UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOSSUPERIORES CUAUTITLN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS
SECCIN CIENCIAS DE LA SALUD HUMANA

MANUAL BSICO DE LABORATORIO

DE INMUNOBIOLOGA

BIOQUMICA DIAGNSTICA

Coordinador de Edicin y Revisin: Ladislao Palomar Morales

Edicin y Revisin: Fonseca Coronado Salvador, Martnez Sosa ngel Germn, Palomar
Morales Ladislao, Vega Lpez Marco Antonio, Romero Rojas Andrs, Gonzlez Ballesteros Eric

AGOSTO 2015

INDICE

Pgina
Programa de la asignatura

Calendario de prcticas

Reglamento general para los laboratorios

Seguridad en el laboratorio de inmunobiologa

Morfologa de las clulas del sistema inmunitario

14

Tcnicas de separacin y purificacin de clulas del sistema inmunitario

18

Fagocitosis

26

Pruebas de aglutinacin, precipitacin y turbidimetra

32

Modelos experimentales y vas de inmunizacin

36

Citometra de flujo

41

Ensayo Inmuno Enzimtico (ELISA)

47

Anatoma del sistema inmunitario

53

10 Histologa e inmunohistoqumica

56

11 Electroforesis en gel de poliacrilamida

64

12 Inmunoelectrotransferencia

71

Programa de la Asignatura

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS
SECCIN CIENCIAS DE LA SALUD HUMANA
CDIGO: FPE-CB-DEX-01-02

CALENDARIZACIN
N Revisin: 03

ASIGNATURA (1638) Inmunobiologa

SEMANA

GRUPO(S) 1601, 1652

FECHA
(SEMANAL)

SEMESTRE 2016-I CARRERA BQD

NMERO Y/O NOMBRE DE LA PRCTICA,

PROYECTO Y/O ACTIVIDAD

CUMPLI
SI

NO

OBSERVACIONES

1 13 y 14/08/2015 Presentacin del curso y organizacin de equipos

2

20 y21/08/2015 Seguridad en el laboratorio de inmunobiologa

3 27 y 28/08/2015 Morfologa de las clulas del sistema inmunitario

4 03 y 04/09/2015

Tcnicas de separacin y purificacin de clulas del

sistema inmunitario

5 10 y 11/09/2015 Fagocitosis
Pruebas de aglutinacin, precipitacin y
turbidimetra y primera inmunizacin
EXAMEN, Citometra de flujo y segunda
7 24 y 25/09/2015
inmunizacin
6 17 y 18/09/2015

8 01 y 02/10/2015 TEORA tercera inmunizacin

9 08 y 09/10/2015 ELISA
10 15 y 16/10/2015 Anatoma del Sistema Inmunitario
11 22 y 23/10/2015 Histologa e Inmunohistoqumica
12 29 al 30/10/2015

Electroforesis en gel de poliacrilamida,

Inmunoelectrotransferencia

13 05 y 06/11/2015 SEMINARIOS
14 12 y 13/11/2015 SEMINARIOS
15 19 y 20/11/2015 EXAMEN

SEM

16 26 y 27/11/2015
FECHA
(SEMANAL)

CUMPLI
OBSERVACIONES
SI NO

EXAMEN

7 24 y 25/09/2015 Primer examen de laboratorio

15 19 y 20/11/2015 Segundo examen de laboratorio*

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS
Fecha de revisin: 30/06/2014

REGLAMENTO GENERAL PARA LOS LABORATORIOS

N revisin: 03

1) Este reglamento aplicar para personal acadmico, alumnos y laboratoristas.

2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deber utilizarse bata blanca con manga larga y zapatos cerrados.
3) La tolerancia para el inicio de la sesin de laboratorio ser hasta de 10 minutos a partir de la hora sealada.
4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las prcticas.
5) En todo momento deber mostrarse una conducta adecuada en el rea de trabajo.
6) Queda prohibido en los laboratorios:
a) Tirar basura fuera del cesto.
b) Ingerir alimentos y/o bebidas.
c) Fumar.
d) Recibir visitas.
e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos.
f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios.
g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesin experimental.
h) Sentarse sobre las mesas de trabajo.
i) Mover el mobiliario de su lugar.
j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura.
7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal fin, entendiendo por residuo
peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos o mezclas de ellos que en cualquier estado fsico representan
un riesgo para el ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas,
txicas, inflamables o biolgico-infecciosas (Art. 3 de la Ley General del Equilibrio y Proteccin del Ambiente).
8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de telfonos celulares, reproductores de sonido o cualquier medio electrnico
de entretenimiento. El uso de las computadoras porttiles queda restringido a temticas relacionadas con la asignatura.
9) El acceso al laboratorio se permitir nicamente cuando est presente uno de los profesores del grupo.
10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deber programarse con el profesor responsable en un horario que no
interfiera con aquel destinado para el desarrollo de las prcticas.
11) Para solicitar material y equipo, es requisito indispensable que el alumno llene debidamente el vale de material (FPECB-DEX-01-09) y lo entregue a la persona responsable, dejando como depsito la credencial vigente de la UNAM.
12) El alumno deber revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando cualquier anomala (faltante o material
daado) y ser devuelto en las condiciones en que se recibi, de no hacerlo, se har acreedor a las sanciones
establecidas en cada laboratorio.
13) Es obligacin de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el laboratorio.

PRCTICA 1
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
INMUNOBIOLOGA
QFB Ladislao Palomar Morales

OBJETIVO
Introducir las medidas de seguridad, qumicas y biolgicas, en el laboratorio de
Inmunobiologa para que el alumno las ponga en prctica y pueda minimizar los riesgos de
trabajo.

