Metodos de Separación

2
Encabezamiento
Cuerpo
Notas
Marginales
10
11
1
3
5
7
9
11
Pie de p
agina
una pulgada + \hoffset

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2
4
6
8
10
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Encabezamiento
Notas
Marginales
Cuerpo
10
11
1
3
5
7
9
11
una pulgada + \hoffset

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Pie de p
agina
2
4
6
8
10
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METODOS INSTRUMENTALES DE
ANALISIS
Edineldo Lans Ceballos. M.Sc
Octubre 16 del 2013
Contenido
1 CROMATOGRAFIA
1.1 Clasificacion de los metodos cromatograficos . . . . . . . . . . . . .
1.1.1 Cromatografa en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2 Cromatografa plana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Clasificacion de los metodos cromatograficos en columna . . . . . .
1.2.1 Cromatografa de Gases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.2 Cromatografa lquida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.3 Cromatografa de fludos supercrticos . . . . . . . . . . . . .
1.3 Algunos terminos y ecuaciones utilizados en cromatografa . . . . .
1.4 Velocidades de separacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Tiempo de retencion Vs coeficiente de particion . . . . . . . . . . .
1.6 Relacion entre el tiempo de retencion y la constantes de distribucion
1.7 Asimetra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8 Tipos de fuerzas que estan presentes en un sistema cromatografico .
1.8.1 Interacciones ionicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8.2 Fuerzas de enalce de hidrogeno . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8.3 Fuerzas de repulsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9 Bases fsicas de la cromatografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.1 Eficiencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.2 Numero de plato teorico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.3 Resolucion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.4 Difusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.5 Ecuacion de Van Deemter . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.10 Ejercicios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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14
14
18
2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

20
2.1 Ventajas de la cromatografa en capa fina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2 Adsorbentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
i
ii
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25
25
3 CROMATOGRAFIA DE GAS
3.1 Cromatograf gas lquido . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Fase movil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Columnas tubulares abiertas . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 WCOT :wall coated tubular column . . . . . .
3.3.2 SCOT: support coated open tubular column. .
3.3.3 PLOT: porous layer open tubular column . . .
3.4 Ventajas de las open tubular column . . . . . . . . .
3.5 Clases de fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . .
3.6 Escogencia de la fase estacionaria . . . . . . . . . . .
3.7 Columnas empacadas . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.8 Indice de retencion . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.9 Programacion de temperatura y presion . . . . . . . .
3.10 Carrier gas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.11 Inyeccion de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.11.1 Inyecion split . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.11.2 Inyeccion splitless . . . . . . . . . . . . . . . .
3.11.3 Inyeccion on column . . . . . . . . . . . . . .
3.12 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.12.1 Claseses de detectores . . . . . . . . . . . . .
3.13 Preparacion de la muestra . . . . . . . . . . . . . . .
3.13.1 Seleccion del metodo en cromatografa de gas
3.14 Escogencia del modo de inyeccion . . . . . . . . . . .
3.15 Analisis cuantitativo y cualitativo . . . . . . . . . . .
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36
36
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.2.1 Proceso de adsorcion . .

2.2.2 Adsorbentes utilizados .
Preparacion de placas . . . . . .
Aplicacion de las muestras . . .
Eleccion del eluyente . . . . . .
Desarrollo de la cromatografa .
Evaluacion de un cromatograma
2.7.1 Analisis cualitativo . . .
2.7.2 Analisis cuantitativo . .
Localizacion de sustancias . . .
2.8.1 Metodos qumicos . . . .
2.8.2 Metodos fsicos . . . . .
Constante Rf . . . . . . . . . .
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de capa fina
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iii
4 ESPECTROMETRIA DE MASAS
4.1 Cualidades de la espectrometra de masas . . . . . . . . . . . . .
4.1.1 Cualidades de indentificacion . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.2 Cuantifica e identifica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.3 Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.4 Universal y especfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.5 Informacion estructural . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.6 Rapidez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Tecnicas de ionizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 Ionizacion por impacto electronico (EI) . . . . . . . . . . . . . .
4.4 Ionizacion qumica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.5 Ionizacion Qumica negativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.6 Ionizacion por campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.7 Fuentes de desorcion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.8 Desorcion por campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.9 Bombardeo por Atomos

Rapidos (FAB) . . . . . . . . . . . . . .
4.10 Ionizacion electrospray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.11 Espectrometro de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.11.1 Camara de ionizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.11.2 Analizador de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.12 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.12.1 Channeltron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.12.2 Copa de faraday . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.13 Metodos acoplados a masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.13.1 Aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.13.2 Desventajas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.13.3 Identificacion de compuestos puros por espectrometra de
4.13.4 Analizador de trampas de iones . . . . . . . . . . . . . .
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masas
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(HPLC)
5 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION
5.1 Proceso cromatografico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1 Efectos del tama
no de las partculas en HPLC . . . . . . . . . . .
5.1.2 Columnas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.3 Columnas analticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.4 Fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.5 Proceso de elucion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Clasificacion de la cromatografa lquida . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1 Cromatografa en fase reversa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2 Cromatografa en fase normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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iv
5.2.3 Cromatografa lquido-lquido o de particion . . . .
5.2.4 Cromatografa de adsorcion . . . . . . . . . . . . .
5.2.5 Eleccion del solvente . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gradiente de elucion isocratica . . . . . . . . . . . . . . . .
Seleccion del modo de separacion . . . . . . . . . . . . . .
Solventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Criterios para una buena separacion . . . . . . . . . . . . .
5.6.1 Atributos de una buena separacion . . . . . . . . .
Optimizacion con un solvente . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.1 Orden de escogencia de un solvente organico . . . .
Optimizacion con dos o tres solventes organicos . . . . . .
Temperatura como una variable en separaciones isocratica
5.9.1 Como se consigue una buena separacion? . . . . .
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6 CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS

6.1 Definiciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2 Caractersticas de un fludo supercrtico . . . . . . . . . . .
6.3 Analitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.4 Fase Movil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5 Cosolventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.1 Fludos usados para extraccion supercrtica . . . . .
6.6 Forma e inyeccion de la muestra . . . . . . . . . . . . . . .
6.7 Columnas y fases estacionarias . . . . . . . . . . . . . . . .
6.8 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.9 Areas donde se utilizan los fludos supercrtico . . . . . . .
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5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
7 ELECTROFORESIS
7.1 Introduccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2 Electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.1 Tipos de electroforesis . . . . . . . . . . . .
7.2.2 Electroforesis convencional . . . . . . . . . .
7.2.3 Electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . .
7.2.4 Cambio de sentido del flujo electroosmotico
7.3 Instrumentacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3.1 Introduccion de la muestra . . . . . . . . . .
7.4 Sistema de deteccion . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.1 Metodos de absorbancia . . . . . . . . . . .
7.5 Modalidades de la electroforesis capilar . . . . . . .
7.5.1 Electroforesis capilar por zona (CZE) . . . .
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v
7.5.2
7.5.3
Electroforesis capilar en gel (CGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

Isotacoforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Bibliografa
76
Lista de tablas
vi
Lista de figuras
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
Cromatografa en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Asimetra de un pico cromatografico . . . . . . . . . . . . . .
Curva Gaussiana ideal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Resolucion de un cromatograma . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ensanchamiento de banda debido a la difusion . . . . . . . . .
Aplicacion de la ecuacion de Van Deemter en cromatografa de
Isotermas comunes y formas de las bandas . . . . . . . . . . .
Silanizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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gas
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3
9
13
13
14
16
17
17
2.1 Placa cromatografica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.2 Siembra de la muestra en una placa cromatografica . . . . . . . . . . . . . 23
2.3 Placa cromatografica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.1 Diagrama esquematico de un cromatografo de gas . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2 Inyeccion split/splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.3 Detector de ionizacion por llama . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
Ionizacion por impacto electronico . .

Partes de un espectrometro de masas
Esquema interno de un espectrometro
Detector channeltron . . . . . . . . .
Copa de faraday . . . . . . . . . . . .
5.1
5.2
5.3
5.4
Cromatografa
Cromatografa
Cromatografa
Cromatografa
. . . . . .
. . . . . .
de masas
. . . . . .
. . . . . .
fase inversa.(Fase movil de

fase normal.(Fase movil de
en fase normal.(Fase movil
en fase inversa.(Fase movil
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42
44
45
46
46
baja polaridad) . .
polaridad media) . .
de polaridad media)
de alta polaridad ) .
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54
55
55
55
7.1 Flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

7.2 Perfil del flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
7.3 Direccion del flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
vii
viii
7.4 Componentes basicos de un sistema de electroforesis capilar .
7.5 Metodos de introduccion de muestra . . . . . . . . . . . . . .
7.6 Dise
nos de celda para mejorar la sensibilidad de deteccion por
absorbancia aumentando el camino optico . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 72
. . . . . . . 73
medida de
. . . . . . . 75
Captulo 1
CROMATOGRAFIA
Ciencia y arte de separar los componentes de una mezcla. Estos componentes son transportados a traves de una fase estacionaria, por el flujo de una fase movil, donde la fase
movil puede ser un lquido o un gas.
Aunque esta es una definicion facilmente entendible en principio, puede presentar algunas
limitaciones, estas limitaciones se deben basicamente al desarrollo de la cromatografa de
fludos supercrticos en la decada de los sesenta, donde la fase movil no es ni un gas ni un
lquido sino un fludo surpercrtico. Por ello es mas conveniente relacionar la cromatografa
como un metodo separativo y aceptar mas bien la definicion dada por Guiddings que la
define como un metodo de migracion en zonas; esto con el fin de aceptar los cambios que
se puedan dar con el avance de las ciencias.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migracion entre los distintos componentes de la mezcla. La cromatografa, fue originalmente descrita por Tswett en
el 1906. Tswett ideo un metodo para separar pigmentos de plantas utilizando un tubo de
vidrio lleno con CaCO3 ,agrego un extracto de planta a la colmna no sin antes lavarla con
un solvente organico y observo que se separaban diferentes bandas coloreadas en el interior
de la columna.A la separacion de bandas coloreadas le dio el nombre de cromatografa,
de la palabra griega Chromatos que significa color.
En la figura 2.1 se muestra una solucion que contiene una mezcla la cual se coloca
sobre una columna empacada con partculas solidas y llenado con solvente. Vemos como
los solutos que conforman la mezcla fluyen hacia abajo de la columna a medida que se
le agrega solvente fresco.De los distintos solutos que conforman la mezcla el primero que
eluye es el menos adsorbido por la fase estacionaria y el que eluye de ultimo es el mas
adsorbido por esta, completandose as la separacion.
En general podemos decir que en la cromatografa no se incluyen separaciones que emplean campos electricos para impulsar las moleculas con cargas, de modo que se separen.
1
E.Lans
Este tipo de metodos se clasifican como electroseparaciones.
1.1
Clasificaci
on de los m
etodos cromatogr
aficos
Los metodos cromatograficos son de dos tipos
1.1.1
Cromatografa en columna
La fase estacionaria esta contenida en un tubo estrecho y se fuerza el paso de la fase movil
a traves del tubo ya sea a presion o gravedad
1.1.2
Cromatografa plana
La fase estacionaria esta sostenida sobre una placa plana, o en los poros de un papel. Aqu
la fase movil se desplaza a traves de la fase estacionaria por capilaridad, o por efectos de
la gravedad.
1.2
Clasificaci
on de los m
etodos cromatogr
aficos en
columna
Los metodos cromatograficos se clasifican seg

un la fase movil, si esta es un gas se denomina
cromatografa de gas, si es un lquido toma el nombre de cromatografa lquida y si es un
fludo supercrtico se le da el nombre de cromatografa de fludos supercrticos.
1.2.1
Cromatografa de Gases
Gas-Lquido:La fase estacionaria es un lquido y la fase movil es un gas.

Gas-S
olido: Donde la fase estacionaria es un solido y la fase movil es un gas.
1.2.2
Cromatografa lquida
Lquido-Lquido o de reparto:La fase estacionaria es un lquido.

Lquido - S
olido:La fase estacionaria es un solido.
Intercambio i
onico:La fase estacionaria es una resina de intercambio ionico.
Exclusi
on por tama
no:La fase estacionaria es un lquido en los intersticios de un solido
polimerico.
Afinidad:La fase estacionaria es un lquido con grupos especficos unidos a una superficie
Conceptos generales
Figura 1.1: Cromatografa en columna
solida.
1.2.3
Cromatografa de fludos supercrticos
Fase movil es un fludo supercrtico.

Como se puede notar las diferentes clases de cromatografa se clasifican de acuerdo a la
fase movil, como se dijo anteriormente.
1.3
Algunos t
erminos y ecuaciones utilizados en cromatografa
Para tener un entendimiento mas preciso, sobre los procesos cromatograficos, se hace
necesario que el lector tenga claro algunos conceptos utilizados en cromatografa. Resoluci
on de una columna:Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar los
analitos pesentes en una mezcla.
Retenci
on relativa o factor de selectividad: Es la retencion de un compuesto con
respecto a otro, tambien la podemos denominar como velocidad de migracion diferencial.
t,r2
= ,
tr1
(1.1)
E.Lans
Entre mas grande el tiempo de retencion relativa, mas grande es la separacion entre
componentes.La retencion relativa es independiente de la velocidad de flujo por que puede
ser usado para identificar picos cuando la velocidad de flujo cambia.
KB
(1.2)
KA
La especie B es mas fuertemente retenida que la especie A, por tanto, siempre va a ser
mayor que la unidad.
(tr )B tm
=
(1.3)
(tr )A tm
=
K B KB
= =
KA KA
(1.4)
Altura de plato H : Es una medida de la eficiencia de una columna.

Fase estacionaria:Material solido en cuya superficie se enlazan las moleculas.
Eluyente:Disolvente que se usa para transportar los componentes de una mezcla a traves
de una fase estacionaria.
Eluato:Fase movil que sale de la columna.
Cromatograma:Es una grafica de alguna se
nal de la concentracion de un soluto en
funcion del tiempo de elucion o el volumen de elucion.
Factor de capacidad(K ):Es un parametro importante que con frecuencia se utiliza

para describir las velocidades de migracion de los analitos en las columnas.Para una especie
A:
KA V S
(1.5)
K =
VM
KA = constante de distribucion de la especie A
VS = volumen de la fase estacionaria(analito)
VM = volumen del analito en la fase movil
De un cromatograma se puede calcular K de la siguiente ecuacion, teniendo en cuenta

las ecuaciones 1.6 a 1.12 as:
L
L
1
=
tr tm 1 + KA
Reordenando tenemos:
KA =
tr tm
tm
(1.6)
Con esta ecuacion se puede calcular KA para un compuesto A desde un cromatograma.

