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UNIVERSIDAD CENTROAMERICANA

FACULTAD DE CIENCIA, TECNOLOGA Y AMBIENTE

Determinacin y cuantificacin mediante HPLC de los cidos


carboxlicos del muclago de Coffea arabica a diferentes pH
durante la etapa de fermentacin

Tesis para obtener el Ttulo de Ingeniero en Calidad Ambiental

AUTOR: Roberto Rivas Hermann

Tutor: MSc. Carlos Vallejos


Asesora: Dra. Susan Jackels

Managua, Nicaragua
Septiembre, 2006

CONTENIDO
RESUMEN/ ABSTRAC
1

INTRODUCCIN

OBJETIVOS

MARCO TERICO

MARCO METODOLOGICO

RESULTADOS

DISCUSIN

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFA

10 ANEXOS

ndice de tablas
TABLA 1 .COMPOSICIN QUMICA DEL CAF VERDE
TABLA 2 - COMPARACIONES ENTRE DISTINTOS TIPOS DE DETECTORES
TABLA 3 - MONTAJE EXPERIMENTAL
TABLA 4 - VARIABLES E INDICADORES
TABLA 5 - IDENTIDAD DE LOTE PROCESADO, FECHA DE RECOLECCIN DE MUESTRA Y FECHA DE
CONCLUSIN DEL EXPERIMENTO

TABLA 6 - MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS DURANTE LA FASE DE LABORATORIO (ETAPA DE EXTRACCIN


DE CIDOS CARBOXLICOS Y DE MONITOREO RPIDO CON REFLECTOQUANT)

TABLA 7 - CONDICIONES DE ANLISIS CROMATOGRFICO


TABLA 8 - CARACTERSTICAS DE LOS CIDOS CARBOXLICOS UTILIZADOS COMO ESTNDARES
TABLA 9 - CONDICIONES DE ANLISIS CROMATOGRFICO PARA EL ANLISIS CUALITATIVO (TIEMPOS Y ORDEN
DE ELUSIN DE CIDOS CARBOXLICOS)

TABLA 10 - MUESTRAS CON QUE SE REALIZ EL ANLISIS CUALITATIVO


TABLA 11 - MUESTRAS UTILIZADAS PARA EL ANLISIS CON HPLC
TABLA 12 - INSTRUMENTO PARA LA RECOLECCIN DE DATOS
TABLA 13 - ORDEN DE ELUSIN DE CIDOS CARBOXLICOS, ANLISIS CUALITATIVO
TABLA 14 - PICOS EN LOS CROMATOGRAMAS Y CIDOS CARBOXLICOS A LOS QUE CORRESPONDEN
TABLA 15 - TIEMPOS DE RETENCIN PARA LOS CIDOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIN DE LA CURVA DE
CALIBRACIN

TABLA 16 - CONDICIONES DE DILUCIN DE ESTNDARES PARA LA ELABORACIN DE LA CURVA DE


CALIBRACIN

TABLA 17 - LMITES DE DETECCIN DEL MTODO PARA CADA CIDO


TABLA 18 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA CIDO GALACTURNICO
TABLA 19 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA CIDO FRMICO
TABLA 20 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA CIDO MLICO
TABLA 21 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA CIDO ACTICO
TABLA 22 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA CIDO CTRICO
TABLA 23 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA CIDO PROPINICO
TABLA 24 - TABLA DE DATOS PARA ANLISIS ESTADSTICO ENTRE GRUPOS, CIDO GALACTURNICO
TABLA 25 - TABLA DE DATOS PARA ANLISIS ESTADSTICO ENTRE GRUPOS, CIDO FRMICO
TABLA 26- TABLA DE DATOS PARA ANLISIS ESTADSTICO ENTRE GRUPOS, CIDO MLICO
TABLA 27- TABLA DE DATOS PARA ANLISIS ESTADSTICO ENTRE GRUPOS, CIDO ACTICO
TABLA 28- TABLA DE DATOS PARA ANLISIS ESTADSTICO ENTRE GRUPOS, CIDO CTRICO
TABLA 29- TABLA DE DATOS PARA ANLISIS ESTADSTICO ENTRE GRUPOS, CIDO PROPINICO

TABLA 30 - PRUEBAS DE NORMALIDAD PARA LOS DATOS DE COMPARACIONES ENTRE GRUPOS DE PH


(CONFIGURACIN ANOVA 1 VA)
TABLA 31 - PRUEBA DE LEVENE PARA MUESTRAS A LAS QUE SE REALIZARA LA PRUEBA ANOVA
TABLA 32 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE UNA VA
TABLA 33- RESULTADOS DE LA PRUEBA KRUSKALL WALLIS PARA CIDO MLICO Y PROPINICO
TABLA 34 - PRUEBA DE LA MEDIANA
TABLA 35- DATOS PARA ANLISIS ESTADSTICO ENTRE GRUPOS Y ENTRE EXPERIMENTOS (ANOVA 2 VAS)
TABLA 36 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE 2 VAS
TABLA 37 - DATOS DE REFLECTOQUANT PARA EL ANLISIS ESTADSTICO ENTRE GRUPOS
TABLA 38 - PRUEBAS DE NORMALIDAD PARA LOS DATOS DE COMPARACIONES ENTRE GRUPOS DE PH
(CONFIGURACIN ANOVA UNA VA)
TABLA 39 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE UNA VA PARA DATOS DE REFLECTOQUANT
TABLA 40 - PRUEBA DE CONTRASTES PARA ANOVA UNA VA, DATOS DE REFLECTOQUANT
TABLA 41 - DATOS DE REFLECTOQUANT PARA EL ANLISIS ESTADSTICO ANOVA DOS VAS, . MLICO Y .
LCTICO

TABLA 42 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE 2 VAS PARA RESULTADOS DE REFLECTOQUANT


TABLA 43- LISTA DE ARCHIVOS DE CROMATOGRAMAS DE MUESTRAS Y EL PATRN INTERNO QUE SE
UTILIZARON PARA DETERMINAR LOS RDENES DE ELUSIN

TABLA 44 - LISTA DE ARCHIVOS CROMATOGRAMAS UTILIZADOS PARA LA ELABORACIN DE LA CURVA DE


CALIBRACIN

TABLA 45- MATRIZ DE CONCENTRACIONES DETERMINADAS PARA LOS CIDOS MLICO Y LCTICO MEDIANTE
REFLECTOQUANT

ndice de figuras
FIGURA 1 - SECCIN LONGITUDINAL DEL CAF CEREZO
FIGURA 2 - CONSTITUCIN DEL TEJIDO DE PERICARPIO DE COFFEA ARABICA VAR. TYPICA CRAMER.
EXAMINACIN POR MICROSCOPA LUEGO DE FERMENTACIN (20 H)
FIGURA 3 - DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESAMIENTO DE CAF POR LA VA HMEDA
FIGURA 4 ESTRUCTURA DEL MUCLAGO Y DEL PERGAMINO ANTES DE LA FERMENTACIN
FIGURA 5 - COMPORTAMIENTO DEL PH EN FUNCIN DEL TIEMPO DE FERMENTACIN
FIGURA 6 - CROMATOGRAFA DE ELUSIN
FIGURA 7 - COMPONENTES DEL SISTEMA DE HPLC
FIGURA 8 - DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO EXPERIMENTAL, FINCA LA CANAVALIA
FIGURA 9 - SEPARACIN DE GRANOS DE CAF DE ACUERDO A SU ESTADO DE MADUREZ
FIGURA 10 - RECIPIENTES DE FERMENTACIN DEL CAF
FIGURA 11 HOJAS DE DATOS UTILIZADAS PARA EL CONTROL EXPERIMENTAL DE LOTES DE CAF EN LA FASE
EXPERIMENTAL

FIGURA 12- DIAGRAMA DE FLUJO DE LA FASE DE LABORATORIO


FIGURA 13- MDULOS DEL SISTEMA HPLC UTILIZADOS EN LA PRESENTE INVESTIGACIN
FIGURA 14 - CIDO PIRAZINCARBOXLICO (PATRN INTERNO)
FIGURA 15 - CURVA DE CALIBRACIN PARA EL ANLISIS POR EL MTODO DEL PATRN INTERNO
FIGURA 16 - DEFINICIONES DEL LMITE DE DETECCIN DEL MTODO (MDL)
FIGURA 17 - CURVA DE CALIBRACIN PARA CIDO GALACTURNICO
FIGURA 18 - CURVA DE CALIBRACIN PARA CIDO FRMICO
FIGURA 19 - CURVA DE CALIBRACIN PARA CIDO MLICO
FIGURA 20 - CURVA DE CALIBRACIN PARA CIDO LCTICO
FIGURA 21 - CURVA DE CALIBRACIN PARA CIDO ACTICO
FIGURA 22 - CURVA DE CALIBRACIN PARA CIDO CTRICO
FIGURA 23 - CURVA DE CALIBRACIN PARA EL CIDO PROPINICO
FIGURA 24 - GRFICOS CAJAS DE PUNTOS O BOXPLOTS PARA DETERMINAR PUNTOS ABERRANTES DENTRO
DE LOS DATOS DE CADA GRUPO PARA CADA CIDO

FIGURA 25 - COMPORTAMIENTO DE LAS CONCENTRACIONES DE CIDO MLICO Y CIDO LCTICO A MEDIDA


QUE AVANZA EL PROCESO DE FERMENTACIN, DATOS DE REFLECTOQUANT

FIGURA 26- COMPORTAMIENTO DE LAS CONCENTRACIONES PROMEDIO DE LOS CIDOS ANALIZADOS EN


DEPENDENCIA DEL PH

FIGURA 27 -CONCENTRACIONES DE CIDOS ORGNICOS CONFORME AVANZA EL PROCESO FERMENTATIVO


FIGURA 28 - GRFICOS DE CAJAS BOXPLOTS, ANLISIS ANOVA 2 VAS ENTRE EXPERIMENTOS

FIGURA 29 - GRFICA Y TABLA CON EL COEFICIENTE DE CORRELACIN PARA CIDO MLICO, TCNICA DEL
REFLECTOQUANT Y HPLC

FIGURA 30 - CONCENTRACIONES DE CIDO LCTICO A MEDIDA QUE DISMINUYE EL PH EN QUE SE


INTERRUMPE LA FERMENTACIN

FIGURA 31 - GRFICA Y TABLA CON EL COEFICIENTE DE CORRELACIN PARA CIDO LCTICO. FASE
EXPERIMENTAL Y FASE DE LABORATORIO

FIGURA 32 - GRFICA Y TABLA DE CORRELACIN (PEARSON) PARA LOS DATOS DE PH MEDIDOS EN LA FASE
EXPERIMENTAL CON EL SISTEMA REFLECTOQUANT Y CON CINTAS INDICADORAS

FIGURA 33- GRFICA Y TABLA DE CORRELACIN (PEARSON) ENTRE LAS MEDICIONES DE PH, FASE
EXPERIMENTAL Y FASE DE LABORATORIO

FIGURA 34 - LOCALIZACIN DE LA FINCA LA CANAVALIA


FIGURA 35- MAPA DE USO DEL SUELO EN LA FINCA LA CANAVALIA.

Dedicatoria

A mis padres Geovannie y Abelardo por el apoyo incondicional durante todos


estos aos

Agradecimientos

Esta investigacin no hubiera sido posible sin la motivacin de los profesores


Susan Jackels (Seattle University) y Charles Jackels (University of Washington)
quienes iniciaron el proyecto solidario Caf para la justicia - Coffee for Justice.
Agradezco al Profesor Carlos Vallejos (Universidad Centroamericana) por el
asesoramiento y el trabajo conjunto durante toda la investigacin.
Todas las personas con quienes trabaj en esta larga tarea: el personal de la finca
La Canavalia - ADDAC y al personal de Seattle University.
A la Facultad de Ciencia, Tecnologa y Ambiente (Universidad Centroamericana)
por mantener lazos de intercambio con Universidades hermanas, lo cual permite y
permitir que otros estudiantes participen en proyectos como ste.

Resumen/ Abstract

En la fermentacin del caf (Coffea arabica) procesado por va hmeda, la


degradacin por parte de la microflora (bacterias y levaduras principalmente) de
azcares constituyentes del muclago va acompaada de un aumento progresivo
de cidos carboxlicos y por consiguiente de una cada del pH. Estos cidos se
han relacionado con la aparicin por un lado de "malos sabores" o por otro lado de
"notas de sabor" en las muestras catadas profesionalmente. Para conocer la
influencia que tendra la interrupcin de la fermentacin a diferentes pH en las
concentraciones de dichos cidos se realizaron tratamientos a muestras de Coffea
arabica, variedad caturra, recolectadas y procesadas en la finca La Canavalia
(San Ramn, Matagalpa) durante la temporada 2005-2006, posteriormente se
cuantificaron los cidos carboxlicos mediante Cromatografa Lquida de alto
Desempeo (HPLC). Se comprob que a medida que avanza el proceso
fermentativo algunos cidos muestran tendencias de aumento en sus
concentraciones, sin embargo no se identificaron diferencias remarcables entre los
grupos de tratamiento, esto debido a las diferencias inherentes a cada lote
experimental.
Palabras claves: Coffea arabica,
muclago, HPLC, cidos carboxlicos

procesamiento

hmedo,

fermentacin,

The fermentation of Coffea arabica during the wet processing method is originated
by the consumption of sugars within the mucilage by micro flora. As a result, the
concentration of carboxilic acids increases and thus the pH falls. At some
concentrations these carboxilic acids are related to the apparition of "off-flavors" or
"flavor notes". With the aim of know which would be the relationship among the
stage of fermentation and the concentration of these acids, coffee samples
(Coffea arabica, var. caturra) of La Canavalia farm (San Ramn, Matagalpa) were
processed during the harvest season 2005-2006 and their fermentation interrupted
at different pH. Then the concentration of representative carboxilic acids was
analyzed by HPLC. Although the statistical tests didn't show clearly differences
among treatments, a pattern in the increasing and decreasing concentration of
some acids was obtained. Differences among experimental batches might be a
cause for such a lack of clearly defined differences among groups.
Key words: Coffea arabica, wet processing, fermentation, mucilage, HPLC,
carboxilic acids

1 INTRODUCCIN

La reciente crisis originada por el colapso del mercado mundial del caf ha
causado severas condiciones econmicas para los productores de caf en pases
productores, incluyendo Nicaragua. Como resultado, muchos productores de caf
desean mejorar la calidad y consistencia de su caf con el propsito de tener
acceso a los mercados de caf especiales.
En Nicaragua los productores cultivan Coffea arabica y lo procesan por medio del
beneficiado hmedo en el cual es crucial la etapa de fermentacin. Para
determinar cul es el punto idneo para interrumpir la fermentacin mediante el
lavado del caf los productores utilizan un mtodo tradicional, ste no es preciso
para determinar cundo el caf se ha sobrefermentado. El tiempo de fermentacin
juega un papel crucial: una sobrefermentacin produce caf con sabores
desagradables, una sub-fermentacin redundara en caf pergamino con
remanentes de muclago.
El conocimiento terico de la qumica de la fermentacin es clave para la
propuesta de un mtodo alternativo para predecir cundo interrumpirla. Los
ltimos estudios plantean que el muclago es separado del caf pergamino
(parnquima) principalmente por los cambios en su pH a lo largo del tiempo de
fermentacin (Avallone et al, 2001a). Por esta razn se considera que el pH
tendra una funcionalidad muy importante para predecir cundo interrumpir la
fermentacin (Puerta-Quintero, 1999, 2001).

Si bien se sabe que estos cambios de pH son el resultado de un aumento gradual


en la concentracin de cidos carboxlicos producidos por microorganismos resta
por investigarse qu consecuencias tendra la interrupcin de la fermentacin del
muclago a un pH especfico sobre la formacin de cidos carboxlicos
caractersticos de sabores desagradables en el caf.
El propsito de esta investigacin es responder a esta pregunta mediante la
identificacin y la cuantificacin de algunos cidos carboxlicos del muclago del
caf a diferentes etapas de su fermentacin (grupos experimentales). Para
identificar y cuantificar los cidos carboxlicos se utiliz la tcnica Cromatografa
Lquida de alto Desempeo (HPLC1). Como tcnica de control se utiliz el sistema
espectrofotomtrico de campo, Reflectoquant, para medir las concentraciones de
cido lctico y cido mlico.
Mediante HPLC se lograron identificar seis cidos carboxlicos: galacturnico,
mlico, propinico, ctrico, actico y frmico. El cido lctico solamente se
identific con el sistema Reflectoquant.
Los anlisis de los resultados no arrojaron diferencias significativas de importancia
entre las concentraciones de ciertos cidos entre los grupos. Excepciones a esto
fueron los cidos mlico y lctico.
Puesto que esta investigacin se enmarca dentro del proyecto Caf por la Justicia
(Coffee for Justice), los resultados de esta tesis fueron retomados por
investigadores de ese proyecto para establecer correlaciones con los puntajes
obtenidos por las mismas muestras en una catacin profesional de caf
(Jackels et al, 2006).

HPLC: siglas internacionalmente reconocidas para la Cromatografa Lquida de Alto Desempeo,

provienen del ingls High Performance Liquid Chromatography.

De forma paralela a los experimentos controlados de las muestras cuyas


concentraciones en cidos carboxlicos se determinaron, el equipo de Caf por la
Justicia distribuy 100 kits a igual nmero de productores. Estos kits contenan lo
necesario para que sus usuarios experimentaran la interrupcin de la fermentacin
en sus lotes de caf a diferentes pH: se compar el pH con que normalmente
interrumpen la fermentacin (mediante el mtodo tradicional) con una interrupcin
a un pH cercano a 4,6. Los resultados tambin fueron catados por un equipo
profesional (Jackels et al, 2006).
Con ambas experiencias los productores de caf se beneficiarn de un mtodo de
evaluacin sencillo para lograr uniformidad en el procesamiento del caf en la
finca, especialmente en el paso de fermentacin. La consistencia y calidad en la
produccin de caf pergamino ayudar en la comercializacin internacional del
caf orgnico de las fincas de pequeos productores de Matagalpa.

2 OBJETIVOS

2.1 GENERAL

Identificar los principales cidos carboxlicos del muclago de caf (Coffea arabica)
en dependencia del pH en el cual se interrumpe su fermentacin.

2.2 ESPECFICOS

Determinar cualitativamente la presencia de cidos carboxlicos en las


muestras de muclago de caf (Coffea arabica) para diferentes pH de
interrupcin de la fermentacin.

Cuantificar las concentraciones de los cidos carboxlicos identificados en


el muclago de caf (Coffea arabica) para diferentes pH de interrupcin de
la fermentacin.

Establecer las relaciones estadsticas entre los cidos carboxlicos


cuantificados en el muclago de caf (Coffea arabica) y las diferentes
etapas en que se interrumpe su fermentacin.

3 MARCO TERICO

3.1 EL MERCADO INTERNACIONAL DEL CAF

3.1.1 De la produccin a la oferta en el mercado internacional del caf


El caf es una bebida moderna cuya masificacin surgi a raz de la revolucin
industrial (Daviron y Lerin, 1990). Secunda al petrleo en cuanto al producto
comercial con ms intercambios a nivel mundial ya que los ingresos por sus
ventas exceden anualmente los 70 billones de dlares estadounidenses. Se
estima que el 75 % de sus 25 millones de productores, estn catalogados como
pequeos productores (Brown, 2004).
Dos especies de caf se cultivan para ser comercializadas: (a) El Arbica (Coffea
arabica) principalmente en Brasil, Colombia, Mxico, Centroamrica, Per y al
este de frica. Tiene un sabor menos amargo que Robusta, ms acidez y ms
cuerpo. (b) El Robusta (Coffea canephora) principalmente en Brasil, Indonesia,
Uganda, Costa de Marfil e India. Tiene un sabor fuerte, amargo y menos acidez
(Nestl, 2004).
Desde el ao 2000, la produccin mundial de caf alcanza anualmente ms de
110 millones de sacos de 60 kg. Geogrficamente la produccin se reparte de la
siguiente forma: 47% en Amrica del Sur, 25 % en los pases de Asia/ Pacfico,

15% en Amrica Central y un 13% en frica. Nicaragua aporta el 1,23 % de la


produccin mundial. La mayor parte del caf producido se exporta hacia los pases
occidentales. (Voituriez, 2005).

3.1.2 La crisis internacional del caf


La sobreproduccin mundial de caf, la puesta en el mercado de grandes
cantidades de caf de baja calidad y las ligeras cadas en la demanda de caf han
sido causas importantes de la crisis econmica ms grande del comercio mundial
de caf. Al momento ms fuerte de su cada, los precios perdieron el 64% de su
valor en dos aos. Entre 1996 y el 2001, la libra de caf verde pas de 130 a 42
centavos de dlar. Esto no haba acontecido en ms de 30 aos (Voituriez, 2005;
Brown, 2004; OI, 2002).
Esta crisis ha debilitado las economas de los pases que dependan en gran
medida de los ingresos por la venta de caf. En Amrica Central el caf puede
aportar entre el 2% y el 8% del PIB y representa cerca de un milln de empleos
(Varangis et al, 2003). En Nicaragua, alrededor de 30 000 familias poseen fincas
de caf, esto redunda en empleos para 150 000 200 000 familias (IICA, 2004;
Gmez, 2005).
Adems de importantes consecuencias para los grandes y los medianos
productores, la precariedad ha recado principalmente sobre los pequeos
productores de caf, quienes han tenido que disminuir sus gastos en salud,
educacin y en la canasta bsica (Varangis et al, 2003; OI, 2002, 2003).

3.1.3 Perspectivas y recomendaciones para afrontar posibles futuras


crisis
Luego del ao 2004, los precios estn en alza: un 36% con relacin a los del 2001
y 20% con relacin a los del 2003 (Voituriez, 2005). La constitucin de reservas
importantes de caf en los pases importadores, muestra que hay una tendencia
de alzas en los precios. Sin embargo todo el optimismo se debe dejar a un lado
puesto que el mercado de caf a mostrado a lo largo del tiempo que es
susceptible a fluctuaciones imprevisibles y a consecuencias catastrficas (Brown,
2004; OI, 2003).
Como estrategias para evitar que crisis similares impacten nuevamente a los
pequeos productores, se han propuesto: la promocin del consumo del caf en
pases productores y pases de economas emergentes, la diversificacin de
produccin agrcola y la produccin de cafs especiales (Scholer, 2004; Varangis
et al, 2003; OI, 2002, 2003).
Se ha planteado que en Nicaragua, la produccin de cafs especiales y la
posterior certificacin de estos (Caf orgnico, Caf Comercio Justo, Caf de
Sombra, Caf producido amigablemente con las aves) por parte de los pequeos
productores podra mejorar sus condiciones de vida en las zonas cafetaleras de
Matagalpa y Jinotega (CRS, 2004, Varangis et al, 2003). Sin embargo, grandes
esfuerzos deben hacerse para mejorar la calidad del caf producido y obtener
dichas certificaciones (van Hilten et al, 2002).

3.2 EL CAF: UN GRANO COMPLEJO

3.2.1 Botnica
La planta de caf pertenece al gnero Coffea de la familia Rubiacea. De acuerdo a
Belitz y Grosch (1999) y a Wood (1998) se han censado alrededor de 70 especies
de caf, sin embargo solamente tres se cultivan: Coffea arabica, la cual provee el
75% de la produccin mundial, C. canephora, alrededor del 25% y C. liberica y
otros, con menos de 1%.
A pesar que la presencia de estas especies est confinada a las regiones
tropicales (Daviron y Lerin, 1990), Coffea arabica se cultiva en altitudes
comprendidas entre 800 y 2000 m bajo temperaturas templadas, al contrario de C.
robusta la cual puede crecer a altitudes inferiores a los 800 m.
Luego del cultivo en viveros, las plantas jvenes son sembradas al inicio de la
poca lluviosa. Adems de recomendarse un suelo frtil y con pH superior a 5.5,
otros factores ambientales afectan al cafeto: la disponibilidad de agua, la
iluminacin, la ventilacin, los fuertes vientos y las sequas (Wood, 1998).
Luego de la siembra hay que esperar hasta 3-4 aos para que los frutos empiecen
a producirse, se espera un rendimiento de productividad mximo de 10-15 aos.
En edad adulta, la altura de la planta puede variar entre 3 a 12 m dependiendo de
la especie, sin embargo se trata de mantenerla entre 2-2.5 m para facilitar la
recoleccin (Snchez-Martn, 2005).

3.2.2 Estructura del grano de caf


La planta del caf produce flores blancas y a partir de ellas se forman los frutos en
una drupa de 1.5 cm aproximadamente (Figura 1). La drupa est recubierta por un
exocarpio o piel que es verde en un inicio, posteriormente cambia a color amarillo,

algo ms tarde se torna roja, paso previo al color carmes que adquiere en la
madurez completa (esta es la razn por la que se le conoce como cereza o uva),
algunas variedades maduran a color amarillo (Guharay et al, 2000). De acuerdo a
Avallone et al (1999) el exocarpio consiste en una capa de pequeas clulas
epidrmicas (~10 x 30 m).
De acuerdo a Belitz y Grosch (1999), el pericarpio exterior encierra un mesocarpio
(15 a 25% masa/masa de la fruta). Este mesocarpio se divide en un mesocarpio
exterior de color amarillezco (pulpa) y un mesocarpio interior (muclago) con un
contenido de pectinas 1,9 veces inferior al de la pulpa (Garca et al, 1991).
El endocarpio tambin se conoce como pergamino, es de color amarillezco o de
color grisceo-verdoso (cascarilla), en el interior de estas estructuras se encuentra
el grano de caf propiamente dicho, este consiste por lo general de dos
hemisferios elpticos, pegados por su parte plana. Cada grano est recubierto por
una fina membrana de tonalidad plateada. Otras veces, 10-15% de las cerezas
solamente tienen un grano esfrico (caracolillo).
Una presentacin ms clara sobre la estructura de este conjunto de capas
(pericaripio) as como sus anchuras promedio y la forma de las clulas que las
conforman se presenta en la Figura 2.

Figura 1 - Seccin longitudinal del caf cerezo

Adaptado de: Avallone et al (2000).


Figura 2 - Constitucin del tejido de pericarpio de Coffea arabica var. typica cramer.
Examinacin por microscopa luego de fermentacin (20 h).

Las clulas que conforman la piel tienen una anchura de 10 x 30 m, la pulpa tiene un
espesor de 1 mm, el muclago 300 m. El pergamino por su parte tiene una anchura de
50-110 m, este ltimo est conformado por esclernquimas transversales (~25 m) y
esclernquimas longitudinales (~150 x 25 m). Adaptado de: Avallone et al (1999).

3.2.3 Composicin qumica del caf verde


Flament (2001) compila los resultados ms importantes en la investigacin sobre
los constituyentes del caf. Tal como lo comentan Merrit et al (1970) la
composicin del grano de caf verde es muy compleja, pero bsicamente consta
de celulosas, lignina, grasas, cenizas, sacarosa, cido clorognico y protenas.
Importantes investigaciones se han hecho para identificar compuestos qumicos
precursores del sabor en el caf verde, sin embargo las investigaciones ms
importantes se han realizado en el caf tostado (Belitz y Grosch, 1999).
Los constituyentes qumicos del grano del caf, son los que en ltima instancia
determinarn la calidad de la taza de caf. Los factores que determinan estas
diferencias en composicin todava no se comprenden en su totalidad, sin
embargo es un hecho que entre estos factores se pueden nombrar: las variedades
cultivadas, el proceso post-cosecha, la sombra y la altitud (Decazy et al, 2003).
Belitz y Grosch (1999) consideran que el caf verde est compuesto por una
buena parte de extracto soluble en agua, lpidos, azcares, sacarosa, fibra cruda,
cidos ctrico, mlico, oxlico y clorognicos, cafena, trigonelina y minerales
(Tabla 1).