RELACIN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TERICO

Es fundamental que el alumno conozca las medidas mnimas de seguridad, qumica y biolgica,
que deben seguirse en un laboratorio donde se manejan reactivos qumicos y muestras
biolgicas, por esto se plantea en el programa de la asignatura como primera prctica del curso.

INTRODUCCIN
Existe un riesgo evidente de contaminacin al que est expuesto el personal de salud
(profesionales, estudiantes, investigadores, etc., personal de limpieza), al tratar con pacientes
infectados o potencialmente infectados, en especial cuando el personal de salud, est en
contacto con sangre o hemoderivados, con agujas, jeringas e instrumental contaminado,
pudiendo adquirir infecciones como el HIV, Hepatitis B, C, etc., as como el riesgo de toxicidad,
cuando en su trabajo emplea substancias qumicas, ya sea como reactivos, o como productos
de desinfeccin, los cuales pueden daar tambin el medio ambiente.
Segn la NOM-018-STPS-2000 se definen como: peligro a la capacidad intrnseca de una
sustancia qumica para generar un dao y riesgo, a la probabilidad de que una sustancia
qumica peligrosa afecte la salud de los trabajadores o dae el centro de trabajo. Es necesario
ampliar estas definiciones para ser aplicadas a y microorganismos y. productos de origen
biolgico.

Aunque existe una gran variedad de sistemas para la identificacin de riesgos los ms usados a
nivel nacional e internacional son dos. Ambos sistemas son muy amigables por el uso de
colores y nmeros para identificar los riesgos, y por tal razn son los recomendados por la
NOM-018-STPS-2000.
A mediados del siglo XX, la Agencia Nacional de Proteccin al Fuego (NFPA, por sus siglas en
ingls) disea el Cdigo 704 para la identificacin de riesgos de las sustancias qumicas.

Rombo (o diamante) del Sistema NFPA

Algunos aos ms tarde la Asociacin Nacional de productores de Pinturas y Recubrimientos
(NPCA, por sus siglas en ingls) desarrolla un sistema alterno para la identificacin de
materiales peligrosos. Hay que mencionar que tienen ligeras diferencias en su aplicacin,
debido a su origen.

Rectngulo HMIS
Las sustancias qumicas son producidas en una regin determinada y posteriormente se
trasladan al lugar donde se van a utilizar, para esto se deben seguir en Mxico, y en el mundo,

las recomendaciones de la ONU para el transporte de materiales peligrosos, estas

recomendaciones surgen por la movilidad de estos materiales despus de la Segunda Guerra
Mundial. En Mxico se debe aplicar la NOM-003-SCT-2008, que obliga a los transportistas a
identificar mediante un cdigo el tipo de material que se est transportando, utilizando colores y
nmeros. Existe un sistema alterno llamado HazChem, utilizado en Europa.

Slido inflamable
Gas inflamable
Miscelneos
Paneles del Sistema de Identificacin para el Transporte de
Materiales Peligrosos

Sistema HazChem

Una vez en el lugar donde se utilizaran las sustancias qumicas, deben ser almacenadas en
base a sus caractersticas qumicas, y no en orden alfabtico. Aunque existen varios sistemas
para almacenamiento, los ms amigables son aquellos que utilizan, simultneamente, colores,
nmeros y pictogramas. Estos sistemas toman el nombre de las empresas productoras que los
crearon, y todos ellos fueron creados a principios de la dcada de los 80s del siglo pasado.

Sistema Baker Saf-T-Date

Sistema ChemAlert

Sistema Winkler

Los colores asignados en base al tipo de riesgo, en estos tres sistemas, son los siguientes:
Tipo de riesgo
Salud
Inflamabilidad
Reactividad
Contacto
General (riesgo menor o igual
a 2 en cualquiera de los tipos)
Incompatibles con otras del
mismo grupo

Baker Saf-T-Data
Azul
Rojo
Amarillo
Blanco

ChemAlert
Azul
Rojo
Amarillo
Blanco

Winkler
Azul
Rojo
Amarillo
Blanco

Verde

Gris

Verde

Color asignado a
rayas diagonales

NO EXISTE

Color asignado y la
leyenda SEPARADO

10

La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) public la primera edicin del Manual de

bioseguridad en el laboratorio en 1983. En ella se alentaba a los pases a aceptar y aplicar
conceptos bsicos en materia de seguridad biolgica y a elaborar cdigos nacionales de
prcticas para la manipulacin sin riesgo de microorganismos patgenos en los laboratorios que
se encuentran dentro de sus fronteras nacionales. Desde 1983, muchos pases han seguido la
orientacin especializada que se ofrece en el manual para elaborar esos cdigos de prcticas.
La OMS establece que la clasificacin por grupos de riesgo se utilizar exclusivamente
para el trabajo de laboratorio. Y hace referencia a los peligros relativos que entraan los
microorganismos infecciosos, clasificados por grupos de riesgo (grupos de riesgo 1, 2, 3 y 4).

Clasificacin de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo

Grupo de riesgo 1(riesgo individual y poblacional escaso o nulo)
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar
enfermedades en el ser humano o los animales.

Grupo de riesgo 2(riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)

Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades humanas o
animales pero que tienen pocas probabilidades de entraar un riesgo grave
para el personal de laboratorio, la poblacin, el ganado o el medio ambiente.
La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin grave, pero
existen medidas preventivas y teraputicas eficaces y el riesgo de
propagacin es limitado.

Grupo de riesgo 3(riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)

Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades humanas o
animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a
otro. Existen medidas preventivas y teraputicas eficaces.

Grupo de riesgo 4(riesgo individual y poblacional elevado)

Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser
humano o los animales y que se transmiten fcilmente de un individuo a
otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas
y teraputicas eficaces.
En el siguiente cuadro se relacionan, no se equiparan, los grupos de riesgo con el nivel de
bioseguridad de los laboratorios destinados al trabajo con microorganismos de cada uno de
esos grupos.