Tiempo de retenci
on:Tiempo que transcurre despues de la inyeccion de la muestra para
Conceptos generales
que el pico del analito alcance el detector, el tiempo de retencion para una especie Bviene
dada por la siguiente ecuacion:
16Rs2 H 2 (1 + KB )3
(tr )B =
(
)
1
(KB )2
(1.7)
Tiempo muerto: Tiempo para que la especie no retenida alcance al detector; es decir la
velocidad de migracion de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del
movimiento de las moleculas de la fase movil.
Tiempo de retenci
on ajustado (tr ): Es la diferencia entre el tiempo de retencion del
analito y el tiempo muerto.
tr = tr tm
tr =
1.4
(tr )B tm
(tr )A tm
(1.8)
(1.9)
Velocidades de separaci
on
La efectividad de una columna cromatografica para separar dos analitos depende en parte
de las velocidades relativas con la que eluyen las dos especies. Estas velocidades estan
determinadas por la magnitud de las constantes de los equilibrios de distribucion de las
especies entre las fases estacionaria y movil.
K=
Cs
Cm
(1.10)
K = Constante de distribucion, razon de distribucion o coeficiente de distribucion. Cs =

Concentracion molar del analito en la fase estacionaria.
Cm = Concentracion molar del analito en la fase movil.
Idealmente K debe ser constante en un amplio intervalo de concentraciones,o sea que
Cs Cm
L
(1.11)
V =
tr
donde V = velocidad lineal media de migracion del analito
L = Longitud de la columna
L
=
(1.12)
tm
E.Lans
= velocidad lineal media del movimiento de las moleculas de la fase movil

Entre mas rapido es la velocidad lineal media de migracion del analito ( flujo lineal),
menos tiempo gasta en la columna y menos ensanchamiento de banda ocure debido a
lo difusion longitudinal.Las velocidades lineales de flujo en cromatografa de lquidos son
significativamente menores que las que se utilizan en cromatografa de gas.
Cuando el factor de capacidad K de una especie dada es menor que la unidad, es

por que la elucion es tan rapida que es difcil determinar con exactitud los tiempos de
retencion. Cuando el K es del orden de 20 a 30 o mayores,es porque los tiempos de retencion son demasiado largos; idealmente las separaciones se realizan en unas condiciones
en las que los factores de capacidad oscilan entre 1-5. El factor de capacidad K , para
cada uno de los picos en un cromatograma esta definido como:
K =
tr tm
tm
(1.13)
Para verificar la eficiencia de una columna es bueno monitorear perodicamente mediendo

el factor de capacidad de un estandar, el n
umero de platos y la asimetra de los picos.
Cambios de estos factores reflejan degradacion de la columna.
V =
1.5
moles de analito en la fase movil

moles totales de analito
1
V =
VS
1 + KA
VM
(1.14)
(1.15)
Tiempo de retenci
on Vs coeficiente de partici
on
La definicion del factor de capacidad es equivalente a decir:

K, =
tsgf e
tsgf m
(1.16)
Donde tsgfe, tsgfm = tiempo del soluto gastado en la fase estacionaria y tiempo soluto
gastado en fase movil respectivamente.
Si tenemos en cuenta la ecuacion(1.13), podemos afirmar que:
Si el soluto gasta todo el tiempo en la fase movil, entonces el factor de capacidad K , = 0
por que el tiempo de retencion sera igual a tm .
Si el soluto gasta igual tiempo en la fase movil y la fase estacionaria, entonces el tr = 2tm ,
Conceptos generales
por lo queK , = 1
Si el soluto gasta tres veces igual tres veces mas tiempo en la fase estacionaria que en la
fase movil, entonces el tr = 4tm , as,K , = 3
De lo anterior podemos deducir que habra tres veces mas moles de soluto en la fase estacionaria.
Cs Vs
Cm Vm
K, =
(1.17)
Donde Cs es la concentracion de soluto en la fase estacionaria, Vs volumen de la fase

estacionaria, Cm , concentracion de soluto en la fase movil y Vm volumen en la fase movil.
Cs Vs
Cs
como K , =
yK=
entonces,
Cm Vm
Cm
Vs
Vm
(1.18)
Vs
t,r
=
V m tm
(1.19)
K, = K
t,r
tr tm
=
como K =
tm
tm
,
K, = K
K, =
1.6
t,r
tm
(1.20)
Relaci
on entre el tiempo de retenci
on y la constantes de distribuci
on
V = fraccion de tiempo que el analito reside en la fase movil

V =
Cm Vm
=
Cm Vm + Cs Vs
V =
1
KVs
1+
Vm
1
Cs Vs
1+
Cm Vm
(1.21)
(1.22)
E.Lans
Como KA =
KA V s
entonces:
Vm
V =
1.7
1 + KA
(1.23)
Asimetra
La asimetra de un pico puede tener distintas causas: Aplicacion de un exceso de analito,

error en la tecnica de inyeccion o columna degradada.
Picos no simetricos generalmente indican que interacciones no deseadas han ocurrido durante el proceso cromatografico.
Picos anchos son comunes en columnas empacadas,indicando que la cinetica de la transferencia de masas es demasiado lenta.
En algunas aplicaciones con columnas empacadas poco se puede hacer al respecto, sin
embargo, el objetivo del cromatografista es lograr unos picos estrechos tanto como sea
posible, para lograr mejores separaciones.
La simetra de los picos se puede clasificar como Tailing o Fronting dependiendo de la
localizacion de la asimetra. El alcance de la asimetra es definido como Tailing Factor
(TF).
b
TF =
(1.24)
a
Tanto a como b son medidos sobre el 10% de la altura del pico. Figura 1.2 en la pagina
9. De acuerdo a la ecuacion (1.3) un pico con tailing tendra un TF mayor que la unidad,
y un pico con fronting su TF es menor que la unidad. Todos los picos que necesiten ser
medidos deben ser simetricos con un TF en el rango de 0,9 a 1,5.
1.8
Tipos de fuerzas que est

an presentes en un sistema cromatogr
afico
En un sistema cromatografico existen varios tipos de interacciones a saber:

1. Interacciones ionicas
2. Fuerzas de enlace de hidrogeno
3. Fuerzas de repulsion
4. Fuerzas de Van Der Walls
Conceptos generales
Figura 1.2: Asimetra de un pico cromatografico
1.8.1
Interacciones i
onicas
Ocurren entre el soluto y una fase o ambas, cuando tienen cargas permanentes. Este tipo
de interacciones me da la cromatografa ionica, que resulta de la interaccion entre los iones
de soluto y los iones de la fase estacionaria.
1.8.2
Fuerzas de enalce de hidr

ogeno
Ocurren entre molelculas que tienen el hidrogeno unido a un peque

no atomo bastante
electronegativo como los alcoholes, aminas y agua los cuales pueden ser donores o aceptores de protones. Los esteres, aldehdos, cetonas y eteres solo pueden ser aceptores de
protones y forman enlace de hidrogeno con compuestos donores de protones
1.8.3
Fuerzas de repulsi
on
Las fuerzas de repulsion se dan entre cargas iguales, la energa de orientacion aumenta
con forme aumenta el momento dipolar.
1.8.4
Fuerzas de Van Der Walls
Las fuerza de Van Der Walls son de tres tipos:

1. Orientacion (dipolo-dipolo) o de Keesom. Se dan entre moleculas con dipolo permanente.
2. Induccion (dipolo inducido-dipolo) o Debye
10
E.Lans
3. Dispersion (dipolo inducido-dipolo inducido)o London
Las fuerzas de London son debiles y se dan entre moleculas simetricas ej: SO3 ,SO2 ,O2 ,N2 ,Br2
etc. ocurren entre una fase y el soluto donde ambas son neutros o polarizables.
1.9
Bases fsicas de la cromatografa
Entre mas grande la razon de los coeficientes de particion mas grande es la separacion
entre los componentes de una mezcla.
Las ecuaciones(1.18) y (1.2) relacionan el tiempo de retencion, coeficiente de particion y
el volumen de las fases estacionaria y movil.
Debido a que t,r K , K la retencion relativa() puede ser expresada como:
,
t,r2 Kr2
K2
= , = , =
tr1 Kr1 K1
1.9.1
Eficiencia
Existen dos factores que contribuyen a la eficiencia de una separacion:

1-La diferencia del tiempo de elucion entre picos, entre mas grande es esta diferencia
mejor la separacion.
2-El ancho de los picos. Entre mas ancho sean los picos mas pobre es la separacion.
La eficiencia de una columna se mide por la altura de plato H. El nombre proviene de
la teora de la destilacion, en la cual la separacion puede ser llevada a cabo en escalones
discretos llamados Altura equivalente o un plato teorico.
El ensanchamiento de banda (ancho de los picos)tambien se produce como consecuencia
de la velocidad finita con la que ocurren los distintos procesos de transferencia de masa
durante la migracion de una especie a lo largode la columna.
La desviacion estandar de una banda = 2Dt.
Donde D = coeficiente de difusion
t = tiempo
m
Si un soluto viaja a una distancia x a una velocidad de flujo lineal
= x el tiempo que
s
x
gasta este al viajar por una columna sera: t = , por lo tanto:
x
x
2D
2D
2 = 2D =
x, si
= H 2 = Hx
x
x
x
2
H=
x
(1.25)
Conceptos generales
11
Donde H es la altura de plato,

es la desviacion estandar de la curva gausiana
y x es la distancia que viaja a traves de la columna.
De las ecuaciones anteriores podemos concluir que la altura de plato es la constante
de proporcionalidad entre la varianza 2 de la banda y la distancia (x)que ha viajado.
Fsicamente NO EXISTEN estos platos en cromatografa, de tal manera que uno debe
considerar la altura de plato como un termino que relaciona el acho de una banda con la
distancia recorrida en una columna. La altura de plato H es proporcional a la varianza
de una banda cromatografica.Cuanto mas peque
no es la altura de plato mas estrecho es
el ancho de una banda.
La capacidad que tiene una columna para separar una mezcla de componentes es mejorada por la disminucion en la altura de plato.
Diferentes solutos que pasan a traves de una misma columna, tienen diferentes alturas
de plato, por que ellos tienen diferentes coeficientes de difusion.
Las alturas de platos en cromatografa de gas son aproximadamente de 0,1 a 1mm, en
HPLC 10m y < 1m en electroforesis capilar.
1.9.2
Numero de plato te
orico
El n
umero de plato teorico de una columna con longitud L es:
L
LX
L
LX L2
N=
= 2 = 2 , si hacemosx = L 2 = 2
H
x
L2
W
L2
=
16
De la figura 1.3 pagina 13 =
as que N =
4
W2
W2
16
Si expresamos L y W en unidades de tiempo, en vez de longitud,Nsera adimensional;
as obtenemos la expresion mas u
til para N
16t2r
N=
W2
(1.26)
12
E.Lans
Si usamos la achura de la altura media en vez de la base, entonces:

N = 5.5
t2r
2
w1/2
(1.27)
La ecuacion anterior se deduce teniendo en cuenta la figura 1.3 y usando la anchura de la

altura media, en vez de la anchura de la base.
1.9.3
Resoluci
on
La resolucion de una columna es el grado de separacion que realiza una esta de los componentes de una mezcla.Figura 1.4
El movimiento del soluto a traves de la columna cromatografica, se propaga en forma
gausiana con una desviacion estandar de .
Entre mas tiempo gasta un soluto pasando a traves de la columna, mas ancha es la banda.
Medidas comunes al ensanchamiento de la banda son la anchura media del pico W1/2 , medida a la mitad de la altura del pico y la anchura de la lnea base W. Figura 1.3
tr
Vr
La resolucion esta dada por, Rs =
=
Wav
Wav
tr y Vr son las diferencias de tiempo de retencion y volumen respectivamente entre
picos y Wav es el promedio de la anchura base de ambos picos en sus unidades correspondientes.
Para analisis cuantitativo una resolucion >de 1.5 es altamente deseada.
Factores que afectan la resoluci

on
La resolucion de una columna se ve afectada por el n
umero de plato teorico N, la retencion
,
relativa y el factor de capacidad K como se observa en la siguiente ecuacion:
N 1
K2,
Rs =
(
)(
(1.28)
, )
4
1 + Kav
Donde N es el n
umero de platos teoricos en la columna, es la retencion relativa de
,
los dos picos K2, es el factor de capacidad para el componente mas retenido y Kav
es el
promedio de los factores de capacidadpara ambos picos. De la ecuacion anterior se deduce
que la resolucion es proporcional a N,de tal modo que si doblamos la longitud de la
columna, se incrementa la resolucion en 2. Igualmente podemos decir que la resolucion
Conceptos generales
13
Figura 1.3: Curva gausiana ideal muestra como w y w1/2 son medidos. El valor de w es obtenido
extrapolando las tangentes en el punto de inflecci
on de la linea base
Figura 1.4: Resolucion de un cromatograma
14
E.Lans
se incrementa cuando aumenta y el factor de capacidad K2, .

La manera de cambiar la retencion relativa es cambiando en cromatografa de gas la fase
estacionaria y en HPLC cambiando la fase estacionaria o fase movil.
1.9.4
Difusi
on
Una causa del ensanchamiento de la banda es la difusion. Una banda del soluto se ensancha a medida que se va moviendo a traves de la columna.Figura1.5
El coeficiente de difusion mide la velocidad a la cual una substancia se mueve aleatoriamente de una region de alta concentracion a otra region de baja concentracion.
El n
umero de moles que cruzan en un metro cuadrado por segundo, se llama flujo y es
proporcional al gradiente de concentracion.
F =
mol
J
m2 S
J = D
dc
dx
(1.29)
(1.30)
De donde D es el coeficiente de difusion, y el signo negativo se debe a que el flujo neto va

dc
de una region de alta concentracion a otra de baja concentracion
son la variacion de
dx
la concentracion molar con respecto a la distancia recorrida
1.9.5
Ecuaci
on de Van Deemter
La ecuacion de Van Deemter nos dice como la columna y la velocidad de flujo afecta
la altura de plato.La eficacia de las columnas cromatograficas pueden evaluarse por la
Figura 1.5: Ensanchamiento de banda debido a la difusi

on
Conceptos generales
15
ecuacion 1.31
H A+
B
+ Cux
x
(1.31)
H= altura de plato en cm A= termino de los m

ultiples pasos, factor de tortuicidad, o
difusion de Eddy. Cux = termino de transferencia de masas, es decir tiempo finito requerido para que el soluto alcance el equilibrio entre la fase movil y la fase estacionaria.
cm
x = velocidad lineal de la fase movil
.
s
B = difusion longitudinal.
La altura de plato debido al termino de transferencia de masa es:
K d2 x
Cux
H=
(K + 1)2 D
(1.32)
K = factor de capacidad d = espesor de la fase estacionaria D = coeficiente de difusion

del soluto en la fase estacionaria
La altura de plato es reducida con el termino de transferencia de masa disminuyendo el
espesor de la fase estacionaria y aumentando la temperatura ya que as se aumenta el coeficiente de difusion del soluto en la fase estacionaria. Las alturas de plato en cromatografa
lquida son un orden de magnitud menores que las correspondientes en cromatografa de
gas; sin embargo en cromatografa lquida el largo de las columnas no son mayores de 25
a 50 cm, ya que no se pueden mantener la alta presion a longitudes mas grandes; cosa
que no ocurre en cromatografa de gas. As vemos que esta contraresta a la H peque
na
en cromatografa lquida dado que en cromatogrfa de gas las columnas pueden alcanzar
hasta 50 m de longitud, la altura de plato(H) y por ende la eficacia de la columna son
mayores con frecuencia en cromatografa de gas.
La expresion 1.31 es llamada ecuacion de Van Deemter la cual se usa para tratar de
explicar las complejas interacciones fsicas y los efectos que conducen al ensanchamiento
de banda.
Si cambiamos la columna y la fase estacionaria cambian tambien los valores de A, B
y C. Seg
un la ecuacion de Van Deemter hay mecanismos de ensanchamiento de la banda
que son proporcional, e inversamente proporcional e independiente a la velocidad de flujo.
Figura 1.6
En las columnas empacadas todos los tres terminos contribuyen al ensanchamiento de
banda. Para las columnas open tubular el termino A es 0, de modo que el ancho de banda
disminuye, aumentanto por tanto la resolucion.
Cuando la altura de plato es mas peque
na, mas estrecha es la banda; as que la ecuacion
de Van Deemter nos dice como afecta la velocidad de flujo y la columna la altura de plato.
16
E.Lans
Figura 1.6: Aplicacion de la ecuaci

