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INTRODUCCION
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos
mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber
luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que
tienen las protenas de unir ciertos colorantes. sensibilidades. Cada uno de estos
mtodos tiene sus ventajas e inconvenientes
Mtodos Derivados Colorimtricos:
Biuret:
Bastante especfico para protenas Muestra pocas interferencias Es barato Tiene
poca sensibilidad
Lowry:
Tiene bastante sensibilidad No todas las protenas reaccionan igual Muestra
muchas interferencias como detergentes no inicos, sulfato amnico etc.
Bradford:
Muy sensible Muestra interferencias con detergentes BCA Es el mtodo mas
sensible Es el que muestra menos interferencias (1)
Por lo cual tomando en estas caracteristicas se decidio tomar el metodo de
colorimetrico de Bradfor que se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue
G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe
en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para
formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que
el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y
pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que
interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.(2)
El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis
cualitativo y cuantitativo de molculas biolgicas. Esto quiere decir que este
instrumento nos ayuda a determinar cules sustancias (protenas, lpidos,
carbohidratos, cidos nucleicos, entre otras), estn presentes en una disolucin y
en qu cantidad. Los espectrofotmetros pueden emitir radiaciones de diferentes
longitudes de onda tanto en el ultravioleta como en el visible. Muchas sustancias
absorben radiacin a diferente longitud de onda (puede ser en el espectro visible o
en el ultravioleta), por tanto, cuando determinamos a qu longitud de onda
absorbe una sustancia desconocida, podemos tener idea de qu tipo de molcula
se trata. Esta misma propiedad se utiliza para cuantificar la sustancia: a mayor
cantidad de radiacin absorbida, mayor concentracin de sta. Si la sustancia no
absorbe radiacin en el ultravioleta o el visible, puede modificarse qumicamente
OBJETIVOS
METODOLOGA
Dnde:
Obteniendo
de la BADH.
Electroforesis
Se ensamblo en mdulo de electroforesis retirando el peine del gel y
enjuagando las pozas con agua destilada, se coloc el cassette del
gel en el bastidor de sujecin una vez hecho esto se agreg el
amortiguador. Posteriormente se prepararon las muestras y se
mezclaron en tubos eppendorf
de 5 ml los volmenes que se
obtuvieron en la quinta columna del cuadro; despus de esto se
aplic la muestra sobre el gen aplicando con cuidado las muestras
estndares y de PM desde el carril 2 hasta el 4 utilizando una micro
pipeta. Posteriormente se colocaron los geles en el interior del
tanque, se tap la cmara y se colocaron los electrodos de acuerdo a
su color, se conectaron los cables y se inici la corrida aplicando 200
V de manera constante.
Una vez terminada la corrida se apag la fuente de poder y se
desconectaron los cables, se retir la tapa y se recuper el
amortiguador, se retir del bastidor de sujecin el cassette con el gel
y se separ con cuidado las dos placas de vidrio, se despegue el gel
desde la placa de vidrio a la que est adherido.
Se retir el agua del recipiente y se fijaron las protenas cubriendo el
gel durante 15 min con Solucin fijadora. Se midi la distancia
recorrida por las protenas estndares y la enzima purificada;
despus se grafic el log del peso molecular de las protenas
estndares, que se proporcionaron en el cuadro, versus su distancia
de migracin; posteriormente se
calcul el PM de la protena
purificada interpolando su migracin relativa en la lnea patrn
obtenida con los estndares.
Resultados y anlisis
Concentracin
Absorbancia
0.078
10
0.132
20
0.147
40
0.182
60
0.306
80
0.312
120
0.528
160
0.639
200
0.649
(Exp)154.87
0.576
(ENZ) 66.15
0.285
En el caso de la actividad enzimtica obtenida por el equipo, esta fue casi nula,
esperando un registro mucho mayor, y en dicho caso se compar el contenido de
Trp y Tyr.
En relacin a la comparacin de diferentes mtodos (Cerna E., et al) opta que el
mejor es el mtodo de Brogdon, debido a que registr lecturas ms altas de
protena en las muestras en un estudio que abarca Evaluacin de mtodos de
cuantificacin de protenas en Tetranychus urticae para su uso potencial en la
deteccin de resistencia a plaguicidas.
Electroforesis
estimacin rpida del numero de protenas de una mezcla o del grado de pureza
de una preparacin proteca determinada. La electroforesis tambin permite la
determinacin de propiedades cruciales de una protena tales como su punto
isoelectrico y su masa molecular aproximada(Lehninger,2009).
Despues de analizar los resultados, se observa un bandeo muy tenue aparte de la
protena analizada, por lo que se dice que esta no esta 100% purificada.
Con base al marcador de peso molecular, se ve que estara entre 50 y 75 Kda.
El gel de poliacrilamida actua como tamiz molecular. Despues de la electroforesis
se utilizo el colorante azul de Coomasie, que se fija a las protenas pero al gel no.
Conclusin
La cuantificacin de la BADH por medio del mtodo de Bradford y por la
absorbancia de la BADH a 280 nm dieron resultados distintos, siendo 154.87
mg/ml y 226 mg/ml respectivamente, esto debido a que la reaccin del reactivo de
Bradford reacciona directamente con aminocidos especficos y las estructuras
terciarias de la protena a 595 nm , a diferencia del mtodo por absorbancia a
280nm, cuya lectura se da por medio de las tirosinas y los triptfanos.
Se determino que la pureza fue casi del 100% y el peso molecular fue de 50 y 75
Kda.
Cuestionario
1. Por qu cuando se cuantifica la protena con el reactivo de Bradford se
debe medir la absorbancia a 595 nm?
R= La unin del colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo
de absorcin del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se
basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en
dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en
azul cuando el colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la
diferencia de Absorbancias entre 595 nm.
2. Describa lo que es el coeficiente de absorcin molar de una molcula y la
relacin que existe entre ste y el contenido de Trp y Tyr de la protena
que aqu se purifica.
R= El coeficiente de absorcin molar es una medida de la fuerza con un tipo de
especie qumica que absorbe luz a una longitud de onda determinada; cabe
mencionar que ninguno de los 20 aminocidos hallados en las protenas absorbe
luz en la zona del espectro visible, tres de ellos la tirosina, el triptfano y la
fenilalanina, absorben luz en el espectro significativamente.
A partir de las unidades que interfieren entre las primera banda y la segunda
es su residuo de 70KDa que es parcialmente el mismo en ambas bandas, las
subunidades que se revelan son de uno de 70 KDa y tres de 45 KDa. Es un
tetrmero.
Bibliografia
(1)Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem. 72: 248-254.
(2)lson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid. An
al Biochem 150: 7685. Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editori
al, John Wiley & Sons, New York
(3) Gentica General. Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en
el opernlac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002
Lehninger, A., Nelson, D., Cox, M., Principios de bioquimica.Quinta edicion.
Editorial Omega. Espaa. Pp. 88-89Klug SW, Cummings RM. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999.
Pp. 5171. Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp.
115-125. Localizacin QH581.2 M 65
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.868-873.