Tabla 1 .Composicin qumica del caf verde.

COMPONENTE

CANTIDAD (% en extracto seco)

Extracto acuoso
Protena bruta
Grasa
Azcares reductores (Expresados como glucosa)
Azcares
reductores
(Expresados
como

29.0-36.2
8.7-12.2
8.3-17.0
0-0.5
2-9

sacarosa)

Sacarosa
Fibra bruta
Acido ctrico
Acido mlico
Acido oxlico
cidos clorognicos
Cafena
Trigonelina
Minerales
Fuente: Belitz y Grosch (1999).

6-7
10-11.7
0.5-1.15
0-0.5
< 0.2
4.5-11-1
0.9-2.6
0.24-1.2
3.0-5.4

3.2.4 Caractersticas organolpticas del caf


Puerta-Quintero (1996) explica que en la evaluacin sensorial de la calidad de los
alimentos se usa el mtodo de calificacin por medio de escalas que describen las
categoras para cada caracterstica del producto, esto se denomina mtodo
descriptivo cuantitativo. Los laboratorios de catacin de caf analizan en base a
estas escalas una serie de parmetros complejos (aroma del caf molido, aroma
de la bebida, la acidez, el amargo, el cuerpo, impresin global o sabor),
posteriormente a estos parmetros se les aplican tcnicas de estadstica: anlisis
multivariado, distribucin de frecuencias y perfiles de la taza de caf para obtener
una valoracin global del lote de caf.
La relacin entre la calidad de la taza de caf y los constituyentes qumicos del
grano pasan por la lnea del anlisis sensorial (Ojijo, 1993). Lo importante es que
evaluaciones de ese tipo se realizan gracias a tcnicas sensoriales cuya base

envuelve tanto la percepcin del aroma en el epitelio olfativo gracias a los


constituyentes qumicos notablemente olorosos, como el sabor que se detecta en
la cavidad oral por los constituyentes fsico-qumicos de la bebida.
El objetivo de esta seccin no es la mera compilacin de listas, sino relacionar los
compuestos censados por la literatura en el caf verde como precursores a otros
sabores en el caf tostado, aquellos sabores que imparten las notas de sabores
claves en las evaluaciones de calidad de la taza.
Se hace nfasis en las contribuciones de los cidos carboxlicos, por ser estos el
objeto de investigacin en esta tesis.
3.2.4.1 Notas aromticas comunes en el caf y sus orgenes qumicos o
sustancias asociadas
Es importante destacar que la mayora de las investigaciones con base en la
qumica sensorial del caf se han realizado teniendo en cuenta el caf tostado
(Holscher et al, 1990). Sin embargo, no hay que olvidar que los compuestos
qumicos del caf tostado tienen su origen en el caf verde, por ello,
Merrit et al (1970) clasifican los compuestos precursores de compuestos voltiles
en el caf tostado en los siguientes grupos: hidrocarburos, aldehdos, cetonas,
teres, compuestos heterocclicos, sulfurosos y aromticos.
En el caf, la complejidad de diferentes sustancias qumicas se combinan de
formas diferentes para crear una armona natural de notas distintivas del aroma.
En el argot del caf, estas notas se reconocen de acuerdo a sus similitudes con
sensaciones o percepciones con odores similares de sustancias ms familiares en
la vida ordinaria: olor a madera, tierroso, mohoso, frutoso, floral.
A continuacin se presentan algunas de las notas aromticas ms importantes en
el caf tostado, los compuestos qumicos precursores en el caf verde y cmo se
originan durante el procesamiento o las operaciones poscosecha.

Frutoso (Fruity): Este es un aroma que recuerda a frutas maduras.

En

concentraciones moderadas, el aroma frutal es deseable puesto que acenta la


percepcin de fineza o acidez. Holscher et al (1990) atribuyen este aroma a
compuesto cetnico -damascenona, este es un producto de carotenoides.
Otros compuestos que acentan este aroma son los cidos alifticos de cadena
corta, especialmente el cido 2-ethil butrico (Ojijo, 1993).
Caramelo (caramelly): sensacin aromtica producida por un conjunto de
compuestos formados por azcares con radicales carbonilo medianamente
voltiles, que encontramos en el olor del caf y producen sensaciones que
recuerdan los dulces o jarabes. Es una nota apreciada y Holscher et al (1990) lo
asocian al furaneol (2,5 dimethil-4-hidroxi-3(2H)-furanona) el cual es un producto
de la degradacin de carbohidratos. Otros compuestos que tienen influencia en el
aroma a caramelo son: alcohol furfural, cido furancarboxlico, hidroximetilfurfural
(HMF), etilfuraneol, cicloteno, isomaltol, maltol, 5-hidroximaltol y 5-hidroxil-5, 6Hidromaltol (Dart y Nursten, 1985).
Otras notas aromticas importantes son listadas por Snchez-Martn (2005):
Fruto seco (nutty): Sensacin aromtica producida por una gama de aldehdos y
cetonas medianamente voltiles que recuerda a los frutos secos tostados.
Malteado (malty): sensacin aromtica producida por una gama de aldehdos y
cetonas moderadamente voltiles que producen sensaciones que recuerdan los
granos tostados.
Chocolatado (chocolaty): sensacin aromtica, producida por un conjunto de
compuestos, moderadamente voltiles, presentes en el retrogusto del caf
(aftertaste), que producen sensaciones que recuerdan el chocolate amargo o
vainilla.

Especiado (spicy): sensacin aromtica producida por una gama de compuestos


hidrocarbonatos ligeramente voltiles presentes en el retrogusto del caf, que
producen sensaciones que recuerdan a la corteza de la canela o del clavo de olor.
Terpnico (turpeny): sensacin aromtica producida por un conjunto de
hidrocarburos y nitrilos que aparecen en el retrogusto del caf y produce una
sensacin similar a las resinas, los productos terpnicos o medicinales parecidos
al alcanfor.
3.2.4.2 El caf sobrefermentado y sus defectos asociados
Algunos de los defectos organolpticos ms objetables son introducidos a los
productos de caf por los llamados granos sobrefermentados o malolientes. Por
lo general la ocurrencia de estos granos se asocia a sabores frutosos, putrefactos
o desagradables, por lo general conllevan a la discriminacin de los lotes
afectados en el comercio de caf.
En su trabajo Bade-Wegner et al (1997) estiman que los compuestos cido
2-metilbutanico etilester (2-MBEE), cido 3-Metilbutanico (3-MBEE) y cido
ciclohexanico (CHEE), son responsables por el sabor sobrefermentado en cafs
arabica y robusta.
Algunas de las notas de sabor caractersticas al sabor sobrefermentado se notan a
continuacin:
Herbal (Green): Es una nota aromtica sugestiva de un verdor intenso como el
pasto. De acuerdo a Puerta-Quintero (1996) esta nota redunda en una evaluacin
media para el aroma. Segn Holscher et al (1990) su origen puede ser el resultado
del compuesto qumico 2, 6 (E,Z-) nonadienal. El mismo autor tambin revela que
el compuesto n-hexanal imparte un odor similar. Ambos compuestos son
generados por la fraccin lpida del caf verde.

Maderoso (Woody): Ojijo (1993) estima que este es un defecto atribuido a la


sustancia nerolidol, un terpeno. Presumiblemente los terpenos del caf tostado se
originan por diterpenos en el caf verde (Arnaud, 1988). Otros autores (Viani,
1988; Parliment et al, 1973) han asociado al compuesto 2(E)-nonenal con esta
nota.
Carbonizado (carbony): sensacin aromtica originada

por un conjunto de

compuestos heterocclicos ligeramente voltiles, presentes en el retrogusto del


caf, que producen sensaciones fenlicas similares a un cresol o la piridina, que
recuerdan las sustancias quemadas.
Uno de los defectos ms nombrados en la literatura es el de los granos rio, este
se

caracteriza

por

tener

notas

fenlicas,

medicinales

mohosas.

Spadone y Liardon (1987) atribuyen al compuesto qumico 2, 4, 6- Trichloromethoxi-benceno (TCA) como el responsable de este defecto. En otra
investigacin Holscher et al (1995) concluyeron que posibles causas de la
generacin de este compuesto pueden ser metabolitos de algunos pesticidas,
aunque antes, Dentan (1987) estimaba que los granos que exhiben estas
caractersticas son ricos en Aspergillus fumigatus.
Finalmente Cantergiani et al (2001) relacionaron el defecto mohoso/tierroso a los
compuestos geosmin, 2-metilisoborneol, 2, 4,6-tricloroanisol y en menor medida a
tres metoxi- pirazinas (2-metoxi-3-isopropil/-3-sec-butil-/-3-isobutil-pirazina). Como
posible causa incluyeron al secado durante la poscosecha.
3.2.4.3 cidos carboxlicos
Los cidos carboxlicos pueden encontrarse de forma natural en las semillas de
caf verde tanto de arabica como de robusta y aportan entre el 1.1-3.1%, en
porcentaje (m/m).

Illy y Viani (1995), desglosan este aporte de la siguiente

manera: cido frmico (0.14%), actico (trazas), oxlico (trazas-0.2%), mlico (0.30.7%), succnico (trazas-0.15), ctrico (0.5-1.5) y qunico (0.3-0.6% en arbicas).

Al parecer la produccin de cidos carboxlicos en el caf verde es un aspecto


determinante para la obtencin de granos tostados balanceados en acidez (Illy y
Viani, 1995). En el caf tostado han sido identificados cerca de 34 cidos, 15 de
los cuales son voltiles y estn presentes en pequeas cantidades en el aroma.
En el tueste hay una reduccin en la suma de ctrico y mlico y aumenta en alguno
de los otros, como el qunico y cidos voltiles.
Los cidos actico, mlico y ctrico son importantes para percibir la acidez. Los
cidos

presentes actan sinrgicamente y sus efectos en el aroma son ms

importantes que aquellos en su relacin con el pH. La percepcin de la acidez es


el resultado de un conjunto de efectos de todos esos cidos juntos. De hecho, es
agradable si un cido no prevalece, mientras comienza a ser desagradable si uno
de ellos predomina. Esto es debido a los efectos combinados de gusto, aroma y
sensaciones tctiles tales como cuerpo y astringencia.
Los datos cuantitativos de los cidos carboxlicos del caf tostado varan
dependiendo de la especie y variedad del caf, del grado y condiciones de tueste.
Los aspectos negativos de los cidos carboxlicos tambin han sido recopilados
por distintos investigadores, con especial nfasis en sus formaciones durante las
etapas de procesamiento (caf verde).
Wootton (1966) mencionaba la relacin entre algunos cidos carboxlicos, el pH, la
degradacin del muclago y la formacin de aromas desagradables en el caf.
Haca hincapi en los cidos lctico y actico, los cuales parecen aparecer en
etapas tempranas de la fermentacin. Los cidos propinico y butrico aparecen
en etapas ms tardadas y posiblemente son los responsables por el aroma
defectuoso a cebolla. Tambin reportaba la presencia de cido frmico.
Dinu (2001) estima que el cido galacturnico es un constituyente fundamental de
los polmeros que forman las pectinas, las pectinas como se mencionar ms
adelante son polisacridos esenciales de las paredes celulares de las plantas.

Lpez et al (1989) investigaron con ms detalle la formacin de cidos


carboxlicos con relacin al tiempo de fermentacin, aunque no confirm una
relacin causal entre las concentraciones de estos cidos y la degradacin de la
calidad del caf a lo largo del tiempo, este estudio sirve de gua para otras
investigaciones en esta lnea. Encontraron los siguientes cidos: galacturnico,
mlico, lctico, ctrico y propinico. El equipo de Avallone et al (2001b) utiliz
solamente cido actico y cido lctico como indicadores de progreso de la
fermentacin, llegaron a la conclusin que estos cidos tienden a aumentar a
medida que avanza el tiempo de fermentacin y disminuyen los azcares
(glucosa, fructosa y sacarosa).

3.3 DEL CAF CEREZO AL CAF PERGAMINO: UN PRODUCTO


SENSIBLE

3.3.1 Cosecha
En su investigacin, Guharay et al (2000) plantean que en Nicaragua la recolecta
inicia a mediados de octubre y finaliza a mediados de marzo. El estado de
madurez de las cerezas (o uvas) de caf durante la recolecta es determinante en
la calidad final del caf. Estas estn maduras cuando el pericarpio es de color rojo
brillante, las sobremaduras son de color violeta a negro y las no maduras todava
verdes. Para producir caf de calidad Gutirrez et al (2005) recomiendan
recolectar solamente cerezas maduras.
La cosecha puede ser mecnica, se han propuesto interesantes y sofisticados
mecanismos para la recoleccin de cerezas de caf, por ejemplo: la cosecha
mediante el impacto a las ramas por medio de un equipo especial que tambin
desprende y recoge los frutos (Garca et al, 2001), o el sistema descrito por

Campillo et al (2001) en el cual un sistema de ventosas se encarga de agarrar y


desprender los frutos de caf.
En la investigacin de Tulet et al (1994) se presenta que tanto los costos, las
caractersticas inherentes del sistema de cultivo del caf, como la mejor calidad de
los granos obtenidos hacen que el sistema de recoleccin manual sea el ms
utilizado. En Nicaragua la cosecha se realiza de forma manual. beda Aguilar
(1997) recomienda hacerla en tres etapas: el graniteo, el corte pleno y la repela.
La primera consiste en eliminar los primeros frutos maduros, brocados (afectados
por la broca del caf: Hypothenemus hampei), sobremaduros, enfermos o
defectuosos, esto se hace para que el resto de la cosecha quede libre de estos
frutos y as evitar una calidad inferior de la cosecha. En la segunda etapa se corta
entre el 80% y 85% de la cosecha, poniendo atencin en cortar solamente el caf
maduro. Finalmente se debe hacer una repela cuando no quede ms que un 9 a
13% de cosecha, aqu se debe de dejar libre la planta y el suelo de toda clase de
frutos para evitar que plagas como la broca se refugien en ellos.
El cmo optimizar la recoleccin manual es motivo de investigacin en centros
como Cenicaf (Centro Nacional para la Investigacin del Caf, Colombia), el
trabajo de Vlez et al (1999) es una gua completa de cmo el recolector debe
realizar sus movimientos en el zurco, alrededor de la planta, con su cuerpo y con
sus manos.

3.3.2 Procesamiento post-cosecha


La transformacin del caf cereza en caf pergamino se denomina beneficio del
caf, este puede realizarse por medio de dos variantes: la va hmeda y la va
seca (Illy, 2000).
Puerta-Quintero (1999) plantea que el proceso por va seca se utiliza para
procesar la mayora del caf robusta de frica (con la excepcin de Zaire),
tambin plantea que en Brasil se procesa por el mismo mtodo tanto caf arbica
como caf robusta. En el proceso seco, luego de recolectadas, las cerezas de caf

son secadas inmediatamente bajo el sol y se extienden alrededor de 30 kg/ m2.


Muchas veces es difcil conseguir que las muestras alcancen un contenido ideal
de humedad (12%) tan solo con el secado bajo el sol, por lo tanto un secado
artificial se realiza con la ayuda de secadores mecnicos (Soccol, 2003). Como
variante dentro del beneficiado en seco Belitz y Grosch (1999) indican que algunas
veces las cerezas frescas son apiladas y dejadas a merced de su propio calor
durante 3-4 das para que la pulpa se fermente, luego se llevan a un proceso
similar al anteriormente comentado. Los cafs aqu recolectados se conocen como
cafs naturales, marcados por su cuerpo.
El beneficiado hmedo es utilizado principalmente para procesar caf Arbica en
Amrica Central, Colombia y frica. Muchos autores convienen que el caf
producido por este mtodo es el de mejor calidad (Flament, 2001; Belitz y Grosch
1999, Puerta-Quintero, 1999).
Con este mtodo el fruto del caf es transformado en tres etapas:
-

La eliminacin de la pulpa por fermentacin y lavado.

El secado y la obtencin del caf pergamino.

El secado hasta un 12% de humedad, trillado, clasificado, seleccin y


ensacado.

Como se ver en el siguiente prrafo lo planteado por Daviron y Lrin (1990) no


siempre es aplicable a todos los pases, ellos infieren que por lo general con los
cafs procesados por la va hmeda, el productor organiza la recolecta y vende su
caf en cerezas, raramente como pergamino, el cual se obtiene por lo general en
pequeas unidades conocidas como beneficios hmedos. El descascarillado y la
clasificacin se realizan en unidades ms grandes (beneficios secos), los cuales
exigen inversiones ms importantes, como por ejemplo en la utilizacin de
selectores electrnicos de granos.

3.3.2.1 El procesamiento del caf en Nicaragua


El caf procesado en Nicaragua es 100% Arbica (Gmez, 2005), razn por la
cual es de esperar que la va hmeda sea la ms utilizada por los productores en
detrimento de la va seca (Berros et al, 2005). Por su parte, Parrilli (1997) estima
que en la zona cafetalera de Carazo, por la cercana entre las fincas y las plantas,
se realizan ambos procesos (beneficiado hmedo y beneficiado seco), mientras
que en Matagalpa, Jinotega y Nueva Segovia, por lo general las plantas slo
hacen el beneficiado seco, dejando a los productores el proceso hmedo, con esta
divisin del procesamiento se obtiene mayor ventaja competitiva ya que muchas
veces los beneficios secos estn relacionados con una comercializadora
exportadora.
En las recomendaciones para procesar cafs especiales, Berros et al (2005) y
Gutirrez et al (2005), consideran que el procesamiento del caf por la va hmeda
debe comprender las etapas fundamentales que se resumen en la Figura 3 y se
explican posteriormente.

Figura 3 - Diagrama de flujo del procesamiento de caf por la va hmeda

Normalmente el caf es procesado mediante la va hmeda, la cual consta de dos fases:


el beneficiado hmedo y el beneficiado seco, por lo general el primero se realiza en las
fincas de los productores y el segundo en un beneficio construido para este propsito.
Adaptado de Soccol (2003).

La recepcin y la clasificacin:

El caf debe transportarse inmediatamente al beneficio hmedo. Se procura


eliminar los granos verdes, pintos o secos colocando cada tipo de grano en un
contenedor diferente.
Un registro de los envos de caf cerezo al beneficio hmedo es de suma
importancia para determinar el tiempo que ha transcurrido desde el corte del caf
hasta su llegada al beneficio hmedo.
Una clasificacin por medio de la prueba de flotacin debe realizarse: esta
consiste en verter el caf en una pila con agua. Los frutos y el material que flota
(frutos secos, brocados, enfermos, palos, hojas) deben ser retirados.
La mezcla de frutos con diferentes calidades disminuir la calidad del caf
obtenido.

El despulpado

Despus de la limpieza y clasificacin, los frutos del caf se procesan para


eliminar la pulpa. Esto se realiza por lo general con mquinas despulpadoras,
estas pueden ser de tambor o de disco (Snchez-Martn, 2004).
En el caso de las despulpadoras de tambor, hay un cilindro giratorio con las
paredes interiores rugosas y con una cubierta estacionaria o coraza que cubre un
tercio de su superficie. Los frutos se alimentan directamente desde los tanques de
clasificacin al despulpador, resultando estrujados al entrar en el hueco,
rompindose el fruto y expulsando suavemente los granos recubiertos con la piel
apergaminada.
En los otros tipos de despulpadores, un disco vertical con una cara rugosa gira
junto a una placa lisa casi vertical, de modo que la abertura entre los dos,
ajustable, es menor en la direccin de rotacin del disco.

Carpio Zavala (1998) reporta que cuando la despulpadora mecnica est mal
calibrada o cuando hay mezclas de variedades de cerezas, se dan heridas o
cortes en el grano verde que lo desvalorizan. Tambin las diversidades en las
texturas y dimetros de las cerezas dificultan al trabajador elegir la calibracin ms
adecuada para el equipo. Una solucin a esto es ajustar la despulpadora de
acuerdo al tamao del grano, con granos ms grandes al inicio de la cosecha y
ms pequeos al final (Gutirrez et al, 2005).
A pesar que Puerta-Quintero (2001) recomienda no utilizar agua ni para el
despulpado ni para transportar las pulpas o los granos despulpados, SnchezMartn (2005) enfatiza que normalmente se utiliza en la prctica. Por otro lado es
de suma importancia limpiar diariamente la despulpadora, para evitar que se forme
suciedad y para retirar los granos que puedan estar atrapados, tambin se
recomienda revisar diariamente el funcionamiento del despulpador: en el caso que
se observe grano mordido, quebrado o machacado, se debe ajustar y corregir
cualquier

problema

(Berros

et

al,

2005;

Gutirrez

et

al,

2005;

Carpio Zavala, 1998).

La fermentacin

En el transcurso del procesamiento del caf por la va hmeda, el caf despulpado


debe someterse a una etapa importante para su preparacin: el desmucilaginado
o fermentacin. Aunque es posible utilizar mquinas para retirar el muclago
(Oliveros y Roa, 1995), la verdad es que el mtodo de la fermentacin o
desmucilaginado natural es el que ms se utiliza en Nicaragua.
El objetivo de esta fermentacin es degradar el muclago que se encuentra
adherido a la cascarilla del grano para obtener caf pergamino que ser
consecuentemente secado. En Nicaragua la fermentacin se realiza en pilas de
concreto, madera o plstico, todas deben poseer desniveles apropiados y filtros en
las salidas. Carpio Zavala (1998) indica que la ventaja de utilizar pozas de
concreto es que es ms fcil higienizarlas.

Como se ver ms adelante (Seccin 3.4.1.2) los tiempos de fermentacin varan


de un sitio a otro dependiendo de un sinnmero de factores y no debe ser
interpretado como un parmetro perfecto para determinar cundo interrumpir la
fermentacin (Carpio Zavala, 1998; Berros et al, 2005).
Los productores utilizan como parmetro para determinar cuando la fermentacin
se ha completado el llamado mtodo tradicional o punteo, en este los productores
introducen hasta el fondo un trozo de madera grueso y limpio en diferentes partes
de la masa del caf fermentado y luego lo retiran. Si al retirar el objeto de la masa
de caf en fermentacin quedara bien hecho el hueco dejado por el mismo, quiere
decir que el caf ya est listo, entonces se debe proceder a lavar inmediatamente
el caf (Jackels y Jackels, 2005).
Berros et al (2005) recomienda el mtodo de la muestra, el cual consiste en tomar
una muestra de caf con la mano, si al apretarla est spera y suena a cascarilla,
el caf ya puede lavarse, si por el contrario el caf est an muy pegajoso, no
debe lavarse todava. Se puede agregar un poco de agua para verificar si
desprende el muclago o no.

El lavado y la clasificacin

El lavado se efecta con el fin de eliminar del grano de caf los productos de la
fermentacin que ocasionan sabor agrio a la bebida de caf, si no se retiran
rpidamente (Carpio Zapata, 1998; Puerta-Quintero, 1999), dentro de estos
productos se incluyen los restos del muclago degradado (Belitz y Grosch, 1999).
Zambrano e Isaza (1994) reportan un consumo de agua de entre 20 y 30 L por
cada kg de caf pergamino lavado.
Despus del lavado la apariencia del grano pergamino debe ser limpia y de olor
agradable. El caf que resulta del lavado se conoce como pergamino, al tacto este
debe ser limpio y al frotarlo entre los dedos y chocarlos entre s deben sonar.

Por lo general el lavado se realiza en canales de concreto (o de correteo)


aledaos a las pilas de fermentacin. Estos canales prueban ser muy eficientes
para clasificar los granos de caf: por lo general los granos de inferior calidad son
arrastrados en primera instancia por la corriente, los granos de superior calidad
permanecen en la parte trasera del canal.
Wootton (1963a, b, c) hace nfasis en la influencia que puede tener la calidad del
agua durante el proceso de la fermentacin y el lavado, otros autores, entre ellos
Puerta-Quintero (2001), alertan sobre la posibilidad de obtener caf sobrefermentado o de muy mala calidad si se utiliza agua sucia o contaminada.
Gutirrez et al (2005) previenen que el agua de lluvia captada por lagunas de
tierra o en pilas de agua puede ser otra causa de sabores y olores desagradables
en el caf.
Puerta-Quintero (1999) plantea que caf de excelente calidad se puede obtener
siempre y cuando se proceda a secar el caf recin lavado. Lpez et al (1989)
tambin consideran que los cafs que son sujetos a almacenamiento y contienen
una humedad cercana a 14% son susceptibles a desarrollar malos sabores y
aromas.
La etapa final del beneficiado hmedo, es decir antes de que el caf abandone la
finca, es el secado en cajas de cedazo o zarandas, aqu los granos debern de
moverse constante, evitando que hayan granos con diferentes grados de humedad
en un mismo lote. Muchas veces el tiempo de permanencia en estas zarandas es
como mximo tres das, tratando de cubrir el lote durante las noches o los das
lluviosos. Cuando hay condiciones para transportar el caf hasta el beneficio seco,
se considera que el grano est oreado.
Es posible que en muchas fincas se requiera mano de obra para un preclasificado
en las cajas de cedazo, sin embargo un clasificado ms eficaz se logra por medio
de los canales de correteo.

El secado

Es la etapa del procesamiento hmedo en la cual se busca que el grano de caf


pierda humedad. El contenido en agua de 65% que inicialmente tiene una cereza
de caf, se reduce hasta un 10 a 12% (Illy, 2002).
El secado se realiza en los llamados beneficios secos, los cuales se encuentran
(caso generalizado en los departamentos de Matagalpa y Jinotega) en otro sitio
diferente al del rea de cosecha y de beneficiado hmedo (Parrilli, 1997). De
acuerdo a Belitz y Grosch (1999) los granos pueden secarse al sol en pisos de
concreto (o como se puede apreciar en Sbaco, en otras superficies como el pasto
o sobre plsticos), tambin se suelen utilizar secadores mecnicos.
Roa et al (2000) presentan una variedad considerable de secadores: entre ellos
Wilken, Guardiola, Torres y Moreira. Todos comparten la peculiaridad que el gasto
de energa se centra en el poder calentar una masa de aire, la cual transmitir el
calor a los granos de caf. La eficiencia radica en el conseguir un secado
uniforme.
Algunos manuales de produccin hacen mucho nfasis en las condiciones de
secado en patios (Roa et al, 2000). Este tipo de secado es el que se realiza en
Solcaf, la cooperativa que procesa la mayora del caf exportado como orgnico
o como comercio justo. Entre las recomendaciones principales que debe cumplirse
para procesar esos tipos de caf, as como los cafs de calidad en general figuran
las siguientes:
- Darle prioridad al secado en patios de ladrillo o cemento, en detrimento del
secado sobre plstico. Estos patios deben de mantenerse limpios y libres de tierra.
- Se recomienda esparcir el caf en capas que no sobrepasen los 5 cm y debe de
moverse constantemente con el propsito de obtener un punto de secado
uniforme.

-Durante las noches se amontonan y se cubren con lminas impermeables al agua


o con plsticos.
El indicador fsico ms importante para comprender la evolucin del secado de los
granos es la humedad (Snchez-Martn, 2005), sin embargo, Berros et al (2005)
resumen una serie de indicadores alternativos o empricos.
Con relacin a la humedad, se debe tener en cuenta que inicialmente es de 53%
aproximadamente, cambios en la coloracin del grano pueden ser de utilidad para
diagnosticar el contenido de humedad: un cambio de color de blanquecino a casi
negro surge cuando la humedad es cercana al 30%. El caf est listo cuando se
tiene un color gris verdoso, caracterstico de granos con un 12% de humedad o
con un color gris azulado que posee un 10% de humedad (Valencia, 1978).

