidacin del compuesto
fenlico.
Asimismo, se aprecia un aumento de la intensidad de pico con la
velocidad de barrido, siendo superior para el electrodo de grafitoTefln
modificadoconnanopartculasdeoro,atribuibleigualmentealefectocataltico
queejercenlasnanopartculasdelmetal.
En la Figura 25 se muestran las representaciones del logaritmo de la
intensidad de pico frente al logaritmo de la velocidad de barrido para ambas
superficieselectrdicas,observndoseunajustelinealenamboscasos.Cuando
seempleunelectrododegrafitoTeflnmodificadoconnanopartculasdeoro
la pendiente de la recta obtenida fue de 0.67, lo que indica que se trata de un
sistemaquenoesttotalmentecontroladopordifusin,sinoquepresentauna
ciertacomponentecataltica.Porotrolado,cuandosetrabajconunelectrodo
degrafitoTeflnseobtuvounvalordelapendientedelarectamuyprximaa
0.5,loqueindicaqueenestecasoelprocesosestcontroladopordifusin.
149

-6.0
log ip= 0.6723 log v- 4.4032

R2 = 0.9867
log ip
-5.5
-5.0
-4.5
-4.0
-2.5
log ip = 0.5134 log v - 4.167

R2 = 0.9982
-2.0
-1.5
log v
-1.0
-0.5
0.0
Figura 26. Representacin del logaritmo de la intensidad de corriente frente al

logaritmodelavelocidaddebarridoparaunadisolucindenaftol5x104
MempleandounelectrododegrafitoTefln()yAucolgrafitoTefln().
Otrosparmetroscalculadosempleandoestassuperficieselectrdicashan
sidoloscoeficientesdedifusindelnaftolyelcoeficientedetransferenciadecarga.
Los valores obtenidos para los coeficientesdedifusin del naftol calculados
mediantecronoamperometra(apartadoII.2.4.)son3.87x106cm2/sy2.75x106
cm2/s para los electrodos de grafito Tefln y de AucolgrafitoTefln
respectivamente. Como era de esperar, los coeficientes de difusin del naftol
obtenidos son muy similares para ambos electrodos dada la ausencia de
especies bloqueantes sobre la superficie que pudiera dificultar el acceso del
compuestofenlicoalelectrodo.
El valor de na, calculado mediante las correspondientes pendientes de
Tafel, es de 0.53 y 0.45 para el electrodo de grafitoTefln y de grafitoTefln
modificado con nanopartculas de oro, respectivamente. Estos valores,
prximos a 0.5, indican que se intercambia un nico electrn en la etapa
limitantedelavelocidad.EnelcasodelelectrododegrafitoTefln,comoyase
ha demostrado anteriormente, el proceso de transferencia electrnica est
150

controladopordifusin,porloquedichoparmetrotambinpuedecalcularsea
partirdelapendientedelarepresentacindelaintensidaddecorrientefrentea
larazcuadradadelavelocidaddebarridoapartirdeladiferenciaentrelos
potenciales de pico y semipico correspondientes a la oxidacin del naftol,
obtenindose unos valores de na de 0.49 y 0.41 por ambos mtodos
respectivamente,prximosalvalorde0.53obtenidoapartirdelapendientede
Tafel.
III.2.1.1.2. Aspectos ms relevantes del inmunosensor basado en un

electrodoAucolgrafitoTefln
El inmunosensor de progesterona desarrollado hace uso de una matriz

compsitamodificadaconnanopartculasdeoro(AucolgrafitoTefln)sobrela
que se inmoviliza directamente el anticuerpo, antiProgesterona. El empleo de
nanopartculas de oro como modificador de la superficie electrdica
proporcionaunaseriedeventajasparaeldesarrollodeestetipodedispositivos.
Porunlado,permitelainmovilizacindirectadelosanticuerpossinnecesidad
de efectuar ningn tipo de reaccin qumica, mantenindose la actividad
biolgica de la biomolcula, y por otro, el efecto cataltico que ejerce sobre la
oxidacin electroqumica del naftol permite aplicar un potencial de deteccin
menor que en ausencia de nanopartculas de oro, con lo que se minimizan
posiblesinterferencias.
Confinescomparativos,yparacorroborarlasventajasdelempleodelas
nanopartculas de oro, se prepar un inmunosensor construido de forma
anloga pero en ausencia del nanomaterial. En este caso se observ un
decrecimiento paulatino de la respuesta amperomtrica atribuido a una
deficiente inmovilizacin del anticuerpo sobre la superficie electrdica dando
lugaraunarespuestamenosestable.Estehechoponedemanifiestolaventaja
ya conocida del empleo de este nanomaterial para llevar a cabo la
151

