Disciplina: Engenharia de Protenas

Prof. Dr. Marcos Tlio de Oliveira

Ma. Flvia Campos Freitas Vieira

Mtodos de Purificao de Protenas

1. Trabalhando com protenas;
2. Purificao Proteica;
3. Mtodos Cromatogrficos;
4. Anlise de Protenas;
5. Quantificao de Protenas.

Trabalhando com Protenas

Compreenso sobre estrutura e funo de
protenas protenas individuais.
Separadas de outras de forma pura a partir da
determinao de suas propriedades.
Protena pura essencial para que suas
propriedades e atividades sejam determinadas.

Trabalhando com Protenas

Como purificar uma protena

Mtodos clssicos

Mtodos modernos

Diferena de
propriedades das
protenas: carga,
tamanho, ligantes.

Clonagem de DNA,
sequenciamento
genmico, chips de
protenas, etc.

Trabalhando com Protenas

Protena nova precedentes estabelecidos e bom senso.
Mais de um mtodo de purificao utilizado.
Escolha do mtodo: emprico.

Levar em considerao mtodos descritos para protenas

semelhantes.
Iniciar com mtodos de baixo custo.

Purificao Proteica: Fonte Proteica

Purificao Proteica: Isolamento

Extrato Bruto

Purificao Proteica: Fracionamento

Fracionamento Separao das protenas do
extrato em diferentes fraes com base no
tamanho, carga.

Diferenas na solubilidade proteica

Funo do pH, temperatura, concentrao de sais e outros
fatores.

Purificao Proteica: Fracionamento

Salting out
Precipitao proteica com elevada concentrao
salina.
((NH4)2SO4)

Purificao Proteica: Preparao

Soluo proteica passa por modificaes para uma
purificao eficiente.
Dilise: separa protenas de pequenos solutos se
aproveitando do maior tamanho das protenas.
Ex: Remoo de sulfato de
amnio da amostra.

Mtodos Cromatogrficos
Cromatografia em Coluna
Poderoso mtodo de fracionamento.

Diferena de tamanho, carga, afinidade de

ligao e outros.
Velocidade da migrao depende da
propriedade da protena.

Lehninger, 5 ed. 2010

Mtodos Cromatogrficos
Tipos de Cromatografia em Coluna:
o Troca Inica (Aninica e Catinica);
o Gel-filtrao ou Excluso por tamanho;

o Afinidade;
o Cromatografia Lquida de Alta Performance (HPLC).

Cromatografia de troca inica

Baseado nas diferenas de sinal e magnitude da carga
eltrica lquida de protenas em um dado pH.
Resina:
o Trocadora de ctions (grupos aninicos);
o Trocadora de nions (grupos catinicos).

Cromatografia de troca inica

Afinidade afetada:
o pH (determina o estado de ionizao da molcula);
o concentrao dos ons dos sais livres que competem
na soluo circundante.

Cromatografia de troca catinica

Matriz carregada negativamente.
Protenas com carga lquida
positiva migram mais lentamente.
Expanso da soluo proteica na
fase mvel:
o separao de protenas com diferentes
propriedades
o espalhamento difusional.

Lehninger, 5 ed. 2010

Cromatografia de troca catinica

Tamanho da coluna aumenta, a resoluo de
dois tipos de protenas com cargas lquidas
tambm aumenta.
A velocidade da soluo proteica diminui com o
tamanho da coluna.
Quanto mais devagar a soluo proteica gasta na
coluna, a resoluo diminui (espalhamento
difusional).

Cromatografia de excluso por tamanho

Ou gel-filtrao.
Separao por tamanho.

Fase slida: grnulos de polmero com

ligaes cruzadas, com poros de tamanho
especfico.
Protenas grandes saem da coluna antes que
as pequenas.

Cromatografia de excluso por tamanho

Protenas grandes no
entram nas cavidades e
so eludas mais
rapidamente.
Enquanto protenas
menores percorrem um
caminho maior dentro dos
poros.
Lehninger, 5 ed. 2010

Cromatografia lquida de alta eficincia

CLAE

(HPLC)

Bombas de alta presso

aceleram o movimento de
molculas de protena
atravs da coluna.
Reduzindo o tempo de
trnsito na coluna, a difuso
de bandas diminuda e a
resoluo aumentada.

Cromatografia de afinidade
Baseado na afinidade de
ligao.
Resina: ligante (grupo qumico
covalentemente ligado).
Protenas com afinidade se
ligam ao ligante.

Lehninger, 5 ed. 2010

 Formado um complexo entre protena e

ligante.

As protenas que no se ligam so

lavadas da coluna.
Protena de interesse eluda com uma
elevada concentrao de sal e do ligante
livre.
O sal interfere nas ligaes inicas que
ligam a protena ao ligante.
O ligante livre se liga a coluna de
afinidade.
Lehninger, 5 ed. 2010

Resina:
Nquel
Ligante:
Histidinas
Grupo quelante:
Imidazol

Fig. 1. Schematic illustration of the protein binding to a metal-chelated affinity support. Strong binding of a
protein onto the IMAC matrix is achieved predominately by multi-point attachment of native or engineered
surface histidines; (a)., or by histidine tag; (b.) added to the N- or C-terminus of the protein. There are many
possibilities for the construction of efficient His tags considering the number of histidines, their location and
microenvironment. However, in practice some simple solutions consisting of consecutive histidine residues,
e.g., His6 or His10, prevail.

Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.

Cromatografia de afinidade: Exemplo

Fonte: Vieira, 2014.

Expresso Heterloga de Protenas

Representao Esquemtica de um Vetor de

Expresso Procaritico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

Representao Esquemtica de um Vetor de

Expresso Procaritico pET SUMO
6x HisStio
tag

Operador
Promotor
forte lac
IPTG induzido

de clonagem

Protena fusionada
Gene de seleo em E. coli

Repressor lac
Interage com a
pBR322 ori

Origem de replicao

Tags de Fuso de Protena Comuns

Produo recombinante de insulina

humana

Anlise de Protenas
Eletroforese;
Focalizao Isoeltrica;

Eletroforese Bidimensional (2D).

Eletroforese de Protenas
Eletroforese: separao com
base na migrao de
protenas carregadas em um
campo eltrico.

No utilizado para
purificar grandes
quantidades de protenas
porque afetam sua estrutura
e a funo.

Eletroforese de Protenas
Vantagens
Mtodo analtico: til tanto separar quanto visualizar
protenas.
Estimar rapidamente o nmero de diferentes protenas
presentes em uma amostra ou o grau de pureza.
Permite determinao do ponto
isoeltrico e massa molecular
aproximada.

Eletroforese de Protenas
Gis de polmero de acrilamida - poliacrilamida.

Migrao afetada pela massa-carga e forma da

protena.

Eletroforese de Protenas
SDS-PAGE

SDS (sodium dodecyl sulfate)

1 molcula de SDS para cada 2
resduos de aminocidos.
Contribui com grande carga negativa.

SDS desdobra parcialmente as

protenas, assumindo forma
semelhantes.

Eletroforese de Protenas
Separao, quase exclusivamente, pela massa molecular.
Polipeptdeos menores migram mais rpido.
Visualizao com Coomassie ou Nitrato de Prata.
Aproximao da massa
molecular para protenas
desconhecidas.

Focalizao Isoeltrica
Processo utilizado para a
determinao do ponto
isoeltrico (pI) de uma
protena.
Quando uma mistura de
protenas aplicada em um
gel com gradiente de pH,
essas migram at que seu
pH coincida com seu pI.

Eletroforese Bidimensional
Combinao sequencial da
focalizao isoeltrica e SDS-PAGE.
Separao de mistura complexa
proteica.

Mais sensvel que os mtodos

isolados.
Massa molecular e pI.

Exemplo de Purificao Proteica

M

M FT1 W1

S1

P1

E1

M [E1]

S2

P2

S3

P3

PP
M P.D. FT2 W2

E2

XAC1201

Fonte: Vieira, 2014

Quantificao de Protenas
Todos os processos de purificao requerem um mtodo
para a quantificao ou a avaliao da protena de
interesse na presena de outras protenas.
A purificao pode ser monitorada pela avaliao da
atividade especfica.

A quantificao de protenas um mtodo empregado

em anlises clnicas, nutrio animal, cincia de
alimentos, bioqumica de protenas, entre outros.

Enzimas
Quantidade determinada: aumento na velocidade
pela qual o substrato convertido a produtos da
reao quando a enzima est presente.

Quantificao de Enzimas
a) A equao global da reao catalisada;
b) Um processo analtico para a determinao do
desaparecimento do substrato ou o aparecimento de um
produto de reao;
c) Se a enzima requer cofatores como ons metlicos ou
coenzimas;
d) A dependncia da atividade enzimtica na concentrao
de substrato;
e) O pH timo;
f) A faixa de temperatura na qual a enzima estvel e
possui atividade mais alta.

Quantificao de Enzimas
1,0 unidade de atividade enzimtica a quantidade de
enzima que promove a transformao de 1,0 mol de
substrato por minuto a 25C sob condies timas de medida.
Atividade total de unidades da enzima em uma soluo.
Atividade especfica nmero de unidades de enzima por
miligrama de protena total.

Quantificao de Enzimas
A atividade e o total de protenas decrescem a cada
passo e a atividade especfica aumenta.
A atividade especfica uma medida de pureza da
enzima: aumenta durante a purificao de uma enzima e
torna-se mxima e constante quando a enzima est pura.

Protena pura quando etapas adicionais de

purificao no aumentam a atividade especfica e
somente uma nica espcie proteica pode ser detectada.

Quantificao de Protenas
Outras protenas
Outros mtodos de quantificao;
Testadas quanto ao efeito
biolgico que produzem;

Exemplos:
o Protenas de transporte;
o Hormnios e toxinas;
o Protenas estruturais.

Mtodos de Quantificao Proteica

Os mtodos espectrofotomtricos utilizam
comprimentos de onda na regio do ultravioleta ou do
visvel (mtodos colorimtricos ou colorimetria).

Mtodos de Quantificao Proteica

A colorimetria uma tcnica que avalia a capacidade
dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda
especficos.
A medida da luz absorvida permite interferir sobre a
concentrao de soluto em uma determinada soluo ou
material biolgico.

Mtodos de Quantificao Proteica

Principais ensaios de quantificao de protenas

Fonte:
http://www.labome.com.br/method/ProteinQuantitation.html

Mtodos de Quantificao Proteica

Quantificaes de protenas-alvo especficas
Vrias tcnicas so empregadas para quantificar
uma protena especfica. As mais utilizadas so:
o ELISA;
o Western Blot;
o Espectrometria de massa.