on de Van Deemter en cromatografa de gas
(Harris 1999)
En electroforesis capilar tanto el termino A como el C son 0 disminuyendo la altura
de plato a valores considerablemente bajos hasta niveles de micrometros produciendo un
poder extraordinario de separacion.
Una grafica de Cs versus Cm (a una temperatura dada) es llamada isoterma. Figura
1.7. En cromatografa se pueden presentar a menudo cromatogramas con picos no muy
bien definidos, presentandose picos con cola, como se puede ver en la parte inferior de
la figura1.7 En la figura 1.7 la isoterma de la izquierda ocurre cuando ha sido agregado
demasiado soluto a la columna, sobrecargandola. Cuando la concentracion del soluto se
incrementa es porque el soluto es mas soluble en la fase estacionaria ; hay tanto soluto en
la fase estacionaria que esta tiende a parecerse al soluto.(semejante disuelve semejante).
Una cola surge cuando algunos sitios retienen soluto mas fuertemente que otros.
La isoterma de abajo de la figura 1.7 ocurre cuando peque
nas cantidades de soluto son
retenidas mas fuertemente que cantidades grandes.
Como se dijo anteriormente, sitios que retienen solutos fuertemente causan cola ; as
los grupos hidroxilos que forman enlaces de hidrogenos con solutos polares producen colas
muy marcadas. La silanizacion reducen las colas porque bloquean a los grupos hidroxilos
con otros grupos no polares, como el trimetilsilil. Figura 1.8
Conceptos generales
17
Figura 1.7: Isotermas comunes y formas de las bandas
(Harris 1999)
Figura 1.8: Silanizaci

on
18
E.Lans
Las columnas de vidrio o de slice usadas en cromatografa de gas o lquida tambien

se pueden silanizar para minimizar la interaccion del soluto con los puntos activos de la
columna.
1.10
Ejercicios
1. Considere un experimento cromatografico en la cual dos componentes con factores

de capacidad de 4,0 y 5,0 respectivamente, son inyectados en una columna con 1x103
platos teoricos. El tiempo de retencion para el compuesto menos retenido es tr1 =
10,0 min.
a)Calcular el tm y tr2
b) Encontrar W1/2 y W
c)Calcular la resolucion de los dos picos.
Rta.
a)tm = 2 min.; tr2 = 12 min.
b)w2 = 1, 52 min. ;W1 = 1, 26;w1/2 pico 1 = 0, 74;w1/2 pico 2 = 0,89
c) Resolucion = 1,44
2. La retencion relativa de dos compuestos en cromatografa de gas es 1,068 en una
columna con una altura de pico de 0,520 mm. El factor de capacidad para el compuesto 1 es 5,16.
a)Cual sera la longitud de la columna requerida para separar los compuestos con
una resolucion de 1?
b) El tiempo de retencion para el aire en la columna(a) es de 2.0 min.. Si el n
umero
de platos es el mismo para ambos compuestos. Encontrar los tiempos de retencion
y la anchura de cada uno de los picos.
c) Si la razon fase estacionaria fase movil es 0,30, encontrar el coeficiente de particion para el componente 1.
Rta.
a) L = 2,71 m
b) tr1 = 12, 32 min. ; tr2 = 13, 02 min. ; W1 = 0, 68 min. ; W2 = 0, 72 min.
c) K = 17
3. Las areas obtenidos de picos por cromatografa de gases para una mezcla de acetato de metilo, propionato de metilo y n-butirato de metilo fueron 17,6 ; 44,7 y
Conceptos generales
19
31,1 respectivamente. Calcular el porcentaje de cada compuesto si las respectivas

respuestas de deteccion relativa fueron 0,65; 0,83; y 0,92.
Captulo 2
CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA
La cromatografa en capa fina se basa en la preparacion de una capa uniforme, de un
adsorbente, mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales
para la cromatografa en capa fina son, pues : un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extension, otro para aplicar la placa de adsorbente
y una placa en la que se desarrollan las placas cubiertas.La fase movil es lquida y la fase
estacionaria un solido.
La fase estacionaria sera un componente polar y el eluyente sera por lo general menos
polar que la fase estacionaria, de modo que los solventes que se desplacen con mayor
velocidad seran menos polares. Figura2.1
2.1
Ventajas de la cromatografa en capa fina
1. La instrumentacion utilizada es mas simple.

2. El tiempo para conseguir las separaciones es mucho menor.
3. El metodo es simple y los resultados son reproducibles, lo que la hace un metodo
adecuado para fines analticos.
2.2
Adsorbentes
Al elegir un adsorbente se debe tener en cuenta el tama

no de las partculas. Cuanto mas
finamente dividido este, mayor sera su adhesion al soporte.
20
21
Cromatografa en capa fina
Figura 2.1: Placa cromatografica
2.2.1
Proceso de adsorci
on
La muestra aplicada en la capa, es adsorbida en la superficie del material por la accion

de fuerzas electrostaticas (fuerzas de van der waals). Luego cuando la placa es expuesta
a un flujo por accion capilar, se inicia una competencia de enlaces entre sitios activos del
adsorbente y la sustancia con el solvente.
2.2.2
Adsorbentes utilizados
Los adsorbentes mas utilizados son la celulosa, el almidon, los azucares, slica gel entre
otros, oxido de aluminio (al
umina) entre otros.
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y
animales.
2.3
Preparaci
on de placas
Para la preparacion de las placas se sigue el siguiente procedimiento:

Mezclar en un erlenmeyer el agua y el adsorbente
Agitar fuertemente
Extender la muestra sobre el soporte de vidrio
Hacer oscilar la mezcla de un lado para otro
22
E.Lans
El espesor de la placa suele ser de 0.1 a 0,2 mm para separaciones analticas. La placa
debe quedar libre de grumos y rugosidades que afectaran el desarrollo del proceso cromatografico. Las placas se dejan en reposo un corto tiempo despues de cubrirlas; luego
se colocan en bandejas metalicas.En este momento se puede activar el adsorbente, bien
dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, o calentandola durante
30-60 minutos a 105-110 grados Celsius, para as expulsar el aire.
2.4
Aplicaci
on de las muestras
Los productos a examinar se disolveran, cuando sea posible en un disolvente organico no

polar que tenga un punto de ebullicion lo suficientemente bajo para que se evapore despues
de su aplicacion. Para sembrar la muestra se utilizan micropipetas o un tubo capilar. El
proceso de siembra se hace tocando con la punta del capilar la placa preparada dejando
una distancia al borde inferior de un centmetro aproximadamente. El punto de aplicacion
de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la
placa solo quedara la muestra a analizar.
2.5
Elecci
on del eluyente
La eleccion del eluyente dependera logicamente del componente que se va a separar y del
material en que la separacion se llevara a cabo.
Entre los principales eluyentes en orden creciente de polaridad tenemos:enemos:Eter de
petroleo,eter dietilico,ciclohexano,acetato de etilo,tetracloruro de carbono,piridina, benceno, etanol,cloroformo,metanol,diclorometano,agua y Acido acetico.
Entre los factores para la eleccion del eluyente se encuentran: Precio,pureza, no utilizar
mezclas de eluyente,no utilizar compuestos muy volatiles, evitar que contengan trazas de
metales (catalizadores)
La eleccion del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez mas polares hasta dar con el mas apropiado.
Otra tecnica para realizar consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra.
Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de tal forma que se
aprecie el eluyente con el cual la separacion se realiza de una manera eficaz.Figura 2.2
23
Figura 2.2: Siembra de la muestra en una placa cromatografica
2.6
Desarrollo de la cromatografa
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el metodo

ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi vertical, por
la accion de la capilaridad.
Generalmente el eluyente se introduce en una camara una hora antes del desarrollo
para permitir la saturacion de la atmosfera. El tiempo de desarrollo, por lo general no
llega a los 30 minutos.Figura 2.3 Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto
se hace para estandarizar los valores de Rf.Frecuentemente esta distancia es de 10 cms.
La mejor posicion de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen
y el frente del eluyente ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor
o menor velocidad.
2.7
Evaluaci
on de un cromatograma de capa fina
Para llevar a cabo una evaluacion de un cromatograma en capa fina se puede realizar por
analisis cualitativo y analisis cuantitativo.
24
E.Lans
Figura 2.3: Placa cromatografica
2.7.1
An
alisis cualitativo
Medida de Rf
Comparacion visual de color/intensidad.
2.7.2
An
alisis cuantitativo
Comparacion visual del diametro y la intensidad del color de la mancha contra una serie
de manchas patrones de concentracion conocida.
2.8
Localizaci
on de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicion de dichos

compuestos. Para ello existen dos metodos:Metodos qumicos y Metodos fsicos.
2.8.1
M
etodos qumicos
Consisten en realizar una reaccion qumica entre un reactivo revelador y los componentes
separados. Para ello se atomiza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de
atomizador. Si el reactivo atomizador es muy corrosivo o peligroso, la atomizacion debera
hacerse en una vitrina de gases.Como reactivo revelador generalmente se utiliza yodo,
el cual forma complejos coloreados con los componentes organicos (con tonos amarillomarron) pero las manchas desaparecen con el tiempo por lo que es conveniente se
nalar
las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el acido sulf
urico, que reacciona con los
componentes organicos produciendo manchas negras. El tama
no de las manchas no esta
relacionado con la cantidad de componente separado.
25
2.8.2
M
etodos fsicos
El mas com
un consiste en a
nadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal manera
que al colocar la placa bajo una lampara ultravioleta, y dependiendo del indicador y la
longitud de onda aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes.
Los compuestos que poseen fluorescencia se pueden detectar directamente bajo la luz
ultravioleta.
2.9
Constante Rf
La constante Rf (ratio of front) es simplemente una manera de expresar la posicion de un

compuesto sobre una placa como una fraccion decimal, mide la retencion de un componente. Se define como:
Rf= distancia recorrida desde el origen por el compuesto/distancia recorrida desde el
origen por el compuesto de referencia
Rf =
X
f
(2.1)
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la

mancha. Para que los Rf sean reproducibles se deben fijar una serie de condiciones tales
como espesor de la pelcula, fase estacionaria, fase movil y cantidad de muestra.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa
y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los Rf, y si son
distintos puede decirse con toda seguridad que no se trata del mismo compuesto.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa
con el mismo eluyente, u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separacion mnima.
Captulo 3
CROMATOGRAFIA DE GAS
En cromatografa de gas el analito es transportado a traves de la columna por una fase
movil gaseosa llamda Carrier gas
3.1
Cromatograf gas lquido
Llamada tambien de particion, la fase estacionaria es un lquido no volatil que cubre la

parte interna de la columna, o esta sobre un soporte solido.
3.2
Fase m
ovil
En cromatografa de gas la fase m

ovil es un gas generalmente He, N2 , o H2 y la fase
estacionaria es generalmente un liquido no volatil y algunas veces un solido. El analito
debe estar en forma gaseosa o como un lquido volatil
La columna debe estar lo suficientemente caliente para proveer presion de vapor del
analito y pueda ser eluato en un tiempo razonable. El detector es mantenido a una
temperatura mas alta que la columna as que todos los analitos seran gaseosos.
Existen dos clases de columnas en cromatogrfa de gas, las tubulares abiertas llamadas tambien open tubular column y las empacadas.
3.3
Columnas tubulares abiertas
La mayora de los analisis usan open tubular column, largas y estrechas hechas de slica
fundida (SiO2 ) y revestida con poliamida (un plastico capaz de resistir hasta 350 o C) para
26
Cromatografa de gas
27
Figura 3.1: Diagrama esquem

atico de un cromat
ografo de gas
soporte y proteccion de la humedad atmosferica. El diametro interno de las columnas esta

entre 0.100.53 mm y la longitud de 15100 m.
3.3.1
WCOT :wall coated tubular column
Caractersticas:El espesor de la pelcula de la fase estacionaria en el interior de la

columna esta entre 0.15m. Disminuyendo el espesor de la pelcula de la fase estacionaria aumenta la resolucion, disminuye el tiempo de retencion y disminuye la cantidad
de muestra. La fase estacionaria esta adherida a las paredes internas de la columna.
3.3.2
SCOT: support coated open tubular column.
Caractersticas:Partculas solidas con la fase estacionaria liquida estan adheridas a las

paredes internas de la columna.
3.3.3
PLOT: porous layer open tubular column
Caractersticas:La fase estacionaria solida esta unida a las paredes internas de la columna.
Para aumentar el area de contacto se tratan las paredes de la columna con HF, luego se
deposita alla la fase estacionaria. La eficiencia de las SCOT es intermedia entre las WCOT
y las columnas empacadas.
3.4
Ventajas de las open tubular column
comparadas con las columnas empacadas las open tubular ofrecen:alta resolucion,tiempo
de analisis mas cortos,gran sensibilidad y mas baja capacidad de muestra.
Las narrow open tubular column ofrecen mas alta resolucion que las wider open tubular
pero requieren mas alta presion para operar y tienen menos capacidad de muestra.
28
3.5
E.Lans
Clases de fase estacionaria
(Diphenyl)x(dimethyl)1-x polysiloxane.
(Cyanopropylphenyl)0.14(dimethyl)0.86 polysiloxane:Polaridad intermedia.
Carbowax (poly(ethyleneglycol)) :Fuertemente polar.
(biscyanopropyl)0.9((cyanopropylphenyl)0.1 polysiloxane: Fuerte polaridad.
3.6
Escogencia de la fase estacionaria
La escogencia de una fase estacionaria dada para un problema dado se basa en la regla:
semejante disuleve semejante. Columnas no polares son mejores para solutos no polares
las de polaridad intermedia son mejores para solutos de polaridad intermedia.
Advertencia:Las altas temperaturas y la exposicion al oxigeno causan degradacion de
la columna y producen cola en los cromatogramas.
Entre solidos usados para columnas PLOT tenemos al
umina Al2 O3 la cual es una fase
estacionaria que separa hidrocarburos en cromatografa de adsorcion gas solido.
Para evitar da
nos a las columnas por impurezas de los gases, estos pueden ser secados utilizando trampas que contienen Mallas Moleculares ya que el agua es fuertemente
retenida por estas. Las mayas moleculares son material inorganico o polmeros organicos
con grandes cavidades dentro de las cuales peque
nas moleculas entran y son parcialmente
retenidas. Moleculas, tales como H2 , O2 , CO2 , CH4 pueden ser separadas una de otras.
Las mallas inorganicas pueden ser regeneradas calentando a 300o C al vacio o bajo flujo
de N2 .
3.7
Columnas empacadas
Contienen un soporte solido fino con un lquido no volatil como fase estacionaria o solo
el soporte solido puede actuar como fase estacionaria. Las columnas son generalmente
hechas de acero inoxidable, nkel o vidrio. El diametro interno es de 3 - 6 mm y la longitud
es de 5 y 20 cm, el soporte solido a menudo es de diatomea que es silanizado..
En las columnas empacadas el tama
no uniforme de las partculas disminuye el termino m
ultiples caminos (A) en la ecuacion de VAN DEEMTER reduciendo as la altura
de plato y aumentando por ende la resolucion.
El peque
no tama
no de las partculas disminuye el tiempo requerido para que el soluto
alcance el equilibrio mejorando la eficiencia de la columna, sin embargo entre mas peque
no
es el tama
no de las partculas se requiere mas presion para que la fase movil pase a traves
de la columna.
Cromatografa de gas
29
El tama
no de las partculas se expresa en micrometros o tama
nos MESH esto se refiere
al tama
no del tamiz a traves del cual las partculas son pasadas o retenidas. Una partcula
de 100/200 mesh pasa a traves de un tamiz de 100 mesh pero no a traves de uno de 200.
Es decir el mesh da la apertura por pulgada lineal del tamiz.
3.8
Indice de retenci
on
Los ndices de retencion de Kovats (I) para alcanos es igual a 100 veces el n
umero de
atomos de carbono. Para el octano el (I) es de 800 para el nonano es de 900.
3.9
Programaci
on de temperatura y presi
on
En la programacion de la temperatura, la temperatura de la columna es subida durante

la separacion para incrementar la presion de vapor de soluto y disminuir el tiempo de
retencion de los compuestos eludos.
A temperatura constante en una mezcla los compuestos mas volatiles pueden emerger
juntos y los menos volatiles pueden a
un no ser eludos de la columna.
Si la temperatura es incrementada de 50 a 250 o C a una velocidad de 8 o C/min, todos
los compuestos son eludos y la separacion de los picos son uniformes. Hay que evitar
subir la temperatura demasiado para prevenir descomposicion termica del analito o la
fase estacionaria.
La programacion de la presion es u
til a analitos labiles que no puedan tolerar altas
temperaturas.
3.10
Carrier gas
La eficiencia de la columna y el detector depende de la identidad del gas soporte.