inmovilizacin de molculas biolgicas. Adems, en ausencia de las

nanopartculas de oro se comprob que, para una misma concentracin de
progesterona, la respuesta del inmunosensor era menor, dando lugar a una
disminucinenlasensibilidad.
Encuantoalosresultadosalcanzadosconelinmunosensordesarrollado,
es importante resaltar la buena linealidad obtenida para bajas concentraciones
de progesterona y la alta sensibilidad alcanzada con respecto a otros
inmunosensores de progesterona encontrados en la bibliografa, citando como
ejemploelbasadoenelempleodeunelectrodoserigrafiadodecarbono[XuF.,
2005].Enmuchosdelosdispositivosladeterminacindeprogesteronaabajas
concentraciones se ve dificultada por el denominado efecto hook, no
pudindose apreciar diferencias en la respuesta correspondiente a bajas
concentracionesprogesterona.Porotraparte,esdedestacarquelasensibilidad
obtenida con el inmunosensor compsito presentado en este trabajo es tres
veces superior a la del inmunosensor serigrafiado. Por ltimo, la buena
repetibilidad de las medidas y la aceptable reproducibilidad en la fabricacin
del inmunosensor permite detectar pequeos cambios de concentracin de
progesteronaanivelesfisiolgicosrelacionadosconloscontrolesdefertilidad.
El inmunosensor desarrollado se ha utilizado para la determinacin de
progesterona en leche. El procedimiento experimental llevado a cabo fue
extremadamente sencillo, consistente nicamente en diluir la muestra
enriquecidaconlaconcentracindeprogesteronaadecuada,hastaunvolumen
finalde1000Lconladisolucinreguladora.Pararealizarelinmunoensayo,3
L de la muestra diluida se mezclan con 5 L de progesterona marcada con
fosfatasa alcalina y se depositan sobre la superficie del inmunosensor. Tras
dejarsecarlasuperficiedurantedoshorasatemperaturaambiente,serealizael
inmunoensayo.
152

La existencia de efecto matriz debido probablemente a la presencia de

sustancias como protenas, grasas, etc., que ensucian la superficie del
inmunosensor, hizo necesario realizar un calibrado en leche. Como era de
esperar, el intervalo de concentraciones til fue menor, de 0 a 15 ng mL1,
siendo tambin menor la pendiente del calibrado de 0.9 nA ng1 mL. No
obstante, dicho intervalo de concentracin es suficiente para determinar
progesterona en leche a las concentraciones requeridas para llevar a cabo el
seguimiento de los periodos de fertilidad de las vacas necesario para su
posteriorfecundacin.
153

III.2.1.2. INMUNOSENSOR BASADO EN UNA SUPERFICIE DE GRAFITO
TEFLN MODIFICADA CON NANOPARTCULAS DE ORO Y
TIROSINASA
Una alternativa al mtodo de deteccin de la interaccin antgeno

anticuerpodescritoanteriormenteparaladeterminacindeprogesterona,esel
empleo como transductor electroqumico de un biosensor compsito de
tirosinasa modificado con nanopartculas de oro (TirAucolgrafitoTefln). La
incorporacindedichaenzimaenlamatriztridimensionalpermitelaoxidacin
catalticadelfenolgeneradoenlareaccinenzimticadelafosfatasaalcalinaa
la
correspondiente
quinona,
cuya
reduccin
electroqumica
puede
monitorizarse sobre la superficie electrdica. Este nuevo diseo del

inmunosensor produce adems de una amplificacin de la respuesta, una
disminucindelpotencialdedeteccin.
A continuacin se comentan algunos aspectos relacionados con la
preparacin del inmunosensor, como es el seguimiento de cada una de las
etapasdemodificacindelasuperficieelectrdicamedianteespectroscopiade
impedanciaelectroqumica,ascomootrosaspectosrelevantesdesudesarrollo.
III.2.1.2.1. Caracterizacin de las superficies electrdicas mediante

espectroscopiadeimpedanciaelectroqumica
Se
registraron
los
espectros
de
impedancia
electroqumica
correspondientes a cada una de las etapas implicadas en la preparacin del

inmunosensor,ascomo loscorrespondientes a lasuperficie electrdica tras la
formacindelcomplejoantgenoanticuerpo.Asimismo,confinescomparativos
sehanobtenidolosdiagramasdeNyquistcorrespondientesalasmismasetapas
enausenciadenanopartculasdeoroenlamatrizcompsita.
En la Figura 27 se muestran los espectros de impedancia electroqumica
obtenidosparaamboscasos.
154

(a)
(b)
1000
800
800
600
600
Z '',
Z '',
1000
400
200
400
200
500
1000
1500
2000
2500
3000
Z ',
500
1000
1500
2000
2500
Z ',
Figura 27. Espectrosdeimpendaciaelectroqumicaparalosinmunosensoresdeanti