La trilla y la clasificacin

Luego del secado los granos se llevan a unas mquinas de trilla para eliminar el
pergamino y finalmente se da brillo al grano y se eliminan los restos de cascarilla,
obtenindose el caf verde.
Snchez-Martn (2005) comenta que los granos de caf verde varan de tamao y
forma, la razn de esto la da Illy (2005), al indicar que se busca uniformidad en el
producto, para asegurar la homogeneidad del tostado y de molido. La clasificacin
se realiza con tamices perforados que funcionan mecnicamente y que separan
los granos segn el tamao. Tambin se utilizan chorros de aire para eliminar los
fragmentos de granos y las sustancias extraas.
La seleccin de los granos de color defectuoso se realiza a mano en la mayora de
los casos, aunque se ha dado un gran desarrollo en los instrumentos de deteccin
fotoelctrica para detectar y eliminar granos sobrefermentados (Gibson y Butty,
1976).

Cada zona productora tiene sus propios nmeros o nombres de

clasificacin y distintos tamices de determinacin.

El almacenamiento

La susceptibilidad del caf para obtener malos sabores y olores durante el


almacenamiento ha sido ampliamente descrita en la literatura sobre el tema,
algunos autores como Spadone y Liardon (1989) y Lpez-Garay et al (1987)
sistematizaron los cambios en la calidad del caf a lo largo del tiempo de
almacenamiento. Una conclusin importante de ambos estudios es que
independientemente de lo bien almacenado que se encuentre el caf siempre va a
ver una degradacin a lo largo del tiempo. Muy a pesar de esto, pueden
emprenderse algunas acciones para evitar dicha degradacin en la calidad.
Dentro de estas recomendaciones, Berros et al (2005) y Puerta-Quintero (2001)
recomiendan que la humedad de los granos se debe mantener con un 11% razn
por la cual la humedad relativa no debe sobrepasar el 65%.
Los aromas de sustancias qumicas, fertilizantes, comidas, combustibles u otros
productos pueden contaminar fcilmente al caf, razn ms que suficiente para no
almacenar dichos compuestos cerca del caf.
Berros et al (2005) tambin recomienda almacenar el caf en sacos de yute o en
sacos bien limpios y de preferencia nuevos. Al parecer el piso y las paredes de la
bodega pueden contaminar los granos, razn por la cual se debe evitar el contacto
con estos sacos.

3.4 LA FERMENTACIN DEL CAF

De acuerdo a Tchana et al (1985) la forma en que se desarrolle la fermentacin


tiene una gran influencia en la calidad final del caf. Si el muclago no es
eliminado, impide el proceso de secado y la superficie de los granos se vuelve
pegajosa, creando problemas de manipulacin (Snchez-Martn, 2005), tambin
se previenen las post-fermentaciones en el secado al sol y se evita un posible
deterioro de la calidad del caf, que podra ocurrir como consecuencia de
fermentaciones indeseables (Berros et al, 2005).
Si el muclago debe ser eliminado, bien se podran utilizar mquinas
desmucilaginadoras (Oliveros y Roa, 1995), sin embargo en Nicaragua el 89.5%
de los productores tienen fincas menores de diez manzanas y muchos de ellos
realizan el beneficiado hmedo en sus fincas (Gmez, 2005), la relacin
produccin-procesado no es lo suficientemente elevada para hacer una inversin
elevada en tecnologa de este tipo (Parrilli, 1997) y Avallone et al (2002)
consideran la fermentacin como el mtodo ms barato.
Por lo tanto al ser la fermentacin tan importante en Nicaragua, se debe tener un
conocimiento adecuado de los mecanismos que se interrelacionan en la
degradacin del muclago, lo contrario puede llevar a sobrefermentaciones o
subfermentaciones, ambas son responsables de defectos en la bebida (PuertaQuintero, 1999; Wootton, 1963a).
En 1998, Wood planteaba que la fermentacin en el caf era el resultado de la
degradacin de las pectinas del muclago. Esta seccin trata de poner en relieve la
validez de anteriores teoras con respecto a investigaciones ms recientes y desde
esa base cimentar la aproximacin terica de esta tesis.

3.4.1 Principios bsicos de la fermentacin


3.4.1.1 Microorganismos
Muchas de las investigaciones sobre la microbiologa de la fermentacin del caf
estn orientadas a determinar las posibilidades de utilizar inculos para optimizar
la fermentacin mediante la disminucin del tiempo que toma degradar el
muclago (Wootton, 1963a). Otras investigaciones han tenido como objetivo
identificar los microorganismos responsables de malos aromas y sabores luego de
la fermentacin (Vanos, 1987). ltimamente Avallone et al (2001b) han
demostrado que la forma ms adecuada de controlar la fermentacin no es
mediante el inculo de colonias que produzcan enzimas pectolticas, si no que una
fermentacin controlable debera de buscar la optimizacin de la relacin bacterias
y levaduras.
En la opinin de Silva et al (2000) hay tres roles importantes de los
microorganismos en el procesamiento del caf: (i) produccin de enzimas
pectinolticas para degradar el muclago (ii) generacin de aromas y sabores
indeseables y (iii) produccin de micotoxinas debido al pobre drenaje y
almacenamiento. Debido a las particularidades del procesamiento por va hmeda,
existen posibilidades de contaminacin por la mquina durante el despulpado.
Avallone et al (2001b) investigaron la relacin entre la formacin de
microorganismos

(bacterias

levaduras)

con

parmetros

bioqumicos

(degradacin de azcares y produccin de cidos carboxlicos). De acuerdo a


estos investigadores, las colonias que se aislaron con mayor frecuencias eran
coniformes comnmente encontradas en el ambiente e identificados como
Klebsiella (73%) y Erwinia (28%). Otras especies que producen pequeas
cantidades de cidos carboxlicos (Erwinia, Aeromonas) tambin fueron censadas.
Es posible que el agua utilizada en el proceso de despulpado contenga cargas
superiores de microflora aerbica mesoflica (enterobacterias). Por esta razn
Puerta-Quintero (1999) no recomienda utilizar agua durante el despulpado. Silva
et al (2000) identificaron 63 colonias de bacterias en cerezas de caf.

Este equipo aisl muestras de bacterias lcticas (Ln. Mesenteroides dextranicum,


Lb brevis), ambas especies demostraron ser heterofermentativas, es decir podan
generar cido actico y cido lctico. Lb brevis se reporta como consumidora de
cido galacturnico. Vanos (1987) identific dos grupos de bacterias lcticas en
muestras de caf sobrefermentado: Lactobacilli y Streptocci.
El equipo de Avallone et al (2001b) estim la presencia de levaduras (Kloeckera,
Candida)

con

capacidades

importantes

para

la

produccin

de

etanol.

Silva et al (2000) identificaron por su parte 15 gneros de levaduras en las


cerezas. Masoud et al (2004) subrayaron la importancia de las levaduras en el
proceso fermentativo: en su investigacin estimaron un aumento importante en el
nmero de levaduras con predominancia de Hanseniaspora uvarum durante la
fermentacin, sin embargo durante el secado dicha especie tendi a disminuir.
Con relacin a los mohos, la investigacin ms extensa fue realizada por Silva et
al (2000) quienes aislaron 292 colonias e identificaron 282 a nivel de gnero:
Cladosporium (39.7%), Fusarium (34.2%), Penicillium (28.8%) y Aspergillus
(2.7%).
Los datos revelados por las investigaciones de Silva et al. (2000) indican la
predominancia de una fermentacin dominada por bacterias, sin embargo, estiman
que los cambios de pH (la disminucin de ste debido a la produccin de cidos
carboxlicos) conllevaran a un cambio en la relacin entre bacterias y levaduras.
Estas ltimas podran perfectamente disminuir el pH en la ausencia de bacterias,
tal y como lo reportan Serrat et al (2002).

3.4.1.2 Tiempos de fermentacin


Como ya se coment, la interrupcin de la fermentacin viene determinada por el
punto el que el muclago ya se ha degradado y debe lavarse. Se coment sobre
los distintos indicadores para determinar el punto de lavado.
Uno de los indicadores es el tiempo de fermentacin, aunque esto ya ha sido
desaconsejado debido a las particularidades medioambientales de cada terroir
(Decazy et al, 2003). Por esta razn, existe mucha variabilidad en cuanto a los
tiempos de fermentacin reportados por distintos autores.
Jackels y Jackels (2005) reportan tiempos de 20 a 25 horas de fermentacin en
fincas cafetaleras del norte de Nicaragua. Esto concuerda con lo que Lpez et al
(1989) reportan como caf correctamente fermentado (19 horas), por el contrario a
las 144 horas indicaban que el caf estaba sobrefermentado.
En cafs del este africano, Wootton (1963c) reportaba que el muclago se
despegaba completamente del pergamino en un tiempo de 36 a 84 horas, sin
embargo haca mencin de las opiniones divergentes en cuanto a la oportunidad
de disminuir o aumentar este tiempo mediante la adicin de enzimas, la
fermentacin bajo agua o la adicin de soda custica (Tchana et al, 1985). En otro
artculo Wootton (1966) realiza una sistematizacin interesante sobre la relacin
entre calidad del caf obtenido en dependencia de pequeas variaciones a la
fermentacin tradicional (pre-lavado, agitacin durante la fermentacin), concluye
que a pesar de algunas cualidades visuales que pudieran adquirir los granos,
mediante tales variaciones, existen riesgos de alargar durante ms tiempo la
fermentacin y por lo tanto aumentar los costos. Quizs por estas razones an se
considera la fermentacin en seco o tradicional como la ms utilizada (Avallone et
al, 2002).
Avallone et al (1999) realizaron sus experimentos con muestras de caf arabica
que fueron fermentadas durante 20 horas.

Tchana et al (1985) reportan tiempos de fermentacin de 16 a 72 horas en las


zonas caficultoras de Camern, sin embargo en sus experimentos demostraron
que cuando se sobrepasaban 36 horas, los granos obtenidos eran susceptibles a
tener gustos indeseables.
Puerta-Quintero (1999) expona que la fermentacin se realizaba durante 12 a 18
horas y haca nfasis en lo crtico que supona este parmetro (el tiempo), puesto
que existe un riesgo real de obtener cafs sobrefermentados, tambin haca
nfasis en el riesgo que supone mezclar cafs despulpados durante diferentes
tiempos. Sin embargo en otra publicacin, Puerta-Quintero (2001) recomendaba
no dejar fermentar el caf por ms de 16 horas, justamente para evitarse riesgos
de obtencin de cafs sobrefermentados.
Una de las razones por las cuales se inici el proyecto caf por la justicia es para
determinar un parmetro ms adecuado para determinar cundo la fermentacin
puede interrumpirse. Como se ha visto el tiempo de fermentacin no parece ser un
parmetro apropiado.

3.4.2 Sobre la degradacin del muclago


3.4.2.1 El muclago
En la opinin de Belitz y Grosch (1999) el muclago est constituido por 84.2% de
agua, 8.9% de protena, 4.1% de azcares, 0.91% de sustancias pectnicas y por
0.7% de cenizas. Previos reportes acerca de la estructura del muclago asuman el
muclago como un hidrogel sin estructura celular (Garca et al, 1991).
En Avallone et al (1999) se plantea que el muclago posee una estructura
convencional de tejido y posee paredes celulares constituidas por celulosa,
sustancias pectolticas y polisacridos. El espesor puede ser cercano a 300 m y
las clulas que lo conforman son de dos a tres capas de clulas alongadas (largo
~160 m; ancho de 15-50 m), no se han observado paredes celulares

secundarias. La presencia de sustancias pcticas fue confirmada por Avallone et


al (2000) y en Garca et al (1991).
El muclago que permanece luego del despulpado industrial y antes de la
fermentacin est conformado principalmente por clulas alongadas que se
encuentran unidas al pergamino esclerenquimatoso por sus bases (Figura 4).
Figura 4 Estructura del muclago y del pergamino antes de la fermentacin.

M-cw: Paredes celulares del muclago,


Pa: Pergamino, IE: Epidermis interior,
Sc: Esclernquima.
Adaptado de: Avallone et al (1999)

3.4.2.2 Gradiente osmtico y cambio de pH

Wootton (1963a, b) plantea que durante la fermentacin, enzimas microbiolgicas


o endgenas del caf se encargaran de degradar las sustancias pectnicas del
muclago, cambiando su textura de un hidrogel a un hidrosol (Carbonell y
Vilanova, 1952; Wilbaux, 1956; Rolz et al. 1982). Otros investigadores han
reportado la presencia de Kluyveromyces marxianus en aguas residuales del
lavado de caf, esta levadura es productora de poligalacturonasa, una enzima
capaz de degradar las pectinas del muclago (Serrat et al, 2002).
Esta hiptesis ha sido rebatida por Avallone et al (1999) quienes compararon la
estructura celular del muclago antes y despus de la fermentacin (20 horas). Por
medio de tcnicas microscpicas y por estudios bioqumicos de los constituyentes
polisacridos del muclago (Avallone et al, 2001a) se apreci que las sustancias

pectolticas no son fraccionadas durante la fermentacin por enzimas endgenas o


bacteriales, en caso que fuesen fraccionadas sucedera a niveles muy bajos o no
detectables.
Un trabajo adicional presentado por Avallone et al (2002) sobre microorganismos
pectolticos detectados durante la fermentacin del muclago demuestra que estos
producen la enzima pectateliasa a niveles ptimos de pH 8.5 (hay que tener en
cuenta que la fermentacin se realiza en condiciones cidas pH 5.3-3.5), por otro
lado, dicha enzima es incapaz de depolimerizar pectinas esterificadas del
muclago sin previa de-esterificacin.
Al inicio de la fermentacin, poco antes del despulpado, el muclago forma un
tejido continuo que cubre el pergamino. Cuando el muclago est expuesto al aire
ambiental, la flora microbiolgica natural empieza a desarrollarse en la superficie
del muclago (Ver Seccin 3.4.1.1). Estos microorganismos parecen ser
responsables de la disminucin importante (60% luego de 20 horas) de la
concentracin del total de azcares simples (glucosa, fructosa y sucrosa) a
medida que la fermentacin avanza en el tiempo, contrariamente la microflora
produce cidos lctico y actico, lo cual induce una acidificacin de un pH de 6.3 a
4.1 (Avallone et al, 2001b). Cuando las azcares son metabolizadas, se induce un
gradiente de presin osmtica desde afuera hacia adentro del muclago. Esto se
compensara con un flujo de agua y posteriormente turgencia en las clulas. Es
muy probable que este gradiente de presin osmtica ejerciera suficiente presin
como para romper las paredes celulares en el sitio en que se unen al pergamino.
Simultneamente, cidos carboxlicos se producen e inducen un gradiente de pH,
al parecer la disminucin del pH induce alteraciones fisico-qumicas en las
paredes celulares, por ejemplo activacin de enzimas en las paredes celulares,
alteracin del gel pctoltico (Avallone et al, 1999).

En trminos prcticos, estas nuevas hiptesis sobre la fermentacin del muclago


inducen a proponer la utilizacin de inculos con buenas caractersticas
fermentativas. En Wootton (1966) se discute sobre bacterias lcticas como una
posibilidad, todo ello en detrimento de los microorganismos pectolticos.

3.4.3 Hacia la propuesta de un indicador qumico apropiado para la


interrupcin de la fermentacin
Jackels y Jackels (2005) publicaron los resultados de un estudio de campo sobre
los cambios qumicos que acompaan la fermentacin del caf in situ en cuatro
fincas del departamento de Matagalpa, Nicaragua. En ese estudio instrumentos
alimentados por bateras se utilizaron para medir temperatura, la concentracin del
ion hidrgeno (pH), glucosa, etanol y cido lctico a lo largo de siete lotes de caf
en fermentacin en tres fincas pequeas y en una finca cafetalera grande. A pesar
que las condiciones como temperatura, altitud, infraestructura y tiempo de
fermentacin variaron entre los lotes, se observ un patrn en el cual el pH se
presentaba inicialmente en el rango de 5.5-5-7 y posteriormente decaa de forma
abrupta a un pH de 4.6 cerca del fin de la fermentacin. Un grfico de este
comportamiento en el pH se muestra en la Figura 5:
Figura 5 - Comportamiento del pH en funcin del tiempo de fermentacin.
6.0

pH

5.5

5.0

4.5

4.0
0

10

Elapsed Time (h)

15

20

Fuente: Jackels y Jackels (2005)

Inmediatamente despus de despulpar el caf y al inicio del proceso de


fermentacin, el pH era de 5.5 o arriba y permaneca en este rango hasta 3-4
horas antes de completarse la fermentacin (aproximadamente 16 horas en esta
figura). En ese momento empieza a decaer linealmente hasta al menos dos horas
despus de completarse la fermentacin. En los casos estudiados, el tiempo en
que se completaba la fermentacin variaba desde nueve horas hasta casi veinte
horas. Basados en una comparacin de siete perfiles de pH, se determin que la
fermentacin conclua a un pH de aproximadamente 4.6 (cuando se midi con
agua purificada que contena sustancias amortiguadoras).
Este perfil de pH tiene una gran utilidad prctica para los productores de caf
porque implica que una simple medida de pH de la masa de granos en
fermentacin puede tener un valor predictivo para determinar cuando la
fermentacin estar completada y tambin puede detectar si el lote se ha
sobrefermentado. Con una medicin de pH el productor puede predecir si el lote
de caf estar listo en 3 -4 horas y por lo tanto podra planear un lavado al
momento oportuno. Por otro lado, los productores tambin pueden determinar si
los granos se han sobrefermentado cuando realizan una primera valoracin en la
maana, en tal caso puede reajustar su horario diario de lavado para evitar tal
sobrefermentacin en posteriores lotes. En cualquier caso este mtodo tendra
ms utilidad que el mtodo tradicional (Seccin 3.3.2.1).

Durante el estudio de campo, tambin se perfilaron los niveles de glucosa, etanol y


cido lctico. Se observ que la concentracin de glucosa disminuy en el
transcurso de la mayora de los lotes en fermentacin, por el contrario las
concentraciones en etanol o cido lctico aumentaron considerablemente
(aproximadamente de forma exponencial) cerca de completada la fermentacin.
Estos indicadores, as como los eventuales estudios que se realizaran con otros
cidos carboxlicos se relacionaran ms con la calidad del sabor de caf, como lo
evidenciaran

las

presencias

de

compuestos

precursores

de

sabores

desagradables en la mezcla fermentativa que eventualmente influenciaran el


sabor en el caf tostado (Holscher et al, 1990; Puerta-Quintero, 1999).

3.5 FUNDAMENTOS DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA DE


ALTO DESEMPEO (HPLC)

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a


separar se distribuyen entre dos fases, una que es estacionaria (fase estacionaria)
mientras que la otra (la fase mvil) se mueve en una direccin determinada. De
acuerdo a la naturaleza de las fases, Toshihiko (1999) clasifica la HPLC dentro
de la cromatografa lquido-lquido, la fase mvil la constituyen disolventes
orgnicos o acuosos con o sin modificadores, la fase estacionaria est formada
por molculas unidas mediante enlaces covalentes a un soporte de slica.
El objetivo de la tcnica cromatogrfica es la obtencin de un cromatograma que
permita el anlisis cualitativo y cuantitativo de todos y cada uno de los analitos
presentes en una muestra
Por la metodologa de trabajo, la HPLC se clasifica como cromatografa de elusin
porque la muestra se introduce en un momento determinado y la fase mvil circula
continuamente. Los componentes de la muestra salen de la columna como zonas,
que en el caso ideal presentan una distribucin gaussiana de concentracin y
estn separadas unas de otras (Figura 6).

Figura 6 - Cromatografa de elusin

El cromatograma que resulta cuando la fase mvil ha transportado al analito y este se


manifiesta como un seal (respuesta del detector al analito que es graficada en
dependencia del tiempo), esta seal forma picos, posteriormente se integra el rea
bajo los mismos (Adaptado de Willard, Merrit, Dean y Settle, 1988).

Los siguientes componentes hacen parte de la HPLC:


-

Eluyentes

Sistema de impulsin

Sistema de inyeccin de muestra

Columna

Detector

Sistema de control y adquisicin de datos.

Figura 7 - Componentes del sistema de HPLC.

Adaptado de Sadek (2000).

La HPLC puede ser de fase normal y de fase inversa.


La HPLC de fase normal posee una fase estacionaria polar, los componentes
ms comunes son: gel de slice, almina, gel de slice modificado con grupos
amino, diol y ciano. La fase mvil por su parte es apolar (ciclohexano, CCl4,
tolueno, CHCl3, CH2Cl2, THF, dioxano).
En este tipo de cromatografa y como resultado de las interacciones analito- fase
estacionaria, en el cromatograma los compuestos menos polares aparecern
antes que los compuestos ms polares.
La HPLC de fase inversa est constituida por una fase estacionaria no polar cuyos
componentes ms comunes son: slica modificada con grupos C2, C8 y C18., slica
modificada con grupos fenilo, o polmeros orgnicos poco polares (estirenodivinilbenceno). La fase mvil es polar (agua, metanol, acetronitrilo).

En el cromatograma los compuestos ms polares y de menor tamao aparecern


antes que los compuestos menos polares y de mayor tamao.
Existe una disponibilidad variada de detectores en HPLC, los ms comunes son:
-

Absorcin Ultravioleta / Visible

ndice de refraccin

Fluorescencia

Conductimtrico

Electroqumico

Msico (dispersin de luz)

Espectrmetro de masas

La Tabla 2 adaptada de Skoog et al (1998) compara las caractersticas de


estabilidad, selectividad, gradiente y sensibilidad para seis diferentes detectores.
Si se compara el detector de absorcin UV-VIS, con los otros tipos de detectores
se puede notar que sus ventajas radican en su alta estabilidad, sin embargo su
selectividad es media y su sensibilidad es variable.

Tabla 2 - Comparaciones entre distintos tipos de detectores


Detector
Absorcin UV-VIS
ndice de refraccin
Fluorescencia
Conductimtrico
Electroqumico
Msico

Estabilidad
Alta
Baja
Alta
Baja
Baja
Media

Fuente: Skoog et al (1998)

Selectividad
Media
No
Si
Si
Si
No

Gradiente
Si
No
Si
No
Si
Si

Sensibilidad
Variable (alta)
500 ng
Variable (0.1 ng)
5 ng
0.01 ng
50 ng

4 MARCO METODOLOGICO

4.1 DISEO EXPERIMENTAL

4.1.1 Tipo de estudio


La investigacin consisti en un estudio experimental en el cual se aplic un
diseo con grupos aleatorizados y posprueba nicamente. Esto conllev a la
formacin de tres grupos. Un cuarto grupo: inicial, se utiliz como control.

4.1.2 Universo de estudio


Se estableci como el Universo de estudio el total de lotes de caf recolectados
y procesados a razn de un lote por da en el beneficio hmedo de la finca La
Canavalia (San Ramn, Matagalpa, Nicaragua) entre el 1 de diciembre del 2005
al 30 de enero del 2006.

4.1.3 Muestra
La investigacin se realiz con 10 muestras de caf despulpado. Cada una de
estas muestras provino de un lote diferente de caf procesado en la finca La

Canavalia. Para seleccionar los lotes se utiliz un muestreo no estadstico, ms


bien resultante del criterio de los investigadores: cada muestra provena de una
fecha diferente y de acuerdo al plan de recolecta de caf de la finca, esto brind
mucha variabilidad al caf tomado como muestra. Por otro lado, para seleccionar
la muestra representativa de cada lote (60 kg) se utiliz un muestreo aleatorio
simple.

4.1.4 Montaje experimental


Para cada muestra se formaron tres grupos (G1, G2, G3), con dos repeticiones de
10 kg cada uno.

A la variable independiente de estos grupos se aplic un

tratamiento (X1, X2, X3). Las consecuencias del tratamiento se observaron en la


variable dependiente (O1, O 2, O 3). Ver Tabla 3.
Tabla 3 - Montaje experimental

RG1 (duplicado)
RG2 (duplicado)
RG3 (duplicado)

X1 (Interrupcin de fermentacin pH= 4,8-4,5)


X2 (Interrupcin de fermentacin pH= 4,4-4,1)
X3 (Interrupcin de fermentacin pH= 4,0-3,6)

O1
O2
O3

R= Formacin aleatoria de los grupos (de Random, en ingls)

4.1.5 Variables e indicadores


La

Tabla 4

presenta la operacionalizacin de las variables independiente y

dependiente. Debido a la complejidad de esta ltima, se ha decidido dividirla en


seis subvariables: estas son los cidos cuyas concentraciones se analizaron de
forma similar (por eso es el mismo indicador).

Tabla 4 - Variables e indicadores

Variable

Sub variable Indicadores

pH
de
interrupcin de
fermentacin
(Independiente)
Concentracin
. Actico
de
cido . Frmico
orgnico.
A.
Propinico
(Dependiente)
A. Lctico
A. Ctrico
A. Mlico

Valor de pH

Escala
medida
pH

de Tipo
de Tipo
de
variable
escala
de
medida
Cuantitativa
Escala de
Continua
proporcin o
razn

Altura y rea de Concentracin


pico del analito (masa
/Volumen)
en
el
cromatograma
(Cromatografa
lquida de alto
desempeo)

Cuantitativa
continua

Escala de
proporcin o
razn

A.
Galacturnico

4.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


La Figura 8 resume las etapas que se realizaron en la fase experimental. A
grandes rasgos se puede dividir en: (a) una etapa de procesamiento previo de las
muestras, muchas tareas fueron realizadas por el personal de la finca, razn por la
cual se puede considerar que las muestras eran representativas de las
condiciones de procesamiento locales. (b) Una etapa experimental en la cual las
muestras fueron monitoreadas y se les aplic el tratamiento.

Figura 8 - Diagrama de flujo del proceso experimental, Finca la Canavalia.

Ntese que solamente 200 g de la muestra se destinaron para los anlisis


cromatogrficos. La mayor parte de las muestras se utilizaron para una investigacin
(Jackels et al, 2006) sobre las cualidades de las bebidas producidas por los distintos lotes
de caf.

4.2.1 Recoleccin de las muestras


La fase experimental se realiz en la finca cafetalera La Canavalia (Figura 35,
Anexos, Seccin 10), esta se localiza en la Comunidad Yasica Sur, Municipio de

San Ramn, Matagalpa (Figura 34, Anexos, Seccin 10) . La altitud de la finca es
de 747 m.s.n.m. Posee una temperatura que oscila entre los 20 a 26 C. y una
pluviosidad que varan entre los 2000 a 2400 mm (INIFOM, 2001).
En Nicaragua predomina el cultivo de la especie Coffea arabica, por tanto esa fue
la especie que se tom para realizar los experimentos y especficamente la
variedad caturra, la cual predomina en las plantaciones de La Canavalia.
Se hizo coincidir la realizacin de los experimentos con la poca de cosecha de
caf. De esta forma, la proveniencia de los lotes de caf estaba en dependencia
del plan de corte de la finca.
La Tabla 5 presenta las fechas en que se recolectaron las muestras as como el
da en que se concluy el experimento. Es de notar que los experimentos
concluyeron normalmente un da despus de recolectadas las muestras, ms
adelante se discute el porqu.