El He, N2 yH2 dan alturas de plato optimos a una velocidad de flujo diferente. (ver
curva de van deemter)
Entre mas rapidamente un soluto se difunde entre las fases, mas peque
nos es la transferencia de masa, termino Cu en la ecuacion de van deempter.
Para la eficiencia de la columna y la velocidad de analisis el H2 es un buen gas soporte. El H2 puede reaccionar catalticamente con compuestos insaturados sobre superficies metalicas.
Las impurezas en el carrier gas degradan la fase estacionaria.
30
E.Lans
Se deben usar gases de alta calidad y a a

un as estos deben pasarse a traves de filtros
para remover el oxigeno , agua y trazas de compuestos organicos antes de que estos entren
a la columna.
3.11
Inyecci
on de la muestra
Los lquidos son inyectados con una jeringa a traves de un serpentn de caucho pasando
por el glass liner silanizado. El gas soporte barre la muestra vaporizada desde el puerto
de inyeccion hacia la columna cromatografica. El volumen de inyeccion es tpicamente 0,1
- 2 L de muestra.
La muestra descompuesta y componentes no volatiles lentamente se acumulan en el
glass linner el cual debe ser reemplazado periodicamente.
3.11.1
Inyeci
on split
Medio de introducir peque

nos vol
umenes de muestra en columnas open tubular. Este
modo se utiliza si el analito de interes constituye mas del 0.1% de la muestra . Para
trabajos de alta resolucion, los mejores resultados son obtenidos con este modo de introduccion de la muestra, preferiblemente conteniendo menor o igual a 1.0 ng de cada uno
de los componentes.
Una inyeccion split libera solamente 0,2 -2% de la muestra en la columna.
3.11.2
Inyecci
on splitless
Modo de inyeccion preferido para analisis a nivel de trazas, el analito constituye menos
del 0,01% en la muestra.
La temperatura de inyeccion para el modo splitless es mas bajo que para el modo
split, aprox 220 o C por que la muestra gasta mucho mas tiempo en el puerto de inyeccion
y no queremos que ocurra descomposicion terrmica. El tiempo de residencia en el glass
liner es aprox de 1 min por que el gas soporte fluye a traves del liner a la columna con
una velocidad de flujo aprox 1 mil/min. En este modo el 80% de la muestra entra a la
columna. Es mejor a niveles de trazas para solutos de alta ebullicion en solventes de baja
ebullicion. Figura 3.3
3.11.3
Inyecci
on on column
Se usa para solutos termicamente inestables, y solventes con alto punto de ebullicion. Es
mejor para analisis cuantitativos que la inyecion split/ splitless. La solucion es inyectada
31
Cromatografa de gas
Figura 3.2: Inyeccion split/splitless
directamente en la columna. En este procedimiento la muestra es sometida a la mas baja

temperatura posible para evitar la perdida de soluto.
3.12
Detectores
Un detector no identifica que esta eluyendo de la columna, sino que algo esta emergiendo.
3.12.1
Claseses de detectores
Detector de ionizaci
on por llama (FID)
Es un detector universal ya que responde a todos los compuestos organicos, entre sus caractersticas se encuentran:Sensibilidad, estabilidad,excelente rango lineal,facil operacion,
mantenimiento y amplia aplicabilidad.Todos estos detalles lo hacen el mas popular de los
detectores en cromatografa de gas. (McNair & Miller 1998)
Figura 3.3: Detector de ionizaci

on por llama
32
E.Lans
Principios:Se aplica un voltaje a la boquilla de la llama y al colector. El carrier gas

que sale de la columna es mezclado con hidrogeno y quemado en la punta de la boquilla,
luego se aplica oxigeno como una mezcla de aire en la camara de combustion para asegurar la eficiencia de la ionizacion del efluente de la columna. Esta combustion genera
iones. El movimiento de estos iones desde la llama al colector cargado positivamente produce una peque
na corriente, estando presente siempre una se
nal de fondo. Al introducir
un compuesto organico en la llama produce unos iones que incrementa la corriente de
base. FIGURA Esta se
nal es procesada por el registrador en un correspondiente pico
cromatografico.
Detector captura de electrones (ECD)
Es un detector de ionizacion que es especfico para compuestos que capturan electrones.Es
usado para analisis de compuestos halogenados debido a la sensibilidad extrema para estos
compuestos.
Principios:Una fuente de electrones de una fuente radiactiva Ni63 es usado para bombardear el efluente de la columna pasando a traves del detector. El make up gas es ionizado
por los electrones libres de la fuente, produciendose un plasma que contiene entre otras
especies electrones termicos. Se aplica una diferencia de potencial a la celda del detector,
el cual permite la captura de iones cargados negativamente y de electrones.Esto crea una
corriente que es la base para todas las medidas. Cuando llegan los compuestos afines
a los electrones estos son capturados produciendose una diferencia de corriente que es
registrada y transformada en una se
nal. La cantidad de corriente reducida es una funcion
de la cantidad de compuesto presente y su capacidad de capturar electrones.FIGURA
Detector de conductividad t
ermica (TCD)
Es sensible a todos los compuestos, pero la sensibilidad y la naturaleza casi universal del
FID ha hecho la utilidad del TCD u
til solamente en areas de aplicacion limitada. Principios: Consiste en dos celdas cada una con un filamento calentado cuya resistencia
al flujo de corriente es mantenida electrnicamente. El carrier gas con el compuesto de
interes pasar a traves de una celda, mientras que la otra celda (referencia) recibira solamente el carrier gas que no ha pasado a traves de la columna. Los filamentos se calientan
simultaneamente; cuando pasa la muestra con el carrier gas hay una absorcion de calor
por la muestra, lo que origina una diferencia de temperatura entre los dos filamentos de
los dos compartimientos. FIGURA Un cambio en la temperatura es medido por el correspondiente cambio en la resistencia del filamento. El cambio resultante en la resistencia
del filamento ( temperatura) es comparado con el filamento de la celda de referencia. La
diferencia entre las corrientes de las dos celdas es la se
nal, que es enviada al registrador
para procesarlo en un pico cromatografico.FIGURA
33
Cromatografa de gas
Detector nitrogeno f
osforo (NPD)
Es un detector de ionizacion que es selectivo hacia compuestos que contienen atomos de

nitrogeno o fosforo.
Principios: Funciona casi similar a FID excepto que tiene una sal alcalina sobre la
llama en la camara de combustion. Una bolita de silicato de aluminio (sulfato de rubidio)
es calentada electricamente a 600 - 800o C por aplicacion de una corriente, produciendose
un plasma sostenida por adicion de hidrogeno y aire. Los iones del metal alcalino son
emitidos desde aqu interactuando con el efluente de la columna.Una peque
na corriente
es producida por los movimientos de iones generados desde el plasma al colector cargada
positivamente. La introduccion de nitrogeno o fosforo contenidos en los compuestos causa
un aumento en la corriente por encima de la corriente base. Esta se
nal es procesada por
el registrador en un pico cromatografico.
Detector fotom
etrico de llama
Es un detector optico y especfico para compuestos que contienen fosforo y sulfuros.
Principios: Se combina H2 y aire O2 para producir una llama, el compuesto azufrado
que proviene del efluente de la columna se quema en la llama y emite una longitud de
onda caracterstica del S2 , lo cual es seleccionado por un filtro, luego esta luz emitida es
enviada a un tubo foto multiplicador que la transforma en corriente, la cual es enviada al
registrador para su procesamiento en el correspondiente pico cromatografico.
H O
2
Compuesto azufrado 2
SO + producto
(3.1)
SO + O3 SO2 + O2
(3.2)
SO2 SO2 + Energa
(3.3)
llama
3.13
Preparaci
on de la muestra
Es un proceso de transformar una muestra en una forma que sea adecuada para el analisis.
El proceso podra evaluar: extraccion del analito en una muestra compleja, preconcentracion de analito muy diluida para su medicion, remover o enmascarar las especies
interferentes, o transformar qumicamente el analito en una especie mas conveniente a
una forma mas facilmente detectable. (derivatizacion.
34
E.Lans
Microextracci
on en fase s
olida
Metodo por medio del cual se puede extraer compuestos de lquidos, aire o lodo sin usar
ning
un solvente.
Purga y trampa
Es un metodo para remover analitos volatiles de lquidos o solidos (tal como aguas subterranea o suelos)concentrando el analito e introduciendolo en el cromatografo. En contraste con la SPME el cual remueve una porcion del analito de la muestra , el objetivo
de purga y trampa es remover el 100% del analito en la muestra. Se burbujea el gas de
purga He en el recipiente donde se encuentra la muestra, el cual es calentado para ayudar
a la evaporacion del analito, el gas de purga junto con el analito salen y pasan a traves
de un tubo de adsorcion que contiene tres capas de compuestos de adsorbente con fuerzas
adsorbentes diferentes ( bajo, moderado y alto) luego es retirado el tubo con los analitos
adsorbidos e inyectados en el cromatografo de gas, donde empieza la desorcion.
3.13.1
Selecci
on del m
etodo en cromatografa de gas
Para seleccionar un metodo en cromatografa de gas se debe tener en cuenta lo siguiente:Objetivo del analisis,preparacion de la muestra,detector, columna y modo de inyeccion.
Objetivo del an
alisis
Que se requiere del analisis?: La identificaci
on cualitativa de los componentes de una mezcla?. Requiere la separacion una alta resolucion en todo el cromatograma? O una buena resolucion en una porcion de este?. Puede
sacrificar resolucion por tiempo de analisis cortos?. Necesita el analisis cuantitativo de
uno o mas componentes?.Necesita alta precision?. Se encuentra el analito en concentracion adecuada o necesita tecnicas especiales para ultra analisis (preconcentracion y un
detector muy sensible).
Preparaci
on de la muestra
La clave para una cromatografa exitosa en una muestra compleja es limpiarla antes de
entrar a la columna, para ello se usa la tecnica SPME o purga y trampa. Otros metodos
incluyen extraccion lquida, extraccion fluidos supercrticos, extraccion en fase solida, desorcion termica de volatiles de un material solido. Estas tecnicas aislan el analito deseado
de sustancias interferentes y pueden ademas concentrar analitos diluidos hasta niveles
Cromatografa de gas
35
detectables. Si la muestra no se limpia bien pueden aparecer un gran numero de picos no

resueltos y sustancias no volatiles pueden arruinar su costosa columna cromatografica.
Escogencia del detector
Para ello se hace necesario si quiere un detector especfico para un elemento en particular, o
para una clase particular de compuesto ej: el FID requiere que la muestra contenga mayor
o igual a 10 ppm de cada analito para la inyeccion split. El de conductividad termica
detecta toda clase de compuestos pero no es suficientemente sensible para analisis alta
resolucion y columnas open tubular de diametro estrecho. El ECD es especfico para
moleculas que contienen halogenos, carbonilos conjugados, nitrilos, y compuestos nitro.
La muestra debe contener concentracion mayor o igual a 100 ppb de cada analito. El detector de fotoionizacion es especfico para compuestos aromaticos. NPD para compuestos
con nitrogeno y fosforo, FPD para compuestos que contienen sulfuros.Fotometrico de
llama para elementos como S, P , Pb o Sn.
MS e IR son utilizados para identificar los eluatos.
Selecci
on de la columna
Para ello hay que tener en cuenta: la fase estacionaria, el diametro de la columna, la
longitud y el espesor de la fase estacionaria. Las columnas pueden ser de polaridad
intermedia, no polar y altamente polar: por ejemplo: Para compuestos altamente polar se
necesita una columna fuertemente POLAR. Una columna con fase estacionaria intermedia
hara las mayoras de las separaciones que la columnas no polar no pueden hacer. La
mas alta resolucion es alcanzada con columnas estrechas y una fase estacionaria con
espesor muy delgado. Esta combinacion minimiza la resistencia a la transferencia de
masa termino C en la ecuacion de van deemter, la fase estacionaria y la movil reducen
la altura de plato. Columnas de pelculas delgada, estrechas son especialmente buenas
para separaciones de mezclas de compuestos de alto punto de ebullicion que son retenidos
demasiado fuertemente sobre columnas con pelculas gruesas. El tiempo de retencion corto
provee alta velocidad de analisis, sin embargo pelcula con espesor de pelculas delgado,
diametro estrecho tienen muy poca capacidad de muestras y requieren un detector con alta
sensibilidad (el FID no es adecuado) no retienen compuestos con bajo punto de ebullicion
y podra sufrir exposicion de sitios activos sobre la superficie de la slice.Columnas con
pelculas gruesa y estrecha dan una buena combinacion entre resolucion y capacidad de
muestra y pueden ser usada con la mayora de los detectores (excepto los TCD y el IR) y
con compuestos de alta volatilidad. Los tiempos de retencion son mas largos que aquellos
de columnas con pelcula delgada.
36
E.Lans
Columnas con diametro grande y pelculas gruesa son sugeridas para detectores de
conductividad termica TCD e IR ya que tienen alta capacidad de muestra y pueden
manejar compuestos volatiles, pero dan baja resolucion y tiempos de retencion muy largos.
Si una columna en particular satisface la mayora de sus requerimientos pero no provee
suficiente resolucion, entonces una columna mas larga del mismo tipo podra ser usada.
Doblando la longitud de la columna dobla el n
umero de platos y aumenta la resolucion
en 21/2, aunque esta no es la mejor manera de aumentar la resolucion por que dobla el
tiempo de retencion.
Al usar una columna mas estrecha o una fase estacionaria mas delgada incrementa la
resolucion sin perjudicar el tiempo de retencion. Cambiando completamente el tiempo de
retencion cambia tambion la retencion relativa de los componentes y podra resolver los
componentes de interes.
3.14
Escogencia del modo de inyecci