ProggrafitoTefln (a) y antiProgAucolgrafitoTefln (b). () biosensor,
() + antiprogesterona, () + BSA, () + progesterona 50 ng mL1, () +
progesteronaAP.MedidasrealizadasenmedioK3(Fe(CN)6]/K4(Fe(CN)6
5MmenKCl0.1M.
Como puede observarse, a medida que se van incorporando diferentes

biomolculas a la superficie electrdica, va aumentando el dimetro del
semicrculo que aparece en la zona de altas frecuencias del diagrama de
Nyquist. Ello se debe a una dificultad creciente en el proceso de transferencia
decargadebidoaunbloqueocadavezmayordelasuperficieelectrdica.Estas
experiencias ponen de manifiesto que se produce la inmovilizacin del
anticuerpo sobre ambas superficies electrdicas, as como la reaccin de
interaccinantgenoanticuerpoquetienelugar.
Enla Tabla16serecogenlosvaloresdelaresistenciaalatransferenciade
cargacorrespondientesalosdiagramasdeNyquistdelaFigura27.
155

Tabla16. Comparacindelaresistenciaalatransferenciadecargaenlasdiferentes
etapas de modificacin de los inmunosensores con ambas superficies
electrdicas.
Superficie
sensora
Bioelectrodos +antiprog
Rct(TirAucolGT),
(104595)
Rct(TirGT),
(150080)
+BSA
(121560) (1280110)
(1615
200)
(195070)
+Prog
50ng/mL
(1555100)
+ProgAP
(1770160)
(218590)
(243590)
Por otro lado, estos resultados confirman nuevamente que el empleo de

electrodos modificados con nanopartculas de oro favorece la transferencia
electrnica, obtenindose en todos los casos un menor valor de la Rct. Estos
resultadossoncoherentesconlosobtenidosmedianteamperometra,dondese
obtiene una importante mejora de la sensibilidad cuando se incorpora el
nanomaterialalamatriz.
III.2.1.2.2. Aspectosmsrelevantesdelinmunosensorbasadoenunelectrodo
TirAucolgrafitoTefln
El hecho de emplear el biosensor de tirosinasa como transductor para

monitorizarelectroqumicamentelareaccinantgenoanticuerpohapermitido
emplear un potencial de deteccin tan bajo como 0.1 V. Adems, se ha
demostrado que la presencia de las nanopartculas de oro en la matriz
electrdica origina un aumento de la cintica de la reaccin enzimtica de
oxidacin del compuesto fenlico, as como de la reaccin de reduccin de la
quinona sobre la superficie del electrodo, dando lugar a un aumento
considerabledelasensibilidad.
Paraeldiseodelnuevoinmunosensordeprogesteronaseoptimizaron
cada una de las etapas implicadas en su preparacin, as como las variables
156

experimentales que estn implicadas en el inmunoensayo competitivo

secuencialpropuesto.
Es de destacar la eleccin de fenilfosfato como sustrato de la fosfatasa
alcalinaenlugardenaftilfosfato,debidoaquelaoxidacindelnaftolporaccin
de la tirosinasa para dar origen a la quinona correspondiente no es favorable;
noobservndosesealdereduccinsobrelasuperficieelectrdicaparavalores
depotencialcomprendidosentre0y0.2V.
OtravariableimportanteeselpHdelmedio,yaquesuvalorinfluyede
manera decisiva en la actividad de las enzimas empleadas, as como en la
reaccinelectrdica.Adems,elpHptimodelasenzimasfosfatasaalcalinay
tirosinasanoeselmismo,siendobsicoparalaprimerayneutrooligeramente
cido para la segunda. Las medidas amperomtricas con el inmunosensor
bienzimticoadiferentespHspermitenobtenerunamayorsensibilidadapH7,
lo que sugiere que la reaccin catalizada por la enzima tirosinasa condiciona
mslarespuestadecorrienteobtenidaquelareaccindehidrlisisdelsustrato
delafosfatasaalcalina.
Al igual que para el diseo anterior del inmunosensor, se compar la
respuestaamperomtricaobtenidaconestenuevodiseo,conlaproporcionada
por un inmunosensorpreparadoenidnticas condiciones peroenausencia de
nanopartculasdeoroenlamatrizelectrdica.Enesteltimocaso,seobserv
quelainmovilizacindelanticuerpo,antiprogesterona,sobrelasuperficiedel
electrodo es menos estable, ya que la respuesta decae un 25 % hasta su
estabilizacin con respecto a la primera medida. Adems la intensidad de
corrienteesun58%menorquelaobtenidaconelinmunosensorenpresenciade
lasnanopartculasdeoro.
A modo de ejemplo en la Figura 28 se muestran los amperogramas

obtenidosparaunaconcentracinde10ngmL1deprogesteronaempleandoel
157

inmunosensor construido con de las nanopartculas de oro, as como en

ausenciadelasmismasunavezalcanzadalaestabilizacindelaseal.
0.25 A
(a)
(b)
Figura 28.Amperogramas obtenidos para una concentracin de 10 ng mL1 de