Tabla 5 - Identidad de lote procesado, fecha de recoleccin de muestra y fecha de


conclusin del experimento.
Da

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

ID
experimento

B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Fecha de
recoleccin
de muestras

29-dic-06
30-dic-05
31-dic-05
02-ene-06
03-ene-06
04-ene-06
06-ene-06
07-ene-06
08-ene-06
09-ene-06

Fecha de
conclusin del
experimento

30-dic-06
31-dic-05
01-ene-06
03-ene-06
04-ene-06
05-ene-06
07-ene-06
08-ene-06
09-ene-06
10-ene-06

Antes del despulpado, el caf se separ por categoras: los granos rojos, los
granos verdes y los granos oscuros (Figura 9). Posteriormente, los granos se
vertieron en un tanque lleno de agua, all se identificaron y eliminaron aquellos que
flotaban (clasificado).
Figura 9 - Separacin de granos de caf de acuerdo a su estado de madurez
Las muestras de caf que
se utilizaron para los
experimentos siguieron el
mismo tratamiento que el
caf recolectado en la
finca. Se procur realizar
una seleccin de granos
rojos y se descartaron
granos
verdes
y
sobrefermentados
(de
color ms oscuro)
Cortesa de S. Jackels.

4.2.2 Despulpado
El despulpado de las muestras de caf se realiz con una despulpadora de
tambor, este tipo de despulpadora consiste en un cilindro giratorio con las paredes
interiores rugosas y con una cubierta estacionaria o coraza que cubre un tercio de
su superficie. El espacio entre el tambor y la coraza es ajustable y disminuye en el
sentido de giro del tambor. Los frutos se alimentaron mediante un sistema de
tuberas directamente desde los tanques de clasificacin al despulpador,
resultando estrujados al entrar en el hueco, rompindose el fruto y expulsando
suavemente los granos recubiertos con la piel apergaminada. La capacidad media
de este despulpador fue de 1200 a 1500 Kg/h de frutos.
La finca adquiri este despulpador gracias al apoyo de CRS en fechas recientes,
por lo tanto al ser relativamente nuevo y estar bien ajustado, se obtuvieron granos
con calidad aceptable de despulpado (pocos granos presentaba pulpa adherida).

4.2.3 Fermentacin
Luego de despulpados, los granos de caf se depositaron en un tanque de
fermentacin. Se procedi a seleccionar 60 kg de forma aleatoria, procurando
obtener una cantidad representativa de todo el lote. Los 60 kg se distribuyeron a
razn de 10 kg en cada uno de los seis recipientes exclusivamente diseados para
los experimentos (Figura 10).

Figura 10 - Recipientes de fermentacin del caf

(a) El conjunto de fermentacin de


caf consisti en cuatro elementos:
dos baldes, una tapa de filtro de
lixiviados y un aislante. El recipiente
de recoleccin de lixiviados permiti
reproducir las condiciones de
buenas prcticas de fermentacin
recomendadas
por
Gutirrez,
Medina y Gmez (2005) y Aguilar
(1997) sobre la instalacin de
drenajes
en
las
pilas
de
fermentacin con el fin de evacuar
esos lixiviados. (b) El sistema de
fermentacin en funcionamiento: 10
kg de caf recin despulpado es
vertido en los baldes experimentales.

Cortesa de S. Jackels.

4.2.4 Control experimental

4.2.4.1 Matriz para el control de datos


Con el fin de monitorear las condiciones experimentales, se ide un instrumento
de trabajo opcional: una ficha de laboratorio para registrar los cambios surgidos en
la variable independiente (pH) a lo largo del tiempo. Esta ficha se presenta en la
Figura 11, consta de dos filas con los datos generales: el cdigo del experimento
(ID, el mismo cdigo que se mencion en la Tabla 5), las fechas (la fecha en que
inici y la fecha en que concluy), la hora en que se realiz el despulpado. La
columna de las Mediciones contiene informacin sobre los datos que se deban
de registrar cada vez que se indagaba sobre el estado de la fermentacin: la hora
en que se realizaron las mediciones, la temperatura de los granos en
fermentacin, el pH medido con Reflectoquant , el pH medido con cintas de
color, la concentracin en parmetros qumicos (etanol, cido lctico, glucosa).
Cabe destacar que el pH medido con Reflectoquant funga como control, ya que
normalmente los productores utilizarn el mtodo de las cintas de color. Teniendo
en cuenta los factores de incertidumbre ligados a la lectura de las cintas de color,
el mtodo cuantitativo de Reflectoquant ayudar a precisar el grado de exactitud y
validez de las lecturas cualitativas.
La columna de los nmeros de baldes seala que a cada uno de los seis baldes
se les dio un cdigo distinto (ver ltima fila: cdigo del lote) y por lo tanto se
trataron como mediciones independientes.
Se puede notar que existen algunas columnas especiales que contienen la
inscripcin Lavado del set #, esto indica que cuando alguno de los lotes
presentes en los baldes alcanzara el pH indicado (4.6, 4.1, o 3.9), se
proceda a interrumpir la fermentacin y era necesario lavar las muestras para
eliminar el muclago remanente.

Figura 11 Hojas de datos utilizadas para el control experimental de lotes de caf en la fase
experimental.

(a) En la primera hoja se indican los datos generales, el inicio de la fermentacin, datos
intermedios y se registra si se tomaron muestra para el primer lavado (pH 4.6).

(b) En la segunda hoja se incluyen los datos relevantes sobre las muestras a las que se
ha de hacer la segunda interrupcin de la fermentacin (pH4.1) y en la tercera
interrupcin (pH3.9).

4.2.4.2 Medicin de la temperatura


La temperatura se registr mediante un termmetro digital. Este se introdujo
durante unos segundos (hasta que los datos fueran constantes) en la masa de
granos en fermentacin.

4.2.4.3 Medicin del pH


Los granos de caf se obtuvieron de la masa de caf en fermentacin. Con una
cuchara grande se hizo un hoyo en el centro de la masa, se levantaron granos del
centro de la masa (20 gramos) y se llen hasta la marca del vaso marcado
granos. Se llen de agua pura (20 mL) el vaso marcado agua hasta la marca.
Luego el agua se agreg al vaso granos y se revolvi por 15 segundos.
Posteriormente el pH se midi por uno de dos mtodos:
(a) Cintas de pH, colorpHast de EMD Chemicals. Se dispona de un set de
cintas que marcaban en el rango de 4.0-7.0 (Catlogo EM-9582-1) y otro en el
rango de 2.5-4.5 (Cat. EM-9581-3).
Se introdujo la cinta de pH en la solucin de la taza granos y se mantuvo
sumergida por 5 segundos. Se sac la cinta y se removi el exceso de lquido.
Inmediatamente se compar la cinta de pH con la tarjeta de colores para
determinar el valor de pH. Si el color concordaba con la tarjeta, se anotaba el
nmero. Si el color estaba entre dos bloques de colores se anotaba el nmero
entre los dos bloques de colores
(b) Cinta de Test pH en el rango de 1.0- 5.0 (Cat. EM-16894-1) para el Sistema de
Anlisis Reflectoquant (Cat. EM-16950-1) de EMD Chemicals.
Ambos datos se registraron en la anterior hoja de datos.

4.2.4.4 Medicin de cido lctico


Solamente se midi la concentracin de cido lctico antes de lavar las muestras
cuyo pH hubo alcanzado el valor deseado. Esto se hizo con la misma solucin de
granos y agua a las que se midi el pH.
Para ello se utiliz el mismo sistema Reflectoquant con cintas de medicin de
cido lctico (Cat. EM-16127-1) cuyo rango de medicin oscila entre 1-60 mg/mL.
Este test determin la presencia de cido lctico total (suma de D-Lctico y LLctico),
4.2.4.5 Medicin de Glucosa
La concentracin de glucosa se midi solamente antes de lavar las muestras cuyo
pH hubo alcanzado el valor previsto en el diseo experimental. Se utiliz el
sistema Reflectoquant con cintas de medicin de glucosa (Cat. EM-16720-1)
cuyo rango de deteccin oscila entre 1-100 mg/mL. Los datos se agregaron a la
matriz de registro de datos.
4.2.4.6 Medicin de etanol
Al igual que los otros dos parmetros, los registros se hicieron solamente cuando
las muestras alcanzaron un pH deseado para su lavado. Tambin se utiliz el
sistema Reflectoquant con cintas de medicin de etanol (Cat. EM-16130-1) con
un rango de deteccin entre 20-200 mg/mL).
4.2.4.7 Medicin de cido mlico (Fase de laboratorio solamente)
Solamente se midi la concentracin de cido mlico durante la fase de
laboratorio (Seccin 4.3). Esto se hizo con la misma mezcla de granos y agua a
las que se midi el pH.

Se utiliz el sistema Reflectoquant con cintas de medicin de cido mlico cuyo


rango de medicin oscila entre 1 60 mg/mL. En la fase de laboratorio por lo
general las muestras se diluyeron a un factor 1:10.

4.2.5 Interrupcin de la fermentacin

4.2.5.1 Toma

de

muestra

refrigeracin

para

posterior

anlisis

cromatogrfico
Cuando la muestra alcanz el pH requerido, y antes de proceder al lavado del caf
contenido en determinado balde, se procedi a tomar alrededor de 500 g de forma
representativa del caf contenido en dicho balde.
Estas muestras de caf se empacaron en bolsas plsticas con cierre hermtico y
se guardaron apropiadamente en el congelador de la finca (que tena temperatura
cercana a los 0C).
Para transportar las muestras hasta Managua y posteriormente hasta el
laboratorio en Seattle, se utilizaron hieleras porttiles con congelantes qumicos,
para mayor seguridad se mantuvo la temperatura cercana a 0C dentro de estas
hieleras.
Las muestras permanecieron en un congelador a una temperatura constante y
cercana a 0C hasta que se realizaron los anlisis cromatogrficos.
De acuerdo a Masoud et al (2004) la temperatura cercana al punto de
congelamiento es un mtodo para interrumpir la fermentacin, ya que se logra
disminuir el crecimiento de la microflora a niveles en los cuales la produccin de
subproductos metablicos no es considerable.

4.2.5.2 Lavado de muestras para posterior catacin


Luego que se separaron 200 g para congelamiento, el resto de la muestra de caf
dentro de cada balde se utilizara para una catacin profesional.
Esta catacin permitira tener una idea de las diferencias entre las calidades
obtenidas para los distintos lotes, como complemento al anlisis cromatogrfico de
los cidos carboxlicos (Jackels et al, 2006).
Para interrumpir la fermentacin, se realiz un lavado a pequea escala de la
muestra contenida en el balde. En condiciones normales, los productores utilizan
grandes cantidades de agua y grandes tanques para realizar este lavado.
Para lavar cada una de las muestras se utilizaron seis barriles de agua limpia y un
cucharn de aluminio. El objetivo era remover el muclago que pudiera quedar
adherido a las paredes.
Con ayuda de un colador se retiraron todos los materiales flotantes y de forma
manual se retiraron los restos de pulpa.

4.3 PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO


La fase de laboratorio se realiz en tres etapas sucesivas (Figura 12):
primeramente, una etapa de extraccin de los cidos carboxlicos con el fin de
obtener una solucin diluida del muclago presente en cada una de las muestras.
Esta solucin fue posteriormente analizada mediante HPLC.
De forma paralela se realiz un monitoreo rpido mediante la tcnica de las cintas
de pH, cido lctico y cido mlico del sistema Reflectoquant (Ver
Seccin 4.2.4).

4.3.1 Protocolo de extraccin de cidos carboxlicos.


El protocolo indicado en la Figura 12, estaba diseado para analizar cada una de
las muestras por separado. Por esta razn, antes de iniciar con el
descongelamiento se levant un registro de las muestras que haba en existencia
y posteriormente se decidi realizar las extracciones en el orden correspondiente a
cada experimento. De esta forma, cada da se realizaron solamente extracciones
para las muestras de un da de experimentos.
Puesto que el objetivo era realizar las diluciones de acuerdo al mismo factor de
dilucin con que se realizaron durante la fase experimental (en ese entonces se
llen un vaso plstico con granos de caf hasta la marca de 50 mL), de cada una
de las muestras descongeladas se tom el equivalente a 30 g de caf y se agreg
un volumen de 50 mL de agua destilada con calidad HPLC.

Figura 12- Diagrama de flujo de la fase de laboratorio.

A grandes rasgos la fase de laboratorio se dividi en tres etapas importantes: la


extraccin de los cidos carboxlicos, la medicin de parmetros qumicos (pH, cido
lctico y cido mlico) para tener una impresin inicial de la muestra antes de realizar el
anlisis cromatogrfico y la cuantificacin cromatogrfica.

Las muestras se agitaron durante 45 minutos con un agitador magntico,


experimentalmente se determin que este era el tiempo ms conveniente para
extraer el muclago que permaneca adherido a los granos de caf. Se lleg a esta
conclusin tras realizar anlisis de muestras variando el tiempo de agitacin
sucesivamente en 30, 45 y 60 minutos.
Luego de la agitacin, se extrajo lquido sobrenadante con la ayuda de una pipeta
Pasteur y se distribuy en cuatro viales de 1 mL. Con la ayuda de una micro
centrfuga se procedi a centrifugar a una velocidad de 10 000 revoluciones por
minuto durante cinco minutos.
Se decant la solucin sobrenadante de los viales con ayuda de la pipeta Pasteur
en un filtro de micro fibra de vidrio de 0.45 m. Posteriormente la solucin filtrada
se verti en una jeringa y se hizo pasar por un filtro de 0.2 m de nylon.
La solucin obtenida estaba lista para ser analizada por medio de HPLC antes de
mezclarla con un patrn interno (Ver la Seccin 4.3.4) bajo determinadas
condiciones

cromatogrficas

un

factor

de

dilucin

especfico

(Ver Seccin 4.3.2).


Los volmenes de la muestra (1400 L) y el del patrn interno (200 L) se
midieron con una micro pipeta (rango de 100 a 1000 L), estos se vertieron en
viales de 1.5 mL para HPLC y se sellaron con un tapn de caucho. Una vez
sellados se agitaron fuertemente y se colocaron en el auto inyector del HPLC.
La Tabla 6 resume los materiales y equipos que se utilizaron durante la etapa de
extraccin de los cidos.

Tabla 6 - Materiales y equipos utilizados durante la fase de laboratorio (etapa de extraccin


de cidos carboxlicos y de monitoreo rpido con Reflectoquant)

Etapa
Pesado

Material
Balanza analtica

Adicin de agua

Esptula
Beaker de 150 mL
Agua HPLC

1
1 por muestra
50 mL

Probeta de 50 mL
Agitador magntico
con imanes
Cronmetro
Pipeta Pasteur
Viales de
centrifugado
Micro centrfuga
Microfiltro de 0.45
m

1
1 por muestra

Agitacin
Centrifugado

Filtrado

Encapsulado para
HPLC

Medicin rpida de
parmetros
qumicos

Microfiltro de 0.2 m
Vial con tapa de
rosca para preservar
el filtrado.
Viales para HPLC
micro pipeta, rango
100 a 1000 L
Puntas para micro
pipeta
Procesador
Reflectoquant
Cintas reflectoquant

Cantidad

1 por muestra
4 por muestra
1
1 por muestra
1 por muestra
1 por muestra

Fabricante
ScienTech,
Loveland, CO, USA
Acros, New Jersey,
NJ, USA
Hach, Loveland, CO,
USA
Fischer Scientific

Whatman Schleider
& Schuell, New
Jersey
Fischer Scientific

1 por muestra

Agilent

Gilson pipetman

1 para muestra,1
para patrn interno
2

EMD Chemicals

1 set de 50 cintas
(cido lctico,
mlico, pH)

EMD Chemicals

4.3.2 Condiciones de anlisis cromatogrfico


El instrumento de HPLC con el cual se realizaron los anlisis est constituido por
un set de mdulos individuales (Figura 13):
1. Un reservorio de solventes para la fase mvil. Como fase mvil se utiliz
una solucin de fosfato de amonio dibsico (NH4H2PO4) al 0.5 % a un pH
de 2.8. Esta fase mvil la recomiendan Lpez et al (1989) para el anlisis
con HPLC de cidos carboxlicos en el muclago del caf. Antes de
empezar a utilizar la fase mvil se desgasific por medio de un
desgasificador de ultrasonido, el propsito era evitar que burbujas
interfirieran en el anlisis.
2. La fase mvil se distribua a la columna por una bomba, en este caso se
utiliz una bomba ISCO, modelo 2350. Esta deba ser programada para que
fluyera la fase mvil a una presin constante. Se control la presin y el
flujo (volumen /min) porque de esta forma habr una separacin constante
basada en la presin y en el tiempo de anlisis. En este caso se utiliz un
flujo isocrtico (constante) de 0.8 mL/min y la presin se mantuvo en el
rango de 740 - 810 PSI.
3. Antes de la columna de separacin se recomienda colocar una columna de
proteccin o pre-columna para prevenir la contaminacin o daos en la
columna principal por partculas pequeas presentes en la muestra o en la
fase mvil. Para este anlisis se ha utilizado una precolumna Prevail para
cidos carboxlicos (Dimetro interno de 4.6 mm y largo de 7.5 mm).
4. La columna de separacin contiene el empacado necesario para cumplir
con la separacin deseada de compuestos. En este caso se utiliz una
columna de fase inversa Alltech Prevail para cidos carboxlicos, con 5m
de empacado, con dimetro interno de 4.6 mm y largo de 150 mm (Alltech
Chromatography, Deerfield, IL, EEUU).

5. El inyector automtico utilizado, Alltech 570, trae incorporado su


controlador. Posee un carrusel con espacio para 100 viales, en cada vial
(cuya capacidad es de 1.5 mL) se puede colocar una muestra.

El

controlador solamente permite controlar para el conjunto de muestras los


parmetros de volumen de inyeccin (20 L), el nmero de repeticiones (3),
el tiempo de anlisis (20 minutos). Luego de cada inyeccin, para evitar
cualquier contaminacin, el circuito en contacto con la muestra se enjuaga
con el mismo lquido de la fase mvil, se program un volumen de 100 L
para este enjuague.
6. Se utiliz un detector de absorbancia Ultravioleta/ Visible, Spectraphysics,
SP 8450. Este permiti ajustar la longitud de onda en 214 nm, tal como
recomiendan Lpez et al (1989) para la deteccin de cidos carboxlicos en
muestras de muclagos de caf.
7. Para la recoleccin de datos se utiliz el sistema Peak Simple, el cual est
compuesto por un hardware y un software. El detector se conecta
directamente al hardware, posteriormente la seal es enviada al sistema de
anlisis por medio del software Peak Simple V. 3.29 de SRI, Inc (2004).
Este sistema permite simplificar la integracin manual y automtica de las
reas bajo los picos, identificar los picos en el cromatograma (agregando
componentes en dependencia de sus tiempos de retencin), realizar tareas
ms complejas como la extrapolacin de diferentes cromatogramas,
exportar los resultados hacia otros programas como Microsoft Excel ,
guardar los cromatogramas en archivos y posteriormente abrirlos en
cualquier otra computadora, obtener reportes impresos de los datos
obtenidos.
Un resumen de las condiciones de anlisis cromatogrfico se presenta en la
Tabla 7.

Tabla 7 - Condiciones de anlisis cromatogrfico.

Fase mvil

Fase
estacionaria

Inyector

Detector
Recoleccin
datos

Compuesto

Fosfato de amonio dibsico 0.5%,


pH 2.5-2.8
Bomba
ISCO 2350
Flujo
0.8 mL/min
Presin
740-850 PSI
Tipo de columna
Fase inversa, Alltech Prevail para cidos
carboxlicos.
Dimensiones (dimetro 4.6 x 150 mm
interno x largo)
Dimetro del empacado 0.5 m
Modelo
Alltech 570, inyector automtico
Volumen inyectado
100 L
Nmero de inyecciones 3
Tiempo de anlisis
20 minutos
Volumen de enjuague 100 L
entre inyecciones
Modelo
Spectraphysics, SP 8450.
Longitud de onda
214 nm
de Hardware
Sistema Peak Simple
Software
Peak Simple, V. 3.29, SRI, Inc (2004)

Figura 13- Mdulos del sistema HPLC utilizados en la presente investigacin.

Los mdulos del sistema HPLC utilizados en la presente investigacin consisten en


(a) Reservorio de solventes para la fase mvil (b)Un sistema de bombeo ISCO 2350,
ISCO inc, USA acoplado a un sistema de programacin por gradiente ISCO 2360
(c) Inyector Alltech 570 (d) Columna Alltech Prevail para cidos carboxlicos,
Chrom 9384 (e) Detector Ultra Violeta Spectraphysics, SP 8450 UV/Vis Detector
(f) Sistema para colectar los datos Peak Simple Chromatography Data System
(g) Computadora para visualizacin y almacenamiento de la informacin, se utiliz el
software Peak Simple Version 3.29 de SRI, Inc (2004).

4.3.3 Anlisis cualitativo


El anlisis cualitativo tiene como objetivo identificar los tiempos de retencin o el
orden de elusin de los compuestos en una muestra, en este caso los cidos
carboxlicos, para esto se hicieron los siguientes ensayos:
1.

Inyeccin de muestras estndares de los cidos carboxlicos que se

presuma estaran presentes en las muestras de caf. Se utilizaron cidos


carboxlicos (galacturnico, mlico, ctrico, lctico, propinico, actico y frmico)
diluidos en agua destilada con calidad HPLC, algunas caractersticas de estos
cidos se detallan en la Tabla 8. Para cada cido se analizaron cinco
concentraciones diferentes (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL), se registraron los tiempos y por
ende, el orden de elusin de los compuestos. Las condiciones de anlisis se
presentan en la Tabla 9.
Tabla 8 - Caractersticas de los cidos carboxlicos utilizados como estndares.

cido

Frmico

Grado de
pureza
95 97%

Propinico
ND
Galacturnico 98%
Mlico

ND

Lctico

ND

Actico

100%

Ctrico

99.9%

Fabricante
Sigma
Chemical,
USA
ND
Fluka, Suiza
Sigma,
China
J.T. Baker
Chemical,
USA
Fisher
Scientific,
USA
J.T. Baker
Chemical,
USA

Frmula

HCOOH

Peso
Molecular
(g/mol)
46.0

Fase

Lquido

CH3CH2COOH 74.0
C6H9NaO7
216.12

Lquido
Slido

C4H6O5

134.09

Slido

C3H6O3

90.1

Lquido

CH3COOH

60.0

Lquido

H3C6H5O7

192.13

Slido

ND: No indicado en el envase pero mayor a 95% de acuerdo a los registros del inventario
en el laboratorio.

Tabla 9 - Condiciones de anlisis cromatogrfico para el anlisis cualitativo (tiempos y


orden de elusin de cidos carboxlicos)

Sistema de bombeo: Beckmann.


Sistema de inyeccin: Inyector automtico Alltech 570.
Volumen de inyeccin: 100 l
Columna: Alltech Prevail para cidos carboxlicos Chrom 9384
Fase mvil: Fosfato de amonio 0.5 %, pH 2.8
Flujo: 1 mL /min
Detector: Spectraphysics SP 8450 UV/Vis Detector
Tiempo de elusin: 15 minutos

2.

Se realiz un anlisis de los tiempos y rdenes de elusin de los cidos

carboxlicos tomando en cuenta un medio diferente al agua con calidad HPLC,


este medio fue el extracto de muclago de caf. Se utilizaron las mismas
condiciones cromatogrficas con que se analizaron todas las muestras (Tabla 7).
En este caso se utilizaron cidos carboxlicos estndares (Tabla 9), estos
estndares se mezclaron en una sola solucin a una concentracin de 8 mg/mL.
Posteriormente se realizaron diferentes ensayos con muestras representativas de
cada grupo experimental (Tabla 10).
Los resultados de los cromatogramas de las soluciones de muclago ms los
estndares se compararon con los cromatogramas resultantes de soluciones de
muclago sin estndares. Esto se realiz con la sobreposicin de cromatogramas
mediante el software PeakSimple , de esta forma fue posible apreciar los
tiempos de retencin en que hubo aumento en las reas de los picos.

Tabla 10 - Muestras con que se realiz el anlisis cualitativo.

Cdigo

Grupo
experimental /pH
en que se
interrumpi la
fermentacin
3.7

5307 D

3.9

6832 K

4.8

6346 E

6.3

8410 B

Caractersticas de la solucin

1400 L muestra, 200 L estndares a 8 mg/mL


1400 L muestra, 200 L cido frmico (1mg/mL) *
1400 L muestra, 200 L patrn interno (blanco)
1400 L muestra, 100 L estndares
1400 L muestra, 200 L estndares
1400 L muestra, 200 L patrn interno (blanco)
1400 L muestra, 100 L estndares
1400 L muestra, 200 L estndares
1400 L muestra, 200 L patrn interno (blanco)
1400 L muestra, 100 L estndares
1400 L muestra, 200 L L estndares
1400 L muestra, 200 L patrn interno (blanco)

(*) Se realiz este ensayo con cido frmico para determinar la posicin de este pico con
respecto a la de un pico aledao.

4.3.4 Anlisis cuantitativo


El anlisis cuantitativo permiti determinar la cantidad de analito presente en la
muestra. En los anlisis cromatogrficos se pueden utilizar una amplia variedad de
mtodos para cuantificar al analito, Snyder (1997) menciona como ms
sobresalientes a las normalizaciones tanto interna como con factor de respuesta y
a los patrones externo o interno.
En esta investigacin se utiliz el mtodo del patrn interno, Johnson y Stevenson
(1978) indican que ste sirve para minimizar los errores asociados a la
preparacin de la muestra, del aparato y de la tcnica.

Este mtodo consiste en la adicin de un estndar que posee un tiempo de


retencin diferente, pero que estructuralmente est relacionado con la muestra. Se
prepara una mezcla de cidos carboxlicos estndares y del patrn interno para
ser inyectada en el cromatgrafo. La composicin puede determinarse a travs de
las reas de los picos del patrn interno y del compuesto de inters. Cabe
destacar que esta tcnica no deja establecido que todos los compuestos han sido
elucidados y detectados en el cromatograma, en efecto, esta tcnica a menudo
indica que podran existir otros compuestos en la muestra original pero no han
sido determinados (por eso es importante realizar un anlisis cualitativo de forma
paralela).
Los requisitos que debe cumplir una solucin para ser considerada patrn interno
son los siguientes:

El pico producido debe destacarse claramente del resto de los picos en la


muestra.

Debe elucidarse cerca de los picos de inters.

Debe ser similar en concentracin y respuesta al detector que los picos de


inters.

No debe de reaccionar con ningn compuesto en la mezcla.

No debe de estar presente en la muestra original.

Debe ser de alta pureza y de disponibilidad inmediata.

El compuesto que cumpli todos estos requisitos y por lo tanto se utiliz como
patrn interno es el cido pirazincarboxlico, cuya frmula es C5H4O2N2, su
estructura molecular se presenta en la Figura 14.
Esta tcnica tambin requiri disponibilidad de estndares puros de los
compuestos de inters (ya se presentaron en la Tabla 8). Con los estndares se
prepararon diferentes mezclas que contenan los compuestos de inters a

diferentes concentraciones, pero todos contenan la misma cantidad de patrn


interno. Luego de realizar el anlisis cromatogrfico y de obtener las reas bajo los
picos, se prepar una curva de calibracin (Figura 15) al graficar la concentracin
de cido (Cm) en dependencia de Ai/ Api (donde Ai es el rea de los estndares y
Api es el rea del patrn interno).
Figura 14 - cido pirazincarboxlico (patrn interno).

Adaptado de Smith y Martell (1989).


Figura 15 - Curva de calibracin para el anlisis por el mtodo del patrn interno.

Puesto que la cantidad de patrn interno que se adiciona a las muestras y a los
estndares es la misma (Cmpi) el eje de las X se puede representar simplemente como
la concentracin en cido (Cmi). Adaptado de Johnson y Stevenson (1978).

