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EXTRACCIN DE ADN Y VISUALIZACIN DEL ADN.

GUTIERREZ MERA, y RENGIFO BERATE;

danny_0920@hotmail.com; andrebernate1243@hotmail.com
Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales, Programa Qumica Farmacutica,
Laboratorio de Bioqumica
Santiago de Cali, Colombia

1. RESULTADOS
2. En esta prctica se realiz la
extraccin de ADN a partir de
clulas humanas de la mucosa
oral; que posteriormente se
visualizaron
en
el
espectrofotmetro. Para llevar a
cabo este proceso primero se
recolect 5mL de saliva, de los
cuales se utiliz 2,5mL de esta,
para la debida extraccin y
visualizacin del ADN. Se realiz
con xito el debido protocolo de
adicin de 2,5mL de SDS al 10 %,
50L de solucin de NaCl 5M
(agitar), y 10mL de etanol al 96%
lo cual hace que el ADN se
deshidrate, es decir, pierda
contacto con las molculas de
agua que lo rodean, y lo asla de
la solucin acuosa para dejarlo
libre de impurezas1. Luego se
pudo observar en el tubo falcon
una especie de telaraa de color
blanco con un aspecto pegajoso,
que
formaba
una
mezcla
heterognea con la disolucin de
los reactivos, que tericamente

corresponda al ADN debidamente


extrado (imagen 1).

3.
4. Imagen 1. Condensacin del DNA,
despus de haber agregado SDS y NaCl.
5.

Al esperar que la muestra se


seque completamente se adiciono
1 mL de Buffer TE y se agito la
muestra permitiendo que la doble
hlice se hidratara para poder
proceder al NanoDrop. Para
calcular la concentracin de DNA
(dobles
cadena
o
cadena
sencilla),
se
utiliz
la
espectrofotmetro NanoDrop 2000
y 2000c, son espectrofotmetros
de UV visible de espectro

completo
utilizados
para
cuantificar y evaluar la pureza de
ADN,
ARN,
protenas,
etc.
NanoDrop 2000 y 2000c son los
nicos espectrofotmetros de
micro volmenes con tecnologa
de
retencin
de
muestras
patentada que miden volmenes
de muestras tan pequeos como
0,5 l. 2

27. 260/23
0
30. Baseli
ne
correct
ion

28. 0,39
31. 340nm

32.

33.
34.

6.

Posteriormente se extrajeron 5
L del ADN obtenido, junto con el de
otros grupos, y se pas a un gel que
contena agarosa al 1%. Se
adicionaron 1 L de SYBR Green, el
cual es un compuesto orgnico que
se asocia a la molcula de ADN,
interactuando con la hendidura
menor del ADN. Esta molcula se
introduce en la estructura secundaria
de la doble hlice del ADN y se
acopla energticamente a los cidos
nucleicos que lo forman, de manera
que se incrementa la tasa de emisin
fluorescente.3
7. TABLA
1.
Datos
obtenidos
espectrofotmetro NanoDrop.

8. Simpl
e ID
11. Type
14. Conc.
17.

9. l

10.

12. ssDNA
15. 71,7ng
/l
18. A260
(10mm
path)
21. A280
(10mm
path)
24. 260/28
0

13. 33,00
16.
19. 2,173

22. 1,830

25. 1,19

en

35. Imagen 2. Grafica obtenida en


muestra que fue depositada en
NanoDrop.

la
el

36. ANALISIS DE RESULTADOS


37. El ADN es una molcula presente
en todas las clulas de los seres
vivos y es la encargada de
codificar todo lo que nosotros
somos, desde el color del pelo
hasta las protenas que tenemos
en nuestra sangre. El ADN es una
molcula cargada que est
asociada a protenas y en el caso
de los organismos eucariontes
est encerrado dentro de un
ncleo. Para extraer el ADN
primero es necesario romper las
clulas y luego se necesita

separar el ADN del resto de los


componentes celulares como
protenas y membranas lipdicas.
Un detergente es una solucin
capaz de disolver las membranas
y as permitir que stas se
separen del resto de los
componentes.
Adems
este
detergente es capaz de unir las
protenas que estn junto al ADN.
La sal de mesa tiene un catin
que se une a la molcula de ADN
y
hace
que
cambie
sus
propiedades
qumicas,
permitiendo que el ADN precipite
en presencia de alcohol. El
alcohol adems disuelve los
azcares y protenas4.
En
nuestra extraccin de ADN se
utiliz el SDS como detergente
para
poder
disolver
las
membranas, luego se le agrego
50 L de cloruro de sodio 5M que
junto con el etanol al 96%,
precipitaron al ADN para poder
visualizar. El SDS es un
detergente aninico que se utiliza
para la ruptura de la membrana
celular,
contribuye
a
la
desnaturalizacin de las protenas
y al aislamiento de los cidos
nucleicos. En cambio el cloruro de
sodio se emplea para prevenir la
contaminacin de la muestra con
polisacridos que afectan la
pureza del ADN, pudiendo inhibir
la actividad de algunas enzimas
como polimerasas, ligasas, etc.
aumentan el poder inico de la
solucin y pueden ocasionar la
precipitacin del ADN. El cloruro

