COLORAO DE GRAM E DE ZIEHL-NEELSEN

Texto 1. A Coloracao de Gram e as Variacoes na sua Execucao

RESUMO
A coloracao de Gram e um importante teste realizado nos laboratorios de
microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnostico de doencas bacterianas. A
partir de um determinado perfil tintorial as bacterias coram-se de roxo ou de rosa e
consequentemente sao classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas,
respectivamente.
A coloracao de Gram envolve uma serie de procedimentos antes de chegar a
etapa final de leitura da lamina preparada: envolve a confeccao do esfregaco, sua
fixacao e passa pela coloracao pro- priamente. Nesta, o corante Cristal Violeta
adsorve-se nas celulas, forma um complexo com o iodo (Lugol) e apos a etapa
diferencial, com alcool-acetona, as celulas sao contra-coradas com Fucsina de
Gram. Neste estudo avaliou-se a influencia de variacoes na referida coloracao
considerando os tempos de exposicao aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de
Gram e o emprego ou nao de lavagens com agua entre as etapas.
Os resultados obtidos mostraram que as diferencas nos procedimentos
aplicados em cada tecnica testada nao alteraram o resultado quando comparados a
laminas padrao.
INTRODUO
Em geral, sao necessarias coloracoes biologicas para a visualizacao de
bacterias de modo adequado e demonstracao dos detalhes finos das suas
estruturas.
O advento da coloracao representa, em grande parte, o fundamento dos
principais avancos produzidos em microbiologia clnica e em outros campos da
microscopia diagnostica durante os ltimos 100 anos.

A maioria das coloracoes utilizadas em bacteriologia tem por finalidade o

diagnostico presuntivo rapido do processo infeccioso e tambem a previa avaliacao
da qualidade da amostra.
A coloracao de Gram e o metodo bacterioscopico mais importante e mais
utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade e a classificacao de
microrganismos com base em suas caractersticas tintoriais, tamanho, forma e
arranjo celular.
As bacterias sao classificadas basicamente em dois grandes grupos: Grampositivas e Gram-negativas. No que diz respeito as caractersticas tintoriais, as
bacterias Gram-positivas coram-se de roxo e as bacterias Gram-negativas coram-se
de rosa.
A deteccao de microrganismos na amostra e de suma importancia, uma vez
que pode indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de
patogenos e, tambem, a necessidade da realizacao de cultura com finalidade
diagnostica e/ou epidemiologica.
A tecnica de coloracao de Gram geralmente respeita um protocolo de acoes
que a padroniza. Contudo, ha variantes nesse procedimento relacionadas aos
tempos de execucao da coloracao e a utilizacao de lavagem com agua em dadas
etapas que podem ou nao interferir na visualizacao das estruturas coradas. Nesse
sentido, este trabalho se propos a verificar se estas pequenas variacoes de tempo e
lavagens a partir de protocolos especficos refletem em alguma alteracao na
interpretacao dos resultados da coloracao de Gram.
FREITAS, Valdonir da Rosa; PICOLI, Simone Ulrich. A coloracao de Gram e as
variacoes na sua execucao. Newslab, v. 82, p. 124-128, 2007.

Texto 2. Tcnica de Coloracao de GRAM

INTRODUO
O metodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia e o metodo de
Gram. A bacterioscopia, apos coloracao pelo metodo de Gram com diagnostico
presuntivo, de triagem, ou ate mesmo confirmatorio em alguns casos, constitui peca
importante e fundamental na erradicacao e no controle das Doencas Sexualmente
Transmissveis (DST). Essa tecnica e simples, rapida e tem capacidade de
resolucao, permitindo o correto diagnostico em cerca de 80% dos pacientes em
carater de pronto atendimento em nvel local.
Os custos com investimento e manutencao sao consideravelmente baixos
diante da eficacia alcancada com os resultados imediatos dos testes. Essa tecnica
requer instalacao simples, necessitando apenas de uma sala pequena com
disponibilidade de agua e gas, onde devera ser instalado um balcao com pia e um
bico de Busen, eventualmente substitudo por uma lamparina ou espiriteira.
Sao ainda necessarios: microscopio com objetiva de imersao e bateria para a
coloracao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo proprio laboratorio ou
por um laboratorio habitado que assegure a qualidade do produto.
Finalmente, e mais importante, sao necessarios tecnicos de laboratorio
treinados, responsaveis e conscientes do valor do seu trabalho.
A coloracao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor,
o medico dinamarques Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que
as bacterias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes.
Isso permitiu classifica-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram
chamadas de Gram- positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gramnegativas.
Apos descricao do metodo, inmeras propostas de modificacao foram feitas.
Neste manual, voce vai conhecer a tecnica, os corantes e os procedimentos para a

correta realizacao da coloracao de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de

Doencas Sexualmente Transmissveis e Aids do Ministerio da Sade.