Progesterona empleando como transductores un biosensor de Tirgrafito
Tefln(a)yunbiosensorTirAucolgrafitoTefln(b).
Por otra parte, los grficos de control construidos para ambos

inmunosensores (Fig. 29) muestran como el tiempo de vida til es mayor
cuandoeltransductoreselbiosensormodificadoconelnanomaterial.
i, A
i, A
3.5
2.0
+ 3
1.5
1.0
0.5
+ 3
2.5
1.5
0.5
0.0
0
10
12 Das
12
16
Das
20
Figura 29.Grficosdecontrolparalosinmunosensoresconstruidosempleandocomo
transductores un biosensor de (a) Tir GT y (b) Tir AucolGT, para la
determinacindeprogesterona10ngmL1enmedioTRIS0.1MdepH7.0
yMgCl21mM.Eap=0.1V
158

Elinmunosensordesarrolladopermitelaobtencindecalibradoslineales
hastaunaconcentracinde50ngmL1, siendoellmitededeteccinde0.43ng
mL1.
En cuanto a su aplicabilidad, hay que destacar que el inmunosensor
desarrollado ha permitido llevar a cabo la determinacin de progesterona en
muestras de leche entera sin necesidad de realizar ningn pretratamiento a la
muestra. La existencia de efecto matriz hace necesario realizar un calibrado
paraprogesteronaempleandolechecomomatriz.
Es de destacar, la buena linealidad obtenida para bajas concentraciones
de progesterona, a diferencia de los resultados obtenidos empleando otros
diseosdelinmunosensorencontradosenlabibliografa,loscuales,presentan
unacurvaturaabajasconcentraciones(efectohook)[XuY.F.,2005].Asimismo
cabe resaltar el aumento de sensibilidad observado respecto del mismo
dispositivoenausenciadenanopartculasdelmetal.
III.2.1.3. COMPARACIN DE LOS INMUNOSENSORES BASADOS EN UNA
SUPERFICIE ELECTRDICA AucolGRAFITOTEFLN Y TirAucolGRAFITO
TEFLN
En esta Memoria se han preparado dos inmunosensores que hacen uso

de una matriz compsita de grafitoTefln modificada con oro coloidal como
transductor electroqumico para la determinacin de progesterona. Los
resultados demuestran que ambos diseos resultan adecuados para la
determinacin de esta hormona en leche. Como ya se ha comentado, la
incorporacin de las nanopartculas metlicas a la matriz electrdica
proporciona notables ventajas resultantes en aumento de la sensibilidad,
menores lmites de deteccin, as como en la obtencin de una superficie
adecuada para la inmovilizacin de biomolculas sin prdidas de su
bioactividad.
159

En cuanto al segundo inmunosensor desarrollado, destacar que la

incorporacin de Tirosinasa a la matriz compsita ha dado lugar a un nuevo
diseo de inmunosensor con una mayor sensibilidad y mejores lmites de
deteccin. Adems, el potencial de deteccin disminuye de +0.3 V a 0.1V, lo
queconduceaunaumentodelaselectividadenladeterminacin.
A modo de comparacin se recogen en la Tabla 18 las caractersticas
analticasobtenidasparaambosinmunosensores.
Tabla18. Comparacindelascaractersticasanalticasdeambosbiosensoresparala
determinacindeprogesterona.
Inmunosensor
antiprogTirAucolGT antiprogAucolGT
Intervalolineal,ng/mL
040
050
Sensibilidad,nAmL/ng
(82.30.4)
(1.1970.008)
Coeficientedecorrelacin
0.995
0.98
Lmitededeteccin,ng/mL
0.37
0.84
Como puede observarse, el empleo del biosensor como transductor

amperomtricoproduceunaumentodelasensibilidaddeaproximadamenteun
80%,ascomounadisminucindellmitededeteccinobtenido,de0.84ngmL
1
enausenciadetirosinasa,a0.37ngmL1enpresenciadelamisma.
160

III.2.2. INMUNOSENSOR COMPSITO PARA LA DETERMINACIN DE
INMUNOGLOBULINAG
ElempleodematricescompsitasdegrafitoTeflnmodificadasconoro
coloidal y tirosinasa, ha demostrado ser una herramienta muy til para el
desarrollo de inmunosensores, reuniendo las propiedades idneas para la
monitorizacindelareaccinantgenoanticuerpo.Entreellascabedestacar,la
capacidad de mantener la actividad biolgica de las biomolculas
inmovilizadas,ascomofacilitarlossitiosdebiorreconocimientodemaneraque
lasuperficieproporcioneunreconocimientorpidoyeficaz.
Este hecho se ha aprovechado para llevar a cabo el desarrollo de un
inmunosensor basado en un ensayo tipo sndwich para la determinacin de
inmunoglobulinaGhabindoseaplicadoaladeterminacindedichoanalitoen
suero.Laimportanciadeladeterminacindeestetipodeinmunoglobulinasse
debe, por un lado, a que se trata de la nica inmunoglobulina capaz de
atravesar la placenta y, por otro, a que las reacciones alrgicas que no se
manifiestandemanerainmediatatraslaingestadelalimento,sonmediadaspor
estainmunoglobulina.
Acontinuacinsecomentan los aspectosms relevantes del inmunosensor
desarrollado.
III.2.2.1.
Aspectos ms relevantes del inmunosensor basado en un