de sodio puede ser usado si hay


SDS en la solucin ya que esta
sal
permite
que
el
SDS
permanezca en solucin en
presencia de etanol 5.
38. Durante la prctica se extrajeron
10 L del ADN obtenido, junto con
el de otros grupos, y se pasaron al
gel que contena agarosa al 1%,
Se adicionaron 10 L de SYBR
Green y se llev a la cmara de
electroforesis, solo se observ
unas pequeos puntos, y unas
cuantas bandas, esto se debe
probablemente a que el SYBER
Green siendo un tinte que se une
a la estructura secundaria de la
doble hlice del ADN y se acopla
energticamente a los cidos
nucleicos que lo forman, emite
fluorescencia.
39. El
nanodrop
es
un
espectrofotmetro de espectro
total (220-750nm) que mide
concentraciones con 1 l de
muestra, con gran exactitud y
reproductibilidad.
Los
cidos
nucleicos absorben eficientemente
luz ultravioleta debido a la
presencia de bases nitrogenadas
a lo largo de las cadenas de ADN.
Esta absorcin nos sirve para
determinar su concentracin, ya
que cada una de las bases tiene
su propio y nico espectro de
absorcin y, por lo tanto,
contribuyen de manera distinta a
la absorcin de UV de una
molcula de ADN6. En este caso

la muestra tiene un orden de


absorbancia en el ADN de 2,17 a
260 nm y una concentracin de
71,7ng/l,
por otro lado la
absorbancia de las protenas a
280nm fue de 1,83; los datos
anteriores
nos
ayudan
a
determinar qu tan contaminada
esta la muestra dado que la
solucin
de
ADN
absorbe
parcialmente la luz a 280 nm y las
que contienen protenas hacen lo
propio a 260 nm, el cociente de
los valores obtenidos a 260 nm y
a
280
nm
(A260/A280)
proporciona una estimacin del
grado de pureza de los cidos
nucleicos
calculando
dicho
cociente 260/280= 1,19, a partir
de esto decimos que la muestra
est contaminada, puesto que el
cociente respectivo para el ADN
es de aproximadamente 1,80 que
con respecto a la muestra se
encuentra muy por debajo de lo
esperado. Esta variacin pudo
haber ocurrido por una mala
extraccin de la muestra de ADN
o porque la muestra no se
40. desnaturaliz y por lo tanto se
encuentra rica en protenas,
polisacridos y otras partculas
presentes, lo cual llev a que no
se encontrara dentro del rango
establecido, ya que el detergente
que se le aplico solo rompa la
membrana sin causar otros
efectos.
41. La electroforesis en gel es una
tcnica que se emplea para

separar los cidos nucleicos y las


protenas. La separacin de las
macromolculas depende de dos
variables: carga y masa. En
determinados soportes, como el
gel de agarosa mostrado aqu, el
medio (gel) ofrece una resistencia
notable al avance de las
molculas, por lo cual la movilidad
depende mucho del tamao de la
molcula. Cuando una muestra
biolgica, como por ejemplo el
ADN, se mezcla en una solucin
tampn y se aplica a un gel, esas
dos
variables
actan
conjuntamente.
La
corriente
elctrica de un electrodo repele
las molculas, al tiempo que el
otro electrodo las atrae. La fuerza
de friccin del material de gel
acta como tamiz molecular,
separando las molculas en
funcin de su tamao7.
42. Durante la electroforesis, las
macromolculas son empujadas a
travs de los poros, dependiendo
su tasa de migracin por el campo
elctrico
de
los
siguientes
factores:
Fuerza del campo
Tamao y forma de las
molculas
Hidrofobicidad relativa de las
muestras
Fuerza inica y temperatura
del tampn en que se
desplazan las molculas.
43.
44. CONCLUSIONES
45.
Las muestras de ADN tienen
contaminacin variable, debido
a que no se le hizo la
adecuada
limpieza
a
la
muestra
de
protenas,

polisacridos
y
dems
sustancias.
Al igual, la concentracin de
ADN es baja, debido a errores
del laboratorio o posibles fallas
del nanodrop.
El transluminador uv presento
fallas al ir a observar la
fluorescencia del ADN en el gel
de agarosa.
El nanodrop tiene la capacidad
de medir muestras muy
concentradas, sin necesidad
de diluirlas.

46.
47.
48.
49.
1. Buscando a etanol 96%: [en
lnea]. [Citado 10 agosto 2015].
Disponible
en:
http://www.cienciaonline.com/2
007/03/10/extraccion-del-adnde-la-saliva/
5.
2. Buscando a NanoDrop: [en
lnea]. [Citado 10 agosto 2015].
Disponible
en:
https://www.thermoscientific.es
/product/nanodrop-20002000cspectrophotometers.html
6.
3. Buscando a SYBR Green: [en
lnea]. [citado 10 agosto 2015].
Disponible
en:
http://www.cultek.com/inf/otros/

50.
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52.
53.
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59. BIBLIOGRAFA
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65.
soluciones/Soluciones-QPCRprotocolos.pdf
7.
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4. Buscando extraccin del ADN:
[en lnea]. [citado 10 agosto
2015].
Disponible
en:
http://www.chilecientifico.cl/cie
ncia-divertida-informacion-

general-103/187-extraccionde-adn.html
22.
5. Buscando
mtodo
de
extraccin del ADN, utilizacin
del NaCl, SDS y Etanol: [en
linea]. [citado 10 de agosto
2015].
Disponible
en:
http://www2.inecc.gob.mx/publi
caciones/libros/530/cap16.pdf

23.
6.

Buscando absorcin de Uv en
el Nanodrop: [en lnea]. [citado
10 de agosto 2015]. Disponible
en:
http://www.juntadeandalucia.es
/agriculturaypesca/ifapa/export/
sites/aquagenet/textos/docs_te
xtos/mat_difusion_y_otros/Tesi
s_Master_Claudia.pdf