El patrn interno que se seleccion, present un tiempo de retencin de 13.633


minutos, el cual es diferente del resto de cidos carboxlicos utilizados como
estndares. Se decidi utilizar una concentracin de 0.05 mg/mL, porque se
observ que la absorbancia en UV/Vis a la longitud de onda de 214 nm brinda un
rea similar al resto de estndares, el cromatograma puede verse en Anexos,
Seccin 10.

4.4 ANLISIS DE LOS RESULTADOS

4.4.1 Clculo de la incertidumbre asociada a la curva de calibracin


Se utilizaron las tcnicas de anlisis estadstico propuesto por Loconto (2006). La
curva de calibracin obtenida por el mtodo del patrn interno se analiz con el
objetivo de identificar qu tan confiable son los parmetros obtenidos por el
mtodo de los mnimos cuadrados. Para ello primeramente se encontr la
desviacin estndar de la recta de calibracin sumando los cuadrados de las
diferencias entre las respuestas experimentales y calculadas del detector para los
N puntos de calibracin (Ecuacin 1):

Sy/x =

(y

e
i

yic ) 2

Ecuacin 1

N 2

Aqu Sy/x representa la desviacin estndar de los residuales verticales y N-2


representa el nmero de grados de libertad. N es el nmero de nmeros puntos de
datos x, y que se utilizaron para construir la recta de calibracin, menos un grado
de libertad utilizado para calcular la pendiente y un segundo grado de libertad que
se utiliz para determinar el intercepto en y.

La incertidumbre tanto de la pendiente como del intercepto de la curva de


calibracin se encontraron utilizando las siguientes ecuaciones, las cuales
permitieron calcular tanto la desviacin estndar de la pendiente, Sm (Ecuacin 2),
como la desviacin estndar en el intercepto, Sb (Ecuacin 3):

Sm =

Sb =

Sy/x

N
i

Ecuacin 2

xi x

S y / x i xi2
N i xi x
N

Ecuacin 3

4.4.2 Clculo de la incertidumbre asociada a la interpolacin de


resultados
Para una determinada respuesta del instrumento, y0, el valor correspondiente x0
se obtuvo por la interpolacin de la curva de calibracin. La desviacin estndar
en x0 se obtuvo mediante la Ecuacin 4:
S x0 =

Sy/x
m

( y y )2
1 1
+ + 2 0N
L N m xi x 2
i

Ecuacin 4

En donde Sx0 representa la desviacin estndar en el valor interpolado x0 y L


representa el nmero de rplicas en la medicin de y0 para la calibracin, teniendo
N puntos de datos x, y.

4.4.3 Clculo de los lmites de deteccin del mtodo


Una de las principales ventajas de utilizar mtodos instrumentales de anlisis es
que estos son capaces de detectar y determinar trazas y ultratrazas de los
analitos. En trminos generales, el lmite de deteccin de un analito puede
describirse como la concentracin que brinda una respuesta del instrumento
distinta a la del blanco o la del ruido.
En esta investigacin se utiliz la frmula planteada por la Agencia de Proteccin
Ambiental de Estados Unidos (U.S. Environmental Protection Agency, 2004) para
calcular el lmite de deteccin del mtodo (MDL), este se define como la mnima
concentracin de una sustancia que puede medirse y puede reportarse con un
99 % de confianza que la concentracin del analito ser mayor de cero. MDL no
implica ni exactitud ni precisin en el mtodo cuantitativo.
El mtodo de la USEPA especifica un mnimo de siete rplicas (n) de muestras
con cantidades bajas aadidas de un estndar. Estas rplicas se analizan por
medio del instrumento y su seal se registra, los datos producirn una distribucin
normal. Por lo tanto este mtodo consiste en la concentracin a la cual no ms
que 1% de las mediciones en blanco resultan en detecciones falsas positivas (esto
implica reportar una deteccin cuando la sustancia no est presente en la
muestra), para su clculo se utiliz la Ecuacin 5:
MDL = s + t n1, =0.99

Ecuacin 5

En donde :
n = nmero de rplicas de estndares analizados mediante el instrumento
por lo general n es 7
s = desviacin estndar de n
t = valor de t de Student con n - 1 grados de libertad
= nivel de significancia

El significado de esta definicin se ilustra con ms detalles en la Figura 16. La


curva A representa la distribucin normal de los valores medidos de la seal del
blanco. Es posible identificar un punto y = P, en la parte ms alta de esta
distribucin e indicar que una seal mayor que este valor difcilmente pueda
deberse al blanco, mientras que una seal inferior a P se asume como resultado
de la muestra blanco.
Figura 16 - Definiciones del lmite de deteccin del Mtodo (MDL)

El mtodo de la Agencia de proteccin Ambiental de Estados Unidos est diseado


para una concentracin que provean un rango falso positivo de no ms del 1 por ciento
(s es la desviacin estndar; t es el valor de la t de Student al 99 % de confianza).
Adaptado de USEPA (2004)

Finalmente se calcul el valor de concentracin que corresponde a este lmite de


deteccin mediante una sustitucin en la recta de calibracin obtenida por el
mtodo de los mnimos cuadrados (Ecuacin 6), los valores MDL corresponden al
lmite de deteccin (Ecuacin 5).
MDL = int ercepto + pendiente x 0
x 0 = ( MDL int ercepto ) / pendiente

Ecuacin 6

4.4.4 Muestras analizadas


Las muestras a las que se realiz anlisis cromatogrfico se presentan en la
Tabla 11.
Tabla 11 - Muestras utilizadas para el anlisis con HPLC
Experimento

Cdigo

pH (papel)

Archivo del
cromatograma

5082
8189
8410
3470
2585
6053
2837
6053
1510
5307
1293
5122
6346
3727
9370
7118
9296
6181
8071
5000
9801
6615
2935
5169
2935
Beneficio
8507
6319
6319
5583
6832
6174
6174
7060
3539
8548

4.5
3.9
6.3
4.3
4.2
4.7
4.2
6.3
4
3.7
4.2
3.9
4.8
4.2
3.8
4.4
4.7
3.9
6.1
4
4.2
4.4
6.1
4.5
4.6

coffee_nic140
coffee_nic79
coffee_nic88
coffee_nic85
coffee_nic82
coffee_nic149
coffee_nic146
coffee_nic152
coffee_nic143
coffee_nic112
coffee_nic118
coffee_nic115
coffee_nic134
coffee_nic131
coffee_nic128
coffee_nic137
coffee_nic159
coffee_nic156
coffee_nic168
coffee_nic171
coffee_nic174
coffee_nic180
coffee_nic183
coffee_nic186
coffee_nic189
coffee_nic192
coffee_nic198
coffee_nic195
coffee_nic201
coffee_nic227
coffee_nic230
coffee_nic233
coffee_nic236
coffee_nic239
coffee_nic242
coffee_nic245

4
3.8
6.1
4.3
3.9
4.7
6.1
4.2
3.9
3.8

Los nombres de los archivos listados corresponden al archivo impreso del


cromatograma, se puede ver que cada muestra se analiz por triplicado, ello tena
el objetivo de obtener una desviacin estndar y un anlisis estadstico ms
apropiado.

4.4.5 Instrumento de obtencin de datos


Consisti en una matriz dividida en tres columnas (grupos experimentales).
Existen divisiones horizontales cada 10 filas (una fila por muestra) para un registro
separado de cada subvariable (Tabla 12). Los resultados recolectados en el
instrumento se presentan en la Seccin 5.2.3.

Tabla 12 - Instrumento para la recoleccin de datos.

Grupos y
duplicados
Subvariables

. Actico
10 filas,
muestra

A. Propinico
10 filas
A. Lctico
10 filas
A. Ctrico
10 filas
A. Mlico
10 filas
A. Galacturnico
10 filas

por

Concentracin de cido orgnico


Inicial (pH= 1 (pH= 4,8- 2 (pH= 4,4- 3 (pH= 4,06.1-6.3)
4,5)
4,1)
3,6)

4.4.6 Tcnicas estadsticas para el anlisis de los datos


Para el anlisis estadstico, se siguieron las recomendaciones de Miller y Miller
(2000). Se utiliz el software SPSS V.11.0 (Lead Software, 1991) con el fin de
realizar las pruebas estadsticas de forma ms eficiente.
Se hicieron dos tipos de anlisis a los datos plasmados en el instrumento de
investigacin. Primeramente se hicieron comparaciones estadsticas para
identificar las fuentes de variacin entre los grupos (inicial, uno, dos y tres) sin
tomar en consideracin las variaciones debidas a los experimentos. En ese caso
se tom en cuenta una configuracin de ANOVA una va.
A los datos configurados mediante ese diseo (Ver Seccin 5.3.1) se realiz en
primer lugar un anlisis exploratorio (Ver Seccin 5.3.2) con el propsito de
determinar si seguan una distribucin normal (prueba Kolmogorov-Smirnov).
Con este mismo anlisis exploratorio se obtuvieron grficos de cajas o boxplots
con el propsito de evaluar de una forma rpida aspectos como la distribucin de
los valores alrededor de la mediana y la identificacin de potenciales puntos
aberrantes. Los puntos sospechosos de ser aberrantes se sometieron a una
prueba estadstica (Prueba de Dixon para pruebas con 3 a 7 datos, o la Prueba
de Grubbs para mayor nmero de datos) para determinar si se descartaban o no
de los datos antes de proceder con otras pruebas.
Cuando se hubo determinado si las muestras seguan una distribucin normal, se
utiliz la prueba paramtrica ANOVA una va (Seccin 5.3.2.1). Una variacin de
la prueba ANOVA una va permiti realizar contrastes entre grupos para
determinar entre cules yacan las tendencias que haca variar entre s a los
grupos.
Se utiliz una prueba no paramtrica en caso que los datos no siguieran una
distribucin normal: prueba Kruskali-Wallis, la prueba de las Medianas se utiliz
como una prueba no paramtrica de respaldo (Seccin 5.3.2.2).

Posteriormente los datos se analizaron tomando en cuenta las variaciones tanto


entre grupos como entre experimentos, en ese caso se utiliz una configuracin
experimental ANOVA dos vas (Seccin 5.3.4).
Dicha configuracin permite comparaciones solamente si no existen espacios en
blanco tanto para las columnas como para las filas presentes en el instrumento de
investigacin. Es decir, las columnas y las filas por comparar deben poseer el
mismo nmero de datos.

5 RESULTADOS

5.1 ANLISIS CUALITATIVO

5.1.1 Orden de elusin de cidos carboxlicos


El primer experimento tuvo como objetivo determinar el orden de elusin de los
cidos carboxlicos que se deseaban identificar y cuantificar en el muclago de
caf. Como se indic en la seccin 4.3.3, esto se realiz con estndares de cidos
carboxlicos diluidos con agua calidad HPLC, las concentraciones de trabajo
fueron de 1, 2, 3, 4 y 5 mg/mL. Los tiempos de elusin promedio para cada
concentracin de cada cido facilitaron la determinacin del orden de elusin, la
Tabla 13 presenta este orden y los cromatogramas se pueden consultar en
Anexos, Seccin 10.

Tabla 13 - Orden de elusin de cidos carboxlicos, anlisis cualitativo


cido
orgnico
Galacturnico
Frmico
Mlico
Lctico
Actico
Citrco
Propinico

Tiempo de elusin
promedio (min)
2.0
2.5
3.0
3.7
4.2
5.3
11.1

Orden de
elusin
1
2
3
4
5
6
7

Esta identificacin se realiz con las condiciones de anlisis cromatogrfico


establecidas en la Tabla 9, pg. 66. Aunque las condiciones de anlisis
cromatogrfico cambiaran para la elaboracin de la curva de calibracin y para el
anlisis de las muestras, el conocimiento de los rdenes de elusin fue
fundamental para identificar los picos en dichos anlisis.
Uno de los elementos que se modific en los posteriores anlisis fue el flujo de
elusin de la fase mvil, originalmente este fue de 1 mL/min, sin embargo esto
prob ser un flujo muy alto, no suficiente como para separar los componentes de
la muestra y por ende la resolucin de los picos en el cromatograma no era
adecuada. Con un flujo de 0.8 mL/min se separaron mejor los componentes y los
picos se pudieron integrar mejor.

5.1.2 Identificacin de cidos carboxlicos en las muestras


Los picos que se eluyeron en cada uno de los cromatogramas se identificaron
inicialmente por letras en orden alfabtico (A-M), esto con el objetivo de agilizar el
anlisis cuantitativo (determinacin de reas) y as evitar errores de adjudicacin
de identidad a un determinado pico. En el diseo de impresin de cada
cromatograma se agreg un reporte en el cual se identificaban estos picos con su
tiempo de elusin, altura y rea.
Los datos de cada uno de estos picos junto con su rea se aadieron a una hoja
de clculos (hoja madre), para posteriormente identificar a qu cidos
correspondan cada uno de estos picos y luego utilizar los datos de rea para
propsitos del anlisis cuantitativo.
Para realizar dicha identificacin, se seleccionaron tres muestras representativas
de todo el conjunto disponible y provenientes de experimentos diferentes, pero
que mostraron una resolucin aceptable de los picos para cada cido orgnico.
Cada muestra se separ en tres viales y a cada vial se aadieron diferentes
volmenes de la mezcla de cidos carboxlicos a una concentracin de 8 mg/mL,

al tercer vial se aadi solamente el patrn interno (una descripcin detallada de


este procedimiento se indic en la Seccin 4.3.3).
El propsito de aadir una mezcla de estndares era aumentar el rea de los
picos de la muestra, posteriormente se sobrepondran ambos cromatogramas (la
muestra sin la mezcla de cidos y la muestra con la mezcla de cidos), la
diferencia en el rea de cada uno de los picos identificados previamente con las
letras de la A-M indicaran qu picos presentaron un aumento sustancial.
La seguridad o la decisin de otorgarle a un determinado pico un cido en
particular, se basara en los hallazgos previos del orden de elusin (ver
Seccin 5.1.1).
Luego de analizados los cromatogramas para las tres muestras se encontr que
los picos que incrementaron fueron A, C, D, E, G, I, K y L. El pico M corresponda
por defecto al patrn interno: cido pyrazincarboxlico. Los cromatogramas se
pueden consultar en Anexos, Seccin 10.3.
Basado en los anteriores resultados, se concluy que los siguientes picos en los
cromatogramas correspondan a los siguientes cidos (Tabla 14).
Tabla 14 - Picos en los cromatogramas y cidos carboxlicos a los que corresponden

Picos en el cromatograma
cido orgnico al que correspondera
A
Galacturnico
B
Frmico
D
Mlico
E
ND*
G
Actico
I
Ctrico
L
Propinico
M
Patrn interno (Pirazinecarboxlico)
* Al inicio este pico se crea que perteneca al cido lctico.

Una dificultad especial se present inicialmente con la identificacin de los picos D


y E, sus tiempos de elusin eran muy similares y por lo tanto haban posibilidades
de cometer errores al otorgarle un valor en especial. Finalmente un anlisis con
adicin de cido Mlico permiti concluir que el pico D corresponda a dicho cido.
El pico E por el contrario constituy una identificacin particularmente difcil y se
concluy que no corresponda a ninguno de los siete estndares utilizados,
aunque en un inicio se crea que dicho pico correspondera al cido lctico, como
se ver ms adelante los controles realizados con el sistema Reflectoquant no
arrojaron resultados concordantes en cuanto a la concentracin. Por otro lado al
adicionar una concentracin ms concentrada de la mezcla de estndares, el pico
E parece dividirse en dos, con la aparicin de un segundo pico muy cerca de la
localizacin F.
Por esta razn el cido lctico no pudo identificarse con la misma seguridad como
la manifestada para los anteriores picos.

5.2 ANLISIS CUANTITATIVO

5.2.1 Curvas de calibracin


Para la elaboracin de las curvas de calibracin se utilizaron las condiciones de
anlisis especificadas en la Tabla 7, pgina 63. Bsicamente se cambi el flujo de
elusin de la fase mvil hacia 0.8 mL/min con el fin de definir mejor los picos del
cromatograma.
Con las nuevas condiciones de anlisis, los tiempos de retencin variaron
significativamente, de hecho como parmetro para definir la identidad de cada pico
se utilizaron los rangos de tiempos de retencin especificados en la Tabla 15.

Tabla 15 - Tiempos de retencin para los cidos utilizados en la elaboracin de la curva de


calibracin
Componentes

. Galacturnico
. Frmico
. Mlico
. Lctico
. Actico
. Ctrico
. Propinico
Patrn Interno

Tiempo de retencin
(min)
Inicio

Fin

1.95
2.464
3.154
3.643
4.287
5.867
10.214
14.121

2.45
2.954
3.511
4.18
4.747
6.534
11.664
15.344

Como se indic en la seccin 4.3.3, la elaboracin de esta curva requiri la


disponibilidad de soluciones estndares constituidas por mezclas de cidos
carboxlicos a una concentracin especfica y con una concentracin igual de
patrn interno en cada una de estas soluciones estndares. En la Tabla 16 se
resumen las condiciones de dilucin de los diferentes estndares con los que se
prepar la curva de calibracin.

Tabla 16 - Condiciones de dilucin de estndares para la elaboracin de la curva de


calibracin.
Concentracin de
cidos carboxlicos
en la mezcla

Volumen
total (L)

Volumen
de cidos
en la
mezcla
(L)

Volumen
de patrn
interno
0.05
mg/mL
(L)

1600

1400

200

(mg/mL)
0.4
1.2
2.4
4
6
8
Blanco

Cabe destacar que se realizaron tres repeticiones para cada medicin. Los datos
incluidos la Tabla 16 se utilizaron como factor de dilucin para calcular

la

concentracin real de los estndares al momento de determinar sus reas. Se


presentan a continuacin los grficos que contienen las curvas de calibracin para
cada uno de los cidos carboxlicos objetos de estudio, los cromatogramas
correspondientes se presentan en Anexos, Seccin 10.4.
Como se defini en la Figura 15, el eje y corresponde al promedio del cociente del
rea del estndar entre el rea del patrn interno. El eje x por su parte
corresponde a la concentracin del estndar tomando en cuenta el factor de
dilucin.
Al sustituir y en la ecuacin de la lnea de regresin, se obtiene la concentracin
del cido en la muestra. Bajo cada grfico se incluye las estadsticas siguientes:
Sy/x (Ecuacin 1), xbar que corresponde al promedio del eje x, ybar corresponde
al promedio del eje y, Sslope

corresponde a Sm (Ecuacin 2), Sintercept

corresponde a Sb (Ecuacin 3), Slope corresponde a la pendiente de la ecuacin


de regresin, n al nmero de puntos x, y.

Para cada uno de los cidos cuantificables en esta investigacin se presenta un


grfico en el que se incluye la ecuacin de la curva y su coeficiente de
determinacin R2. Bajo el grfico se incluyen dos tablas, en la primera se
incluyen los datos con que se elabor la curva y en la segunda los estadsticos de
importancia. A continuacin se listan los cidos y el nmero de figura que
corresponde a su grfico de calibracin.

cido orgnico
Galacturnico
Frmico
Mlico
Lctico
Actico
Ctrico
Propinico

Figura
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23

Es importante destacar que el coeficiente de determinacin R2 no indica por s


solo la calidad de la correlacin, pero su raz cuadrada R (coeficiente de
correlacin) si es adecuado. En las grficas se indica solamente el primero, esto
se debe a que es el que presenta por defecto el Software Microsoft Excel , sin
embargo la mayora de las curvas de regresin poseen un coeficiente con un valor
superior a R2 =.99. Al calcular R, el valor obtenido es muy aproximado. Esto lleva
a la conclusin que las curvas de calibracin poseen una excelente correlacin.
Se puede apreciar que los valores del intercepto en y son negativos, esto se
analiz con detalle y es posible que sea el resultado de un error sistemtico en la
etapa de medicin de volmenes o por parte del instrumento.

Figura 17 - Curva de calibracin para cido galacturnico

Calibration Curve for Galacturonic Acid


10
9
y = 1.2083x - 0.1343
R2 = 0.997

8
7

Ai/Api

6
5
4
3
2
1
0
0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

-1
Concentration (mg/mL)

Datos de la curva de calibracin, cido


galacturnico
Ci (mg/ml)

Datos Estadsticos

Ai/Api
0.00
0.35
1.05
2.10
3.50
5.25
7.00

0.00
0.41
1.14
2.23
3.89
6.08
8.57

Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n

0.19
2.75
3.19
0.03
0.11
1.21
-0.13
7.00

Figura 18 - Curva de calibracin para cido frmico


Calibration Curve for Formic Acid
25
y = 3.1534x - 0.2802
R2 = 0.9975
20

Ai/Api

15

10

0
0

-5
Concentration (mg/mL)

Datos de la curva de calibracin, cido


frmico
Ci (mg/ml)

Ai/Api
0
0.35
1.05
2.1
3.5
5.25
7

0.00
1.02
3.07
6.16
10.23
15.83
22.43

Datos estadsticos

Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n

0.46
2.75
8.39
0.07
0.26
3.15
-0.28
7.00

Figura 19 - Curva de calibracin para cido mlico


Calibration Curve for Malic Acid
25

y = 2.9278x - 0.2847
R2 = 0.9974

20

Ai/Api

15

10

0
0

-5
Concentration (mg/ml)

Datos de la curva de calibracin, cido


mlico
Ci (mg/ml)
0
0.35
1.05
2.1
3.5
5.25
7

Datos estadsticos

Ai/Api
0.00
0.93
2.81
5.67
9.46
14.67
20.81

Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n

0.43
2.75
7.77
0.07
0.25
2.93
-0.28
7.00

Figura 20 - Curva de calibracin para cido lctico


Calibration Curve for Lactic Acid
14

12

y = 1.6744x - 0.225
R2 = 0.995

10

Ai/Api

0
0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

-2
Concentration (mg/mL)

Datos de la curva de
calibracin, cido lctico
Ci
(mg/ml)
0.00
0.35
1.05
2.10
3.50
5.25
7.00

Datos estadsticos

Ai/Api
0.00
0.51
1.55
3.14
5.27
8.22
11.98

Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n

0.34
2.75
4.38
0.05
0.19
1.67
-0.22
7.00

7.00

8.00

Figura 21 - Curva de calibracin para cido actico


Calibration Curve for Acetic Acid
14

y = 1.7445x - 0.1809
R2 = 0.9971

12

10

Ai/Api

0
0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

-2
Concentration (mg/mL)

Datos de la curva de
calibracin, cido actico
Ci (mg/ml)
Ai/Api
0.00
0.00
0.35
0.55
1.05
1.67
2.10
3.36
3.50
5.60
5.25
8.73
7.00
12.41

Datos estadsticos
Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n

0.27
2.75
4.62
0.04
0.16
1.74
-0.18
7.00

8.00

Figura 22 - Curva de calibracin para cido ctrico


Calibration Curve for Citric Acid
35

30

y = 4.2093x - 0.6756
R2 = 0.992

25

Ai/Api

20

15

10

0
0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

-5
Concentration (mg/mL)

Datos de la curva de
calibracin, cido ctrico
Ci
(mg/ml)
0.00
0.35
1.05
2.10
3.50
5.25
7.00

Datos estadsticos
Sy/x

Ai/Api
0.00
1.26
3.83
7.73
12.86
20.29
30.33

xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n

1.09
2.75
10.90
0.17
0.62
4.21
-0.68
7.00

7.00

8.00

Figura 23 - Curva de calibracin para el cido propinico


Calibration Curve for Propionic Acid
14
y = 1.8139x - 0.1955
R2 = 0.9927

12

10

Ai/Api

0
0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

-2
Concentration (mg/mL)

Datos de la curva de
calibracin, cido propinico
Ci (mg/ml)
0.00
0.35
1.05
2.10
3.50
5.25
7.00

Ai/Api
0.00
0.63
1.96
3.28
5.63
8.97
13.09

Datos estadsticos

Sy/x
xbar
ybar
Sslope
Sintercept
Slope
Intercept
n

0.45
2.75
4.79
0.07
0.26
1.81
-0.20
7.00

8.00

5.2.2 Lmite de deteccin del mtodo (MDL o LDM)


Como se mencion anteriormente, el LDM sirve para indicar bajo cual
concentracin el mtodo posee un gran margen de error para asegurar la
presencia o ausencia de un analito.
Para la obtencin del LDM se siguieron los procedimientos estipulados en la
Seccin 4.4.3. Recapitulando, se corrieron 12 repeticiones de anlisis de una
muestra que contena los siete estndares de cidos carboxlicos y el patrn
interno a una concentracin tan baja como una de las utilizadas para elaborar la
curva de calibracin. Posteriormente, se determin la desviacin estndar del
cociente del rea de cada cido entre el rea del patrn interno (para cada
cromatograma). Esta desviacin estndar se multiplic por el valor de la t de
student (n-1, =0.99). Los resultados se indican en la Tabla 17.

Tabla 17 - Lmites de deteccin del mtodo para cada cido.


cido
Galacturnico
Frmico
Mlico
Lctico
Actico
Ctrico
Propinico

s
(Ai/Api)
0.0130
0.0288
0.0232
0.0121
0.0129
0.0276
0.0575

12

3.05

MDL
0.0398
0.0879
0.0707
0.0368
0.0393
0.0840
0.1755

X0
(mg/mL)
0.1441
0.1167
0.1214
0.1563
0.1262
0.1805
0.2046

Hay que sealar que el valor de X0 se obtuvo mediante los datos de la curva de
calibracin para cada cido en particular, razn por la cual se expresa como
mg/mL.

5.2.3 Matrices de resultados con las concentraciones de cidos


carboxlicos determinadas analticamente mediante HPLC
El diseo experimental que se explic en la Seccin 4.4.5 permite ver que cada
cido se analiz por separado. El objetivo de esta seccin es presentar de forma
general los resultados (mg/mL) obtenidos para cada cido. Las secciones
posteriores analizarn el comportamiento de cada cido por separado.

Los

cromatogramas pueden consultarse en Anexos, Seccin 10.5.


Para determinar las concentraciones en cidos carboxlicos en las distintas
muestras, se recurri al procedimiento del patrn interno (Seccin 4.3.4), para ello
se utiliz tambin la curva de calibracin de cada cido orgnico, tal como se
explic anteriormente.
Posteriormente la concentracin se determin al sustituir la media del cociente del
rea del cido (encontrado en cada cromatograma) entre el rea del patrn interno
del mismo cromatograma (eje y) en la ecuacin de la curva de calibracin.
La desviacin estndar (Sx0) se determin mediante la Ecuacin 4 y se indica con
color rojo en la columna de la izquierda de cada concentracin. Las tablas de
resultados

tambin

permiten

apreciar

la

conformacin

de

los

grupos

experimentales (el grupo beneficio fueron muestras obtenidas fuera de las


condiciones experimentales y no se incluirn en los posteriores anlisis
estadsticos), el grupo inicial incluye las muestras cuya fermentacin se
interrumpi entre los pH de 6.1 y 6.3. El grupo 1 por su parte incluye las muestras
cuya fermentacin se interrumpi entre los pH de 4.5 y 4.8. Las muestras del
grupo 2 se interrumpieron a un pH entre 4.1 y 4.4 y las muestras del grupo 3 a un
pH entre 3.7 y 4.
A continuacin se presentan los cidos galacturnico (Tabla 18), frmico
(Tabla 19), mlico (Tabla 20), actico (Tabla 21), ctrico (Tabla 22) y propinico
(Tabla 23).

Tabla 18 - Matriz de resultados para cido galacturnico


Concentraciones (mg/ ml)
cido

Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Benef.