biosensorTirAucolgrafitoTeflncomotransductor
Elempleodelbiosensorcompsitomodificadoconnanopartculasdeoro
paraladeterminacindeinmunoglobulinaGpresentaexcelentescaractersticas
analticas, en cuanto a sensibilidad y estabilidad, comparado con otros
inmunosensoresencontradosenlabibliografa.
161

Por un lado, la presencia del nanomaterial permite una inmovilizacin

ms eficiente las molculas biolgicas, manteniendo su bioactividad, y por
otro, la incorporacin de la tirosinasa en la matriz compsita permite llevar a
cabo la deteccin amperomtrica a un valor del potencial de 0.1 V para la
determinacin de la inmunoglobulina, lo que implica minimizar posibles
interferenciaselectroqumicas.
LamodificacindelasuperficieelectrdicaconProtenaAconstituyeuna
etapacrucialeneldesarrollodelinmunosensor,yaqueestaprotenaposeeuna
alta afinidad por los aminocidos de la regin Fc de las inmunoglobulinas,
consiguindose, de este modo, una perfecta orientacin del anticuerpo
facilitando posteriormente el inmunoensayo. La unin de la protena A con la
reginFcdelainmunoglobulinaimplicalaformacindeenlacesnocovalentes,
tales como puentes de hidrgeno, interacciones electrostticas, interacciones
hidrofbicas y fuerzas de Van der Waals. Estos enlaces son dbiles si se
consideran por separado, sin embargo la totalidad de las interacciones
producen una energa de unin que equivale o supera a un enlace covalente.
Esta protena ha sido empleada en otras configuraciones electrdicas
encontradas en la bibliografa para la inmovilizacin de inmunoglobulinas,
consiguindose igualmente una perfecta orientacin del anticuerpo [Zacco,
2004].
En este caso el inmunoensayo realizado es de tipo sndwich, donde el
primer anticuerpo (antiinmunoglobulina G) se inmoviliza sobre la superficie
slida previamente modificada con protena A. El anticuerpo secundario,
conjugadoconlafosfatasaalcalina,seunealantgeno(inmunoglobulinaG)tras
una etapa de incubacin, quedando el analito, de este modo, entre los dos
anticuerpos. A la hora de llevara cabo el inmunoensayo es necesario tener en
cuentaqueambosanticuerposhandeestarenexceso;elprimerodeellospara
162

permitir una adsorcin completa del antgeno y el segundo, para asegurar la

marcacincompletadelinmunocomplejo.
Mediante espectroscopia de impedancia electroqumica se realiz un
seguimiento del desarrollo del inmunosensor, as como del inmunoensayo,
observndoseunaumentodelaresistenciaalatransferenciadecargaamedida
quesevamodificandolasuperficieelectrdicacomoconsecuenciadeunmayor
bloqueodelamisma.
Con fines comparativos se llevo a cabo la preparacin de otro
inmunosensor de inmunoglobulina G, siguiendo el mismo procedimiento
experimental,perosinutilizarprotenaA.Enestecaso,ycomoeradeesperar,
se obtuvieron peores resultados que con el inmunosensor diseado con
protena A ya que no se consigue la orientacin adecuada de la anti
inmunoglobulina, dificultndose la posterior interaccin antgenoanticuerpo.
As, se obtuvo una desviacin estndar relativa del 14.3% (n=5) para las
medidas realizadas con inmunosensores sin protena A, mientras que en
presenciadedichaprotenaelvalordeRSDfuedel4.8%(n=5),loqueponede
manifiesto una mayor reproducibilidad con los inmunosensores construidos
conelectrodosmodificadosconprotenaA.
Deformaanloga,sepreparuninmunosensorsinnanopartculasdeoro,
comprobndose como la presencia del oro coloidal permite una mejor
inmovilizacin del material proteico, obtenindose, adems de mejores
caractersticas analticas, una mayor estabilidad del inmunosensor. En la Tabla
19semuestranlosresultadosobtenidosconambasconfiguraciones.
163

