Ao de la consolidacin econmica y social del Per

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGIA

TECNICAS DE COLORACION

DOCENTE: Angel castro

ASIGNATURA: Microbiologa
CICLO: III
ESTUDIANTES:

Acosta Gonzales, Karina

Paz cruz, Luis
Rodrguez bayona, stefanny

Nuevo Chimbote, mayo del 2011

PRACTICA DE LABORATORIO N 05

TECNICAS DE COLORACION
INTRODUCCION:
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de
ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre
la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es
la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms
corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se
realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos,
tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las
clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo
que es realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o
teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con
frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los
cidos nuclicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catatnicos son
el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas
cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la
eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos
de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o
depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr
atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la
microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de

metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas
rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles
celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en
muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se
dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por
tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es
un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de
partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua).
La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las
clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la
presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman
en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares
autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el
mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse
muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al
creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

OBJETIVOS:

Realizar adecuadamente una coloracin simple de bacterias y de levaduras

de una muestra microbiana.
Ejecutar eficientemente una coloracin gram de una suspensin bacteriana.
Ejecutar adecuadamente una coloracin negativa de una suspensin
bacteriana.
Diferenciar la bacteria cida y no cido alcohol resistentes.
Obtener destrezas para observar ntidamente las lminas preparadas con
coloracin simple y coloracin gram

PROCEDIMIENTO:

1. COLORACIN SIMPLE

Flamea la aza bacteriolgica frente a un mechero hasta el rojo vivo. Esperar

que se enfre:

Colocar dos azadas de la suspensin de bacillus subtilis, en forma asptica

en el centro de la lmina portaobjetos.

Proceder a fijarlo pasando el portaobjeto tres veces por la llama del

mechero, cuidando que solo el lado opuesto del frontis est en contacto con
la llama, dejar enfriar.

Agregar el colorante de cristal violeta encima de la muestra seca durante

un minuto.

Observar en el microscopio con los objetivos 10x, luego con 40x y 100x

2. COLORACION GRAM:
Flamea la aza bacteriolgica frente a un mechero hasta el rojo vivo. Esperar
que se enfre:

Colocar dos azadas de la suspensin de bacillus subtilis, staphylococus y

bacillus en forma asptica en el centro de la lmina portaobjetos.

Agregamos a las tres muestras, el colorante de cristal violeta encima de la

muestra seca durante un minuto.

Posteriormente le agregamos a las tres muestras lugol:

Lavar e inmediatamente agregar unas cuantas gotas de safranina, volver a

lavar y llevar al microscopio para ser observado a 100x.

RESULTADOS:

E.coli
Objetivo: 40x

Staphylococus
Objetivo: 40x

Bacillus
Objetivo: 40x

DISCUSIONES:
Curtis (2000), nos dice que las clulas deben ser teidas porque la cantidad de
interferencia producida cuando la luz atraviesa las diferentes estructuras de una
clula no es grande y el contraste que se detecta es escaso. Gavio et al. (2004),
menciona que los mtodos de coloracin vital constituyen un procedimiento
intermedio entre el examen fresco y las tcnicas de coloracin despus de la
fijacin, con las coloraciones vitales se hacen visibles ciertas estructuras, sin
causar o causando poca alteracin fisicoqumica del protoplasma, es decir, en cierta
manera se deja intacta la vitalidad celular. En la prctica utilizamos diferentes
colorantes para diferenciar estructuras y reconocer diferentes clulas.

Wistreich (1983), nos dice que la diferenciacin de Gram se basa en el color que
adquieren las bacterias cuando se tratan con el colorante Cristal Violeta seguido
por una solucin yodo yodurada de potasio. Ciertos organismos pierden la coloracin
violeta con suma rapidez cuando se aplica el alcohol etlico, en tanto que otros la
pierden con ms lentitud, despus de la coloracin se usa una coloracin de
contraste casi siempre safranina. Las bacterias resistentes a la decoloracin
conservan una tonalidad azul clasificndose como organismos Gram (+), los
microorganismos que no pueden retener la tincin con cristal violeta, toman

la

coloracin de contraste y, por ende, presentan una coloracin rosa o roja; a estos
organismos se les denomina Gram (-). Nosotros observamos que en la coloracin
Gram que se hizo al sarro dentario la coloracin sali Gram (+).
Gavio et al. (2004), nos dice que la mayora de los colorantes son compuestos
orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares.
Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos
de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan
con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas
protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro
grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se
combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar
la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudn.

CONCLUSIONES:

En la coloracin simple se utiliza un solo colorante.

Las bacterias Gram positivas se tien de color violeta.
Las bacterias Gram negativas se decoloran y presentan un color rojo-

rosado.
Los colorantes son indispensables para la diferenciacin de las estructuras

celulares y organismos.
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan
difciles de ver con el microscopio ptico.

La principal dificultad de la notoriedad de la clula es la falta de contraste

entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el

contraste es la utilizacin de colorantes.

Los colorantes pueden emplearse para distinguir diferentes estructuras de
las clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros
de actividad respiratoria, etc.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Curtis et al. 2002. Biologa 6taedicin. Edit. Panamericana. Madrid Espaa
Nason. A. 2006. Biologa. Edit. Limusa. Mxico
Gavio et al. 2004. Tcnicas Biolgicas selectas de Laboratorio y de Campo.
Edit. Limusa. Mxico
Wistreich et al. 1983. Prcticas de laboratorio en microbiologa. Edit. Limusa.
Mxico

PREGUNTAS
1. Por qu se dice que la coloracin Gram es una coloracin diferencial?
La coloracin diferencial es aquella donde usas ms de un colorante. Con
esta tincin se podr observar la morfologa, tamao, organizacin de las
bacterias y adems categorizar los microorganismos en varios grupos, segn
su afinidad con el colorante que utilicemos. Hay varios tipos de tincin
diferencial pero las que uno ms usa son la TINCION DE GRAM O
COLORACION DE GRAM y la COLORACION DE ZIEHL NEELSEN.
Es decir la coloracin Gram es un tipo de coloracin diferencial.

2. Menciones 05 gneros microbianos de bacterias Gram positivas y 05 Gram

negativas.
GRAM POSITIVAS:
Micrococcus
Arthrobacter
Actinomyces
Nocardia
Mycobacterium
GRAM NEGATIVAS:
Chlamydiales
Enterobacteriaceae
Edwardsiella tarda
Enterobacter
Escherichia coli
3. Qu tipo de estructuras se colorea en la coloracin simple?
La tincin simple se utiliza para observar la morfologa de las clulas y el
arreglo en el crecimiento de las bacterias.
4. en una coloracin Gram, que tipo de color adquirirn las esporas de Bacillus
subtilis?
Adquirirn un color medio violceo.
5. Mencione 3 gneros microbianos distintos que son acido alcohol resistente.
El gnero Nocardia, Mycobacterium y Bacillus
6. Cmo observaras los grnulos de poli-beta-hidroxibutirico PHB?
Muchos microbios acumulan grnulos de polifosfato; se tien con azul de
toluidina y reciben el nombre de Grnulos de poli-beta-hidroxibutirico PHB
la mejor manera de observarlos seria por la coloracin Gram.