Como funciona a coloracao de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, varios pesquisadores tentaram, com
pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no metodo de coloracao.
Conceitos diversos tem sido apresentados, tais como:
1.

existencia

de

um

substrato

Gram-positivo

especfico;

2.As bacterias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam

diferentes afinidades com o corante primario cristal de violeta; e
3.A existencia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos
Gram-positivos e Gram-negativos.
Este ltimo e o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare- de celular,
quanto as dimensoes dos espacos intersticiais, por exemplo, diametro do poro,
parecem ser determinantes do resultado final da coloracao de Gram.
Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares sao cobertas pela
violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adicao do lugol, tambem chamado
de mordente, ocorre a formacao do completo iodo-pararosanilina. Esta reacao tem a
propriedade de fixar o corante primario nas estruturas coradas. Algumas estruturas
perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como
alcool etlico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou nao perdem a
cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.
As

bacterias

que

tem

parede

celular

composta

por

murena

(peptdeoglicano - peptdeo de acido n-acetil muramico), durante o proces- so de

descoloracao com alcool etlico, retem o corante. Ja as bacterias com parede celular
composta

predominantemente

por

acidos

graxos

(lipopolissacardeos

lipoprotenas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante

de fundo.

Brasilia: Ministerio da Sade, Tecnica de Coloracao de Gram. Programa

Nacional de Doencas Sexualmente Transmissveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Serie
TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doencas Sexualmente Transmissveis e
AIDS,

(Brasil).

II.

Serie

TELELAB.

Disponvel

em:

http://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art02.pdf. Acesso em: 15 out

2014.

TEXTO 3. Coloracao de Gram e cido Resistente (Tortora)

A coloracao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologis- ta dinamarques

Hans Christian Gram. Ela e um dos procedimentos de coloracao mais teis, pois
classifica as bacterias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.
Neste procedimento (Figura 3.12a),
1. Um esfregaco fixado pelo calor e recoberto com um corante basico prpura,
geralmente o cristal violeta. Uma vez que a coloracao prpura impregna todas
as celulas, ela e denominada coloracao primria.
2. Apos um curto perodo de tempo, o corante prpura e lavado, e o esfregaco e
recoberto com iodo, um mordente. Quando o iodo e lavado, ambas as
bacterias gram-positivas e gram-negativas aparecem em cor violeta escuro ou
prpura.
3. A seguir, a lamina e lavada com alcool ou uma solucao de alcool-acetona.
Essa solucao e um agente descolorante, que remove o prpura das celulas
de algumas especies, mas nao de outras.
4. O alcool e lavado, e a lamina e entao corada com safranina, um corante
basico vermelho. O esfregaco e lavado novamente, seco com papel e
examinado microscopicamente.
O corante prpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bacteria,
corando-a de violeta escuro ou prpura. As bacte- rias que retem essa cor apos a
tentativa de descolori-las com alcool sao classificadas como gram-positivas; as
bacterias que perdem a cor violeta escuro ou prpura apos a descoloracao sao
classificadas como gram-negativas (Figura 3.12b). Como as bacterias gram-

-negativas sao incolores apos a lavagem com alcool, elas nao sao mais visveis.
por isso que o corante basico safranina e aplica- do; ele cora a bacterias gramnegativas de rosa.
Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a
coloracao primaria, sao denominados contracorantes. Como as bacterias grampositivas retem a cor prpura original, nao sao afetadas pelo contracorante
safranina.
Os diferentes tipos de bacterias reagem de modo distinto a coloracao de
Gram, pois diferencas es- truturais em suas paredes celulares afetam a retencao ou
a liberacao de uma combinacao de cristal violeta e iodo, denominada comple- xo
cristal violeta-iodo (CV-I).
Entre outras diferencas, as bacterias gram-positivas possuem uma parede
celular de peptideoglicano mais espessa (dissacardeos e aminoacidos) que as
bacterias gram- -negativas. Alem disso, as bacterias gram-negativas contem uma
camada de lipopolissacardeo (lipdios e polissacardeos) como parte de sua parede
celular (veja a Figura 4.13, pagina 86).
Quando aplicados a celulas gram-positivas e gram-negativas, o cristal violeta e o iodo penetram facilmente nas celulas. Dentro das mesmas, o cristal violeta e
o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo e maior que a molecula de
cristal violeta que penetrou na celula e, devido a seu tamanho, nao pode ser
removido da camada intacta de peptideoglicano das celulas gram-positivas pelo
alcool. Consequentemente, as celulas gram-positivas retem a cor do co- rante cristal
violeta.
Nas celulas gram-negativas, contudo, a lava- gem com alcool rompe a
camada externa de lipopolissacardeo, e o complexo CV-I e removido atraves da
camada delgada de peptide- oglicano. Como resultado, as celulas gram-negativas
permanecem incolores ate serem contracoradas com a safranina, quando adquirem a cor rosa.
Em resumo, as celulas gram-positivas retem o corante e permanecem com a
cor prpura. As celulas gram-negativas nao retem o corante; elas ficam incolores ate

serem contracoradas com um corante vermelho.