on
Inyecci
on split
Es u
til para analitos altamente concentrados, con este modo de inyeccion se consigue alta
resolucion.
Inyecci
on splitless
Es util cuando las muestras estan muy diludas, se consigue igualmente alta resolucion.
Inyecci
on on column
Es mejor para analisis cuantitativo y compuestos termicamente sensibles. Es una tecnica
de baja resolucion y no puede ser usada con columnas cuyo diametro interno sea menor de
0.25 mm. Puede manejar soluciones diluidas o concentradas y vol
umenes relativamente
grandes o pequeos.
3.15
An
alisis cuantitativo y cualitativo
Para identificar compuestos dos detectores son muy comunes. El espectrometro de masas
y el IR con transformada de fourier. Un pico puede se identificado comparando su espectro
con una biblioteca de espectros que tiene el computador.
37
Cromatografa de gas
Co-Cromatografa
Es una forma mas adecuada de comparar tiempos de retencion. Una muestra autentica
es agregada a una desconocida. Si el componente agregado es identico a la desconocida,
entonces el area relativa del pico aumenta.
An
alisis cuantitativo
Para la cuantificacion, en cromatografa se utilizan varios metodos, como son el metodo
del estandar interno, metodo del estard externo y el metodo de normalizacion de area.
M
etodo el est
andar interno
Un estandar interno es un compuesto distinto al analito de interes pero que tiene propiedades
similares
El metodo del estandar interno se utiliza mucho en cromatografa ya que permite
una mayor precision toda vez que evita las peque
nas variaciones de corrida en corrida
difciles de controlar producidas por la inyeccion de la muestra. (Harris 1999). Otra
razon para utilizar el estandar interno es que debido a la peque
nas contidades de muestras
inyectadas en cromatografa no son muy reproducibles. El procedimiento consiste en
agregar una cantidad exactamente conocida de un estandar interno tanto a la muestra
como a los estandares,la relacion de las areas ( o alturas)del analito y de estandar interno,
sirven como parametro analtico. Para poder aplicar este metodo se requiere que el pico
de estandar interno este bien separado de los picos de los demas componentes de la
muestra,esto se consigue con una resolucion mayor de 1,25 mas o menos; no obstante a lo
anterior se requiere ademas que el pico del estandar este cerca del pico de analito.(Skoog
& Holler 1998)
Para cuantificar por medio de este metodo se utiliza la siguiente ecuacion:
Ax /[] = F (As /[S])
(3.4)
Donde: Ax = Area de la se
nal del analito
As = Area de la se
nal del estandar
[X[ = Concentracion del analito en estudio
[S] = Concentracion del estandar
F = Factor de respuesta
La ecaucion anterior obedece que la respuesta relativa del detector al analito y al
estandar es constante bajo un amplio rango de condiciones; por ejemplo si la se
nal de
38
E.Lans
estandar incrementa por el cambio en la velocidad de flujo del solvente, ese mismo incremento lo sufre la se
nal del estandar.(Harris 1999)
M
etodo de normalizaci
on de
area
Para aplicar este metodo se toman el promedio de 5 replicas(inyecciones) del area del
analito de interes. Se escoge un componente como referencia y la respuesta relativa de
otros componentes se determinan dividiendo el area del pico de interes por el area del
pico de referencia. El factor de respuesta del detector se puede usar para calcular el area
corregida del pico de interes. Este procedimiento aplica para cada uno de los picos de los
componentes a estudiar, determinando su area relativa. Luego se suman todas las areas
corregidas y se divide por el area del pico en cuestion y multiplicandolo por cien.(A. &
F.J 1999).Veamos el siguiente ejemplo.
Para un componente x cuando existen patrones:
FRD =
Ax
Ax
FRx =
Aref
mx
(3.5)
De donde:
FRD = Factor de respuesta del detector
FRx = Factor de respuesta del compuesto x
Ax =Area de compuesto de interes
mx =masa del compuesto de interes
Para el calculo del area corregida de un componente cuando existen patrones, lo cual
nos permite hacer un calculo exacto, se utiliza la siguiente ecuacion:
Acorregida = FRD Ax
%Ax =
Acorregida x
100
Acorregida
(3.6)
(3.7)
Como es area es proporcional al peso(aforando al mismo volumen) entonces:
%WA =
Acorregida
100
Acorregida
(3.8)
Cuando no existen patrones solo se puede hacer un calculo semicuantitativo, para ello
se utiliza la siguiente formula:
39
Cromatografa de gas
Ax
100
Ai
Para la exactitud del metodo se deben tener en cuenta los siguientes criterios:
%Ax =
(3.9)
1. Todos los analitos deben ser eludos

2. Todos los analitos deben ser detectados
3. Todos los analitos deben tener igual sensibilidad (respuesta/masa)
M
etodo del est
andar externo
Uno de los metodos mas sencillos es este, el cual consiste en preparar una serie de disoluciones patron de composicion pararecida a la muestra. Luego se obtienen los cromatogramas de los patrones, representados en las alturas de plato o areas de pico en funcion de
la concentracion. Esta grafica debera originar una lnea recta que pasa por el origen de
coordenadas. Para mejor exactitud en la medida se le debe hallar su pendiente con su
el intercepto con sus desviaciones estandar, el coeficiente de determinacion r 2 y chequear
frecuentemente despues de varias corridas. Una vez hecha la curva se toma la lectura de
la muestra y se interpola en la grafica, lograndose as la concentracion buscada.
Captulo 4
ESPECTROMETRIA DE MASAS
La espectrometra de masas da el nombre a un conjunto de tecnicas utilizadas para la
medida de las masas de los iones y su abundancia en la fase gaseosa.
El conjunto de tecnicas llamadas espectrometra de masas es una de las mas versatiles
e importantes instrumentos de analisis qumicos
4.1
4.1.1
Cualidades de la espectrometra de masas

Cualidades de indentificaci
on
Puede identificar cualitativamente de forma inequvoca casi cualquier tipo de sustancia.
4.1.2
Cuantifica e identifica
Puede identificar y cuantificar la concentracion de la sustancia bajo estudio.
4.1.3
Sensibilidad
Detecta en el orden de ppq (ICP-MS) y tiene capacidad de separar mezclas complejas.
4.1.4
Universal y especfica
Analiza sustancias o mezclas de sustancias solidas, lquidas y gaseosas. Es capaz de

detectar y separar una sustancia en presencia de una matriz compleja.
40
41
Espectrometra de masas
4.1.5
Informaci
on estructural
Suministra informacion estructural de la molecula.
4.1.6
Rapidez
Puede realizar un espectro en decimas de segundos.
4.2
Tecnicas de ionizaci
on
Dependiendo de la naturaleza del compuesto a analizar o del interes del investigador

se utilizan varias tecnicas de ionizacion. Entre ellas tenemos: Ionizacion por impacto
electronico(EI),ionizacion qumica(CI) ,ionizacion por campo(FD), desorcion por campo(FD),bombeo
con atomos rapidos(FAB),electrospray ( ES, ESI), ionizacion a presion atmosferica.
Las tres primeras fuentes requieren la volatilizacion de la muestra antes de la ionizacion;a
ellas se les llama fuentes de fase gas; por tanto solo se pueden usar para compuestos
termicamente estables que tengan puntos de ebullicion menores de 500 o C. Mayoritariamente las fuentes de gas estan limitadas a compuestos con pesos moloculares menores de
103 daltons.
4.3
Ionizaci
on por impacto electr
onico (EI)
Es el mas utilizado. Cuando las moleculas se encuentran en la camara de ionizacion son

sometidas a un bombardeo con una corriente de electrones provenientes de un filamento.
El n
umero de electrones es controlado por la temperatura del filamento, mientras que su
energa lo es por el potencial a que se mantiene el filamento. El potencial del filamento
se puede variar. 70 eV es el mas usual.Figura 4.1
M + e M+ + 2 e
4.4
(4.1)
Ionizaci
on qumica
En las fuentes de ionizacion qumica se utiliza un gas reactivo ( metano, amonaco, argon,
isobutano etc) para suavizar las condiciones de ionizacion de la muestra . Por tal razon
hay menos energa en exceso y por ende menos fragmentacion que el EI ( por encima de
la que se necesita para la ionizacion). Se introduce el gas en la camara de ionizacion a
una presion de 103 torr, su concentracion es mucho mas alta que la de la muestra. Se
42
E.Lans
Figura 4.1: Ionizacion por impacto electronico
(Esteban 1993)
ioniza el gas con un haz de electrones y a traves de su subsiguientes reacciones acepta
protones para formar iones moleculares.
Si se usa metano el ion primario formado es el CH5 + , este, transfiere un proton a las
moleculas de analito que tienen mayor afinidad por el proton, mediante la reaccion:
CH5 + + M MH+ + CH4
4.5
(4.2)
Ionizaci
on Qumica negativa
La reaccion mas frecuente es la abstraccion protonica.

MH + R M + RH + Energa
(4.3)
El exceso de energa producido en la reaccion suele quedar en forma de energa vibracional

asociada al enlace RH de la especie neutra formada, lo que hace que la especie M
formada sea muy estable y halla una ausencia casi total de fragmentacion.
4.6
43
Ionizaci
on por campo
Aqu los iones se forman bajo la influencia de un campo electrico elevado al aplicar altos
voltajes (10 a 20 kV) a emisores que contienen numerosas puntas finas de diametros
menores de 1m. Estos emisores adquieren la forma de un fino hilo de tungsteno en la
cual se han hecho crecer centenares de agujas microscopicas de carbon por pirolisis de
benzonitrilo que emergen desde la superficie del hilo.
La muestra gaseosa se difunde en el area del campo elevado alrededor de las micropuntas donde se concentra este. En las micropuntas es donde tiene lugar la ionizacion donde
los electrones del analito son extrados. En este caso el analito adquiere poca energa
vibracional y rotacional por lo que se produce poca fragmentacion.
4.7
Fuentes de desorci
on
Son aquellas donde no es posible la ionizacion de analitos termicamente inestables y no

volatiles.
Los metodos de desorcion prescinden de la volatilizacion y la posterior ionizacion.
En su lugar se suministra energa a la muestra lquida o solida de modo que se provoca
la formacion directa de iones gaseosos. Como consecuencia, los espectros aparecen muy
simplificados y a menudo consisten solo en el ion molecular o el ion molecular protonado.
Con esta tecnica se puede obtener informacion sobre espectros de masas de especies bioqumicas y especies con PM por encima de 10.000 daltons.
4.8
Desorci
on por campo
Se utiliza un emisor con multiples puntas como se describio anteriormente. En este caso
el electrodo se monta sobre una sonda que puede separarse del compartimiento de la
muestra y mojarse con una solucion de la muestra. Despues la sonda se reinserta en el
compartimiento de la muestra, la ionizacion tiene lugar por la aplicacion de un potencial
elevado a este electrodo.
4.9
Bombardeo por Atomos

R
apidos (FAB)
Es importante para el estudio por espectrometra de masas para compuestos de elevado

peso molecular. La muestra condensada (a menudo en glicerol) se ionizan por bombardeo
con atomos de elevada energa de xenon o argon. Tanto los iones negativos y positivos
del analito son expulsados de la superficie de la muestra por un proceso de desorcion.
44
E.Lans
Este procedimiento permite un calentamiento rapido de la muestra reduciendo su fragmentacion.
4.10
Ionizaci
on electrospray
4.11
Espectr
ometro de masas
Un espectrometro de masas4.2 consta de:

1. Una fuente de ionizacion
2. Un analizador
3. Transductor(dectector)
4.11.1
C
amara de ionizaci
on
Zona donde se introducen la moleculas ( pueden ser gaseosas, lquidas o solidas), se evapora, se ioniza y se aceleran. (las muestras gaseosas se ionizan entre dos placas cargadas).
Los iones formados son de masas diferentes.
4.11.2
Analizador de masas
Despues de ser acelerados los iones pasan al analizador de masas que son de varios tipos,
donde se separan de acuerdo a su masa. Figura 4.3. En general en el analizador se necesita
un vaco del orden 107 torr o mejor. Para lograrlo se debe utilizar un sistema eficiente
de bombeo.(?)
Figura 4.2: Partes de un espectrometro de masas
45
Figura 4.3: Esquema interno de un espectr

ometro de masas
4.12
Detectores
Como ya lo habiamos dicho un detector es aquel que convierte una propiedad qumica de
un analito en una se
nal subsectible de ser medida. En masas el detector mas utilizado
es el channeltron.El efecto es muy parecido al fotomultiplicador. Es un tubo de vidrio
abierto con un cono en una terminacion. Para la deteccion de iones positivos, el cono es
sometido a un alto potencial negativo (aproximadamente 3kV ).
4.12.1
Channeltron
Cuando los iones salen del analizador de masas, son atrados por el potencial negativo
del cono. Cuando los iones chocan con su superficie,as se originan uno o mas electrones
secundarios. El potencial dentro del tubo vara continuamente con la posicion, tal que
los electrones secundarios se mueven hasta llegar a otra zona donde se originan otros
electrones secundarios, y as sucesivamente.Figura 4.4
El tubo esta cubierto por un material semiconductor. La vida media del multiplicador
esta determinada por la carga total acumulada.
4.12.2
Copa de faraday
El analizador del gas consiste en una fuente del Ion, un espectrometro total, y una seccion
de la medida. Se ioniza el gas residual cuando choca con los filamentos termoelectronicos
cargados de alta temperatura, y los iones que se crean, se aceleran y convergen sobre
46
E.Lans
Figura 4.4: Detector channeltron
Figura 4.5: Copa de faraday
47
el espectrometro total. En el espectrometro total, los voltajes de la corriente alterna se

aplican a los cuatro electrodos cilndricos (quadropole), que permite que los iones sean
separados de acuerdo a su realcion masa/carga. Los iones separados son detectados como
corriente electrica por la Copa de Faraday. La corriente del on es proporcional a la masa
(presion parcial) del gas. Figura 4.5
4.13
M
etodos acoplados a masas
Aunque la espectrometra de masas es una poderosa herramienta para la identificacion

de compuestos puros es insuficiente para el analisis de incluso mezclas simples ya que
la identificacion esta limitada por el inmenso n
umero de fragmentos de diferentes valores
m/z producidos.
Cromatografa de gas/masas- cromatografa lquida/masas

Es una buena herramienta para el analisis de mezclas organicas y bioqumicas complejas.
En este caso se efect
uan los espectros de los compuestos que salen de la columna cromatografica;los cuales son almacenados en un ordenador para el siguiente proceso.
Los espectrometros de masas tambien se pueden acoplar a cromatografa lquida MS/LC
para el analisis de muestras que tienen constituyentes no volatiles. El inconveniente que
se presenta en los acoplamientos anteriores es que la muestra en el cromatografo esta
diluda por el gas o el lquido portador de la columna; por lo que es necesario eliminar el
eluyente antes de la introduccion de la muestra en el espectrometro de masas.
El detector de masas mas simple para cromatografa de gases es el detector de trampa
de iones (ITD)
Espectrometra de masas en tandem MS/MS
Consiste en acoplar un espectrometro de masas a otro. El primer espectrometro sirve
para aislar los iones moleculares de varios componentes de una mezcla. Estos iones se
introducen uno de tras otro en un segundo espectrometro de masas. En un instrumento
en tandem el primer espectrometro esta equipado con un metodo de ionizacion suave(
ionizacion qumica) para que la salida sea mayoritariamente de iones moleculares o iones
moleculares protonados.Estos iones pasan entonces a la fuente de ionizacion del segundo
espectrometro. Esta fuente de iones consiste en una camara de colisiones sin campo en
la que se bombea helio. Las colisiones entre los iones progenitores y los atomos de helio
producen fragmentaciones de iones progenitores dando numerosos iones hijos. El espectro
48
E.Lans
de estos iones hijos se efect

ua por un segundo espectrometro. El primer espectrometro
tienen la misma funcion que la columna en GC/MS o GC/LC.
Aplicaciones de la espectrometra de masas en tandem
La espectrometra de masas en tandem parece ofrecer las mismas ventajas que GC/MS y
LC/MS pero es mas rapida.
La espectrometra de masas en tandem es potencialmente mas sensible que las dos
tecnicas cromatograficas acopladas, ya que el ruido asociado a su uso es menor.
4.13.1
Aplicaciones
Se ha utilizado en la determinacion cualitativa y cuantitativa de los componentes de

una amplia variedad de materiales complejos encontrados en la naturaleza y la industria.Ejemplos
1. Identificacion y determinacion de metabolitos de drogas.
2. Feromonas de insectos.
3. Alcaloides en las plantas.
4. Trazas de contaminantes en el aire.
5. Secuencia de polmeros.
6. Compuestos petroqumicos.
7. Bifenilos policlorados.
8. Gases de escape de automotores.
9. Olores en aire.
4.13.2
Desventajas
Una desventaja de la cromatografa de masas en tandem con respecto a los otros procedimientos cromatograficos es el alto costo del equipo requerido.
4.13.3
49
Identificaci
on de compuestos puros por espectrometra
de masas
El espectro de masas de un compuesto puro nos da informacion a cerca de:

1. Peso molecular del compuesto.
2. De su formula qumica.
3. Sobre la presencia de varios grupos funcionales, estudiando el modelo de fragmentacion y comparando el espectro del compuesto con uno conocido hasta su total
coincidencia.
4. Relacion con los picos debido a impurezas. Cuando existen dudas se deben utilizar
los espectros de ionizacion qumica o ionizacion por campo.
4.13.4
Analizador de trampas de iones
En este instrumento, los iones se generan a partir de la muestra eluda, por impacto
electronico o ionizacion qumica y luego se almacenan en un campo de radiofrecuencia. A
continuacion los iones atrapados se expulsan del area de almacenamiento hacia un detector
multiplicador de electrones. La expulsion se lleva a cabo de tal forma que es posible un
barrido en funcion del cociente/masa carga.
Captulo 5
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
(HPLC)
ALTA RESOLUCION
La cromatografa lquida es muy importante porque la mayora de los compuestos no son
lo suficientemente volatiles para analizarse por cromatografa de gas.
En HPLC se usa alta presion para forzar el solvente a pasar a traves de una columna
que contiene unas partculas muy finas que dan alta resolucion a las separaciones. El
sitema HPLC involucra:
1. Un sistema de entrega de solvente.
2. Una valvula de inyeccion de la muestra.
3. Una columna que resiste alta presion.
4. Un detector.
5. Un computador para el control del sistema. Modernamente se usa un sistema para
el control de la temperatura.
5.1
Proceso cromatogr
afico
En cromatografa de gas para incrementar la eficiencia se incrementara la velocidad de

transferencia de masas entre la fase estacionaria y la fase movil. Para una columna
open tubular esto es adecuado ya que disminuyendo el espesor de la pelcula de la fase
estacionaria y reduciendo el diametro de la columna las moleculas pueden difundirse
50
Cromatografa lquida de alta resolucion
51
rapidamente.
La difusion de los lquidos es 100 veces mas lento que la difusi
n de los gases. Por tanto
en cromatografa lquida no es generalmente factible usar columnas open tubular, por que
el diametro de los canales del solvente es demasiado grande para ser atravesado por una
molecula de soluto en corto tiempo. De modo que la cromatografa lquida es llevada a
cabo en columnas empacadas.
5.1.1
Efectos del tama

no de las partculas en HPLC
La eficiencia de una columna empacada se incrementa cuando el tama

no de las partculas
de la fase estacionaria decrece ya que disminuye la altura de plato. En condiciones
optimas el n
umero de platos teoricos en una columna de longitud L (cm) es: N =
3.500L(cm)/dp(m)
dp = tama
no de las partculas en micrometro.
Una razon de porque las partculas peque
nas dan mejor resolucion es que ellas proveen
un flujo mas uniforme a traves de la columna, por tanto reducen el termino de m
ultiples
pasos A en la ecuacion de Van Deempter.
Una segunda razon es que la distancia a traves de la cual el soluto debe difundirse en
la fase movil entre partculas se debe al tama
no de estas. Cuando las partculas son
peque
nas, hay menos distancia entre ellas, para que el soluto se difunda mejor en la fase
movil. Este efecto disminuye el termino C en la ecuacion de Van Deemter, dando un
tiempo finito entre equilibrio.
El inconveniente del peque
no tama
no de las partculas es la resistencia al flujo del
solvente, es por ello que requiere alta presion ( 70-400 atm).
5.1.2
Columnas
Las columnas en HPLC pueden ser de plastico, vidrio o acero inoxidable con longitudes
entre 5 y 30 cms, con un diametro interno de 1-5 mm. Las columnas son costosas,
facilmente degradables debido al polvo o partculas que se encuentran en la muestra o
el solvente, por lo que se requiere de un guarda columna. Un guarda columna es
una columna corta que contiene la misma fase estacionaria que la columna principal. Las
partculas finas e impurezas son retenidas por el guarda columna, la cual es periodicamente
reemplazado.
Si se calienta la columna generalmente disminuye la viscosidad del solvente, aumentando
su velocidad de flujo y reduciendo la presion requerida.
52
E.Lans
Igualmente incrementando la temperatura disminuye el tiempo de retencion mejorando

la resolucion, ya que aumenta la difusion del soluto; no obstante este aumento de temperatura puede degradar la fase estacionaria disminuyendo la vida u
til de la columna.Si
calentamos la columna unos pocos grados sobre la temperatura ambiente, mejora , la precision (reproducibilidad y repetibilidad) del analisis cuantitativo y el tiempo de retencion.
5.1.3
Columnas analticas
El tama
no de las partculas de relleno en esta columnas son de 3-10 m.
La columna mas utilizada es la de 25 cm con tama
no de partculas de 5 my diametro
interno de 4.6 mm.
Estas columnas alcanzan unas alturas de platos teoricos de 40.000 a 60.000.
5.1.4
Fase estacionaria
Existen dos tipos basicos de relleno pelicular y de partcula porosa. La mas com
un son
partculas microporosas esfericas de slica que son permeables al solvente y tienen un
area de superficie bastante grande. Las esferas son de vidrio o polmeros con diametro
de 30 a 40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa
de slice, al
umina o resina de intercambio ionico.Estas esferas tambien se pueden tratar
qumicamente para obtener una capa superficial organica.
Los tpicos rellenos de partculas porosas en cromatografa de lquidos estan formados
por micro partculas porosas con diametros de 3 a 10 m.
5.1.5
Proceso de eluci
on
En la cromatografa de adsorcion las moleculas de solvente compiten con las moleculas de

solutos por los sitios activos de la fase estacionaria.
Las capacidades relativas de los diferentes solventes para eluir un soluto dado del
adsorbente son casi independiente de la naturaleza del soluto.
La eluci
on se puede describir como un desplazamiento de soluto a traves la fase estacionaria por el solvente.
Fuerza del eluente o
Es una medida de la energa de adsorcion del solvente, la cual es cero (0) para el pentano
para adsorcion sobre slica. Entre mas polar es el solvente mas fuerza de elusion tiene
sobre la slica. Entre mas grande sea la fuerza del eluente mas rapidamente sera eludo
de la columna.
53
La cromatografa de adsorcion sobre slica bare es un ejemplo de cromatografa en

fase normal en la cual usamos una fase estacionaria polar y un solvente menos polar. Un
solvente mas polar tiene una fuerza de eluente mas alta.
5.2
Clasificaci
on de la cromatografa lquida
La cromatografa lquida la podemos clasificar como:
5.2.1
Cromatografa en fase reversa
Es la mas com
un donde el solvente es polar y la fase estacionaria es a polar o ligeramente
polar. Aqu un solvente menos polar tiene una fuerza de elucion mayor. Generalmente el
solvente es un hidrocarburo.
En la cromatografa en fase reversa se eliminan picos con cola (tailing) por que la
fase estacionaria tiene pocos sitios que puedan adsorber fuertemente al soluto como para
producir el tailing. La cromatografa en fase reversa es menos sensible a las impurezas
polares (como agua) en el eluente. En esta cromatografa los componentes mas polares
aparecen primero y un aumento en la polaridad de la fase movil disminuye el tiempo de
elucion.
5.2.2
Cromatografa en fase normal
En cromatografa en fase normal la fase estacionaria es polar y la fase movil es apolar;

el soluto menos polar se eluye primero debido a que es mas soluble en la fase movil y un
aumento en la polaridad en la fase movil aumenta el tiempo de elucion.
5.2.3
Cromatografa lquido-lquido o de partici

on
En esta cromatografa las moleculas de soluto se distribuyen entre dos lquidos, uno de
ellos hace la veces de fase estacionaria y el otro de fase movil, esta u
ltima se encuentra
homogeneamente dispersa en un soporte solido.
Este tipo de cromatografa presento inconvenientes mayores como el hecho de que:1)se
requera presaturar la fase movil con la fase estacionaria.2)era necesario disolver la muestra
en la fase movil presaturada con la fase estacionaria y 3)no se podan llevar a cabo
gradientes de elucion.
54
E.Lans
Ejemplos
El siguiente ejemplo muestra el comportamiento de elucion de los distintos componentes
teniendo en cuenta su polaridad y la clase de polarografa utilizada.(Skoog & Holler 1998)
5.2.4
Cromatografa de adsorci
on
Llamada cromatografa liquido-solido. Las u

nicas fases que se utilizan en HPLC lquidosolido son la slice y la al
umina, siendo la slice la que mas es utilizada, se usa para
casi todas las aplicaciones debido a su mayor capacidad de carga y mayor diversidad de
presentaciones.
En cromatografa lquido-solido la u
nica variable que se puede utilizar para optimizar
K y es la composicion de la fase movil.
La cromatografa de adsorcion es mas adecuada para compuestos no polares con masas
moleculares inferiores a 5000.
Esta cromatografa es mas adecuada para muestras que son solubles en disolventes
no polares, por lo que tiene una solubilidad limitada en los disolventes acuosos utilizados
en cromatografa de fase inversa. Una caracterstica particular de la cromatografa de
adsorcion es su capacidad de diferenciar isomeros.
5.2.5
Elecci
on del solvente
Para elegir el solvente adecuado se vara la relacion entre los disolventes y se obtiene as
un valor adecuado de k . Se ha encontrado que un aumento de 0,05 unidades en el valor
de o por lo general disminuye 3 o 4 veces el valor de k .

Con estas combinaciones se pueden encontrar la relacion que favorezcan los tiempos
de retencion para cualquier mezcla, pero por desgracia la relacion de volumen no es lineal
con o .
Figura 5.1: Cromatografa fase inversa.(Fase m

ovil de baja polaridad)
Polaridad de los componentes: A>B>C
Figura 5.2: Cromatografa fase normal.(Fase m

ovil de polaridad media)
Figura 5.3: Cromatografa en fase normal.(Fase m

ovil de polaridad media)
Polaridad de los componentes: A>B>C
Figura 5.4: Cromatografa en fase inversa.(Fase m

ovil de alta polaridad )
55
56
5.3
E.Lans
Gradiente de eluci
on isocr
atica
La elucion isocratica es llevada a cabo con un solo solvente (o mezcla constante de solvente). Cuando un solvente no es capaz de dar una elucion rapida de todos los componentes, entonces se usa el gradiente de elucion, que no es mas que hacer cambios
continuos en la composici
on del solvente para aumentar su fuerza.
El gradiente de elucion en HPLC es analogo a la programacion de temperatura en
cromatografa de gas.Aumentando la fuerza del solvente se eluye mas rapidamente el
soluto retenido.
5.4
Selecci
on del modo de separaci
on
Hay varias formas de separar un componente de una mezcla dada. En cualquier caso la
primera pregunta que se debe hacer es si es soluble en agua o en un solvente organico.
Si el soluto se disuelve en un solvente no polar o debilmente polar, usaremos la cromatografa en fase reversa. Si el peso molecular del soluto es mayor de 2000 y son solubles
en solventes organicos con diametro molecular menor de 30 nm escogemos cromatografa
fase reversa (C18 , C8 , C4 ).
Si el peso molecular es mayor de 2000 y es soluble en solvente organico y el tama
no
molecular esta entre 30-400 nm la cromatografa a escoger es la exclusion por tama
no.
Si el peso molecular del soluto es menor de 2000 y es soluble en agua y es ionico la
cromatografa a escoger es la ionica.
5.5
Solventes
Se requieren solventes grados HPLC muy puros para evitar la degradacion de la columna
debido a las impurezas y minimizar la se
nal de fondo del detector debido a contaminantes.
Para evitar esto se utilizan filtros para retener las partculas con tama
nos de las micra.
La muestra y el solvente son pasados a traves de un guarda columna. A
un contando
con un guarda columna se recomienda el lavado periodico de la columna analtica para
prolongar su vida u
til.
Antes del uso del solvente estos son purgados con He para remover el aire disuelto, ya
que las burbujas de aire les causan problemas a las bombas,a las columnas y detectores.
Las separaciones en fase normal son muy sensibles al agua en el solvente.
Una buena cromatografa con fases moviles interactivas, requiere un equilibrio adecuado entre las fuerzas intermoleculares entre los tres participantes activos en el proceso
de separacion soluto, fase m
ovil y fase estacionaria. Estas fuerzas intermoleculares
57
se describen en terminos de polaridad relativa de cada uno de los reactivos.

Para una separacion cromatografica de reparto la polaridad de la fase estacionaria ha de
ser similar a la del analito y para la elusion se requiere entonces una fase movil de una
polaridad considerablemente distinta. La polaridad de los grupos funcionales viene dada:
HIDROCARBUROS<ETERES <ESTERES <CETONA<ALDEHIDOS<AMIDAS <AMINAS
<ALCOHOLES. En conclusion podemos decir que para que ocurra una buena separacion
las polaridades del soluto, fase movil y la fase estacionaria deben armonizarse, por que si
el soluto tiene mucha mas afinidad con la fase movil, los tiempos de retencion seran demasiado cortos para fines practicos, y si tiene demasiada afinidad con la fase estacionaria
los tiempos de retencion se hacen demasiado largos.
5.6
Criterios para una buena separaci

on
El factor de capacidad es una medida del tiempo de retencion (tr ) en unidades de tiempo.
Separaciones razonables demandan que el factor de capacidad para todos los picos
deben estar en el rango 0,5-20. Si el factor de capacidad es demasiado peque
no el primer
pico es distorcionado por el frente del solvente. Si el factor de capacidad es demasiado
grande el tiempo de analisis es muy prolongado.
Cuando no se observa perturbacion en la lnea base de un cromatograma el tiempo muerto
se puede estimar con la ecuacion :
tm =
Ldc
2F
(5.1)
Donde L = longitud de la columna

dc = diametro interno de la columna
F = velocidad de flujo
En cromatografa en fase reversa el tm puede ser medido pasando un soluto no retenido
(por ej. uracil detectado a 260 nm) a traves de la columna.
Para la cuantificacion una resolucion mnima entre dos picos vecinos de 1.5 es deseada.
Para mayor robustez una resolucion de 2 es mucho mejor.
Otro criterio para una adecuada separacion cromatografica es no exceder la presion de
operacion por encima de 15 MPa (150 atm) esto prolonga la vida de la bomba, valvulas,
sellos y el automuestreador.
Todos los picos que necesiten ser medidos deben ser simetricos con un factor de
asimetra A/B en el rango de 0.9-1.5
58
E.Lans
5.6.1
Atributos de una buena separaci

on
Para que se produzca una buena separacion, se deben cumplir las siguientes condiciones:
1. 0,5 6 K 6 20
2. Resolucion 2
3. 0.96 factor asimetra 6 1.5
4. Presion de operacion 6 15 MPa ( 150 atm)
5.7
Optimizaci
on con un solvente
Combinaciones de acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano(THF) con agua (buffer acuoso)