Inicial
6.3
7.35
0.16
16.32
0.35

6.15

0.14

8.61

0.18

Galacturnico

4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

9.72

13.58

0.29

7.38

0.16

10.26

0.14
0.19
0.26
0.27
0.30
0.17
4.5
13.00
0.27

12.70

0.27

20.14

0.44

10.93

0.23

4.2
11.27
11.68
11.59
9.67

0.24
0.24
0.24
0.20

8.03

0.17

7.80

0.16

0.21

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)


4.3
9.18
0.19

10.38 0.22
7.90
0.17
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
8.75
0.18

4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

6.37
8.98
12.30
12.67
14.24
8.29
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6

0.20

4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

6.1

14.92

3.7

0.32
12.91

7.87

0.17

10.50

0.22

0.27

8.22

0.17

12.22

0.26

11.54
5.67

0.13

10.34

0.22

8.29

0.17

0.24

En color rojo se presentan las desviaciones estndares de los resultados (Obtenidas


mediante la Ecuacin 4).

Tabla 19 - Matriz de resultados para cido frmico


Concentraciones (mg/ ml)
cido

Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Benef.

Inicial
6.3
0.36
0.11
0.50
0.11

0.36

0.11

Frmico

0.39

0.41

0.11

0.48

0.11

0.62

0.61

0.11

0.31

0.11

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)


4.3
0.34
0.11

0.11

4.5
0.43
0.11

0.43

0.11

4.2
0.37
0.53
0.51
0.34

0.11
0.11
0.11
0.11

0.35

0.11

0.33

0.11

3.7

0.11
0.51
0.33

0.36

0.79

Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.37
0.11

4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.11
0.11

0.11

4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.32
0.46

Grupo 1 (pH =4.8-4.5)


4.7
4.6

4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

6.1

0.11

0.49
0.29

0.11

0.41

0.11

0.11

0.11

0.11

En color rojo se presentan las desviaciones estndares de los resultados (Obtenidas


mediante la Ecuacin 4).

Tabla 20 - Matriz de resultados para cido mlico


Concentraciones (mg/ ml)
cido

Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Benef.

Inicial
6.3
0.32
0.12
0.35
0.12

0.21

0.12

0.19

0.12

Mlico

4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.20

0.35

0.12

0.21

0.12

0.19

0.12
0.12
0.12
0.12
0.12
0.12
4.5
0.23
0.12

0.22

0.12

0.27

0.12

0.20

0.12

4.2
0.23
0.31
0.22
0.20

0.12
0.12
0.12
0.12

0.19

0.12

0.17

0.12

0.12

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)


4.3
0.22
0.12

0.19 0.12
0.17
0.12
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.21
0.12

4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.26
0.32
0.26
0.28
0.28
0.17
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6

0.12

4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

6.1

0.32

3.7

0.12
0.20

0.18

0.12

0.19

0.12

0.12

0.18

0.12

0.21

0.12

0.20
0.17

0.12

0.20

0.12

0.27

0.12

0.12

En color rojo se presentan las desviaciones estndares de los resultados (Obtenidas


mediante la Ecuacin 4).

Tabla 21 - Matriz de resultados para cido actico


Concentraciones (mg/ ml)
cido

Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Benef.

Inicial
6.3
0.31
0.12
0.35
0.12

0.36

0.12

0.23

0.12

Actico

4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.23

0.40

0.12

0.34

0.12

0.29

0.12
0.12
0.12
0.12
0.12
0.12
4.5
0.38
0.12

0.23

0.12

0.29

0.12

0.25

0.12

4.2
0.36
0.36
0.48
0.30

0.12
0.12
0.12
0.12

0.28

0.12

0.33

0.12

0.12

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)


4.3
0.34
0.12

0.37 0.12
0.20
0.12
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.32
0.12

4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.28
0.31
0.26
0.28
0.28
0.23
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6

0.12

4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

6.1

0.47

3.7

0.12
0.41

0.28

0.12

0.27

0.12

0.12

0.25

0.12

0.29

0.12

0.40
0.24

0.12

0.35

0.12

0.26

0.12

0.12

En color rojo se presentan las desviaciones estndares de los resultados (Obtenidas


mediante la Ecuacin 4).

Tabla 22 - Matriz de resultados para cido ctrico


Concentraciones (mg/ ml)
cido

Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Benef.

Inicial
6.3
0.26
0.21
0.26
0.21

0.21

0.21

0.23

0.21

Ctrico

4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.24

0.31

0.20

0.24

0.21

0.28

0.21
0.21
0.21
0.21
0.21
0.21
4.5
0.27
0.20

0.23

0.21

0.25

0.21

0.23

0.21

4.2
0.25
0.27
0.29
0.24

0.21
0.20
0.20
0.21

0.24

0.21

0.22

0.21

0.20

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)


4.3
0.24
0.21

0.26 0.21
0.23
0.21
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.25
0.21

4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.22
0.25
0.22
0.23
0.24
0.22
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6

0.21

4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

6.1

0.32

3.7

0.20
0.29

0.23

0.21

0.23

0.21

0.20

0.22

0.21

0.26

0.21

0.29
0.22

0.21

0.26

0.21

0.22

0.21

0.20

En color rojo se presentan las desviaciones estndares de los resultados (Obtenidas


mediante la Ecuacin 4).

Tabla 23 - Matriz de resultados para cido propinico


Concentraciones (mg/ ml)
cido

Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Benef.

Inicial
6.3
0.13
0.20
0.13
0.20

0.11

0.20

0.17

0.20

Propinico

4.8
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.14

0.13

0.20

0.13

0.20

0.14

0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
4.5
0.14
0.20

0.15

0.20

0.13

0.20

0.13

0.20

4.2
0.12
0.14
0.13
0.14

0.20
0.20
0.20
0.20

0.14

0.20

0.12

0.20

0.20

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)


4.3
0.12
0.20

0.16 0.20
0.16
0.20
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
0.12
0.20

4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

0.13
0.12
0.13
0.12
0.15
0.16
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
4.7
4.6

0.20

4.4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

6.1

0.13

3.7

0.20
0.13

0.12

0.20

0.13

0.20

0.20

0.13

0.20

0.17
0.15

0.20

0.13
0.12

0.20

0.13

0.20

0.20

0.20

En color rojo se presentan las desviaciones estndares de los resultados (Obtenidas


mediante la Ecuacin 4).

5.3 ANLISIS ESTADSTICO

5.3.1 Tablas de datos para anlisis estadsticos entre grupos


El anlisis estadstico entre grupos analiza los valores de concentraciones
obtenidas para cada uno de los grupos sin tomar en consideracin las diferencias
entre experimentos. Una prueba paramtrica tpica y representativa la constituye
la configuracin ANOVA de una va.
En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se especificaron con
anterioridad y para agruparlos se van a tomar en cuenta todos los valores que se
incluyan dentro de ese rango. En esta seccin solamente se presentan las tablas
que sirvieron de alimentacin para las pruebas estadsticas.
A continuacin se presentan los datos para los cidos galacturnico (Tabla 24), frmico (

Tabla 25), mlico (Tabla 26), actico (Tabla 27), ctrico (Tabla 28) y propinico
(Tabla 29).
Tabla 24 - Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido galacturnico

cido Galacturnico, grupos experimentales (mg/mL)


Inicial
G1
G2
G3
6.3719
7.3475

9.7245
13.5783

12.6971
20.1431

14.9155
7.8665

8.9796

7.3790

9.1762

10.4979

12.2969

10.2629

10.3750

8.7515

12.6683
14.2431
16.3197

10.9316
12.9968
7.8049

11.2735
11.6850
11.5932

12.9060
8.2224
12.2159

9.6696

5.6711

8.0291

10.3402

7.9028

8.2879
11.5425

8.29

Tabla 25 - Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido frmico

cido Frmico, grupos experimentales (mg/mL)


Inicial

G1

G2

G3

0.3152
0.3565
0.4601
0.4997
0.7893

0.3099
0.3330
0.3929
0.4269
0.4311

0.4056
0.4753
0.3371
0.3656
0.5257

0.6155
0.3570
0.3721
0.5128
0.3254

0.6130

0.5127
0.3400
0.3497

0.2876
0.4112
0.4851

Tabla 26- Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido mlico

cido Mlico, grupos experimentales (mg/mL)


Inicial
G1
G2
G3
0.3172
0.3529
0.2631
0.3183
0.2607
0.2846
0.2751
0.17

0.2017
0.3492
0.2123
0.1893
0.1954
0.2253
0.1675

0.2238
0.2670
0.2239
0.1879
0.2328
0.3096
0.2183
0.2049
0.1943
0.1673

0.3173
0.1804
0.1892
0.2089
0.2019
0.1827
0.2122
0.1688
0.2001
0.2736
0.1955

Tabla 27- Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido actico

cido Actico, grupos experimentales (mg/mL)


Inicial
G1
G2
G3
0.3052
0.3505
0.2821
0.3052
0.2629
0.2817
0.2810
0.23

0.2297
0.3971
0.3357
0.2862
0.2516
0.3761
0.3279

0.2274
0.2929
0.3361
0.3689
0.3557
0.3554
0.4780
0.3029
0.2767
0.2015

0.4727
0.2830
0.2721
0.3212
0.4138
0.2469
0.2874
0.2390
0.3528
0.2630
0.3969

Tabla 28- Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido ctrico

cido Ctrico, grupos experimentales (mg/mL)


Inicial
G1
G2
G3
0.2588
0.2582
0.2156
0.2515
0.2205
0.2339
0.2421

0.2362
0.3136
0.2395
0.2756
0.2334
0.2744
0.2204

0.2275
0.2469
0.2445
0.2564
0.2479
0.2703
0.2930
0.2429
0.2404
0.2330

0.3223
0.2250
0.2327
0.2509
0.2935
0.2187
0.2584
0.2238
0.2616
0.2202
0.2869

Tabla 29- Tabla de datos para anlisis estadstico entre grupos, cido propinico

cido Propinico, grupos experimentales (mg/mL)


Inicial
G1
G2
G3
0.1251
0.1255
0.1262
0.1226
0.1257
0.1175
0.1528
0.16

0.1428
0.1265
0.1275
0.1419
0.1280
0.1445
0.1223

0.1528
0.1276
0.1195
0.1592
0.1214
0.1382
0.1274
0.1448
0.1359
0.1614

0.1330
0.1248
0.1338
0.1224
0.1262
0.1253
0.1718
0.1204
0.1266
0.1496

5.3.2 Anlisis estadstico entre grupos


El anlisis estadstico entre grupos se realiz segn lo estipulado en la Seccin
4.4.6. Se inici con un anlisis exploratorio de los datos (EDA), este permiti
determinar si las tcnicas estadsticas que se utilizaran posteriormente para
comparar los grupos seran las ms apropiadas.
Se realiz una prueba de normalidad para determinar si los grupos de pH dentro
de cada cido se ajustaban a una distribucin normal. Con este propsito se

realizaron dos pruebas de forma paralela para los seis cidos carboxlicos: la
prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Shapiro-Wilk.
Ambas prueban la hiptesis nula que los datos poseen una distribucin normal. Un
nivel de significancia particularmente bajo (generalmente menor a 0.05) indica que
la distribucin de los datos difiere significativamente de una distribucin normal. A
continuacin se presenta una matriz resumen de la prueba que se realiz con el
software SPSS (Tabla 30).
En este caso se analizaron los datos para la prueba Kolmogorov-Smirnov, estos
muestran que no hay distribucin normal para las concentraciones de cido
mlico en dos de los grupos: G1 (pH 6.1-6.3) y G4 (pH 3.7-4). Las
concentraciones en cido propinico tampoco se ajustan a una distribucin
normal en los grupos G1 y G4.
muestran una distribucin normal.

Las concentraciones para los otros cidos

Tabla 30 - Pruebas de normalidad para los datos de comparaciones entre grupos de pH


(configuracin ANOVA 1 va)
Tests of Normality
a

CONC_GAL

CONC_MAL

CON_ACE

CON_CIT

CON_PROP

CONC_FOR
*

PH_GROUP
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4

Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
.196
8
.200*
.152
7
.200*
.251
10
.074
.149
11
.200*
.236
8
.200*
.322
7
.027
.205
10
.200*
.315
11
.003
.201
8
.200*
.154
7
.200*
.165
10
.200*
.218
11
.149
.179
8
.200*
.265
7
.146
.250
10
.078
.186
11
.200*
.392
8
.001
.289
7
.079
.169
10
.200*
.292
11
.010
.267
5
.200*
.284
6
.141
.229
8
.200*
.172
8
.200*

*. This is a lower bound of the true significance.


a. Lilliefors Significance Correction

Statistic
.939
.939
.793
.978
.920
.747
.933
.782
.947
.957
.960
.914
.907
.897
.888
.892
.746
.835
.928
.729
.881
.879
.848
.950

Shapiro-Wilk
df
8
7
10
11
8
7
10
11
8
7
10
11
8
7
10
11
8
7
10
11
5
6
8
8

Sig.
.606
.633
.012
.956
.429
.012
.479
.006
.678
.797
.783
.272
.336
.313
.160
.146
.007
.088
.426
.001
.314
.264
.091
.713

Con estos resultados se concluy que una prueba no paramtrica para encontrar
diferencias

entre

grupos

deba

realizarse

tanto

los

grupos

de

las

concentraciones de cido mlico como a los del cido propinico.


Los grupos en los otros cidos se podran comparar mediante una prueba
paramtrica, en este caso ANOVA una va.
Se puede apreciar que los valores obtenidos para las dos pruebas son similares y
comparables, la prueba Shapiro-Wilk es particularmente til cuando el nmero de
datos es bajo.
Como parte de las pruebas EDA, se obtuvieron grficos sobre la distribucin de
los valores de los datos (boxplots o cajas de puntos) para los datos de cada uno
de los cidos cuyos grupos se ajustaron a una distribucin normal (Figura 24). El
objetivo de estos es poseer de forma grfica una impresin sobre posibles datos
discordantes.
En estos grficos, la lnea gruesa negra dentro de cada caja marca el cincuentavo
percentil (50avo) o la mediana de la distribucin. Los lmites inferior y superior
dentro de cada caja marcan el veinticincoavo (25avo) y el setenticincoavo (75avo)
de cada distribucin, respectivamente. Las barras que aparecen arriba y debajo de
cada caja no marcan datos discordantes, pero estos se marcan mediante O, el
nmero que aparece al lado corresponde a la lnea de los datos con que se
aliment a la prueba estadstica, y en ltima instancia en donde se encontrar el
valor sospechoso. Los valores extremos se marcan con un asterisco (*).

Figura 24 - Grficos cajas de puntos o boxplots para determinar puntos aberrantes dentro
de los datos de cada grupo para cada cido
30

.5

(b)

(a)

22

.4
20

17

10

CON_ACE

CONC_GAL

.3

0
N=

"6.1-6.3"

.34

4.5-4.8

10

11

4.2-4.4

3.7-4

.1
N=

.9

(c)

.6

.26

.5

.24
.22
.20
"6.1-6.3"

4.5-4.8

10

11

4.2-4.4

3.7-4

CONC_FOR

.28

10

11

4.2-4.4

3.7-4

.7

22

4.5-4.8

(d)

.8

.30

N=

"6.1-6.3"

.32

CON_CIT

.2

10

.4
.3
.2
N=

"6.1-6.3"

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4

(a) A. galacturnico, (b) A. Actico, (c) A. ctrico (d) A. frmico. En el eje de


las x se indican los distintos grupos experimentales.

Se puede apreciar que para el cido galacturnico hay un probable punto


discordante para uno de los valores del Grupo 3 (pH =4.2- 4.4). Se aplic la
prueba de Grubbs para determinar si el punto se descartaba o no se descartaba y
se encontr que el punto correspondiente a una concentracin de 20.14 mg/mL
deba eliminarse (con un nivel de significancia del 5%) para ello se compar un
valor tabular de Grubbs de 2.29, con el valor calculado de 2.54, al ser este ltimo
mayor que el valor tabular, se decidi no tomar en cuenta el valor para los anlisis
de varianza.
El cido actico por su parte present un valor discordante en el grupo 3
(marcado mediante el nmero 22), este valor se examin con la prueba de Grubbs
y el valor calculado (1.85) fue inferior al valor tabular (2.29) por lo tanto no fue
necesario descartar este punto de la serie de datos.
El cido ctrico present tambin un punto discordante en el grupo 3, al realizar la
prueba de Grubbs, se concluy que el valor deba preservarse.
El cido frmico present dos valores discordantes, uno en el grupo 1 y otro en el
grupo 2. En ambos casos se aplic la prueba de Dixon, ya que el nmero de
datos era inferior a 7. Para ninguno de los dos grupos se descartaron los puntos
aberrantes ya que los valores de Q calculada fueron inferiores a la Q tabular a un
5% de nivel de significancia.

5.3.2.1 Anlisis ANOVA de una va


Los datos que se adaptaron a una distribucin normal fueron analizados mediante
la prueba ANOVA de una va. Esta prueba la hiptesis que las medias de dos o
ms grupos no son significativamente diferentes.
Antes se realiz la prueba estadstica de Levene (Tabla 31) en la cual se prueba la
hiptesis nula que las varianzas entre los grupos son iguales, esto es importante
de saber antes de realizar la prueba ANOVA, porque sta solamente se puede
realizar si las varianzas de los grupos son iguales.

Tabla 31 - Prueba de Levene para muestras a las que se realizara la prueba ANOVA
Test of Homogeneity of Variances

CONC_FOR
CON_ACE
CON_CIT

Levene
Statistic
.866
1.957
2.685

df1

df2
3
3
3

23
32
32

Sig.
.473
.140
.063

Test of Homogeneity of Variances


C_gal
Levene
Statistic
2.566

df1

df2
3

31

Sig.
.072

Los resultados de la prueba de homogeneidad de varianzas indican que los


niveles de significancia para los grupos en los cuatro cidos son mayores a .05,
esto sugiere que las varianzas para los distintos cidos son iguales y que la
prueba ANOVA se podra aplicar.

Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 32),


esta matriz presenta la variacin para cada cido en dos componentes principales.
La variacin entre grupos (Between Groups) estima la variacin de las medias
de los grupos alrededor de una media general. La variacin dentro del grupo
(Within Groups) representa la variacin de puntajes individuales alrededor de sus
medias respectivas. Sig. Indica el nivel de significancia para la prueba F, valores
de significancia bajos (<.05) indican diferencias entre los grupos.
Los resultados presentados muestran que los grupos experimentales no poseen
diferencias estadsticas, esto se aprecia en valores de significancia relativamente
altos.

Tabla 32 - Resultados prueba ANOVA de una va.


ANOVA
C_gal

Between Groups
Within Groups
Total

Sum of
Squares
2.414
216.585
218.999

df
3
31
34

Mean Square
.805
6.987

F
.115

Sig.
.951

ANOVA

CONC_FOR

CON_ACE

CON_CIT

Between Groups
Within Groups
Total
Between Groups
Within Groups
Total
Between Groups
Within Groups
Total

Sum of
Squares
.018
.324
.343
.006
.146
.153
.002
.024
.026

df
3
23
26
3
32
35
3
32
35

Mean Square
.006
.014

F
.432

Sig.
.732

.002
.005

.449

.719

.001
.001

.720

.547

5.3.2.2 Pruebas no paramtricas para datos de cidos sin distribucin


normal

Los cidos mlico y propinico no estaban sujetos a una distribucin normal, por
esta razn a ambos se les aplicaron pruebas no paramtricas, especficamente la
prueba Kruskal Wallis y la prueba de comparacin de medianas. Ambas pruebas
estn diseadas para probar la significancia de las diferencias entre mltiples
grupos, bsicamente cumplen el papel sustituto de la prueba ANOVA.
La prueba Kruskal-Wallis mide cuanto los rangos dentro de un grupo difieren del
rango medio del resto de los grupos, el valor chi-cuadrado se obtiene en base a
estos valores de los rangos. Los grados de libertad para la prueba estadstica chicuadrado son iguales al nmero de grupos menos uno.
La significancia asintomtica estima la probabilidad de obtener un estadstico chicuadrado mayor o igual al que se presenta, en el caso que verdaderamente no
hubiese diferencias entre los rangos de los grupos. Cuando el valor es inferior a
.05 hay diferencias entre los grupos.
En el caso de los cidos mlico y propinico la prueba Kruskal Wallis no arroja
diferencias entre los grupos (Tabla 33).

Tabla 33- Resultados de la prueba Kruskall Wallis para cido mlico y propinico

Test Statisticsa,b
Chi-Square
df
Asymp. Sig.

CONC_MAL
7.286
3
.063

CON_PROP
2.747
3
.432

a. Kruskal Wallis Test


b. Grouping Variable: PH_GROUP

La prueba de la mediana, tiene como hiptesis nula que las mediana de todo el
conjunto de datos es una buena aproximacin con el centro de cada uno de los
grupos experimentales. Para probar esta hiptesis, cada grupo se divide en dos
subgrupos: aquellos cuyos valores se ajustan cerca o bajo la mediana, y aquellos
cuyos valores son superiores a los de la mediana. El resultado es una tabla de
frecuencias de dos vas con dos filas y un nmero n de columnas donde n es el
nmero de categoras de la variable agrupadora. En la Tabla 34- a, por ejemplo, la
primera celda es el nmero de valores de concentracin de cido que para el
grupo 1 son superiores a la mediana.
La prueba de la Mediana detecta diferencias en la localizacin y forma entre los
grupos. La mediana lista la mediana general ignorando la membresa a
determinados grupos. Si los grupos no difieren, la mediana general debera
eventualmente separar cada grupo. El estadstico chi-cuadrado compara las
separaciones observadas a las separaciones tericas. Los niveles de significancia
inferiores a .05 indican que los grupos difieren estadsticamente.
En el caso del cido mlico el nivel de significancia (Asymp. Sig.) .023, por lo
tanto los grupos dentro del cido mlico diferiran entre s. Por otro lado, las
concentraciones de los grupos en cido propinico poseen un nivel de
significancia (Asymp. Sig) de .127, por lo que se concluye los grupos no se
diferencian entre s.

Tabla 34 - Prueba de la mediana

(a) Tabla de Frecuencias


Frequencies

CONC_MAL
CON_PROP

> Median
<= Median
> Median
<= Median

"6.1-6.3"
7
1
2
6

PH_GROUP
4.5-4.8
4.2-4.4
3
6
4
4
5
7
2
3

3.7-4
2
9
4
7

(b) Datos estadsticos de la prueba de la mediana


Test Statisticsb
N
Median
Chi-Square
df
Asymp. Sig.

CONC_MAL CON_PROP
36
36
.212250
.127450
9.497a
5.704a
3
3
.023
.127

a. 4 cells (.0%) have expected frequencies less than


5. The minimum expected cell frequency is 3.5.
b. Grouping Variable: PH_GROUP

5.3.3 Tablas de datos para anlisis estadsticos entre grupos y entre


experimentos
El anlisis estadstico entre grupos y entre experimentos analiza los valores de
concentraciones obtenidos para cada grupo y toma en consideracin las
diferencias entre experimentos. Una prueba paramtrica tpica y representativa la
constituye la configuracin ANOVA de dos vas.
En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se identificaron con
anterioridad, para agruparlos se va a tomar en cuenta todos los valores que se
incluyan dentro de ese rango para cada experimento por separado. Si dentro del
rango de pH para cada experimento hay ms de un valor se calcular el promedio

de esos valores. Uno de los requerimientos para las pruebas de dos vas es que
se tenga el mismo nmero de valores para las columnas y para las filas, en esto
se diferencia de la configuracin precedente. Por tal razn no fue posible obtener
ms que una matriz de 4 filas (experimentos) por 4 columnas (grupos) para los 7
cidos en estudio
En esta seccin se presentan las tablas que sirvieron de alimentacin a las
pruebas estadsticas. A. galacturnico (Tabla 35 a), frmico (Tabla 35b), mlico
(Tabla 35c), actico (Tabla 35d), ctrico (Tabla 35e) y propinico (Tabla 35f).

Tabla 35- Datos para anlisis estadstico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2 vas)

(a)
cido Galacturnico
Exp
Inicial
(mg/mL)
B
C
F
K

7.348
16.320
6.372
14.243

Grupos
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL)
12.997
13.578
7.379
10.263

10.225
11.685
12.697
10.375

G3
(mg/mL)
8.752
14.915
8.222
12.216

(b)

Exp

B
C
F

cido Frmico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.356
0.500
0.315

0.431
0.613
0.310

0.351
0.526
0.406

G3
(mg/mL)
0.372
0.615
0.325

(c)

Exp

B
C
F
K

cido Mlico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.317
0.353
0.263
0.275

0.225
0.349
0.212
0.189

0.228
0.310
0.224
0.188

G3
(mg/mL)
0.209
0.317
0.183
0.212

(d)

Exp

B
C
F
K

cido Actico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.305
0.351
0.282
0.281

0.376
0.397
0.336
0.286

0.346
0.355
0.227
0.369

G3
(mg/mL)
0.321
0.473
0.247
0.287

(e)

Exp

B
C
F
K

cido Ctrico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.259
0.258
0.216
0.242

0.274
0.314
0.240
0.276

0.246
0.270
0.228
0.256

G3
(mg/mL)
0.251
0.322
0.219
0.258

(f)

Exp

B
C
F
K

cido Propinico
Grupos
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0.125
0.125
0.126
0.153

0.144
0.127
0.128
0.142

0.120
0.138
0.153
0.159

G3
(mg/mL)
0.122
0.133
0.125
0.172

5.3.4 Anlisis estadstico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2


vas)
La prueba ANOVA de dos vas analiza la hiptesis que las medias de dos o ms
grupos no son significativamente diferentes. Existen otros datos o pruebas que se
obtienen y realizan de forma paralela a ANOVA.
Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 36),
esta matriz presenta la variacin para cada cido en dos componentes principales
o fuentes de variacin: la variacin entre filas (rows) estima la variacin entre los
experimentos. La variacin entre columnas (columns) representa la variacin
entre los grupos. El valor F calculado debe ser superior al valor F-crtico (F-Crit)
para considerar que existen diferencias ya sea entre filas o entre columnas. El
valor P indica el porcentaje de certeza con un .05 de nivel de significancia (en el
caso de los . galacturnico y ctrico se trabaj con .1 como nivel de significancia)
que la diferencia entre los grupos (si las hay) no se deba al azar, por lo general
esto se manifiesta cuando el valor se aproxima a cero.
Los resultados de la Tabla 36-a muestran que para el . galacturnico hay
diferencias claramente remarcables entre los experimentos (rows) pero no entre
los grupos (columns). Esto se manifiesta en valores de F calculado superiores a F
crtica, en este caso se utiliz un nivel de significancia de 0.1 para calcular F. Las
diferencias entre los experimentos no se deben al azar de acuerdo al valor P, en

cambio el hecho que no existan diferencias entre los grupos indican que esto se
debera al azar.
Por otro lado, la prueba para el . mlico (Tabla 36-b), presenta diferencias claras
tanto entre los grupos de pH como entre los experimentos. Los valores de P
relativamente bajos indican que las diferencias no se deben al azar.
El . ctrico por su parte presenta diferencias entre los grupos de pH, las
diferencias entre los experimentos tambin es remarcable. Al igual que para el .
galacturnico, se utiliz un nivel de significancia de 0.1 para el clculo de F.
Ambas diferencias no se deberan al azar de acuerdo a estos resultados.
El . frmico presenta diferencias entre experimentos pero no entre los grupos
experimentales. Las diferencias entre los experimentos no se deben al azar, en
cambio el hecho que entre grupos no haya diferencias podra deberse al azar, en
parte debido al valor relativamente elevado del coeficiente P.
Por su parte, se pueden apreciar diferencias entre los experimentos pero no entre
los grupos tanto para el cido actico como para el . propinico. En ambos casos
las diferencias entre los experimentos no seran el resultado del azar, pero s el
hecho que no existan diferencias entre los grupos se debera al azar.