11

Relacin de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prcticas y el
equipo
GRUPO DE
NIVEL DE
TIPO DE
PRCTICAS DE
EQUIPO DE
RIESGO BIOSEGURIDAD LABORATORIO
LABORATORIO
SEGURIDAD
Enseanza bsica, TMA
Ninguno; trabajo en
Bsico
investigacin
mesa de laboratorio al
1
Nivel 1
descubierto
Servicios de
TMA y ropa
Trabajo en mesa al
Bsico
atencin primaria; protectora; seal de descubierto y CSB
2
Nivel 2
diagnstico,
riesgo biolgico
para posibles
investigacin
aerosoles
Diagnstico
Prcticas de nivel 2 CSB adems de otros
especial,
ms ropa especial, medios de contencin
Contencin
investigacin
acceso controlado y primaria para todas
3
Nivel 3
flujo direccional del las actividades
aire
Unidades de
Prcticas de nivel 3 CSB de clase III o
patgenos
ms cmara de
trajes presurizados
Contencin
peligrosos
entrada con cierre junto con CSB de
mxima
hermtico, salida
clase II, autoclave de
4
Nivel 4
con ducha y
doble puerta (a travs
eliminacin especial de la pared), aire
de residuos
filtrado
En todo laboratorio escolar, o de diagnstico clnico, se generan residuos de diferentes tipos,
cada uno de los cuales requiere diferentes condiciones para su recoleccin, traslado,
almacenamiento y disposicin definitiva. De acuerdo con las NOM-052-SEMARNAT-2005 y
NOM-087-ECOL-SSA1-2002 los residuos deben separarse de acuerdo con el cdigo CRETIB
(acrnimo de Corrosivo, Reactivo, Explosivo, Toxico, Inflamable y Biolgico infeccioso).
Cada residuo debe segregarse de los otros y ser depositado en contenedores adecuados, sin
mezclarse entre s. En nuestra facultad debemos seguir las indicaciones proporcionadas en la
Instruccin de trabajo especfica para la identificacin clasificacin y eliminacin de residuos
peligrosos, elaborada por profesores del Departamento de Ciencias Biolgicas, que engloba
las normas anteriores.
Cada contenedor de residuos qumicos debe etiquetarse de la siguiente forma:

Laboratorio que lo gener.

Tipo de residuos segn la clave CRETIB, y de ser posible el
pictograma correspondiente.
Composicin aproximada de la mezcla.
Fecha de inicio y trmino de la recoleccin.
Generador del residuo

12

Los residuos biolgicos deben ser segregados de acuerdo con la NOM-087-ECOL-SSA1-2002

de la siguiente forma:
TIPO DE RESIDUOS

ESTADO FISICO

Sangre y derivados

Lquido

Cultivos y cepas de
agentes infecciosos

Slido
Slidos

Patolgicos
Lquidos
Residuos no
anatmicos

Objetos punzocortantes

Slidos
Lquidos
Slidos

ENVASE
Recipiente
hermtico
Bolsa de
polietileno
Bolsa de
polietileno
Recipiente
hermtico
Bolsa de
polietileno
Recipientes
hermticos
Recipiente
rgido de
polipropileno

COLOR
Rojo
Rojo
Amarillo
Amarillo
Rojo
Rojo
Rojo

DISCUSIN
Discutir la importancia de conocer, implementar, y trabajar con las normas de seguridad
adecuadas al laboratorio de esta asignatura.

BIBLIOGRAFA
1. Funes Espinoza Ftima, Panozo Meneces Adela y Cardozo Salinas Teresa. (2005). Bioseguridad y
Seguridad Qumica en Laboratorio. [En lnea] http://www.swisscontact.bo/sw_files/mvhvmxjnomq.pdf
obtenido el 12 de junio de 2011.
2. NOM-018-STPS-2000. Sistema para la identificacin y comunicacin de peligros y riesgos por
sustancias qumicas peligrosas en los centros de trabajo. [En lnea]
http://132.248.50.5/CLS/INFORMACIONPARACONSULTA/DERRAMESDEQUIMICOS/NOM-018STPS-2000.pdf, consultada el 12 de junio de 2011.
3. NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Proteccin ambiental- Salud ambiental-Residuos peligrosos biolgicoInfecciosos-Clasificacin y especificaciones de manejo. [En lnea]
http://www.semarnat.gob.mx/leyesynormas/Normas%20Oficiales%20Mexicanas%20vigentes/NOM087-ECOL-SSA1-2002.pdf, obtenida el 12 de junio de 2011.
4. NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las caractersticas, el procedimiento de identificacin,
clasificacin y los listados de los residuos peligrosos. [En lnea]
http://www.semarnat.gob.mx/leyesynormas/Normas%20Oficiales%20Mexicanas%20vigentes/NOM%
20052_23_JUN_2006.pdf, consultada el 12 de junio de 2011.
5. NOM-003-SCT-2008, Caractersticas de las etiquetas de envases y embalajes, destinadas al
transporte de substancias, materiales y residuos peligrosos. [En lnea]
http://www.sct.gob.mx/fileadmin/normatividad/transporte_terrestre/43.pdf, obtenida el 12 de junio de
2011.
6. Organizacin Mundial de la Salud. (2005). Manual de Bioseguridad en el laboratorio. [En lnea]
http://whqlibdoc.who.int/publications/2005/9243546503_spa.pdf, obtenido el 12 de junio de 2011.

13

PRCTICA 2
MORFOLOGA DE LAS CLULAS DEL
SISTEMA INMUNITARIO
QFB Ladislao Palomar Morales

OBJETIVOS

Conocer y aplicar la metodologa y clculos para el conteo de clulas en cmara de

Neubauer.