son muy adecuados para separar un gran n
umero de compuestos por cromatografa en
fase reversa.
La primera mezcla a probar sera acetonitrilo y agua. El acetonitrilo tiene una viscosidad baja que permite operar a presiones relativamente bajas, y permite deteccion UV
por debajo de los 190 nm.
A esta longitud de onda un gran n
umero de analitos presentan absorcion.
El metanol es el segundo solvente escogido por que tiene una alta viscosidad y un
cut-off(longitud de onda a la cual no hay absorcion del solvente por parte del detector)
en el UV mas grande.
El THF es la tercera mezcla escogida por que tiene un rango menor utilizable en el
UV, es lentamente degradado por oxidacion y se equilibra mas lentamente con la fase
estacionaria.
5.7.1
Orden de escogencia de un solvente org

anico
1. ACETONITRILO
2. METANOL
3. HF
1
El acetonitrilo es un reactivo peligroso por lo que sus desechos deben ser hidrolizados con acetato de
sodio y vertidos al drenaje.
5.8
59
Optimizaci
on con dos o tres solventes org
anicos
Cuando se requieren dos o tres solventes organicos, se requiere primeramente una optimizacion, para ello se deben seguir los siguientes pasos:
Paso 1: Se optimiza la separacion con acetonitrilo/buffer para generar un cromatograma
A.
Paso 2: Se optimiza la separacion con metanol/buffer para generar un cromatograma
B.
Paso 3: Se optimiza la separacion con THF/buffer, para generar un cromatograma
C. Paso 4: Se mezclan los solventes, de los pasos 1,2 y 3 en proporciones 1:1 para generar
los cromatogramas D, E y F.
Paso 5: Hacer una mezcla de acetonitrilo, metanol y THF en proporcion 1:1:1 para
generar un cromatograma G.
Paso 6: Si alguno de los resultados mostrados en los cromatogramas de A a G, es
adecuado, seleccionelo.
Si la separacion no se consigue con ninguno de los pasos anteriores es necesario que usted
pruebe una columna diferente u otra forma de cromatografa.(Harris 1999)
5.9
Temperatura como una variable en separaciones

isocr
atica
Cambiando la temperatura de la columna puede afectar la retencion relativa de los diferentes compuestos en una mezcla, la temperatura tiene mucha influencia en compuestos
ionicos( cationes amonio, cationes carboxilatos)y moleculas con m
ultiples sustituyentes
polares.
Para elevadas temperaturas de operacion, el pH debe estar por debajo de 6 para
retardar la disolucion de la fase estacionaria de slica.
5.9.1
Como se consigue una buena separaci

on?
Para hacer una buena separacion se debe aumentar la resolucion, para ello usted debe:
1. Disminuir la velocidad del flujo.
2. Incrementar la longitud de la columna.
3. Disminuir el tama
no de las partculas en la columna.
60
E.Lans
Resolucion =
tr
tr
=
Wav 1.70w 1
2
tr = Separacion entre picos

Wav =Promedio del ancho de la lnea base
W 1 =Promedio del ancho de pico a la mitad de la altura
2
(5.2)
Captulo 6
CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS
SUPERCRITICOS
6.1
Definiciones
La cromatografa de fludos supercrticos es una tecnicas se separacion llamada tambieen

estraccion supercrtica.La cromatografa de fludos supercrticos tiene importancia por que
permite la separacion y la determinacion de un grupo de compuestos que no se pueden
analizar adecuadamente ni por cromatografa de gas ni por cromatografa lquida
Los fludos supercrticos combinan caractersticas de gases y lquidos Ej.: los coeficientes
de difusion y viscosidad de los FSC son semejantes a la de los gases de arrastre en cromatografa de gas, mientras que sus densidades se aproximan a la de los lquidos.
Estos compuestos son los no volatiles o termicamente labiles a los que no se pueden aplicar
los procedimientos de cromatografaa de gas y aquellos que no contienen grupos funcionales
que hagan posible su deteccion por las tecnicas espectroscopicas o electroqumicas que se
utilizan en cromatografa lquida
En CFS es posible hacer variar tres condiciones que son similares a los que se hacen
variar en HPLC: Temperatura, composicion del eluyente y la velocidad de la fase movil
Fludo supercrtico:Sustancia llevada mediante operaciones mecanicas a unas
condiciones operativas de presion y temperatura crtica.
Temperatura crtica:Temperatura por encima de la cual no puede existir una fase
lquida independientemente de la presion.
Presi
on crtica:Es la presion de vapor de una sustancia a temperatura crtica.
Punto crtico:Temperatura y presion superiores proximas a la presion y temperatura crtica.
61
62
E.Lans
6.2
Car
actersticas de un fludo supercrtico
Gran poder disolvente junto con una enorme capacidad de penetracion en solidos,
lo que permite el agotamiento rapido y practicamente total de los solidos extrables.
A diferencia en HPLC y GC en los FSC el aumento de presion a una temperatura
dada incrementa la densidad la cual aumenta la solubilidad de la mayora de los
analitos.
Otra caracterstica de los FSC es que un aumento de temperatura a determinada presion
produce una menor densidad del fludo, lo que conduce a una menor solubilidad. Como
resultado, incluso cuando la temperatura y la composicion del eluyente son constantes, la
cada de presion desde la entrada hasta la salida de la columna significa que las solubilidades de los analitos disminuye conforme estos avanzan por la columna. Para resumir
podemos decir que el metodo es menos sencillo que en GC y HPLC.
6.3
Analitos
En la actualidad la CFS no es tan popular como GC o HPLC. Es una tecnica casi ideal
para realizar separaciones de algunos surfactantes y polmeros. Se prefiere la CFS para
estos compuestos por que no es necesario la volatilizacion para obtener un gas, y la
transferencia de masas es un orden de magnitud mayor que en las fases moviles de HPLC.
Esto implica una reduccion significativa del tiempo de analisis, pues logra un equilibrio
mas rapido entre la fase movil y la estacionaria.Tambien se ha demostrado que CFS es
u
til para separar algunos compuestos quirales. El orden de retencion suele ser el mismo
que para HPLC quiral, pero las separaciones son mas rapidas.
6.4
Fase M
ovil
La fase movil en CFS se inicia en un cilindro de gas a alta presion, pero el fludo permanece comprimido y se calienta por encima de su temperatura critica, para as obtener
condiciones supercrticas. El dioxido de carbono es la fase movil que se emplea con mayor
frecuencia, debido a su bajo costo, no es inflamable ni toxico. Como no es polar se le
agregan modificadores polares para permitir el analisis de compuestos polares.
Los modificadores que se agregan con frecuencia incluyen metanol y etanol, para sustancias basicas, aminas. Los gradientes en CFS se obtienen cambiando las condiciones que
modifican la solubilidad del analito en la fase movil supercrtica.
6.5
63
Cosolventes
Sustancia que se le agrega al sistema para aumentar la selectividad y el poder disolvente

del fludo, con caractersticas similares a las del soluto. Se agrega en una concentracion
mayor que la del soluto pero menor que la del disolvente.
Las diferencias de solubilidad de distintas sustancias en Fludos supercrtico se deben a
las caractersticas de los solutos solidos tales como presion de vapor y a las interacciones
particulares que se establecen entre un soluto dado con el disolvente supercrtco.Como
consecuencia de esto moleculas muy parecidas pueden tener solubilidades muy diferentes
ej:La extraccon con CO2 supercrtico la cafena de los granos del caf
e y de la teobromina de las hojas del t
e. Para el extraccion de la cafena el proceso es excelente
y no lo es as para la extraccion de la teobromina del te a pesar de que la u
nica diferencia entre ambas moleculas es que donde tiene la teobromina un atomo de hidrogeno,
la cafena tiene un grupo CH3 .La extraccion de cafena es uno de los procesos mas exitosos de extraccon supercrtica, mientras que la baja solubilidad de la teobromina en
CO2 supercrtico impide el uso de este proceso para extraerla. Cerca de 100, 000 toneladas
de cafe son tratadas anualmente con CO2 supercrtico para extrarerlo totalmente.
6.5.1
Fludos usados para extracci

on supercrtica
Para la extraccion en fludos supercrticos se utilizan las siguientes fases moviles: CO2 ,
H2 O, C2 H6 , C2 H4 ,C3 H8 ,Xe,N2 O.
El CO2 cuya temperatura crtica de 31, 2oC cercana a la ambiente, se convierte en el
disolvente apropiado para manejar sustancias labiles a pesar de que sus propiedades como
disolvente son mucho mas modesta que las del agua. Por ejemplo son insolubles en CO2 ,
incluso a altas densidades, las sustancias polares y muchas no polares. La solubilidad de
una sustancia en un disolvente superctico es en general menor que en los lquidos convencionales., esto se compensa por que cuando se emplean FSC la separacion de soluto
y disolvente le logra eficientemente mediante un simple proceso de expansion. Esto evita
tener que aumentar la temperatura para eliminar el disolvente por evaporacion, como
sucede con los disolventes adicionales.
Los procesos que emplean FSC son, en general, mas caros que los convencionales debido
a costo de la etapa de compresion y del confinamiento de los fludos.
6.6
Forma e inyecci
on de la muestra
La introduccion del liquido en CFS es similar a la inyeccion en HPLC. Las muestras en fase
gaseosa no son adecuadas para CFS. Los solidos se extraen con los FSC y se concentra el
64
E.Lans
extracto. El tipo de muestra que se emplea en CFS con mayor frecuencia es una solucion.
6.7
Columnas y fases estacionarias
Las columnas para CFS son practicamente iguales a las de HPLC y algunas columnas en
GC. Son de acero inoxidable, y se empacan con partculas de 5 m; los calibres peque
nos
de 250 y 530m son los mas comunes. Las fases estacionarias pueden ser del tipo que
se emplean en HPLC normal o fase reversa: slica porosa, al
umina y slica con grupos
organicos enlazados.
6.8
Detectores
Los detectores de gases FID y UV en HPLC deben estar construidos para funcionar
con el volumen relativamente grande de gas que se produce al despresurizar el fludo
supercrtico. Los detectores similares a los que se utilizan en HPLC se modifican para
tolerar las presiones necesarias para mantener a los fludos supercrticos.
6.9
Areas donde se utilizan los fludos supercrtico
Un area de reciente interes en la aplicacion de los FSC es la de los procesos de descontaminaci

on o desctrucci
on de residuos t
xicos. Suelos o sedimentos fluviales contaminados con pesticidas, como DDT y otros contaminantes organicos han sido tratados
exitosamente con CO2 , mientras que fenoles y productos relacionados han sido extrados
eficientemente de disoluciones acuosas.En lo relativo a los desechos toxicos, el agua supercrtica presenta una ventaja respecto a la incineracion, ya que esta u
ltima requiere
o
temperaturas hasta de 1, 200 C, provacando la emision de sustancias que contaminan el
ambiente, entre ellos las dioxinas producidas por la incineracion incompleta especialmente
las aromaticas policloradas.. Utilizando agua supercrtica a unos 500o C y en presencia
de un oxidante es posible quemar sustancias organicas completamente en una reaccion
termicamente autosostenida, produciendo solo nitrogeno, dioxido de carbono y otras sustancias inorganicas. El inconveniente radica en la alta corrosividad del agua supercrtica
sobre los materiales utilizados, lo que obliga a utilizar aleaciones especiales encareciendo
el proceso.
Otrs areas de utilizacion de FSC son los metodos analticos separativos en cromatografa
utilizando fludos supercrtico, obtenci
on de productos naturales y alimenticios(extraccion
de aceites vegetales y grasa de semillas, drogas de plantas, aromas,sabores, perfumes
65
y especias, eliminacion de nicotina del tabaco).separaci

on de hidrocarburos pesados(desasfaltado de las fracciones pesadas del petroleo, recuperacion y purificacion de
lubricantes, licuefacion del carbon etc.) regeneraci
on(carbon activado, adsorbentes, filtros y catalizadores)agua potable a partir de agua de mar(oxidacion de corrientes
acuosas que contienen productos organicos).
Captulo 7
ELECTROFORESIS
7.1
Introducci
on
Una separacion electroforetica se lleva a cabo inyectando una peque

na parte de la muestra
a una disolucion tampon que esta alojada en un tubo estrecho o en un medio de soporte
poroso y plano, como un tubo estrecho, papel o un gel semisolido. Seguidamente se aplica
un elevado potencial de corriente continua a traves del tampon mediante dos electrodos
situados en los extremos del tampon. El potencial impulsa los iones de la muestra a migrar
hacia uno u otro extremo de los electrodos. La velocidad de migracion de un especie dada
depende de su carga y su tama
no.
Las separaciones en consecuencia se basan en las diferencias en la relacion tama
nocarga entre los diferentes analitos presentes en la muestra.Cuanto mayor es esta relacion
mas rapido migra un ion en el seno del campo electrico. La separacion se lleva a cabo en
un medio tamponado que act
ua simultaneamente como conductor de la corriente electrica
y controlando o fijando la carga electrica de las sustancias a analizar
7.2
Electroforesis
El termino electroforesis se emplea para describir aquellas tecnicas de separacion que se

basan en la diferente movilidad que tienen las partculas cargadas en el interior de un
campo electrico. Es un metodo de separacion que se basa en la diferente velocidad de
migracion de las especies cargadas, en el seno de una disolucion amortiguadora, a traves
de la cual se aplica un campo electrico constante.
El parametro mas importante de esta tecnica es el campo electrico,(E) definido como
el voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de separacion, de acuerdo a esto
prodramos decir que cuanto mayor sea el campo electrico aplicado mayor sera la res66
67
Electroforesis
olucion que se podra obtener, puesto que mayor sera al velocidad de migracion de los
diferentes componentes de la muestra no obstante a campor electricos elevados, la corriente electrica que circula por el medio de separacion va a ser alta y como consecuencia
se va a generar una cantidad de calor. Este calor es un inconveniente por varias razones
a la hora de llevar a cabo una separacion por que puede generar gradientes de temperaturas, flujos de conveccion del tampon que dificultara la separacion, desnaturalizacion de
protenas o perdidas de actividades enzimaticas etc.
Para solucionar estos problemas generados por el calor se han utilizado varios procedimientos, entre ellos trabajar a campos electricos bajos, pero podramos obtener tiempos
de separacion muy grandes y mala resolucio. trabajar con medios anticonvectivos, como
los geles de poliacrilamida o garosa que de acuerdo a su naturaleza microporosa son resistentes a la circulacion del tampon. trabajar a campos electricos altos pero la separaci
on
se da dentro de un capilar relleno de tamp
no esto u
ltimo dio origen a la electroforesis
capilar
7.2.1
Tipos de electroforesis
Existen dos tipos de electroforesis, electroforesis capilar y la electroforesis convencional.
7.2.2
Electroforesis convencional
Es utilizada para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interes biologico
y bioqumico.
En la electroforesis convencional, las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semisolido y poroso que contiene un tampon acuoso en el
interior de sus poros. En estas placas se pueden separar varias muestras simultaneamente
como en cromatografa en capa fina. Las muestras se disponen como manchas o bandas
sobre la placa y se aplica el potencial de corriente continua, a traves de la placa, durante
un perodo de tiempo fijo. Cuando creemos que las separaciones se ha completado se
interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se ti
nen para visualizarse.
La velocidad de migracion de un ion en centmetros por segundo, en el seno de un campo
electrico es igual al producto de la intensidad del campo electrico por la movilidad electroforetica.
= e E
(7.1)
E(V cm1 )
e (cm2 V 1 S 1 )
La e (movilidad electroforetica) es directamente proporcional a la carga del analito e
68
E.Lans
inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento. El potencial electrico

act
ua sobre los iones por lo que se moveran a traves del tampon. Las especies neutras no
se separan.
Para iones del mismo tama
no la fuerza impulsora sera mayor en el de mayor carga,
y tendra una movilidad de migracion mas rapida. Para iones que tengan igual carga la
velocidad de migracion sera mas rapida en el ion mas peque
no. La relacion tama
no-carga
de los iones cambiaran estos efectos.
7.2.3
Electroforesis capilar
La electroforesis convencional es lenta y laboriosa y ademas no proporciona resultados

cuantitativos precisos.
La electroforesis capilar da lugar a separaciones con vol
umenes de muestra de 0.1 a 10
nL, contrario a la convencional que usa volumen de uL.
Aqu en vez de colorear, para identificar la sustancia se utilizan detectores cuantitativos
como los empleados en HPLC.
Velocidad de migraci
on
La velocidad de migracion depende de la intensidad del campo electrico aplicado. El
campo electrico (E) se determina por la magnitud del potencial aplicado (V en voltios) y
la longitud sobre la que se aplica.
= e
V
L
(7.2)
Factores que determinan la resoluci

on en electrofor
esis capilar
N
umero de platos:
En cromatografa tanto la difusion longitudinal como la transferencia de masas contribuyen al ensanchamiento de la banda. Como en electroforesis esta implicada una sola
fase, solo se considera la difusion longitudinal. Para electroforesis el n
umero de platos
(N) viene dado por la siguiente expresion
N = e
V
2D
(7.3)
D = Coeficiente de difusion del soluto en cm2 S 1