Tabla19. Comparacindelascaractersticasanalticasdeambosbiosensoresparala
determinacindeinmunoglobulinaG.
antiIgGTirAucolGT antiIgGTirGT
Intervalolineal,ng/mL
5100
1065
Sensibilidad,nAmL/ng
(11.80.5)
(4.60.4)
Coeficientedecorrelacin
0.992
0.990
Lmitededeteccin,ng/mL
2.6
4.1
Tiempodevidatil,das
16
5
Inmunosensor
Por tanto,seempleel biosensorTirAucolgrafitoTeflncomo superficie

electrdicaparaeldesarrollodelinmunosensor,modificndosedichasuperficie
con protena A para la posterior inmovilizacin del anticuerpo. Una vez
realizadoelinmunoensayosellevacaboladeterminacindeIgGenmuestras
de suero previamente enriquecidas, as como en una muestra de suero
certificadasiguiendolosprocedimientosdescritosenelapartadoII.4.3.
EncuantoaladeterminacindeIgGenmuestrasdesuerocertificadofue
necesario llevar a cabo una dilucin 1:1000 de la muestra, debido al alto
contenido deinmunoglobulina presente en el suero(3118 mg dL1 deIgG). En
amboscasosseobtuvieronresultadossatisfactorios,obtenindoseenelcasodel
suero enriquecido una recuperacin de (104 6) % y del (1033) % para la
muestracertificada.
164
PUBLICACIONES
Development of a tyrosinase biosensor based on

gold nanoparticles-modified glassy carbon
electrodes. Application to the measurement of a
bioelectrochemical polyphenols index in wines
V. Carralero, M.L. Mena, A. Gonzalez-Corts, P. Yez-Sedeo and J.M. Pingarrn
AnalyticaChimicaActa
528,18(2005)

169

170

171

172

173

174

175

176
Development of a high analytical performancetyrosinase biosensor based on a composite

graphite-Teflon electrode modified with gold
nanoparticles
V. Carralero, M.L. Mena, A. Gonzalez-Corts, P. Yez-Sedeo and J.M. Pingarrn
BiosensorsBioelectronics
22,730736(2006)
179
180
181
182
183
184
185
Bioelectrochemical evaluation of the total phenols

content in olive oil mill wastewaters using a
tyrosinase-colloidal gold-graphite-Teflon biosensor
M.L. Mena, V. Carralero, A. Gonzlez-Corts, P. Yez-Sedeo and J. M. Pingarrn
EnvironmentalAnalytical
Chemistry
87,5765(2007)
189
190
191
192
193
194
195
196
197
Development of a Progesterone Immunosensor

Based on a Colloidal Gold-Graphite-Teflon
Composite Electrode
V. Carralero, A. Gonzlez-Corts, P. Yez-Sedeo and J. M. Pingarrn
Electroanalysis
19,853858(2007)
201
202
203
204
205
206
Nanostructured progesterone immunosensor using

a tyrosinase-colloidal gold-graphite-Teflon
biosensor as amperometric transducter
V. Carralero, A. Gonzalez-Corts, P. Yez-Sedeo and J.M. Pingarrn
AnalyticaChimicaActa
596,8691(2007)
209
210
211
212
213
214
Amperometric IgG Immunosensor using

Tyrosinase-colloidal gold-Graphite-Teflon
biosensor as transducer
V. Carralero, A. Gonzalez-Corts, P. Yez-Sedeo and J.M. Pingarrn
AnalyticalLetters
41,244259(2008)

217

218

219

220

221

222

223

224

225

226

227

228

229

230

231

232
CONCLUSIONES

Conclusiones
ApartirdelosresultadosobtenidosydescritosenlaMemoriadeestaTesis
Doctoralsehallegadoalassiguientesconclusiones:
1. Elempleodesuperficieselectrdicasmodificadasconnanopartculasdeoro
permite desarrollar biosensores electroqumicos con mejores caractersticas
analticas que en ausencia de las mismas. Los procedimientos de inmovilizacin
de las nanopartculas bien por electrodeposicin (electrodo de carbono
vitrificado), bien por incorporacin del oro coloidal en la matriz compsita
(electrodo grafitoTefln), han permitido llevar a cabo la modificacin de
diferenteselectrodosdeunaformarpidayreproducible,obtenindoseeltamao
delasnanopartculasdeseado.
2. Lacombinacindelasventajasdeutilizarunamatrizcompsitadegrafito
Teflnparalainmovilizacindeenzimasylaincorporacindelasnanopartculas
de oro en dicha matriz, ha permitido desarrollar un biosensor de tirosinasa con
excelentescaractersticasanalticas,mejorandoloslmitesdedeteccinalcanzados
con otras configuraciones descritas en la literatura. Se ha comprobado que la
presenciadeorocoloidal,aumentatantolacinticadelareaccinimplicadaenel
procesodereconocimientobioqumicocomoladelareaccinbasedelprocesode
transduccin electroqumica, consiguindose una gran sensibilidad en la
deteccindecompuestosfenlicos.Adems,lafcilregeneracindelasuperficie
sensoramediantesimplepulido,juntoconlacapacidaddelasnanopartculasde
oro de retener la actividad biolgica de las protenas, ha permitido construir un
biosensorreutilizableyreproducibleconunagranestabilidadeneltiempo.
3. Las inherentes propiedades ventajosas de los electrodos de grafitoTefln
modificados con oro coloidal fueron aprovechados para el desarrollo de
diferentes inmunosensores electroqumicos novedosos. El inmunosensor de
progesteronabasadoenlainmovilizacindeantiprogesteronasobrelasuperficie
235