Identificar microscpicamente a las clulas del sistema inmune presentes en circulacin y

conocer sus principales caractersticas fenotpicas.

RELACIN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TERICO

En la unidad 2 se abordan los Mecanismos Inespecficos y parcialmente especficos de Defensa
(MID), en el punto 2.5 se deben describir el fenotipo y la funcin de las clulas que participan en
los MID Y MPE.

INTRODUCCIN
El conteo de leucocitos se refiere a la cantidad total
de leucocitos en sangre, contados utilizando la
cmara de Neubauer; La cmara de Neubauer tiene
dibujado en el centro un gran cuadrado, subdividido
en nueve cuadros ms pequeos. Los cuatro
cuadrados de las esquinas se utilizan para el
recuento leucocitario y, a su vez, estn subdivididos
en diecisis cuadrados terciarios.
El cuadro central es el de cuenta de eritrocitos.

14

La Cuenta Diferencial consiste en evaluar la proporcin y la morfologa de los diferentes tipos

de leucocitos que hay en sangre perifrica. El examen de una extensin de sangre, es parte
importante de la evaluacin de la serie blanca, la fiabilidad de la informacin obtenida depende
principalmente de lo bien hechas y bien teidas que estn las extensiones, las cuales son
sistemticamente examinadas.

MATERIAL

REACTIVOS

Placa de 96 pozos
Cmara de Neubauer
Microscopio
Juego de micropipetas y puntas
Portaobjetos
Tubo Capilar
Algodn
Piano Contador

Solucin de Turk
EDTA
Colorante de Wright
Aceite de Inmersin
Amortiguador de fosfatos con pH 6.6
Agua destilada

DIAGRAMA DE FLUJO
Sangre con
anticoagulante

R1

Recuento de
leucocitos

Cuenta
diferencial

Diluir 1/20 con

lquido de Turk

Teir con
Wright

Llenar la
cmara de
Neubauer

R2

Contar a 100X

Contar a 10X

R1: Aguja, al contenedor de punzocortantes; Algodn, basura municipal; tubo con sangre a contenedor
con cloro
R2: Residuos de Wright, Contenedor especial

15

METODOLOGA
Tomar una muestra de sangre con sistema Vacutainer, utilizando EDTA como anticoagulante.
1. Conteo de leucocitos
En un pozo de una microplaca, colocar 5 L de sangre completa y adicionar 95 L de lquido de
Turk, mezclar suavemente. Tomar 10 L de la sangre diluida y llenar un lado de la cmara de
Neubauer. Dejar reposar durante 1 minuto.
Colocar la cmara de Neubauer en el microscopio y buscar la cuadricula con el objetivo de 10X.
Realizar el conteo de leucocitos con el objetivo de 40X, en forma de culebra. Reportar el valor
en: leucocitos/mm3 y leucocitos/mL.

2. Cuenta diferencial de la serie blanca

Colocar una gota del tubo capilar en el extremo de un portaobjetos. Extenderla con otro
portaobjetos con un movimiento suave, haciendo la extensin de sangre lo ms delgada y fina
que se pueda. Secar al aire rpidamente. Cubrir con colorante de Wright durante 5 a 8 minutos.
Agregar el amortiguador, sin tirar el colorante, hasta que se forme una capa metlica que cubra
el frotis y dejarlo reposar de 5 a 8 minutos. Enjuagar con agua destilada y secar.
Colocar el frotis en el microscopio y enfocar con el objetivo de 40X, colocar una gota de aceite
de inmersin y realizar la cuenta con el objetivo 100X, en forma de culebra, contando un mnimo
de 200 clulas.

16

RESULTADOS
Valores absolutos y relativos de los leucocitos.

DISCUSIN
Discuta los valores obtenidos contra los valores de referencia y las implicaciones que tienen un
aumento y/o una disminucin de estas clulas del sistema inmune.

BIBLIOGRAFA
1. Bernard, Henry John. (1993). Diagnstico y Tratamiento Clnico por el Laboratorio, 9 edicin, Ed.
Salvat Medicina, Mxico, DF. 1509 pp.
2. Velez A, Hernan. (1992). Fundamentos de Medicina Hematologa. 4 edicin. Editorial Corporacin
para Investigaciones Biolgicas. Medelln, Colombia. 395 pp.
3. Williams, William J. (1979). Hematologa. 1 edicin. Salvat Editores, S.A. Barcelona, Espaa.1503
pp.

17

PRCTICA 3
TCNICAS DE SEPARACIN Y PURIFICACIN
DE CLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO
Dr. Salvador Fonseca Coronado y QFB Ladislao Palomar Morales

OBJETIVO Y COMPETENCIAS
Al finalizar el procedimiento experimental es deseable que el alumno haya adquirido las
siguientes competencias:

Conocer las principales tcnicas de separacin y purificacin de clulas a partir de sangre

perifrica.

Realizar el procedimiento de estratificacin de sangre sobre Ficoll-Hypaque y la obtencin

de las clulas mononucleares.

Conocer y aplicar los principios de purificacin de clulas por el mtodo de perlas

superparamagnticas acopladas a anticuerpos especficos.

RELACIN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TERICO

En la unidad 3 se describen los mecanismos especficos de defensa (MED) y especficamente
en el apartado 3.1 se hace mencin del fenotipo y funcin de las clulas de los MED y en el 3.9
de la estructura y funcin de los receptores celulares, en esta prctica se lleva a cabo un
procedimiento para la separacin de clulas mononucleares, entre las que se encuentran
clulas de la inmunidad innata, y un procedimiento para la purificacin especfica de clulas NK
las cuales son clulas fundamentales en los MID por su funcin citotxica.