Como la resolucion se incrementa al aumentar el n
umero de platos, se debe aplicar un
69
Electroforesis
elevado potencial para obtener mayores separaciones. Observese que aqu el n

umero de
plato no se incrementa con la longitud de la columna.
La electroforesis capilar genera normalmente un n
umero de platos comprendido entre
100.000 y 200.000 comparados con los 5.000 y 20.000 obtenidos en HPLC.
Flujo electroom
ostico
Cuando se aplica un potencial elevado a traves de un capilar que contiene un tampon, se
origina un flujo llamado, flujo electroosmotico, gracias al cual el solvente migra hacia el
anodo o el catodo.
La causa del flujo electroosmotico es la doble capa electrica que se forma en la interfase
slice/disolucion. Figura 7.1
A valores de pH por encima de 3 la pared interna de un capilar de slice presenta
carga negativa debido a la ionizacion de los grupos silanoles (SiOH) de la superficie.
Los cationes del tampon se agrupan sobre la superficie negativa de capilar de slice para
formar la doble capa electrica.
Los cationes que estan en la capa exterior de la doble capa, son atrados haca el catodo,
y dado que los cationes estan solvatados arrastran el resto de la disolucion con ellos a lo
largo del capilar. La electroosmosis conduce un flujo en la disolucion que tiene un perfil
plano, perpendicular al capilar, contrario del perfil parabolico del flujo en cromatografa
lquida, cuyo origen es la presion. Debido a este perfil plano el flujo electrosmotico no
contribuye al ensanchamiento de banda de manera significativa, como s ocurre con el
flujo producido por la presion en HPLC. Figura 7.2.
Aunque los analitos migran seg
un su carga dentro del capilar, la velocidad del flujo
electrosmotico es normalmente suficiente como para arrastrar todos las especies cargadas
positivamente, los neutros y los cargados negativamente hacia el mismo extremo del capilar, de tal forma que todos ellos pueden detectarse al pasar por un punto com
un. El
electroforegrama es similar a un cromatograma. La velocidad de flujo electrosmotico
viene dada por una ecuacion similar a la anteriormente vista, esto es:
= eo E
(7.4)
En presencia de la electroosmosis la velocidad de un ion es la suma de su velocidad de

migracion y de la velocidad del flujo electrosmotico as:
V = (eo + e )E
(7.5)
e = En caso de un anion tendra signo negativo

Como consecuencia de la electroosmosis, el orden de elucion en una separacion por electroforesis capilar tpica es:
70
E.Lans
Figura 7.1: Flujo electroosmotico
Figura 7.2: Perfil del flujo electroosmotico
Electroforesis
71
Primero los cationes mas rapidos, seguido de los mas lentos, segundo las especies
neutras en una zona y finalmente los aniones. Figura 7.3
En algunos casos la velocidad de flujo electrosmotico no es lo bastante grande como
para superar la velocidad a la cual se mueven algunos aniones hacia el anodo, en cuyo
caso estas especies se desplazan hacia el a
nodo.
7.2.4
Cambio de sentido del flujo electroosm

otico
Se logra agregando un tensoactivo cationico al tampon. El tensoactivo se adsorbe sobre

la pared del capilar y hace que esta quede cargada positivamente. Ahora los aniones del
tampon se agrupan en las proximidades de la pared y son arrastrados hacia el anodo,
electrodo positivo.
Esta estratagema se usa a menudo para acelerar la separacion de los aniones.
El flujo electroosmotico puede ser eliminado recubriendo la pared interna del capilar con
un reactivo como el trimetilclorsilano para eliminar los grupos silanoles de la superficie.
7.3
Instrumentaci
on
Consta de un capilar de slice fundida con 10-100 m de diametro interno de 40 a 100

cm. de longitud y que esta lleno de un tampon conectado entre si por dos recipientes que
contienen el mismo tampon, que tambien contienen dos (2) electrodos de platino.
La introduccion de la muestra se lleva a cabo por uno de los extremos y la deteccion
por el otro extremo.Figura 7.4
7.3.1
Introducci
on de la muestra
Inyecci
on electrocin
etica
Un de los recipientes del capilar se retira con su respectivo electrodo. Luego este extremo
es sumergido en el recipiente donde se encuentra la muestra y se le aplica un potencial
determinado hasta que la muestra penetre en el capilar debido a la actuacion conjunta de
los fenomenos de migracion ionico y flujo electroosmotico. Luego el extremo retirado se
coloca nuevamente en la solucion tamp
on original donde se mantiene durante el proceso de separacion.Figura. 7.5
Inyecci
on por presi
on
Se retira un extremo del capilar y se introduce en el recipiente de la muestra, a la cual se le
aplica una diferencia de presion. Esta diferencia de presion proviene de aplicar vacio en el
72
E.Lans
Figura 7.3: Direccion del flujo electroosm

otico
Figura 7.4: Componentes b

asicos de un sistema de electroforesis capilar
73
Electroforesis
Figura 7.5: Metodos de introducci

on de muestra
extremo del detector o de la aplicacion de presion en el recipiente que contiene la muestra,

o bien por elevacion del extremo que contiene la muestra. En ambos casos el volumen
inyectado se controla por la duracion de la inyeccion. 5-50 nL son los mas comunes.
7.4
Sistema de detecci
on
Los detectores son similares en dise

no y funcion a los utilizados en HPLC. La diferencia
esta en el comportamiento de estos; en electroforesis capilar cada ion migra a una velocidad
determinada debido a su movilidad electroforetica. Por tanto las bandas del analito llegan
al detector a diferentes velocidades, lo que hace que las areas de los picos sean dependientes
del tiempo de retencion. En cambio en HPLC todas las especies pasan a traves del detector
a la misma velocidad de la fase movil, as que las areas de los picos son independientes
de los tiempos de retencion.
7.4.1
M
etodos de absorbancia
El camino optico para las medidas de absorbancia es muy peque

no, y para mejorar estas
medidas se han propuestos varios metodos.
1. a) Celda tipo Z de 3 mm: Se dobla el extremo del calpilar para aumentar el
camino optico
74
E.Lans
2. b)Celda de tipo burbuja de 150 m: Se forma una burbuja cerca del capilar
3. c) Celda de reflexiones m
ultiples: En el extremo del capilar se deposita un
recubrimiento de plata reflectante , y la radiacion experimenta numerosas reflexiones
antes de salir del capilar. Figura.7.6
7.5
Modalidades de la electroforesis capilar
La electroforesis capilar es el nombre generico para una familia de tecnicas relacionadas

que tiene su origen en la electroforesis capilar por zona (CZE) y son: electroforesis capilar por gel(CGE), enfoque isolectrico capilar(CIEF), cromatografa capilar miscelar electrocinetica (MECC) y la isotacoforesis capilar(CITP). Aunque las tecnicas difieren signicativamente una de otras, se pueden llevar a cabo con la misma instrumentacion basica.
7.5.1
Electroforesis capilar por zona (CZE)
La composicion del tampon es constante en toda la zona de separacion. El potencial

aplicado hace que los diferentes componentes ionicos de la mezcla migren cada uno seg
un
su propia movilidad y se separen en zonas.
7.5.2
Electroforesis capilar en gel (CGE)
Se lleva a cabo en una matriz polimerica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla tampon en la que se lleva a cabo la separacion.
7.5.3
Isotacoforesis capilar
Las bandas de todos los analitos migran finalmente a la misma velocidad, por eso recibe
el nombre de ISO, igual y TACO velocidad. La razon por la cual todas las bandas se
mueven a la misma velocidad es que el potencial se hace mas reducido para las bandas
mas moviles, y se hace mas intensa para las bandas mas lentas, de tal forma que la
corriente es la misma en todas las zonas del tampon. (A. & F.J 1999)
Electroforesis
75
Figura 7.6: Dise

nos de celda para mejorar la sensibilidad de detecci
on por medida de absorbancia
aumentando el camino optico
Bibliografia
A., B. & F.J, S. (1999), Chromatographic Methods, fifth edn, Kluwer Academic Publishers.
Esteban, L. (1993), La Espectrometra de masas en imagenes.
Harris, D. C. (1999), Quantitative Chemical Analysis, Vol. 1, 5a edn, W.H.Freeman and
Company, New York.
McNair, H. M. & Miller, J. M. (1998), Basic Gas Chromatographic, 1 edn, John Wiley
and Sons, INC.
Skoog, D. A. & Holler, F. (1998), Principles of Instrumental Analysis, Vol. 1, fifth edition
edn, Harcourt Brace and Company, Orlando Florida.
76
Indice Alfab
etico
Adsorbentes, 20
Aplicaciones, 48
Asimetra, 8
Co-cromatografa, 37
Coeficiente de difusion, 14
Coeficiente de particion, 6
Columnas, 51
empacadas, 28
tubulares abierta, 26
Columnas analticas, 52
Constante de distribucion, 7
Constante RF, 25
Cosolventes, 63
Cromatografa, 1
capa fina, 20
de fludos supercrticos, 3
de gases, 2
fase reversa
fase normal, 53
lquida, 2
plana, 2
Cromatografa de adsorcion, 54
Cromatograma, 4
cut-off, 58
Desorcion, 43
desorcion, 41
Detector, 45
FID
ECD, 31
Fotometrico de llamas, 33
TCD
NPD, 32
Difusion, 68
Dioxinas, 64
Eficiencia, 10, 51
Electroforeris
capilar por zona
en gel, 74
Electroforesis
capilar, 68
convencional, 66
Eluato, 4
Elucion, 52
Eluyente, 4, 22
Factor de capacidad, 4
Fludo supercrtico, 61
Flujo electrosmotico, 69
fuerza del eluente, 52
Fuerzas
ionicas
enlaces de hidrogeno, 9
repulsion
Van Der Walls, 9
Gradiente, 56
Inyeccion
on column, 36
por presion
electrocinetica, 71
split
77
78
splitless, 36
Ionizacion
por bombardeo de atomos rapidos
electrospray, 44
por campo, 43
qumica
quimca negativa, 41
ionizacion, 44
EI, 41
ionizacion impacto electronico, 41
ionizacion por campo, 41
ionizacion qumica, 41
Isotacoforesis, 74
Isoterma, 16
Labil, 63
Metodos
qumicos
fsicos , 24
Masas, 40
N
umero de plato, 69
optimizacion con solventes, 58
Placas, 21
Plato teorico, 11
Presion crtica, 61
Punto crtico, 61
Resolucion, 12, 57, 68
Resolucion de una columna, 3
Retencion relativa, 4
Separacion, 1, 59
Solventes, 56
Supercrtico, 63
supercrtico, 64
Tailing, 8, 53
Tandem, 47
E.Lans
Temperatura crtica, 61
Tiempo
muerto
retencion ajustado, 5
Van Deemter, 14

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2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

2.2.1 Proceso de adsorcion . .

4.9 Bombardeo por Atomos

6 CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS

Electroforesis capilar en gel (CGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

2.1 Placa cromatografica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Ionizacion por impacto electronico . .

fase inversa.(Fase movil de

7.1 Flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

Este tipo de metodos se clasifican como electroseparaciones.

Los metodos cromatograficos son de dos tipos

Los metodos cromatograficos se clasifican seg

Gas-Lquido:La fase estacionaria es un lquido y la fase movil es un gas.

Lquido-Lquido o de reparto:La fase estacionaria es un lquido.

Figura 1.1: Cromatografa en columna

Cromatografa de fludos supercrticos

Fase movil es un fludo supercrtico.

Altura de plato H : Es una medida de la eficiencia de una columna.

Factor de capacidad(K ):Es un parametro importante que con frecuencia se utiliza

De un cromatograma se puede calcular K de la siguiente ecuacion, teniendo en cuenta

Con esta ecuacion se puede calcular KA para un compuesto A desde un cromatograma.

K = Constante de distribucion, razon de distribucion o coeficiente de distribucion. Cs =

= velocidad lineal media del movimiento de las moleculas de la fase movil

Cuando el factor de capacidad K de una especie dada es menor que la unidad, es

Para verificar la eficiencia de una columna es bueno monitorear perodicamente mediendo

moles de analito en la fase movil

La definicion del factor de capacidad es equivalente a decir:

Donde Cs es la concentracion de soluto en la fase estacionaria, Vs volumen de la fase

V = fraccion de tiempo que el analito reside en la fase movil

La asimetra de un pico puede tener distintas causas: Aplicacion de un exceso de analito,

Tipos de fuerzas que est

En un sistema cromatografico existen varios tipos de interacciones a saber:

Figura 1.2: Asimetra de un pico cromatografico

Fuerzas de enalce de hidr

Ocurren entre molelculas que tienen el hidrogeno unido a un peque

Fuerzas de Van Der Walls

Las fuerza de Van Der Walls son de tres tipos:

Bases fsicas de la cromatografa

Existen dos factores que contribuyen a la eficiencia de una separacion:

Donde H es la altura de plato,

Si usamos la achura de la altura media en vez de la base, entonces:

La ecuacion anterior se deduce teniendo en cuenta la figura 1.3 y usando la anchura de la

Factores que afectan la resoluci

Figura 1.4: Resolucion de un cromatograma

se incrementa cuando aumenta y el factor de capacidad K2, .

De donde D es el coeficiente de difusion, y el signo negativo se debe a que el flujo neto va

Figura 1.5: Ensanchamiento de banda debido a la difusi

H= altura de plato en cm A= termino de los m

K = factor de capacidad d = espesor de la fase estacionaria D = coeficiente de difusion

Figura 1.6: Aplicacion de la ecuaci

Figura 1.7: Isotermas comunes y formas de las bandas

Figura 1.8: Silanizaci

Las columnas de vidrio o de slice usadas en cromatografa de gas o lquida tambien

1. Considere un experimento cromatografico en la cual dos componentes con factores

31,1 respectivamente. Calcular el porcentaje de cada compuesto si las respectivas

Ventajas de la cromatografa en capa fina

1. La instrumentacion utilizada es mas simple.

Al elegir un adsorbente se debe tener en cuenta el tama

Cromatografa en capa fina