O metodo de Gram e uma das mais importantes tecnicas de coloracao na
microbiologia medica. Porem, os resultados da co- loracao de Gram nao sao
universalmente aplicaveis, pois algumas celulas bacterianas coram-se fracamente
ou nao adquirem cor. A reacao de Gram e mais consistente quando utilizada em
bacterias jovens, em crescimento.

Figura 1. Procedimento para a realizacao da coloracao de Gram.

Figura 2. Micrografia de bactrias coradas pelo Gram. Os bastonetes e os

cocos (roxo) sao gram-positivos, e os vibrioes (rosa) sao gram-negativos.

Coloracao lcool-cido resistente

Outra importante coloracao diferencial (que classifica as bacterias em grupos
distintos) e a coloracao lcool-cido resistente, que se liga fortemente apenas a
bacterias que possuem material cereo em suas paredes celulares.
Os microbiologistas utilizam essa coloracao para identificar todas as bacterias
do genero Mycobacterium, incluindo os dois importantes patogenos Mycobacterium
tuberculosis, o agente causador da tuberculose, e Mycobacterium leprae, o agente
causador da lepra. Essa coloracao tambem e usada para identificar as linhagens
patogenicas do genero Nocardia. As bacterias dos generos Mycobacterium e
Nocardia sao alcool-acido resistentes.
No procedimento de coloracao alcool-acido resistente, o corante vermelho
carbolfucsina e aplicado a um esfregaco fixado, e a lamina e aquecida levemente
por varios minutos. (O calor aumenta a penetracao e a retencao do corante.) A
seguir, a lamina e resfriada e lavada com agua.
O esfregaco e tratado com alcool-acido, um descolorante, que remove o
corante vermelho das bacterias que nao sao alcool-acido resistentes. Os
microrganismos alcool-acido resistentes retem a cor vermelha, pois a carbol-fucsina
e mais solvel nos lipdios da parede celular que no alcool-acido.
Em bacterias que nao sao alcool-acido resistentes, cujas paredes celulares
nao possuem os componentes lipdicos, a carbolfucsina e rapidamente removida
durante a desco- loracao, deixando as celulas incolores. O esfregaco e entao corado
com o contracorante azul de metileno. As celulas que nao sao alco- ol-acido
resistentes ficam azuis apos a aplicacao do contracorante.

Figura 3. Bactrias lcool-cido resistentes (BAAR). As bactrias Mycobacterium

leprae que infectaram este tecido foram coradas de vermelho com uma coloracao
lcool-cido. As clulas que nao sao lcool-cido resistentes estao coradas com o
contracorante azul de metileno.

TORTORA, Gerard J; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. Porto

Alegre: Artmed, 2012. 934 p. Traducao: Aristobolo Mendes da Silva [et al.]; revisao
tecnica: Flavio Guimaraes da Fonseca.

TEXTO 4. Coloracao de Gram e Zhiel-Neelsen Prticas de

Microbiologia

COLORAO DE GRAM
Foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista Hans Christian Gram e e a
coloracao diferencial mais utilizada em bacteriologia. Esta coloracao separa as
bacterias em dois grandes grupos: as Gram-positivas (Gram +) e as Gram-negativas
(Gram -). Este metodo de coloracao e o metodo de escolha para a identificacao de
bacterias, porem deve der utilizado em bacterias em fase de crescimento. A