INTRODUCCIN
En inmunologa, al igual que en la mayora de las ciencias de la vida, para describir un
fenmeno particular, es necesario aislarlo del conjunto de variables con los que coexiste.

18

En la actualidad, casi todos los estudios con clulas del sistema inmune requieren su
aislamiento y purificacin, bien para describir funciones especficas, o para el estudio delos
efectos de otras clulas, agentes o molculas sobre ellas; el conocimiento de todas las
funciones descritas de las clulas hasta el momento, ha sido posible gracias a que se cuenta
con tcnicas para la purificacin de una estirpe en particular, a partir de un grupo heterogneo
de estas.

Las clulas inmunes se pueden separar por varios mtodos

Mtodos fsicos

Aislamiento por centrifugacin en gradiente de densidad (Ficoll-Hypaque): Con esta tcnica

podemos obtener de forma separada las clulas mononucleares (linfocitos y monocitos)
delos granulocitos.

Separacin por adhesin selectiva:

Los monocitos se adhieren a superficies de vidrio o plstico y se separan de los
linfocitos.
Los linfocitos B se fijan a columnas o jeringas en lana de nylon o algodn (se obtienen
poblaciones separadas de LB y LT).

Estudio de marcadores y antgenos de membrana (diferencia poblaciones y

subpoblaciones de clulas). Las tcnicas ms empleadas son:

Citometra de flujo con FACS (separador celular activado por fluorescencia)

Formacin de rosetas por linfocitos B y T

Separacin por sus antgenos de membrana:

Separacin magntica
Separacin por afinidad en columnas

MATERIAL Y EQUIPO

REACTIVOS

Sistema Vacutainer para obtencin de

sangre con anticoagulante
Cmara de Neubauer.
Microscopio.
Tubos cnicos de 15 mL
Tubos de vidrio 13x100
Algodn (Torundas)
Contador de clulas.
Micropipetas de 10 y 100 L. con puntas
Pipetas de 5 y 10 mL y Pipetas Pasteur

Ficoll-hypaque
SSF o PBS
Colorante de Wright
Aceite de Inmersin
Amortiguador de fosfatos con pH 6.6
Solucin de Turk

19

Centrfuga clnica
Balanza de dos platos
Portaobjetos

Opcional
Equipo magntico para purificacin de clulas

Opcional
Medio RPMI 1640 suplementado
Mezcla de anticuerpos monoclonales
contra marcadores de identidad
acoplados a biotina
Anticuerpos monoclonales anti-biotina
acoplados a perlas magnticas
Amortiguador de purificacin: PBS albminaEDTA

DIAGRAMA DE FLUJO
Obtener 2 tubos de
sangre perifrica

R3

R1

Centrifugar un
tubo

Estratificar el contenido del otro

tubo sobre Ficoll-hipaque

Obtener la capa
de Leucocitos

Centrifugar y obtener la
capa de mononucleares

R2

Resuspender
en 1 mL
R4

Contar en cmara
de Neubauer

Preparar un frotis, teir con

Wright y observar morfologa

R1: Aguja, al contenedor de punzocortantes; Algodn, basura municipal; tubo con sangre a contenedor
con cloro
R2 y R3:Palangana con cloro
R4:Residuos de Wrigth, Contenedor especial

METODOLOGA
1. Obtener dos tubos de sangre, 5 mL en cada uno, con anticoagulante (heparina de
preferencia).

20

Obtencin de Buffy Coat

2. Centrifugar, uno de los tubos, a 700 g
durante 5 minutos.
3. Con pipeta Pasteur extraer y desechar el
plasma.
4. Con pipeta Pasteur obtener la capa de
Leucocitos (1 mm aproximadamente) y
colocar en un tubo de ensaye.
5. Completar a 1 mL con SSF o PBS.
6. Realizar

el

conteo

de

las

clulas

obtenidas en la cmara de Neubauer.

7. Preparar un frotis con la suspensin y
teir con Wright. Observar morfologa a
100X.

Separacin por gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque.

8. Colocar 2 mL de Ficoll-hypaque en un tubo de ensaye de 13x100, estratificar lentamente la
sangre de un tubo sobre la superficie del Ficoll con ayuda de una pipeta Pasteur, de tal
manera que se formen dos fases.
9. Centrifugar a 300 g por 15 minutos.
10. Como se observa en la figura se forman cuatro
estratos diferentes introducir una pipeta Pasteur
hasta el estrato de clulas mononucleares (PBMC
del ingls: Peripheral blood Mononuclear Cells) y
extraer el anillo en forma circular evitando extraer la
menor cantidad de Ficoll posible.
11. Colocar las PBMC en otro tubo, adicionar 5 mL de
PBS y centrifugar 5 min a 300 g, repetir el lavado
una vez ms. Resuspender en 1 mL de PBS
12. Prepara un frotis con la suspensin de PBMC y teir con Wright; Observar la morfologa a
100X.

13. Realizar el conteo de las clulas obtenidas en la cmara de Neubauer.

21

RESULTADOS
Indicar la cantidad de clulas/mL de suspensin y morfologa de las clulas obtenidas por cada
mtodo.

DISCUSIN
El alumno debe comprender y describir detalladamente el fundamento de la purificacin de
clulas por seleccin negativa con perlas magnticas.