Conclusiones
de grafitoTefln nanoestructurada, ha ofrecido importantes ventajas analticas

con respecto a otros inmunosensores encontrados en la bibliografa. De este
modo, se consigui mejorar tanto el rango de linealidad como la sensibilidad
obtenida para la determinacin de progesterona. La utilizacin de un biosensor
compsitodetirosinasamodificadoconnanopartculasdeorocomotransductor
amperomtricodelareaccindeafinidad,hapermitidodisminuirelpotencialde
deteccin para la determinacin de progesterona, aumentando an ms la
sensibilidad y mejorando los lmites de deteccin alcanzados para la
determinacindedichoanalito.Adems,labuenarepetibilidaddelasmedidasy
la aceptable reproducibilidad alcanzada en su fabricacin hace de estos
inmunosensores una perfecta herramienta para llevar a cabo la deteccin de
cambiosenlaconcentracindeprogesteronaanivelesfisiolgicosdeinterspara
estudiosdefertilidadenlasvacas.Porotraparte,elempleodeestebiosensorpara
desarrollar un inmunosensor de inmunoglobulina G ha permitido alcanzar una
gransensibilidadyestabilidadcomparadoconotrosinmunosensoresreportados
en la bibliografa. La incorporacin de las nanopartculas de oro ha demostrado
unavezmssuadecuacinparainmovilizarbiomolculasdeformaeficiente,as
como su capacidad para producir una amplificacin de la respuesta
amperomtrica.
4. Todos los resultados obtenidos demuestran la utilidad analtica y la
versatilidad de los biosensores desarrollados. Los valores de las desviaciones
estndar relativas, tanto para la repetibilidad de las medidas como para la
reproducibilidadentredistintosbiosensores,hanresultadoserentodosloscasos
inferiores al 10%, lo que demuestra la fiabilidad del proceso de fabricacin de
cadaunodelosbiosensoresenzimticoseinmunosensores.
5. Finalmente,losbiosensoresdesarrolladossehanaplicadoaladeterminacin
delosanalitoscorrespondientesenmuestrasrealesoenmuestrasenriquecidasa
236

Conclusiones
niveles de concentracin de inters. As, por lo que respecta a los biosensores