observacao de material coletado corado pela tecnica de Gram nao so e importante

para acompanhar o isolamento de amostras, como tambem para determinar o tipo
de antibiotico que deve ser utilizado em diferentes infeccoes.
Neste tipo de coloracao sao utilizados 4 reagentes diferentes, como sera
descrito a seguir. O preparo das amostras e rapido e se inicia com a coloracao de
um esfregaco de celulas fixados a uma lamina histologica pelo calor, com o corante
cristal violeta que cora as celulas com cor prpura. Este corante se impregna em
todas as celulas e esta primeira coloracao e denominada coloracao primria.
Logo apos, as celulas sao recobertas por uma solucao de iodo que age como
um mordente que e qualquer substancia que forma um complexo insolvel quando
se liga ao corante primario.
A seguir, as laminas contendo o esfregaco de celulas sao lavadas com etanol
95% (agente descolorante), que descora seletivamente alguns tipos de celulas. O
alcool e entao removido por lavagem em agua e as celulas sao coradas por um
segundo corante, a safranina, um contracorante, sendo sua coloracao bem
diferente daquela dada pelo cristal violeta. As bacterias denominadas Gram +
adquirem cor prpura (roxo), enquanto as Gram apresentam coloracao cor-derosa.
O princpio da tecnica esta baseado na diferenca de composicao da parede
de diferentes bacterias e na capacidade destas paredes em reterem os corantes
utilizados. Sabemos hoje que as bacterias Gram + possuem uma parede celular
mais espessa e diferente da parede das bacterias Gram -.
A princpio, os dois tipos de celulas se coram pelo cristal violeta associado ao
iodo. O complexo formado pelo cristal violeta e pelo iodo se liga a componentes
presentes na parede das bacterias Gram +, que possuem na sua composicao
magnesio e acidos ribonucleicos. Esta ligacao forma um complexo (Mg RNA CV
I) de difcil remocao.

Durante a utilizacao do alcool e que a diferenca na composicao da parede

celular das bacterias sera de extrema importancia para definir os dois grupos de
bacterias. O alcool tera duas funcoes: dissolver lipdios e desidratar as celulas.
O corante associado a parede das bacterias Gram + e que possui alto peso
molecular nao consegue se difundir de volta para o meio externo durante a lavagem
com o alcool a clula permanece corada na cor roxa.
No caso das Gram -, sabemos que a camada de parede e extremamente
mais delgada e que sobre a parede encontramos uma outra membrana a externa, de
natureza lipdica.
Ao utilizar o alcool, a membrana externa das Gram e solubilizada e, como a
camada de parede celular e mais fina, nao possuindo a mesma composicao da
parede das bacterias Gram +, o complexo cristal violeta-iodo e capaz de se difundir,
deixando a celula descorada. Quando se aplica o contracorante safranina, as
clulas Gram + adquirem a cor rosada do novo corante. As solucoes adiante sao
utilizadas na coloracao de Gram.
COLORAO DE RESISTNCIA AO LCOOL-CIDO (MTODO DE ZIEHLNEELSEN)
Esta e a coloracao de escolha para a identificacao de bacterias do genero
Mycobacterium, como por exemplo, as especies Mycobacterium tuberculosis e
Mycobacterium leprae, bem como para identificar cepas patogenicas de bacterias do
genero Nocardia.
A parede de micobacterias possui uma espessa camada de lipdios (acido
micolico) que evita a penetracao de diversos corantes. Por outro lado, quando o
corante penetra alcancando o citoplasma da celula, ele nao pode ser removido com
facilidade, mesmo com o uso de agentes descolorantes (mistura alcool-acido).
A celula que permanece corada apos a mistura alcool-acido ter sido aplicada
e denominada lcool-cido resistente, enquanto que aquelas que se descoram por

nao possurem a mesma composicao de parede celular sao denominadas lcoolcido sensveis.
Uma vez que as especies M. tuberculosis e M. leprae sao patogenicas para
humanos, esta coloracao e de alto valor diagnostico. Algumas modificacoes e
cuidados devem ser observados durante a confeccao de laminas com micobacterias.
No caso do esfregaco, notar que as micobacterias sao difceis de serem
espalhadas na gota de agua sobre a lamina. Isto se deve a caracterstica hidrofobica
de sua parede. O esfregaco deve ser seco ao ar por 15 a 30 minutos e fixados pelo
calor, passando-se a lamina sobre a chama de 3 a 5 vezes durante 3-4 segundos.
O esfregaco devera ser recoberto com o corante (carbolfucsina) e colocado
sobre uma placa aquecedora morna ou sobre um recipiente com agua quente.
Atencao: nao deixe o corante evaporar. Va colocando mais corante se
necessario. A alta temperatura facilita a penetracao do corante pela parede da
bacteria.
Apos lavar a lamina com agua, resfrie rapidamente na geladeira ou passe
jatos de agua gelada. O resfriamento deixa a camada de lipdios das bacterias alcool
acidos resistentes mais consistentes, evitando que o corante saia do citoplasma.
A lamina e tratada com alcool-acido que age como um agente descolorante,
descorando um grupo de celulas. As celulas descoradas sao entao coradas em azul
pelo azul de metileno. Duas populacoes de cores diferentes surgem apos este tipo
de coloracao: clulas vermelhas (alcool-acido resistentes, como as bacterias do
genero Mycobacterium) e clulas azuis (alcool-acido sensveis).
Da mesma maneira como acontece na coloracao de Gram, a composicao da
superfcie das celulas e o fator preponderante na obtencao da coloracao. O corante
apos a lavagem com o agente descolorante apenas continua impregnado em
celulas.