REFERENCIAS
Current Protocols in Immunology. (1997) A.3F.1-A.3F.2 Common Immunologic Techniques. Supplement
21, John Wiley & Sons, Inc. DOI: 10.1002/0471142735.ima03fs21

URLs
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142735.ima03fs21/pdf (Libre acceso dentro de la UNAM).
www.miltenyibiotec.com/download/datasheets_en/253/MiltenyiBiotec_DataSheet_CD4+-T-Cell-IsolationKit-II,-human_130-091-155.pdf

22

Opcional:
Purificacin de clulas por perlas superparamagnticas (MACS)
DIAGRAMA DE FLUJO

23

Importancia: La purificacin de una poblacin celular en particular, nos

permite evaluar una gran variedad de funciones especficas y de respuestas a
diferentes estmulos entre ellos por supuesto, los efectos de un determinado
frmaco.
1. De acuerdo al nmero de clulas contadas, ajuste una solucin de 1x107 clulas en 40 L
de buffer y adicione la cantidad de cocktail de anticuerpos anti-CD indicado en el instructivo
del producto. (La finalidad de esto es familiarizar al estudiante con insertos en idioma
ingls).
2. Incube 10 minutos en hielo
3. Adicione 10 L de anticuerpos anti biotina acoplados a perlas magnticas mezcle y deje en
incubacin por 15 minutos.
4. Mientras esta en incubacin la suspensin, coloque una columna LS sobre l magneto y
lave tres ocasiones por adicin de 3 mL de PBS-albmina.
5. Adicione la suspensin en la columna y colecte el eluato en un tubo cnico, lave en tres
ocasiones por adicin de 2 mL de PBS-albmina colectando el eluato en el mismo tubo
(esta fraccin es rica en clulas purificadas).
6. Separe la columna del magneto y adicione en tres ocasiones 3 mL de buffer para sacar de
la columna las clulas marcadas (Esta fraccin es rica en las poblaciones no purificadas).
7. Realice el conteo de ambas fracciones y calcule la eficacia del proceso, compare su
resultado experimental con el terico esperado de acuerdo a la poblacin purificada.

24

APNDICE
Preparacin de medio RPMI 1640
Dependiendo del fabricante, el medio puede venir en varias presentaciones, hay presentaciones
de 100 mL listas para su uso, sobres con polvo para disolver en un litro y frascos con polvo para
preparar 10 litros, en este ltimo caso se pesa la cantidad adecuada para los mL que se desee
preparar. El polvo debe ser disuelto en agua tridestilada y desionizada o en agua milliQ.
Para preparar un litro de medio:
Disolver la cantidad de polvo indicada en aproximadamente 970 mL de agua; agregar 2 gramos
de bicarbonato de sodio en polvo (grado cultivo celular) y 1 gramo de HEPES; adicionar 10 mL
de L-glutamina 100 mM y 10 mL de antibitico-antimictico (penicilina/estreptomicinaFungizona); ajustar el pH a 7 con NaOH 0.1 N y aforar a 1 litro. Filtrar en una unidad de
esterilizacin de 0.22 m y etiquetar como medio base. El medio para cultivo celular se
suplementa por adicin de 10 % de suero fetal bovino estril.
Preparacin de solucin amortiguadora de fosfatos (PBS) pH 7.2
Pesar 8 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 0.16 g de KH2PO4 y 0.79 g de Na2HPO4 anhidro, disolver en
agua desionizada y ajustar el pH a 7.2 con NaOH o HCl segn sea el caso.
Esterilizar por filtracin y almacenar a 4 C.
Preparacin de solucin amortiguadora de separacin para MACS.
Preparar 1 litro de PBS 1X y adicionar 0.5 % de albmina srica bovina y EDTA 2 mM

25

PRCTICA 4
FAGOCITOSIS
QFB Ladislao Palomar Morales

OBJETIVO
Evaluar la funcin fagoctica en clulas de sangre perifrica humana para determinar:
a) Porcentaje de clulas con capacidad fagoctica
b) Porcentaje de clulas con capacidad de producir radicales intermediarios del oxgeno
c) Nmero de levaduras, en promedio, que fagocita una clula

RELACIN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TERICO

Mecanismos inespecficos y parcialmente especficos de defensa (MID), Unidad 2, punto 2.7

INTRODUCCIN
En la fagocitosis (del griego -phagos, 'el que come', kytos, 'clula') algunas clulas rodean con
su membrana citoplasmtica a una sustancia extracelular (un slido generalmente) y la
introducen al interior celular.
Clulas fagocticas
En los animales superiores, la fagocitosis es una funcin de clulas especializadas (fagocitos
profesionales) del sistema inmune capaces de remover cuerpos extraos y combatir infecciones
como primera lnea de defensa natural. Varias clulas ejercen funciones fagocticas: Neutrfilos,
monocitos y macrfagos.
Los macrfagos son clulas fagocticas de gran tamao presentes en la
mayora de los tejidos y cavidades, proceden de los monocitos que migran
desde la sangre hacia los tejidos. Algunos permanecen en los tejidos
durante aos y otros circulan por los tejidos linfoides secundarios. Tambin
pueden actuar como clulas presentadoras de antgenos.