Tabla 36 - Resultados prueba ANOVA de 2 vas


Source of Variation
Rows
Columns
Error

(a) . Galacturnico
SS
df
MS
F
P-value
F crit
68.52777357
3 22.84259 3.26403 0.073326 2.812863
0.11817867
3 0.039393 0.005629 0.999373 2.812863
62.98449855
9 6.998278

Total

131.6304508

Source of Variation
Rows
Columns
Error

SS
0.035034891
0.01299707
0.003971187

Total

0.052003148

Source of Variation
Rows
Columns
Error

SS
0.008659529
0.002415798
0.001944975

Total

0.013020303

Source of Variation
Rows
Columns
Error

SS
0.1151609
0.00611956
0.01459855

Total

0.13587901

Source of Variation
Rows
Columns
Error

SS
0.031752
0.004007
0.020547

Total

0.056306

Source of Variation
Rows
Columns
Error

SS
0.002043
0.000232
0.001236

Total

0.003511

15
(b) . Mlico
df
MS
F
P-value
F crit
3 0.011678 26.46682 8.49E-05 3.862548
3 0.004332 9.818529 0.003375 3.862548
9 0.000441
15

(c) . Ctrico
df
MS
F
P-value
F crit
3 0.002887 13.35677 0.001156 2.812863
3 0.000805 3.726215 0.054411 2.812863
9 0.000216
15
(d) . Frmico
df
MS
F
P-value
F crit
2 0.05758045 23.6655458 0.001424 5.143253
3 0.00203985 0.83837925 0.520357 4.757063
6 0.00243309
11

(e) . actico
df
MS
F
P-value
F crit
3 0.010584 4.635999 0.031792 3.862548
3 0.001336 0.585051 0.639759 3.862548
9 0.002283
15

(f) A. Propinico
df
MS
F
P-value
F crit
3 0.000681 4.957748 0.026658 3.862548
3 7.72E-05 0.561768 0.653589 3.862548
9 0.000137
15

5.4 MEDICIONES CON REFLECTOQUANT

Los resultados de las mediciones de reflectoquant para los cidos mlico y lctico
se han resumido en una matriz (Tabla 45, Anexos, Seccin 10.6).

5.4.1 Tablas de datos para anlisis estadsticos entre grupos


El anlisis estadstico entre grupos analiza los valores de concentraciones
obtenidos para cada uno de los grupos sin tomar en consideracin las diferencias
entre experimentos. Una prueba paramtrica tpica y representativa la constituye
la configuracin ANOVA de una va.
En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se especificaron con
anterioridad y para agruparlos se van a tomar en cuenta todos los valores que se
incluyan dentro de ese rango. En esta seccin solamente se presentan las tablas
que sirvieron de alimentacin para las pruebas estadsticas, tanto para cido
mlico como para cido lctico (Tabla 37).

Tabla 37 - Datos de Reflectoquant para el anlisis estadstico entre grupos.

cido Mlico
Inicial
G1
G2
G3
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
139
125
190
198
166
186
159

95
145
86
74
73
128
60

151
83
65
61
62
135
102
93
79
118

cido Lctico
Inicial
G1
G2
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)

150
72
103
84
136
73
75
96
52
97
159
104.5

27
17
21
15
18
18
14

36
42
25
33
26
36
31

60
44
43
46
31
32
41
47
31
39

G3
(mg/mL)
93
108
48
62
75
69
59
57
28
31
19
56

5.4.2 Anlisis estadstico entre grupos


Se inici con un anlisis exploratorio de los datos (EDA), este permiti determinar
si las tcnicas estadsticas que se utilizaran posteriormente para comparar los
grupos seran las ms apropiadas.
Se realiz una prueba de normalidad para determinar si los grupos de pH dentro
de cada cido se ajustaban a una distribucin normal. Con este propsito se
realizaron dos pruebas de forma paralela para los siete cidos carboxlicos: la
prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Shapiro-Wilk.
Ambas prueban la hiptesis nula que los datos poseen una distribucin normal. Un
nivel de significancia particularmente bajo (generalmente menor a 0.05) indica que
la distribucin de los datos difiere significativamente de una distribucin normal. A
continuacin se presenta una matriz resumen de la prueba que se realiz con el
software SPSS (Tabla 38).

Con estos se resultados se concluy que una prueba paramtrica podra


realizarse para encontrar diferencias entre grupos para ambos cidos.
Los grficos de caja (boxplots) no se presentan aqu, pero en ellos no se
encontraron datos aberrantes o fuera de rango, se concluye por lo tanto que no
era necesario eliminar ningn dato y por lo tanto se pudo realizar directamente la
prueba ANOVA una va.
Los datos que se adaptaron a una distribucin normal fueron analizados mediante
la prueba ANOVA de una va.

Tabla 38 - Pruebas de normalidad para los datos de comparaciones entre grupos de pH


(configuracin ANOVA una va).
Tests of Normality
a

CONC_MAL

CON_LAC

PH_GROUP
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4
"6.1-6.3"
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4

Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
.195
7
.200*
.207
7
.200*
.148
10
.200*
.181
11
.200*
.267
7
.143
.154
7
.200*
.165
10
.200*
.120
11
.200*

Statistic
.940
.906
.919
.928
.890
.953
.912
.971

Shapiro-Wilk
df
7
7
10
11
7
7
10
11

Sig.
.642
.368
.346
.391
.274
.757
.295
.899

*. This is a lower bound of the true significance.


a. Lilliefors Significance Correction

Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 39),


esta matriz presenta la variacin para cada cido en dos componentes principales.
La variacin entre grupos (Between Groups) estima la variacin de las medias
de los grupos alrededor de una media general. La variacin dentro del grupo
(Within Groups) representa la variacin de puntajes individuales alrededor de sus
medias respectivas. Sig. Indica el nivel de significancia para la prueba F, valores
de significancia bajos (<.05) indican diferencias entre los grupos.

Los resultados presentados muestran que los grupos experimentales si poseen


diferencias estadsticas, esto se aprecia en valores de significancia bajos.
Para ambos cidos se realiz una prueba de contrastes para determinar entre qu
grupos se presentaban las diferencias.
Los contrastes se enlistan en la Tabla 40, a. En este caso, cuatro contrastes son
investigados, el primero compara el grupo inicio con el grupo G3 (pH=3.7 -4.0). El
segundo compara los grupos intermedios (G1, pH = 4.5 4.8 con G2, pH= 4.24.4). El tercero compara los grupos G2 con G3. El cuarto compara los grupos G1 y
G2 con el grupo G3.

Tabla 39 - Resultados prueba ANOVA de una va para datos de Reflectoquant


ANOVA

CONC_MAL

CON_LAC

Between Groups
Within Groups
Total
Between Groups
Within Groups
Total

Sum of
Squares
27011.071
31149.971
58161.043
7525.948
8444.452
15970.400

df
3
31
34
3
31
34

Mean Square
9003.690
1004.838

F
8.960

Sig.
.000

2508.649
272.402

9.209

.000

Por su parte los resultados de la prueba de contrastes se enlistan en la


Tabla 40-b. En este caso el software realiz las pruebas de contrastes a ambos
casos, asumiendo tanto que hay igualdad de varianzas como que no hay igualdad
de varianzas, en la tabla se pueden apreciar los cuatro tipos de contrastes
anteriormente explicados para cada uno de los cidos.
Puestos que los datos presentan igualdad de varianzas, se asumirn como vlidos
los datos presentados en la columna assume equal variances.
Para el cido mlico solamente el contraste 1 ha indicado diferencias entre el
grupo inicial y el G3.

Para el cido lctico se puede apreciar que solamente para los contrastes 1 y 4 se
han percibido diferencias entre los grupos. Es decir que el grupo inicial y el G3,
presentan diferencias, as como el G1, G2 con el G3.
Tabla 40 - Prueba de contrastes para ANOVA una va, datos de reflectoquant

(a)
Contrast Coefficients

Contrast
1
2
3
4

"6.1-6.3"
-1
0
0
0

PH_GROUP
4.5-4.8
4.2-4.4
0
0
-1
1
0
-1
-.5
-.5

3.7-4
1
0
1
1

(b)
Contrast Tests

Mal_Refl

Assume equal variances

Does not assume equal


variances

Lac_Refl

Assume equal variances

Does not assume equal


variances

Contrast
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4

Value of
Contrast
-65.64286
.471429
5.600000
5.835714
-65.64286
.471429
5.600000
5.835714
40.337662
8.685714
17.509091
21.851948
40.337662
8.685714
17.509091
21.851948

Std. Error
15.32635
15.62152
13.85037
12.34329
14.67480
15.39460
14.41052
12.97824
7.9798693
8.1335535
7.2113769
6.4266991
8.3637379
3.6209769
8.6733414
8.3977674

t
-4.283
.030
.404
.473
-4.473
.031
.389
.450
5.055
1.068
2.428
3.400
4.823
2.399
2.019
2.602

df
31
31
31
31
15.103
13.137
19.000
19.440
31
31
31
31
10.792
14.995
12.322
10.981

Sig. (2-tailed)
.000
.976
.689
.640
.000
.976
.702
.658
.000
.294
.021
.002
.001
.030
.066
.025

Las concentraciones tanto del cido mlico como del cido lctico para los datos
de reflectoquant se graficaron en dependencia del pH en que se interrumpi la
fermentacin. Se pueden apreciar dos comportamientos diferentes tanto para el
cido mlico como para el cido lctico. El primero (Figura 25-a) presenta un
comportamiento decreciente, a medida que avanza el proceso fermentativo su
concentracin disminuye, se mantiene casi constante entre los G1, G2 y G3,
aumenta ligeramente en G3.
El cido lctico por su parte, para el cual no se obtuvieron datos mediante el
sistema HPLC presenta un comportamiento diferente (Figura 25-b), con la
concentracin aumentando de forma casi constante desde 20 mg/L al inicio hasta
alrededor de 60 mg/L hasta el G3.
Figura 25 - Comportamiento de las concentraciones de cido mlico y cido lctico a
medida que avanza el proceso de fermentacin, datos de Reflectoquant.
70

180

160

(a)

60

(b)

50

Mean of CON_LAC

Mean of CONC_MAL

140

120

100

80
"6.1-6.3"

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4

40
30
20
10
"6.1-6.3"

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4

(a) . mlico (b) . lctico. Las concentraciones se presentan en mg/L, debido a


que esta es la unidad de medida de Reflectoquant.

5.4.3 Anlisis estadstico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2


vas)
Las siguientes tablas sirvieron de alimentacin a la prueba estadstica ANOVA
dos vas para los resultados de Reflectoquant (Tabla 41).

Tabla 41 - Datos de Reflectoquant para el anlisis estadstico ANOVA dos vas, . mlico y .
lctico

(a) cido Mlico


Inicial
G1
G2

Exp
B
C
F
K

139
125
190
159

128
145
86
74

G3

63.5
135
151
61

(b) cido Lctico


Inicial
G1
G2

Exp
B
C
F
K

27
17
21
14

36
42
25
33

84
150
73
75

G3
37
32
60
46

62
93
69
59

Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 42),


se puede apreciar que para el . mlico no se determinaron diferencias ni entre los
grupos (Columns) ni entre los experimentos (Rows), esto se explica por valores F
calculada inferiores a los de F tabular. Por otro lado, los valores de P indicaran
que de cierta forma el azar sera responsable de estas similitudes entre los grupos
y experimentos.

Tabla 42 - Resultados prueba ANOVA de 2 vas para resultados de Reflectoquant.


(a) . Mlico

Source of Variation
Rows
Columns
Error

SS
5243.922
8167.922
11230.27

df
3
3
9

Total

24642.11

15

MS
1747.974
2722.641
1247.807

F
1.400836
2.18194

P-value
0.304813
0.159894

F crit
3.862548
3.862548

(b) . Lctico

Source of Variation
Rows
Columns
Error

SS
149.1875
5554.688
1261.063

df
3
3
9

Total

6964.938

15

MS
49.72917
1851.563
140.1181

F
0.354909
13.2143

P-value
0.786919
0.001201

F crit
3.862548
3.862548

En el caso del . lctico, las diferencias entre experimentos no son evidentes y por
el contrario se podra concluir que sus similitudes se deberan al azar (un valor P
relativamente alto). En el caso de los grupos, hay diferencias claras y el valor P
bajo indica que otras son las causas (no el azar) de esas diferencias.

6 DISCUSIN

En la Seccin 5.1.2 se presentaban las aproximaciones ms importantes en


cuanto a los picos identificados para distintas muestras de cidos, se haca nfasis
en lo acontecido para el pico E, cuyo aumento no corresponda al cido lctico, tal
como se asumi en un principio, sino que al cido lctico ms otro pico de carcter
desconocido.
Se realizaron posteriormente una serie de experimentos para determinar a qu
cido en particular corresponda este pico. Se utiliz como ayuda la hoja de
referencia de la columna HPLC, la cual indica que casi en el mismo tiempo de
retencin que el cido lctico se retiene el cido ascrbico. Tambin se consult la
bibliografa (Belitz y Grosch, 1999), la cual indic que el cido ascrbico se
encuentra presente en la fruta del caf. Posteriormente, se realizaron
experimentos para determinar si el pico E corresponda a dicho cido. Los
resultados (Anexos, Seccin 10.7) confirmaron esta hiptesis.
Los resultados obtenidos para el lmite de deteccin (Tabla 17) demuestran que
dicho lmite ronda los 0.12 mg/mL para el . mlico y los 0.20 mg/mL para el .
propinico. Como se mencion con anterioridad esta sera la concentracin
mnima bajo la cual se podra asegurar que la seal que se observa corresponde
a la muestra y no a interferencias inherentes al equipo (USEPA, 2004). Esto es

importante tenerlo en cuenta al momento de analizar hasta qu concentraciones


es capaz de analizarse con los mtodos e instrumentos planteados en esta
investigacin.
Otra aproximacin para comprender la magnitud de los lmites con los cuales la
metodologa aqu utilizada es capaz de trabajar la constituyen las incertidumbres
planteadas en las tablas de resultados (Tabla 18 - Tabla 23). En dichas tablas,
para cada cido se report la desviacin estndar a la par de cada una de las
concentraciones calculadas para las muestras.
Se puede observar que para el cido galacturnico (Tabla 18) las desviaciones
estndares de los resultados no implican un nivel de incertidumbre muy grande.
Esto se debe a que las concentraciones calculadas son los suficientemente
grandes como para verse afectadas por dicho valor.
El cido frmico por su parte (Tabla 19), posee valores de desviaciones
estndares que agregaran incertidumbre al resultado calculado. Sin embargo los
valores de incertidumbre no exceden los valores de las concentraciones
calculadas, lo que no pondra en riesgo la validez del resultado. Una conclusin
similar se desprendera de las concentraciones calculadas para el cido mlico
(Tabla 20) y para el cido actico (Tabla 21), cuyas concentraciones y
desviaciones estndares se acoplan al mismo rango de valores.
Los valores del cido ctrico (Tabla 22) y del cido propinico (Tabla 23) poseen
las desviaciones estndares ms remarcables de todo el conjunto de cidos
analizados (0.20 mg/mL). En el caso del cido ctrico esta concentracin se
compara muy de cerca con los valores obtenidos para la mayor parte de las
muestras, por lo cual se podra concluir que gran parte de los valores
determinados para dicho cido encajaran dentro de un margen de incertidumbre
suficientemente importante. Algo un poco ms drstico acontece con el .
propinico, para el cual las concentraciones determinadas son inferiores a la
incertidumbre.

Para analizar los resultados incluidos en el instrumento de investigacin, se


perfilaron dos alternativas, y se plasmaron en la seccin de resultados: un diseo
ANOVA 1 va con el fin de comparar solamente los grupos de pH y un diseo
ANOVA 2 vas con el fin de identificar diferencias tanto entre dichos grupos como
entre los experimentos.
El diseo ANOVA 1 va tiene la desventaja que asume que todos los datos dentro
del mismo grupo han sido obtenidos de una forma similar, por esa razn antes de
aplicar la prueba de anlisis de varianza (ANOVA 1 va) hubo que determinar si
dichos datos dentro de los grupos se ajustaban a una distribucin normal. En
efecto, esto permiti identificar que haba menos datos para los grupos Inicial y G1
que para los grupos G3 y G4.
Se utilizaron menos datos para el anlisis del cido frmico (

Tabla 25) debido a que durante los das en que se realiz dicho experimento las
condiciones experimentales variaron un poco con relacin a las que se venan
manifestando en das previos, uno de los aspectos ms destacables fue la
temperatura, durante el da en que se llev a cabo el anlisis (26/06/06) la
temperatura del laboratorio y en especial en el sitio en donde se encontraba el
equipo de HPLC sufri un incremento cercano a los 10 C con relacin a los das
con que previamente se haban analizado otras muestras. Esto fue una de las
causas por las cuales los picos en los cromatogramas presentaron tiempos de
elusin diferentes a los que en da previos venan presentando, adems, se pudo
observar que a temperaturas ms altas el pico que representaba al . frmico se
fusionaba con el pico de . galacturnico, razn por la cual no fue posible
identificarlo y estos datos no se pudieron incluir en el instrumento de investigacin.
A pesar que en general los resultados obtenidos tanto para la prueba ANOVA 1
va (Seccin 5.3.2.1) y como los resultados de la prueba de Kruskall- Wallis
(Seccin 5.3.2.2) no indicaron diferencias importantes entre los grupos, los
resultados

deben

analizarse

con

ms

detenimiento

para

identificar

los

comportamientos de las concentraciones de los cidos a medida que el proceso


fermentativo avanza (disminucin del pH).
Los primeros resultados arrojados por la prueba de ANOVA 1 va para los grupos
dentro de los cidos que se adaptaron a una distribucin normal arrojaron
comportamientos diferentes para sus medias. El cido frmico (Figura 26-a)
present un comportamiento decreciente: inicialmente su concentracin se
encuentra sobre 0.48 mg/mL y desciende bajo 0.42 mg/mL a medida que el pH
disminuye, posteriormente aumenta ligeramente cuando disminuye el pH de
interrupcin, sin embargo, la prueba ANOVA no indic que estos promedios
defirieran entre s, claramente se puede apreciar que los grupos G1, G2 y G3
poseen concentraciones muy similares.
Por otro lado, el cido actico (Figura 26-b) parece comportarse de forma
diferente, el pH inicial arroja concentraciones cercanas a 0.29 mg/mL,
posteriormente la concentracin aumenta sbitamente a 0.32 mg/mL, durante los
valores de pH con los cuales la fermentacin se interrumpi, posteriormente el
aumento de la concentracin de este cido muestra solamente ligeros
incrementos. El comportamiento de este cido fue reportado de forma similar en
el estudio de

Avallone et al (2001b), Wootton (1963b) tambin report el

incremento de este cido conforme el pH disminuye. Esto hace entrever la


influencia que definitivamente tiene este cido tanto en la disminucin del pH
como en el ser precursor del cido actico en caf tostado. De acuerdo a Flament
(2002), cuando el caf se tuesta, la cantidad de . actico aumenta por un factor
de 3. El mismo autor seala que concentraciones ms altas de este cido se
encontraran en granos defectuosos, concentraciones ms bajas se encontraran
en granos en buen estado. La desventaja es que el olor producido es fuerte,
punzante y cido, adems de ser desagradable cuando est altamente
concentrado.
El cido ctrico (Figura 26-c) presenta tambin una tendencia de aumentar su
concentracin a medida que disminuye el pH en que se interrumpe su
fermentacin, de forma tal que la concentracin promedio en el grupo inicial es

inferior a 0.24 mg/ml, posteriormente registra un incremento cuando la


fermentacin se interrumpe a un pH entre 4.5 y 4.8. Una ligera disminucin en la
concentracin del cido se registra cuando el pH se interrumpe en un pH entre 4.2
y 4.4, para finalmente incrementar su concentracin nuevamente cuando la
fermentacin se interrumpe entre los pH 3.7 y 4. La literatura (Flament, 2002)
indica que el . ctrico es de suma importancia para controles del sabor en el caf
tostado, por ende las concentraciones de este cido en el caf verde son
precursores esenciales junto con la temperatura de tueste para obtener sabores
agradables cuando las concentraciones de este cido se encuentran entre 0.02 a
0.08% de peso en seco.
El cido galacturnico (Figura 26-d) por su parte registra una tendencia de
disminucin de su concentracin a medida que el proceso de fermentacin avanza
(pH disminuye). Inicia con una concentracin de cidos por encima de 10.8 mg/mL
y progresivamente disminuye (al pH comprendido entre 4.5 y 4.8, de una forma un
poco ms pronunciada a 10.4), posteriormente la concentracin disminuye de
forma menos pronunciada que para la primera disminucin entre los G2 y G3.
Algunos investigadores (Dinu, 2001) indican que el . galacturnico y el .
poligalacturnico son constituyentes importantes de las pectinas. Las anteriores
teoras sobre la degradacin del muclago presuponan que la degradacin del
muclago se deba a la digestin de las pectinas por enzimas presentes en
microorganismos (Garca et al, 1991).
El cido mlico por su parte (Figura 26-e) presenta una concentracin decreciente
a medida que el proceso de fermentacin avanza. Inicialmente la concentracin
del cido presenta valores cercanos a 0.28 mg/mL, se registra luego una
disminucin pronunciada al pH de 4.5-4.8, posteriormente la concentracin en este
cido no presenta cambios perceptibles, mantenindose constante en el rango de
los G1, G2 y G3. Ligeramente se puede apreciar que en el G3 la concentracin del
cido es inferior que en el G1 y G2. Este patrn en el comportamiento de la
concentracin del cido mlico a medida que avanza el proceso fermentativo es
muy similar al que se midi mediante la tcnica del Reflectoquant (Figura 25-a),

esto puede dar una indicacin que ambas tcnicas estaran correlacionadas y que
definitivamente el patrn observado para este cido tiene una relacin con la cada
del pH.
A pesar de estas diferencias en cuanto al carcter de la distribucin, en ambos
casos hubo diferencias entre los grupos debido a las caractersticas del
comportamiento de la concentracin del cido mlico en dependencia del pH y en
base a la prueba de contrastes que se realizaron a los datos de reflectoquant
(Tabla 40). La literatura (Flament, 2002) reporta que este cido es responsable de
la acidez junto con los cidos actico y ctrico. Por lo general el . mlico se asocia
con notas de sabores acaramelados.
Algunos de los grupos dentro del cido propinico tampoco se ajustaron a una
distribucin normal, por lo tanto se realiz una prueba no paramtrica y los
resultados de esta indicaron que no haba diferencias entre los grupos.

Esto

explicara el comportamiento presentado por dicho cido en el transcurso de la


fermentacin (Figura 26-f), se puede apreciar que a medida que el proceso
fermentativo avanza, aumenta ligeramente la concentracin de dicho cido entre
el grupo inicial y el G1, posteriormente dicho aumento se hace un poco ms
pronunciado entre el G1 y el G2, finalmente disminuye entre G2 y G3. Wootton
(1963a, b) indica que este cido solamente aparece en etapas muy avanzadas del
proceso fermentativo, no en las etapas tempranas. Por esta razn, los valores
obtenidos fueron muy bajos y con alta incertidumbre. El . propinico est
asociado a notas de sabores desagradables (aroma a cebollas), con los resultados
obtenidos no se puede decir categricamente que el pH ms bajo influye en el
aumento de la concentracin de dicho cido.

Figura 26- Comportamiento de las concentraciones promedio de los cidos analizados en


dependencia del pH
.50

.33

(a)

.48

(b)
.32

.31

Mean of CON_ACE

Mean of CONC_FOR

.46

.44

.42

.40
"6.1-6.3"
.26

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4

.30

.29

.28
"6.1-6.3"

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4

4.2-4.4

3.7-4

11.0

(d)

(c)
10.8

10.6

Mean of C_gal

Mean of CON_CIT

.25

.24

.23
"6.1-6.3"

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4

(e)

4.5-4.8

(f)

.136

.24

.22

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4

Mean of CON_PROP

Mean of CONC_MAL

10.0
"6.1-6.3"

.138

.26

.20
"6.1-6.3"

10.2

.140

.30

.28

10.4

.134

.132

.130
"6.1-6.3"

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4

(a) Concentraciones de . frmico (b) Concentraciones de . actico


(c) Concentracin de . ctrico (d) . galacturnico (e) . mlico (f) . Propinico

Vistos los comportamientos para todos estos cidos, se puede decir que en
trminos generales para la prueba ANOVA 1 va, los resultados no arrojaron
diferencias significativas entre todos los grupos. Los grficos de concentracin en

dependencia del pH en que se interrumpe la fermentacin hacen indicar que en


realidad hubo ligeros cambios en las concentraciones de los cidos.
Un anlisis ms detallado de estas variaciones en dependencia del avance del
proceso fermentativo fue ya estudiado por Lpez et al (1989). En dicho estudio se
estudiaron los mismos cidos carboxlicos que en la presente investigacin y de
forma paralela se estudiaron las caractersticas organolpticas de las muestras
ensayadas. En cuanto al comportamiento de los cidos, algunas caractersticas
importantes pueden apreciarse en la Figura 27, al igual que en el presente estudio
las concentraciones determinadas para los cidos actico, frmico, ctrico y
frmico fueron inferiores a 0.5 mg/mL a lo largo del proceso fermentativo. Las
concentraciones

de

cido

galacturnico

fueron

inferiores

3.5 mg/mL, en cambio en la presente investigacin se registraron concentraciones


superiores a 10 mg/mL, anlisis cualitativos posteriores mediante HPLC indicaron
que el cido tartrico y el cido glucornico presentaban tiempos de retencin
similares al del cido galacturnico, lo cual hace sospechar que este aumento en
las concentraciones tenga sus causas inmediatas en la mezcla de dichos cidos y
no exclusivamente . galacturnico (Anexos, Seccin 10.7).
Otro cido que muestra una fuerte presencia en las muestras analizadas por
Lpez et al (1989) es . mlico, el cual posee concentraciones de importancia en
dicho estudio, aunque en la presente investigacin sus concentraciones no difieren
mucho de las que se determinaron para los otros cidos (con excepcin de .
galacturnico). La situacin de . lctico ya se discuti con anterioridad y se
mencionaron los problemas inherentes a su separacin mediante tcnicas
cromatogrficas.
Se aprecia que en ambos estudios las concentraciones de los cidos, a pesar que
varan de cierta forma en el transcurso del proceso fermentativo, no siguen un
patrn claramente definido de aumento categrico en las concentraciones
promedio de los cidos (ver ltima lnea en ambas grficas). Algunas
explicaciones puede encontrarse en el comportamiento individual de las
concentraciones de ciertos cidos. Por ejemplo, el . actico y el . frmico

tienden a aumentar conforme avanza el proceso fermentativo, otro cido


(propinico) mantiene una concentracin relativamente constante mientras que el
. galacturnico disminuye.
Los resultados de la prueba ANOVA 2 vas (Seccin 5.3.4) indican diferencias
importantes entre los experimentos. Para cinco de los cidos (con excepcin de .
frmico) se compararon 4 experimentos (B, C, F y K) debido a que la prueba
ANOVA 2 vas solamente se puede realizar cuando el nmero de datos es igual
para todas las columnas y para las filas. Un anlisis estadstico por medio de la
tcnica grfica de las cajas de puntos muestra que el experimento C presenta
diferencias remarcables con respecto al resto de experimentos (Figura 28). El
cuaderno de experimentos no registra anotaciones excepcionales para el da en
que se realiz el experimento C. Al contrario de otros das experimentales en los
que se indicaron comentarios especiales para cuando la temperatura disminuy
sobremanera con relacin a los das previos. Esto lleva a estimar que los anlisis
realizados mediante la tcnica ANOVA 1 va deben analizarse con cuidado,
bsicamente porque las semejanzas o diferencias entre grupos podran estar
influenciadas por caractersticas inherentes a dichos experimentos. Wootton
(1963a) ya haba comentado sobre las altas variabilidades que existen entre
diferentes lotes de caf provenientes inclusive de una misma finca, otorgaba como
causas de estas variabilidades a factores como las condiciones de cada planta y al
grado de madurez de las frutas, ambos factores podran influenciar las
caractersticas bioqumicas de los granos. En este caso se debe tener en cuenta
que cada experimento consisti en muestras provenientes de puntos distintos de
la finca.

