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Real-time PCR
PCR based assays are currently used routinely in most
microbiology laboratories. But, with few exceptions, they
are restricted to the field of virology, especially to a limited
number of viral targets with important economical interest
for which commercially well standardized assays are
available. For several reasons, it has had a poor
implementation of the PCR assays into routine diagnostics
for other infectious diseases despite they are
advantageous. Combined with automated sample
isolation of nucleic acids, real-time PCR gives an ideal
platform for the development of molecular assays for a
wide range of infectious agents with clinical interest.
Because of its advantages, as simplicity, rapidity and
minor risk of contamination, real-time PCR will go replace
conventional PCR assays and its use will extend to a wide
range of applications in clinical microbiology.
Key words: Real-time PCR. Molecular diagnostics.
Fluorogenic probes.
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para los que se han comercializado sistemas bien estandarizados y, en mayor o menor medida, automatizados. Para
otros agentes infecciosos con menor inters econmico,
para los que no hay kits comerciales para llevarlos a cabo o,
si los hay, no son de fcil aplicacin, se emplean mtodos
no comercializados, optimizados en los propios laboratorios, aunque, en general, su uso se ha limitado a centros
de referencia o a grandes hospitales. El empleo generalizado de esos mtodos caseros no parece muy aconsejable,
ya que diversos estudios efectuados hace algunos aos
para evaluar su calidad revelaron graves deficiencias de
reproducibilidad, sensibilidad y especificidad en la mayora
de los laboratorios participantes. Las causas de estas deficiencias son mltiples. Por ejemplo, la gran heterogeneidad de las muestras que llegan al laboratorio y de los
agentes infecciosos que deben ser identificados obliga a disponer de diferentes mtodos de extraccin, en algunos casos muy complejos y laboriosos. La aparicin, hace algunos aos, de mtodos comerciales basados en columnas con
matrices de silicatos y la reciente irrupcin de robots que
llevan a cabo la extraccin de cidos nucleicos de manera
automatizada, en algunos tipos de muestras, representan
una mejora considerable. La presencia en algunas muestras de sustancias que inhiben la PCR origina falsos negativos, siendo recomendable introducir controles internos en
las reacciones de amplificacin para detectarlas. Aunque
los problemas ms importantes de la PCR en microbiologa
afectan sobre todo a la especificidad. Debido a la elevada
sensibilidad del mtodo, el riesgo de contaminacin cruzada entre muestras es considerable. La fuente de contaminacin ms comn son los fragmentos de ADN amplificados previamente en el laboratorio (amplicones) que pueden
contaminar reactivos, superficies y materiales y producir
resultados falsos positivos. Para disminuir el riesgo de
contaminacin hay que tomar y respetar rigurosamente
una serie de precauciones de diversa ndole1, que incluyen una distribucin del laboratorio en distintas reas de
trabajo (pre y post-PCR), la adopcin de tediosos hbitos
de trabajo que minimizan el riesgo, el uso de material especial o el empleo de sistemas anticontaminacin, como la
irradiacin de superficies y reactivos con luz ultravioleta
o los sistemas qumicos como la isopsoralina2 o la uracil-Nglucosilasa (UNG)3.
Adems, la cuantificacin del ADN diana en la muestra
por PCR resulta complicada. La dificultad principal radica
en que la eficacia de amplificacin de la PCR va disminuyendo con el tiempo, hasta que la reaccin llega a una fase
de saturacin en la que ya no se produce incremento de
ADN. Puesto que los fragmentos amplificados se detectan
al final de la PCR cuando la mayora de reacciones han
alcanzado ya la fase de saturacin, la cantidad de ADN obtenido no suele guardar mucha relacin con la concentracin inicial de ADN en la muestra. Adems, al ser la PCR
una reaccin de tipo exponencial, pequeas oscilaciones en
la eficacia de amplificacin para cada muestra se traducen
en importantes variaciones en la cantidad de ADN obtenido al final del proceso. Para superar este escollo se han
desarrollado diversas estrategias. La ms comn consiste
en hacer que el ADN diana compita durante la amplificacin con una cantidad conocida de control interno aadida antes de iniciar el proceso (PCR competitiva). Sin embargo, esos mtodos son laboriosos, poco precisos y suelen
tener un rango de cuantificacin limitado.
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Mx abs (nm)
Mx em (nm)
374-403
491
503
494
497
513
495
430
522
525
530
552
534
540
553
560
460,502
643
480,565
526
580
480,565
596
534
536
685
743
795
422-430
509
512
520
520
532
535
540
550
555
560
565
570
570
575
580
526,650
667
670
605
605
613
615
616
617
705
767
849
Sonda
Hibridacin
una estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unin especfica con el ADN diana.
Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no
est hibridada, lo que conlleva que donador y aceptor estn muy cerca uno de otro. En esta conformacin la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo. Sin embargo, al
hibridar con el ADN diana la sonda se abre, alejndose donador y aceptor, pudiendo ser detectada la fluorescencia
emitida por el primero8 (fig. 2).
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B
Lector
Fabricante
Sistema
trmico
Tiempo
Capacidad
de reaccin
2h
96
ICycler iQ
BioRad
2h
96-384
LightCycler
Roche
Aire
Diagnostics
20-60 min
32
SmartCycler
Cepheid
40-60 min
16-96
Convencional
Placa
cermica
MX4000
Stratagene
Convencional
90 min
96
Rotor Gene
Corbett
Research
Aire
50 min
32
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104
103
10
15
20
102
25
101
30
35
40
45
Ciclos
Tm: 56 Tm: 59
Tipo mutado
Tipo salvaje
0
Temperatura
gran variedad de pruebas moleculares para la identificacin o cuantificacin de esos agentes infecciosos. Es el caso
de muchos virus10,11 (familia de los Herpesvirus, virus respiratorios, enterovirus, virus JC, virus BK, etc.) o de bacterias que no crecen en medios de cultivo como Tropheryma wippeli12, o que crecen mal como Bordetella pertussis13
o Bartonella14 o muy lentamente como Mycobacterium tuberculosis15. Tambin, de micosis invasivas16, especialmente por Aspergillus ssp. o de infecciones parasitarias
como las ocasionadas por Toxoplasma gondii17 en lquido
amnitico o en lquido cefalorraqudeo (LCR).
Otro campo potencial de aplicacin de la PCR a tiempo
real es en la identificacin de organismos fcilmente cultivables, cuya deteccin rpida sea beneficiosa por algn
motivo. Por ejemplo, la identificacin de Streptococcus del
grupo B (S. agalactiae) en frotis vaginales18. La colonizacin del tracto genital de mujeres parturientas por este
agente se relaciona con un mayor riesgo de infeccin neonatal grave. El tiempo necesario para el aislamiento de
esta bacteria mediante cultivo es de 1-2 das, mientras que
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NOTA
Los artculos publicados en la seccin Formacin Mdica Continuada forman parte de grupos
temticos especficos (antibiograma, antimicrobianos, etc.). Una vez finalizada la publicacin de
cada tema, se irn presentando al Sistema Espaol de Acreditacin de la Formacin Mdica Continuada (SEAFORMEC) para la obtencin de crditos.
Una vez concedida la acreditacin, sta se anunciar oportunamente en la revista y se abrir un
perodo de inscripcin gratuito durante 3 meses para los socios de la SEIMC y suscriptores de la
Revista, al cabo del cual se iniciar la evaluacin, durante 1 mes, que se realizar a travs de la web
de Ediciones Doyma.
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