26

Su cintica de diferenciacin es la siguiente: monocito (en sangre),

Histiocito (clulas de Kupffer, osteoclastos, clulas de la microglia, clulas
del mesangio, etc.), macrfagos inflamatorios y finalmente los macrfagos
clsicamente (M1/CAM) y alternativamente activados (M2/AAM).
Los macrfagos expresan receptores de membrana para numerosos antgenos bacterianos, por
ejemplo: receptor para lipopolisacrido (CD14), receptores CD11b/CD18, receptores para
manosa, y receptor para glcidos entre otros. Los macrfagos participan en gran medida de la
respuesta inmune innata a infecciones gracias a sus receptores "scavengers", o barredores,
que poseen una especificidad a ligandos muy amplia como: lipoprotenas, protenas, poli y
oligonucletidos, polisacridos aninicos, fosfolpidos y otras molculas.
Los neutrfilos son los leucocitos ms abundantes (>70 %). Su
tamao es de 10-20 m de dimetro y se clasifican como granulocitos
debido a sus grnulos citoplasmticos de lisozimas y de lactoferrina.
Pasan menos de 48 horas en la circulacin antes de migrar a los
tejidos, debido a la influencia de los estmulos quimiotcticos. Es en
ellos donde ejercen su accin fagoctica y eventualmente mueren.
Los monocitos son clulas circulares cuyo dimetro oscila entre 15 a 30 m
y poseen una alta relacin ncleo/citoplasma. Se originan en la mdula
sea y constituyen cerca del 5 % del total de leucocitos de la sangre, donde
permanecen slo unos tres das. Despus atraviesan las paredes de las
vnulas y capilares (diapdesis) donde la circulacin es lenta. Una vez en
los rganos, se transforman en macrfagos, lo que se refleja en el aumento
de su capacidad fagoctica, de la sntesis de protenas, el nmero de
lisosomas y la cantidad de aparato de Golgi, microtbulos y microfilamentos.
Estos ltimos se relacionan con la formacin de seudpodos, responsables
del movimiento de los macrfagos.
Reconocimiento y unin de partculas por fagocitos
A pesar de que la fagocitosis de partculas fue demostrada por Haeckel en 1862 y que los
macrfagos y micrfagos fueron descritos por Metchnikoff en 1892, el rol de los factores sricos
que intervienen en este proceso fue puesto en evidencia hasta 1904 cuando Wright y Douglas
determinaron que dichas sustancias eran fundamentales para una ptima ingestin.

27

Etapas de la fagocitosis
1- Quimiotxis
Es la etapa de movilizacin y reclutamiento de clulas fagocticas por medio de interacciones
celulares con la zona o tejido lesionado. El fagocito se adhiere a la superficie del endotelio
previamente activado por citocinas, a travs de uniones moleculares de baja afinidad entre
receptores del fagocito y selectinas presentes en el endotelio.
En un punto especfico, determinado por la presencia y activacin de quimiocinas, los fagocitos
movilizados establecen interacciones intercelulares de gran afinidad con el endotelio por medio
de integrinas y otros ligandos endoteliales. En especial las molculas endoteliales selectina-E,
ICAM-1,2,3; VCAM-1 se adhieren a ligandos especficos sobre los fagocitos, entre ellos CLA,
LFA-1 y Mac-1.
Los fagocitos atrados por gradientes de concentracin de las quimiocinas, atraviesan entonces
el endotelio vascular hacia el foco de infeccin patgena.
2- Opsonizacin
La opsonizacin se consigue recubriendo las partculas con anticuerpos especficos de la clase
IgG, con o sin complemento. Debido a que los fagocitos tienen receptores de membrana para el
fragmento Fc de IgG, reconocen a estas partculas recubiertas por los anticuerpos. La IgM no
tiene capacidad de opsonizar, pero su unin a las partculas induce la activacin del sistema de
complemento. Esto lleva a que el componente C3b se deposite sobre las partculas, las cuales
son reconocidas por los receptores CR1, CR3 y CR4, de los fagocitos para el fragmento C3b.
A pesar que el reconocimiento de partculas recubiertas con IgG y/o C3b va los receptores Fc
y C3b, es el principal mecanismo de ingestin de partculas extraas, llamado fagocitosis
inmune, existen otros factores que median o ejercen su influencia sobre este proceso.
3- Adherencia
Receptores especficos sobre la membrana de los fagocitos permiten la adherencia sobre los
microorganismos, ya sea a productos microbianos especficos o sobre opsoninas del sistema
inmune del hospedador.
Algunos receptores de membrana presentes en las clulas fagocticas son: receptor de manosa,
receptor para el complejo LPS-LBP (LBP: protena de unin al LPS) que est formado por el
TLR4 y el CD14, receptores para los fragmentos Fc de los anticuerpos opsonizantes IgG2 e
IgG3.

28

4- Ingestin
La unin a receptores de adherencia promueve seales de comunicacin intracelular que
resultan en la invaginacin de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su ligando
patognico. Al rodear por completo al complejo receptor-molcula, la membrana se une en sus
extremos y libera al interior de la clula un fagosoma. Esto puede ocurrir en ms de un punto de
la membrana celular.
5- Digestin
Los fagocitos cuentan con variados mecanismos microbicidas, los cuales se activan al
fusionarse el fagosoma con un lisosoma intracelular. Las enzimas del lisosoma se liberan dentro
del fagolisosoma recin formado actuando sobre su contenido. Otros componentes txicos
usados en la digestin de microorganismos son los intermediarios reactivos del O2 y el xido
ntrico.

La Autofagia es un proceso del fagocito en el cual su retculo endoplsmico crea un

autofagosoma en su misma mitocondria liberando grnulos para la destruccin de la misma
mitocondria y as liberar los grnulos contenidos de la mitocondria que son los grnulos
secundarios especficos.

MATERIAL

REACTIVOS

1 Tubo vacutainer con heparina

1 pipeta Pasteur
2 portaobjetos
Bao Mara
Charola para Tincin
Microscopio ptico
Contador de Clulas

Suspensin de levaduras en SSF

Nitroazul de Tetrazolio al 0.1 % en SSF (NBT)
Colorante de Wright
Solucin amortiguadora pH 5.5 a 7.2
Aceite de inmersin

29

DIAGRAMA DE FLUJO

Obtencin de sangre perifrica

Suspensin de
levaduras

R1

Incubar a
37 C, 30 min

Realizar un frotis

R2

Teir con Wrigth

R3

Contar a 100X

R1: Aguja, al contenedor de punzocortante; Algodn, basura municipal

R2: Sangre con levaduras, Contenedor con cloro
R3: Residuos de Wright, Recipiente para resduos de wrigth

METODOLOGIA
1. Obtener 3 mL de Sangre perifrica con Heparina.
2. Agregar 1 mL de levaduras y 1 ml nitroazul de tetrazolio al tubo vacutainer y mezclar
suavemente.
3. Incubar, en bao Mara, durante 30 minutos a 37 C, mezclando ocasionalmente.