enzimticos,sehallevadoacabolaestimacindelcontenidototaldepolifenoles
en vinos y de compuestos fenlicos en aguas procedentes de una refinera y en
muestras de alpechn. Los resultados obtenidos se compararon con los
proporcionados por otras tcnicas habitualmente empleadas para tales fines,
obtenindoseunabuenacorrelacinentrelasdistintasmetodologas.
6. Con respecto a los inmunosensores, se ha determinado el contenido de
progesteronaenmuestrasdelecheenriquecidas,ascomodeinmunoglobulinaG
en sueros. Los estudios de recuperacin realizados en muestras enriquecidas,
resultaron muy satisfactorios, siendo dichos porcentajes de recuperacin
prximos al 100% en todos los casos. De esta forma, ha quedado demostrado la
aplicabilidad de estos biosensores para la determinacin de los analitos en
muestras reales, proporcionando una serie de ventajas como son la rapidez de
respuesta,el bajo coste, facilidad de la fabricacin y conservacin, minimizacin
del nmero de interferencias, as como la posibilidad de miniaturizacin,
pudindose realizar medidas rpidas e in situ, a diferencia de otras tcnicas
analticas que requieren un mayor tiempo de anlisis, un mayor coste y un
pretratamientodelamuestra.
237
BIBLIOGRAFA
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GLOSARIO DE
ABREVIATURAS
Glosariodeabreviaturas
4AMPh:4Aminotiofenol
Ab:Anticuerpo
AChE:Acetilcolinesterasa
ACN:Acetonitrilo
ADH:Alcoholdeshidrogenasa
AET:Mercaptoetilamina
AFB1:AflatoxinaB1
AFP:1Fetoprotena
Ag:Antgeno
AntiAFP:Antifetoprotena
AntiCEA:Anticuerpocarcinoembrinico
AntihCG:antihumanchorionicgonadotrophin
AP:Fosfatasaalcalina
APTS:3Aminopropiltrietoxisilano
ASV:Voltamperometradestrippingandico
Aucol:Orocoloidal
B:Boro
BSA:Suerodealbminabovino
CA125:Carcinomaantigeno125
CA153:Marcadortumoraldelcncermamario
Cdl:Capacidaddeladoblecapa
CE:ComunidadEuropea
CEA:Antgenocarcinoembrinico
CitC:CitocromoC
CNT:Nanotubodecarbono
CPE:Elementodefaseconstante
CV:Voltamperometracclica
261
DA:cidodomoico
DHB:Dihidroxibenceno
DMG:Dimetilformamida
DMP:Dimetilfenol
DOPAC:3,4Dihidroxifenilactico
DPV:Voltamperometradiferencialdeimpulsos
DTSP:33`Ditiobis(cidopropionicoNhidroxisuccinimidaester)
EDC:1Etil3(dimetilaminopropil)carbodimida
EIS:Espectroscopiadeimpedanciaelectroqumica
EPA:AgenciadeProteccinAmbientalNorteamericana
EPD:Etilenpropilendieno
GA:Glutaraldehdo
GCE:Electrododecarbonovitrificado
GCPE:Electrodopastadecarbonovitrificado
GDH:Glucosadeshidrogenasa
GOx:Glucosaoxidasa
GT:GrafitoTefln
H.pyIgG:HelicobacterPylori
HbsAg:AntgenodelahepatitisB
HDT:1,6Hexanoditiol
HRP:Peroxidasaderbano
Hx:Hipoxantina
IgG:InmunoglobulinaG
ITO:xidodetitanioeindio
K:Constantedetransferenciaelectrnica
LBL:Layerbylayer
LD:Lmitededeteccin
LDL:Lipoprotenasdebajadensidad.
262
lgpfuml1:Logaritmodeunidadesformadorasdeplacas.(plaqueforming
unit)
LSV:Voltamperometradebarridolineal
mAb:InmunoglobulinaGderatn
MP11:Microperoxidasa
MPTS:Mercaptopropiltrietoxisilano.
nAu:Nanopartculasdeoro
Nf:Nafion
NHS:NHidroxisulfoxinimida
ODT:1Octanodecanotiol
PANAM:Poliamidoamina
PBS:Disolucinreguladorafosfato
PEDOT.3,4Etilenditioxitiofeno
PLY:Pneumolisina
PSA:Antgenoespecficodelaprostata
pSf:Polisulfona
PVB:Polivinilbutiral
PVS:cidopolivinilsulfnico
QMC:Microbalanzacristaldecuarzo
RBC:Redbloodcellsofcruciancarp
Rct:Resistenciaalatransferenciadecarga
rIgG:InmunoglobulinaGdeconejo
Rs:Resistenciadeladisolucin
RVC:Carbonovtreoreticulado
SAMs:Monocapasautoensambladas
ScreenPrinted:Electrodosserigrafiados
SEM:Microscopiaelectrnicadebarrido
SH:Salicilatohidroxilasa
263
SjAb:AnticuerpodeSchistosomajaponicum
SPE:Electrodosdescreenprinted
SWV:Voltamperometradeondacuadrada
TAC:Triacetatodecelulosa
TB:AzuldeToluidina
Thi:Tionina
Tir:Tirosinasa
TMB:Tetratiafulvaleno
XOD:Xantinaoxidasa
Zw:ImpedanciadeWarburg
264

Preparacion de Biosensores Enzimaticos e Inmunosensores Basados en Elctrodos Modificados Con Nanoparticulas de Oro

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

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reproducibles, estables y muy sensibles. As, Wu y colaboradores prepararon

biosensor con excelente respuesta electrocataltica hacia la glucosa, que

Reg. Fosfato 0.1 M, pH 6.8

Adsorc. de GOx sobre

Reg. Fosfato 0.1 M, pH 7.0

Inmov. covalente de GOx

Inmov. nAu y GOx sobre

Inmov. covalente de GOx

Reg. fosfato 0.1M pH 7.4

Tcnica LBL para prep.

Inter. Lineal: 1.0x10 -1.3x10 M

Inter. lineal: 0.005 - 2.4 mM

Inter. Lineal: < 9.9 mM

[Liu Y., 2007]

Inter. Lineal: < 1.5 mM

Inter. lineal : Hasta 1.5 mM

Inter. lineal : 0.01 10 Mm

Reg. fosfato 0.05 M pH 7.4

Repetib.: 8.3% (RSD)

Inter. lineal : 1.0x10-6 - 1.6x10-3 M

Inter. Lineal: 1.0x10-6-8.0x10-4 M

Incorp. de GOx y Au col.

Inmov. de GOx sobre Au

Inmov. de GOx sobre

Reg. fosfato 0.1 M pH 6.8

Inmov. de HRP sobre

Inmov. de HRP sobre

Inter. Lineal: < 22.0 mM

Inter. Lineal: < 36 mM

Inter. Lineal: 0.5-32 mM

Inter. lineal: 0.008 - 15 mM

Inter. lineal: 0.0014 - 2.8 mM

Inter. lineal: 0.39 M-0.33 mM

Inter. Linel : 0.04-0.28 mM

Inter. Lineal: 8.0 M-7.0 mM

[Xu S., 2006]

Inter. lineal: 5 M-10 mM

Cronoamper. RSD: 2.2% (n=5)

Inter. lineal: 0.05-30.6 mM