Figura 27 -Concentraciones de cidos orgnicos conforme avanza el proceso fermentativo

(a)

Concentracin de cidos en dependencia del pH de interrupcin de la fermentacin

(b)
12.00

10.00

6.00

C (mg/ml)

8.00

4.00

2.00

Galacturnico

Propinico

Ctrico

Actico

Mlico

Frmico

Promedio

0.00
6.1- 4.56.3 4.8 4.2- 3.74.4 4-0
pH de interrupcin
de fermentacin

(a) Concentraciones de . orgnicos identificadas por Lpez et al (1989) (b)


Concentraciones de . orgnicos identificadas en la presente investigacin. En
ambos casos las unidades son mg/mL.

Figura 28 - Grficos de cajas boxplots, anlisis ANOVA 2 vas entre experimentos


18
16

.4

(a)

(b)

14

.3

12
10

.2

C_MALIC

Gal_Acid

8
6
4
N=

.1
N=

.5

.34

(c)

.32

(d)

.30

.4

.28
.26

C_CITRIC

C_ACETIC

.3

.2
N=

.22
.20
N=

.18
.17

.24

.7

(e)

.6

(f)

.16
.5

.15
.14

C_FORMIC

.4

C_PROP

.13
.12
.11
N=

.3
.2
N=

(a) A. galacturnico, (b) A. mlico, (c) A. actico (d) A. ctrico (e) . Propinico
(f) . Frmico. Eje X presenta los experimentos.

Las pruebas ANOVA de 2 vas solamente indicaron diferencias estadsticas entre


las concentraciones de . mlico y . ctrico cuando se realizaron comparaciones
entre los cuatro grupos para dicho experimento, reforzando nuevamente los
resultados ya obtenidos con ANOVA 1 va para el . mlico. Como tambin la
impresin que las muestras obtenidas de diferentes experimentos realmente
tenan diferencias entre s.
Los anlisis mediante reflectoquant constituyeron una valiosa fuente de
informacin al momento de determinar las concentraciones para el cido lctico
(Ver Seccin 5.4.2). Se puede apreciar claramente que la concentracin de dicho
cido aumenta de forma proporcional al avance del proceso fermentativo
(disminucin del pH). La cuestin es hasta qu punto los datos mediante este
sistema son comparables o confiables en comparacin a los obtenidos mediante la
tcnica del HPLC.
Lo anterior puede analizarse mediante correlaciones entre ambas tcnicas, en
este caso tomando como referencia el cido mlico para el cual hay suficientes
datos obtenidos mediante ambas tcnicas (Figura 29). El resultado de las
correlaciones entre ambas tcnicas indica .598, para un nivel de significancia de
0.01 (prueba de 2 colas). En parte se puede decir que es un valor aceptable, con
una correlacin positiva, sin embargo indica en buena parte las variabilidades que
con anterioridad se presentaron para ambas tcnicas como las diferencias en
cuanto a los lmites de deteccin y a las distribuciones obtenidas. No debe
descartarse que la tcnica HPLC implica un protocolo mucho ms extenso, lleva
ms procedimientos y por lo tanto las probabilidades de realizar errores en el
laboratorio aumentan.

Figura 29 - Grfica y tabla con el coeficiente de correlacin para cido mlico, tcnica del
reflectoquant y HPLC.
.20
.18
Correlations

.16
.14

M_Refl (mg/ml)

M_Refl (mg/ml)

.12
M_HPLC (mg/ml)

.10
.08

Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N

M_Refl
M_HPLC
(mg/ml)
(mg/ml)
1
.598**
.
.000
36
36
.598**
1
.000
.
36
36

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

.06
.04
.1

.2

.3

.4

M_HPLC (mg/ml)

El coeficiente de correlacin de Pearson se presenta cuando se compara la


columna M_Refl con la columna M_HPLC.

La tcnica del Reflectoquant obvia la centrifugacin y las continuas filtraciones,


razn por la cual hay ms probabilidades que partculas mayores interacten con
las cintas de medicin y tiendan a otorgar un valor inferior en la concentracin del
cido. Asimismo en la fase de campo el tiempo de agitacin fue muy inferior
(alrededor de 15 segundos, contrario a la fase de laboratorio que fueron 45
minutos ms o menos.
Como se ha indicado en la Seccin 4.2.4.4, pgina 54, el cido lctico se midi
tambin durante la fase experimental. Una medicin en dicha fase se vislumbra de
gran utilidad para determinar si las caractersticas de las muestras en cuanto a la
concentracin de los cidos sufren variaciones debido al procedimiento
experimental y de anlisis instrumental.
Los resultados de las mediciones de las concentraciones de cido lctico durante
la fase experimental (Figura 30) muestran un comportamiento similar a las
concentraciones

de cido lctico medidas durante la fase de laboratorio

(Figura 25-b). Se puede apreciar un incremento en las concentraciones del cido a

medida que avanza el proceso fermentativo, este incremento fue reportado por
Wootton (1963b) y comprobado por Avallone et al (2001b).
Figura 30 - Concentraciones de cido lctico a medida que disminuye el pH en que se
interrumpe la fermentacin
120
100

Mean of C_L_FIEL

80
60
40
20
0
"6.1-6.3"

"4.5-4.8"

"4.2-4.4"

"3.7-4"

En el eje de las x se indican los distintos grupos experimentales durante los


cuales se interrumpi la fermentacin, en el eje de las y el promedio de las
concentraciones de cido lctico para los distintos grupos experimentales.

Si las grficas de las medias en dependencia de los grupos indican similitudes en


los comportamientos del cido lctico en las fases experimental y de laboratorio,
en tanto control experimental, se compararon para determinar que tan bien
correlacionados estaban los valores de concentracin obtenidos en ambas fases.
El coeficiente de Pearson es de .877. Lo cual implica que la correlacin es muy
importante entre ambas mediciones, y esto prueba que las caractersticas de las
muestras se mantuvieron de forma adecuada (Figura 31). Sin embargo, ligeras
diferencias se aprecian en cuanto a las concentraciones determinadas en distintas
etapas del anlisis. En efecto, se puede apreciar en la Figura 31 que los valores
medidos en la fase experimental (campo) son distintos a los registrados para las
mismas muestras en la fase de laboratorio. En una investigacin de este tipo, en el
que se trataron de mantener constantes las condiciones de extraccin de los
cidos en la fase experimental (Seccin 4.2.4), junto con las condiciones de

extraccin durante la fase de laboratorio (Seccin 4.3.1), es de extraar que


dichos cambios ocurrieran.
Figura 31 - Grfica y tabla con el coeficiente de correlacin para cido lctico. Fase
experimental y fase de laboratorio
120
100

Correlations

80

C_L_FIEL

60

C_L_LAB

C_L_LAB

40

Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N

C_L_FIEL C_L_LAB
1
.877**
.
.000
34
34
.877**
1
.000
.
34
34

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

20
0
0

100

200

300

400

C_L_FIEL

El coeficiente de correlacin de Pearson indica un valor de .877, esto hace entrever


que los valores de concentracin de cido lctico en la fase experimental
(C_L_Fiel) tienen una muy buena correlacin con los valores de cido lctico de la
fase de laboratorio (C_L_Lab).

Una causa de estos cambios es el factor de dilucin empleado para disolver las
muestras en agua destilada, a pesar que se trat de emplear un factor de dilucin
similar para ambas fases, se obviaron mediciones cuantitativas con instrumentos
volumtricos en la fase experimental, en su defecto se utilizaron recipientes de
plstico graduados para representar el lmite mximo de granos o de agua
purificada (tratando de representar al mximo las condiciones en que los
cafetaleros utilizaran el mtodo). Por otro lado en la fase de laboratorio las
mediciones se realizaron con frascos volumtricos y tambin se llev un registro
ms estricto de las masas y volmenes con que se diluy cada muestra.

En la misma lnea de las comparaciones entre las mediciones de las


concentraciones de . lctico durante la fase de campo y durante la fase
experimental, se realizaron comparaciones

de las mediciones del pH durante

ambas fases, se persigue un mismo objetivo: determinar si durante el transcurso


de interrupcin de la fermentacin y el almacenamiento mediante congelamiento,
las muestras sufrieron cambios importantes en sus caractersticas.
De forma previa a las comparaciones de pH entre ambas etapas, se realiz una
correlacin entre los pH medidos mediante la tcnica del reflectoquant y aquellos
determinados mediante las cintas de pH en la fase experimental (Seccin 4.2.4.3).
Los resultados de la correlacin indican un valor de p = .986 (Figura 32). Esto
hace entrever la validez de las mediciones con la tcnica de las cintas, a pesar de
la dificultad que implica dicha tcnica cualitativa (debido a la subjetividad de los
colores y por ende las diferentes percepciones dependiendo de quien haga la
medicin).
Figura 32 - Grfica y tabla de correlacin (Pearson) para los datos de pH medidos en la fase
experimental con el sistema Reflectoquant y con cintas indicadoras
6.5
Correlations

6.0
PH_STRIP

5.5
PH_REF_F

5.0

PH_STRIP PH_REF_F
1
.986**
.
.000
27
27
.986**
1
.000
.
27
27

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

4.5

PH_REF_F

Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N

4.0
3.5
3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

PH_STRIP

El coeficiente de correlacin de Pearson se presenta cuando se comparan los


datos de pH con Reflectoquant (pH_Ref_F) con el pH medido mediante las cintas
(pH_strip). Ambos conjuntos de datos fueron obtenidos durante la fase de campo.

Puesto que los grupos experimentales se formaron en base a las mediciones de


pH realizadas con el sistema cualitativo de las cintas se puede tener la seguridad
que dicho agrupamiento fue correctamente realizado.
Una segunda interrogante podra surgir cuando se analizan los datos del pH: tras
el tiempo de transporte y almacenamiento las muestras preservaron su
constancia en pH?
Para responder a esta interrogante se correlacionaron los datos de pH obtenidos
mediante la tcnica de las cintas cualitativas durante la fase de campo con los
datos obtenidos mediante las mediciones cuantitativas mediante Reflectoquant en
la fase de laboratorio (Figura 33). Los resultados de dicha correlacin arrojan un
valor de p=.903. Es decir la relacin se mantuvo constante durante ambas fases.

Figura 33- Grfica y tabla de correlacin (Pearson) entre las mediciones de pH, fase
experimental y fase de laboratorio
6.5

Correlations

6.0

PH_FIELD

5.5

PH_LAB

5.0

Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N

PH_FIELD
PH_LAB
1
.903**
.
.000
34
34
.903**
1
.000
.
34
34

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

PH_FIELD

4.5
4.0
3.5
3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

PH_LAB

Las mediciones de pH durante la fase de campo mediante las cintas cualitativas


(pH_Field), se correlacionaron con las mediciones cuantitativas durante la fase
de laboratorio (pH_lab).

En la Figura 33 se puede apreciar que los valores de pH medidos mediante la


tcnica Reflectoquant en la Fase de laboratorio (pH_lab), tienden a arrojar valores
ligeramente inferiores que aquellos medidos en el campo con las cintas
(pH_Field). El equipo investigador discuti con anterioridad este hecho, se piensa
que el agua utilizada en la fase de campo (agua purificada comercial) posee
sustancias amortiguadoras (buffer) que tienden a otorgar valores de pH diferentes
a los que se obtienen cuando dichas mediciones se realizan con agua destilada (el
caso de la fase de laboratorio).

7 CONCLUSIONES

Los anlisis cualitativos realizados mediante la tcnica HPLC permitieron separar


e identificar 6 cidos carboxlicos: . galacturnico, . frmico, . mlico, .
actico, . ctrico y . propinico.
El cido lctico se identific mediante la tcnica Reflectoquant, sin embargo no se
pudo separar mediante las condiciones de anlisis cromatogrfico empleadas
debido a que el . ascrbico present un tiempo de retencin que se extrapol con
el del . lctico.
Los anlisis estadsticos de los datos obtenidos mediante HPLC y utilizando la
prueba ANOVA 1 va y la prueba no paramtrica Kruskal-Wallis no indicaron
diferencias estadsticas entre las concentraciones para los distintos grupos de pH
para los cuales se interrumpi la fermentacin.
Cuando se configuraron los datos mediante un diseo ANOVA 2 vas y se
compararon los grupos de pH y los das experimentales, surgieron diferencias
entre los das experimentales.
Las diferencias entre das experimentales explicaran que no hubiese diferencias
al realizar un anlisis ANOVA 1 va. Es de esperar que dentro de un mismo
universo de estudio (cosecha dentro de una finca) existan diferencias en las
composiciones qumicas de los granos de caf.

Por otro lado, los promedios de las concentraciones de cada cido dentro de cada
grupo (tomando en cuenta todos los valores) indican un incremento conforme
avanza la fermentacin para cidos representativos como actico, ctrico y mlico.
Los datos de Reflectoquant obtenidos para el . mlico se correlacionaron con los
obtenidos con HPLC y la correlacin fue altamente positiva, lo cual valida la
tcnica del Reflectoquant.
Los datos de Reflectoquant tambin fueron tiles para conocer el comportamiento
del . lctico, el cual, como se explic con anterioridad, no pudo ser detectado
mediante HPLC. Para este cido se comprob un comportamiento de aumento de
la concentracin conforme avanza el proceso fermentativo.

8 RECOMENDACIONES

De acuerdo a las pocas diferencias observadas entre grupos experimentales


mediante el diseo ANOVA 1 va, para futuras investigaciones se recomienda
realizar un

diseo experimental ms centrado en la constitucin de grupos y

bloques para un anlisis de varianza ANOVA 2 vas.


A grandes rasgos, los resultados no demuestran diferencias muy marcadas entre
los grupos experimentales. Sin embargo, al analizar el patrn de las
concentraciones de los distintos cidos conforme avanza la fermentacin, se
aprecian aumentos de concentraciones en cidos representativos como actico,
ctrico y lctico. Esto debe tomarse en cuenta al momento de elaborar un manual
destinado a un control ms adecuado del proceso fermentativo, especialmente si
se requieren evitar concentraciones muy elevadas de estos cidos (lo cual ocurre
por lo general en el G2 y G3, con pH entre 3.7- 4.0).
De acuerdo a los resultados presentados por Jackels et al (2006) en los resultados
de la catacin profesional de las muestras utilizadas para este estudio difcilmente
se apreciaron diferencias significativas entre el grupo de pH en el cual se
interrumpi la fermentacin y la calidad organolptica del caf. Sin embargo los
resultados muestran valores de calidad ligeramente superiores y con menor
incertidumbre para las muestras cuya fermentacin se interrumpi en el pH del
G1.

Los resultados del mismo estudio (Jackels et al, 2006), pero con los experimentos
realizados de forma independiente por productores de caf con los kit distribuidos
en sus fincas, indicaron mejoras remarcables en la calidad del caf cuya
fermentacin fue interrumpida en un pH cercano a 4.6. Dichas mejoras fueron
destacables en aquellos productores que midieron adecuadamente el pH y
registraron los valores de forma correcta.
Los anteriores resultados, as como el patrn identificado para determinados
cidos (actico, ctrico y lctico) en la presenta investigacin, adems de la
correlacin muy buena entre la tcnica cualitativa de las cintas de pH y la tcnica
cuantitativa de medicin de pH mediante Reflectoquant, permite recomendar
futuras prcticas con el uso del kit para controlar el pH de fermentacin. Un
aspecto fundamental es la utilizacin correcta del kit: la lectura adecuada de los
pH indicados por los colores de las cintas, anotar los datos correctos. Se ha
discutido la posibilidad de capacitar en la realizacin de esas tareas a los
miembros ms jvenes de las familias, tomando en cuenta que estn envueltos en
el sistema educativo y que conjugan los conocimientos heredados de sus mayores
en cuanto al procesamiento del caf con una apertura personal para aceptar
modificaciones a las tcnicas con que procesan el caf.
La longitud de onda del detector UV (214 nm) detect interferencias en el tiempo
de retencin del c. Lctico. El c. interferente fue cido ascrbico, se recomienda
por tanto realizar ensayos con longitudes de onda diferentes con el fin de
comparar la deteccin excluyente del cido ascrbico.
Como se apreci, la tcnica HPLC tiene sus limitantes al realizarse anlisis con
caf verde. Las comparaciones de calidad basadas en las concentraciones de
determinados cidos se podran mejorar al utilizar caf tostado y la tcnica de
Cromatografa de Gas (GC). Ambas experiencias podrn desarrollarse con
instrumentos ya existentes en la Universidad como parte de futuros proyectos de
tesis.

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10 ANEXOS

10.1 MAPA DE LOCALIZACIN DE LA FINCA CAFETALERA LA


CANAVALIA Y MAPA DE LA FINCA
Figura 34 - Localizacin de la finca la Canavalia,

La finca se localiza en la parte alta de la cuenca del Ro Grande de Matagalpa, en el


Municipio de San Ramn, Departamento de Matagalpa. La zona cafetalera ms
importante de Nicaragua se localiza en las partes altas de las cuencas fluviales

La finca tiene una produccin diversificada: los cafetales bajo sombra albergan rboles frutales, otras actividades
econmicas implican la ganadera mayor (con reas de pastos importantes) y la ganadera menor. El rea total de
la finca es de 178 manzanas (125.42 Ha), y se han destinado 36 manzanas (26 Ha) para el cultivo de caf
orgnico.

Figura 35- Mapa de uso del suelo en la finca La Canavalia.

10.2 ORDEN DE ELUSIN DE CIDOS CARBOXLICOS

Como se indic en la Seccin 5.1.1, el primer experimento consisti en identificar


el orden de elusin de los cidos carboxlicos durante un anlisis cromatogrfico.
A continuacin se presentan cromatogramas para cada una de las soluciones
estndares de cidos carboxlicos, en las cuales haba solamente un cido
presente a una concentracin de 3 mg/mL.
Al final se presenta tambin el cromatograma del patrn interno, se puede apreciar
que bajo condiciones de anlisis similares presenta un tiempo de elusin diferente
al conjunto de cidos carboxlicos estndares, asimismo su rea con una
concentracin de 0.05 mg/mL se acopla al rea del resto de estndares.
Tabla 43- Lista de archivos de cromatogramas de muestras y el patrn interno que se
utilizaron para determinar los rdenes de elusin.
cido orgnico
Galacturnico
Frmico
Mlico
Lctico
Actico
Citrco
Propinico
Pirazincarboxlico
(Patrn Interno)

Archivo

Orden (luego de esta pgina)


Roberto 05

Roberto 36
Roberto 11
Carlos 13
Roberto 30
Roberto 17
Roberto 24
Newinternal 02

2
3
4
5
6
7
8

10.3 IDENTIFICACIN DE CIDOS CARBOXLICOS EN LAS


MUESTRAS

En el siguiente set de cromatogramas se presentan los resultados del anlisis


cualitativo cuyo fin era determinar el carcter de los picos eluidos para las
muestras de caf.
Como se mencion en la Seccin 5.1.2 para el primer anlisis se utiliz una
muestra de caf (6832K) con un pH bajo (3.9), a esta muestra se le agregaron
100l de mezcla de estndares (cidos carboxlicos) a 8 mg/mL, el cromatograma
resultante (coffee_nic253) puede apreciarse de color azul en la primera pgina del
set de cromatogramas. A este cromatograma se le sobrepuso el cromatograma
coffee_nic254, que consiste en la misma muestra (6832K) ms 200 l de la
mezcla de estndares. Se puede apreciar claramente un incremento en las reas
de determinados picos, esto conlleva a una primera conclusin sobre los picos que
corresponden a los cidos carboxlicos de inters y los que no corresponden.
Lo anterior se comprueba en el segundo cromatograma del set, en el cual a la
muestra 6832K + 200 l de la mezcla de estndares (Coffee_nic 255) se ha
comparado con el cromatograma de esta muestra ms 200 l de patrn interno
(Coffee_nic 258), un incremento en las reas se aprecia en los picos identificados
como A, C, D, E, G, I, K y L.
Estos mismos picos muestran un incremento en la muestra de pH 4.8 (6346E), en
el tercer cromatograma del set. En ese caso se compar el cromatograma
Coffee_nic 261 (muestra + 200 l de estndares de cidos carboxlicos), con los
cromatogramas Coffee_nic 264 (muestra + 100 l de estndares de cidos
carboxlicos) y Coffee_nic 267 (muestra + 200 l de patrn interno).

10.4 CROMATOGRAMAS UTILIZADOS PARA LA ELABORACIN


DE LAS CURVAS DE CALIBRACIN

Los siguientes cromatogramas se utilizaron para obtener los datos de la curva de


calibracin (Ver Seccin 5.2.1). Cabe destacar que los anlisis se realizaron por
triplicado, sin embargo a continuacin se presentar solamente un cromatograma
representativo.
Tabla 44 - Lista de archivos cromatogramas utilizados para la elaboracin de la curva de
calibracin

Mezcla de cidos
(mg/mL)
0.4
1.2
2.4
4
6
8

Archivo

Coffee_nic 91
Coffee_nic 92
Coffee_nic 95
Coffee_nic 98
Coffee_nic 101
Coffee_nic 105

Orden en el set de
cromatogramas
1
2
3
4
5
6

10.5 CROMATOGRAMAS

CORRESPONDIENTES

LAS

MUESTRAS DE MUCLAGO ANALIZADAS MEDIANTE HPLC

Experimento
B

Cdigo
5082
8189
8410
3470
2585
6053
2837
6053
1510
5307
1293
5122
6346
3727
9370
7118
9296
6181
8071
5000
9801
6615
2935
5169
2935
Beneficio
8507
6319
6319
5583
6832
6174
6174
7060
3539
8548

pH (papel)
4.5
3.9
6.3
4.3
4.2
4.7
4.2
6.3
4
3.7
4.2
3.9
4.8
4.2
3.8
4.4
4.7
3.9
6.1
4
4.2
4.4
6.1
4.5
4.6
4
3.8
6.1
4.3
3.9
4.7
6.1
4.2
3.9
3.8

archivo
coffee_nic140
coffee_nic79
coffee_nic88
coffee_nic85
coffee_nic82
coffee_nic149
coffee_nic146
coffee_nic152
coffee_nic143
coffee_nic112
coffee_nic118
coffee_nic115
coffee_nic134
coffee_nic131
coffee_nic128
coffee_nic137
coffee_nic159
coffee_nic156
coffee_nic168
coffee_nic171
coffee_nic174
coffee_nic180
coffee_nic183
coffee_nic186
coffee_nic189
coffee_nic192
coffee_nic198
coffee_nic195
coffee_nic201
coffee_nic227
coffee_nic230
coffee_nic233
coffee_nic236
coffee_nic239
coffee_nic242
coffee_nic245

10.6 MATRICES

DE

CONCENTRACIONES

RESULTADOS
DE

CIDOS

CON

LAS

CARBOXLICOS

DETERMINADAS MEDIANTE REFLECTOQUANT

En las siguientes matrices se presentan las mediciones realizadas para los cidos
mlico y lctico mediante Reflectoquant .
La configuracin de las matrices es igual a la utilizada para recolectar los datos
mediante HPLC, con las filas indicando las separaciones entre experimentos y las
columnas las separaciones entre pH.
Para las mediciones de estos parmetros se utilizaron las mismas muestras que
para el anlisis mediante HPLC.

Tabla 45- Matriz de concentraciones determinadas para los cidos mlico y lctico mediante
reflectoquant
. Mlico Concentraciones (mg/ l)
Exp.

Benef.

Inicial
6.3

6.1

4.8

139.00

C
D
E
F
G
H
J
K
L

125.00

C
D
E
F
G
H
J
K
L

B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Exp.
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

190.00
198.00
80.00
166.00
186.00
159.00
159.00
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
4.4
4.3
4.2
65.00
62.00
135.00
102.00
93.00
151.00
79.00
83.00
61.00
118.00

145.00
95.00
86.00
73.00

60.00

74.00
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
3.9
3.8
84.00

3.7

150.00
136.00

104.50
52.00

73.00
72.00
103.00

97.00
75.00

. Lctico Concentraciones (mg/ l)


Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
6.3
6.1
4.8
4.7
4.6
27.00
B
17.00
C
42.00
D
E
36.00
21.00
F
25.00
15.00
G
37.00
18.00
H
26.00
18.00
J
14.00
K
33.00
19.00
L
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
4.4
4.3
4.2
4
3.9
3.8
43.00
31.00
B
62.00
32.00
C
93.00
41.00
D
75.00
47.00
E
28.00
60.00
F
69.00
31.00
G
108.00
44.00
H
J
48.00
31.00
46.00
K
59.00
39.00
L
57.00

Benef.

4.5
128.00

4
B
C
D
E
F
G
H
J
K
L

Grupo 1 (pH =4.8-4.5)


4.7
4.6

Inicial

4.5
36.00

31.00

3.7

56.00

10.7 CROMATOGRAMAS DE COMPONENTES ASOCIADOS AL


CIDO GALACTURNICO

El archivo glucoronic 04 consiste en un cromatograma con los 7 cidos


estndares, se puede apreciar que el rea del cido galacturnico es 189.5100,
con un tiempo de retencin de 2.083 min, en color azul se revelan los picos para
esta mezcla se sobreponen en color rojo los picos del archivo glucoronic03. A esta
mezcla de 7 cidos se agreg cido glucornico (glucoronic03) y el rea en donde
se haba registrado el . galacturnico aument hasta 892.8160. El tiempo de
retencin fue de 1.966 casi sobrepuesto con el tiempo de retencin anteriormente
registrado para . galacturnico.
En el cromatograma tarta02 presenta los tiempos de retencin y las reas
medidas para una mezcla de 7 cidos. En este caso el cido galacturnico
presenta un tiempo de retencin de 2.300 minutos y un rea de 809.6140 min.
En el archivo tarta01 se presenta un cromatograma en el cual a la anterior
mezcla de cidos se ha agregado . tartrico, como se puede ver el resultado es
la aparicin de un pico con rea 14323 .9145 y con tiempo de retencin de 2.316
min. Con un tiempo de retencin similar al del . galacturnico.

10.8 CROMATOGRAMAS

PARA

LA

DETERMINACIN

DE

COMPONENTE ASOCIADO AL CIDO LCTICO

En los siguientes cromatogramas se presentan los resultados del anlisis


realizado al cido ascrbico, en el primero de ellos (mezcladeacidos08) se
presenta el anlisis de una mezcla de cidos estndares con los siguientes
rdenes de elusin: galacturnico, frmico, mlico, lctico, actico, ctrico

propinico. Se puede apreciar que para el componente cido lctico (tiempo de


retencin 3.683 min) el rea en este cromatograma es de 982.05, en el segundo
cromatograma, (mezcladeacidos07) en el que a la misma concentracin de cidos
en mezcla se ha aadido cido ascrbico, se aprecia que para el mismo tiempo de
retencin de cido lctico el rea ha aumentado a 1764.61.
El tercer cromatograma (mezcladeacidos09) en el que se ha analizado el .
ascrbico en solitario, demuestra que el tiempo de retencin de dicho cido es
muy similar al del . lctico y por ende en el previo cromatograma el aumento en el
rea se deba a la inclusin de . ascrbico.