30

4. Mezclar suavemente, tomar una gota de la sangre y extender sobre un portaobjetos.

5. Teir como si fuera un frotis para conteo diferencial.
6. Observar a 100X, contando por lo menos 200 clulas, contando las levaduras fagocitadas
por cada clula.

RESULTADOS
Expresar los resultados como:
%

(100)

DISCUSIN
Discuta la importancia de la fagocitosis como un mecanismo inespecfico y parcialmente
especfico de defensa.

BIBLIOGRAFA
1. Aguilar Torrenta, Faviola. (2001). Manual del Curso Practico de Inmunologa, 1 edicin, Editorial
ENCB IPN, Mxico DF, 204 pp.
2. Gradwohl, RBH; Sonnenwirth, AC; Jarett, L; Zlochevsky Landes, D. (1986). Mtodos y Diagnsticos
del Laboratorio Clnico, Volumen I, 8 edicin, Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 1110
pp.
3. Palomar Morales, Ladislao. (1988). Fagocitosis en cerdos alimentados con diferentes niveles de
aflatoxina B1. Tesis UNAM. FES Cuautitln.
4. Roitt, Ivan. (2000). Inmunologa, 5 edicin. Harcourt ediciones. Madrid, Espaa. 423 pp.

31

PRCTICA 5
AGLUTINACIN, PRECIPITACIN Y
TURBIDIMETRA
QFB Ladislao Palomar Morales

OBJETIVOS

Que el estudiante comprenda las bases tericas de la reaccin de aglutinacin, los

diferentes factores que contribuyen a la reaccin, y sus aplicaciones clnicas para el
diagnstico de algunas patologas.

Determinar la presencia de inmunoglobulinas (Igs) sricas llevando a cabo la prueba de

precipitacin de sulfito de sodio.

RELACIN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TERICO

En la unidad 3, Mecanismos especficos de defensa, se describen los conceptos de antgeno,
antigenicidad e inmunoglobulinas. En la parte del contenido prctico se hace mencin de las
reacciones antgeno-cognato.

INTRODUCCIN
Jules Bordet propuso que la aglutinacin tomaba lugar en dos fases: a) la combinacin
especfica del anticuerpo y el antgeno y b) la agregacin visible de las partculas. Ambas fases
son mediadas por la atraccin especfica entre el anticuerpo y el antgeno.
A principios del siglo XX, Karl Landsteiner, menciona que en los eritrocitos deben existir
aglutingenos (hoy llamados antgenos) que reaccionaban con las aglutininas del suero (hoy
llamados anticuerpos) formando agregados de gran tamao visibles a simple vista.

32

Las reacciones de aglutinacin y de precipitacin son la base de la mayor parte de las tcnicas
inmunolgicas. Su principio se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo. Para comprender lo
anterior es necesario recordar qu es un antgeno y un anticuerpo.
Antgeno es una sustancia de alto peso molecular, con cierta rigidez estructural y que tiene la
particularidad de ser parcialmente metabolizado por clulas especializadas llamadas
macrfagos, por lo tanto es capaz de generar una respuesta inmune en un organismo que la
detecte como un agente extrao. Mientras que un anticuerpo es una glicoprotena, producida
por linfocitos B activados, llamados clulas plasmticas, como respuesta a la presencia de un
antgeno en el organismo, a su vez los anticuerpos pueden ser producidos por lneas celulares
in vitro, como es el caso de la produccin de anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos
llamados tambin inmunoglobulinas, se presentan en cinco clases principales, IgG, IgM, IgA,
IgD e IgE, que se diferencian entre s por sus caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas.
La capacidad inmunognica de distintas partculas, es en orden decreciente la siguiente:
protenas, glicoprotenas, polisacridos, lpidos y azcares. Las tcnicas de aglutinacin son
slo semicuantitativas y algo ms difciles. La aglutinacin de los antgenos nativos insolubles o
de las partculas recubiertas por el antgeno puede evaluarse a simple vista con o sin la ayuda
del microscopio. Entre las ventajas de las reacciones de aglutinacin estn su alto grado de
sensibilidad y la enorme variedad de substancias identificables a travs del uso de partculas
que estn recubiertas por antgeno o por anticuerpo.
Segn Coombs existen 3 requerimientos principales en las pruebas de aglutinacin:
1. Disponibilidad de una suspensin estable de clulas o de partculas.
2. Presencia de uno o ms antgenos cercanos a la superficie.
3. Conocimiento de que los anticuerpos "incompletos" o no aglutinables no son
localizables sin modificacin (reacciones antiglobulina).
Existen algunas variantes de la tcnica de aglutinacin, entre las cuales podemos mencionar:

Aglutinacin Directa: Anticuerpo soluble y antgeno presente en una clula o partcula

insoluble.

Aglutinacin Indirecta: Anticuerpo unido a una clula o partcula insoluble y antgeno

soluble.

33

Inhibicin de la Aglutinacin: Reaccin en dos pasos; primero se ponen a reaccionar

el anticuerpo y el antgeno (ambos en forma soluble) y en una segunda etapa se agrega
uno de ellos unido a una clula o partcula insoluble.

Floculacin: El complejo antgeno-anticuerpo no es tan grande como en las reacciones

de aglutinacin, y en ocasiones el complejo puede ser inestable.

MATERIAL

REACTIVOS

Placas de cristal o plstico de fondo negro y/o

fondo transparente
5 tubos de ensaye 13X100
Centrifuga
Balanza de dos platos
Juego de micropipetas y puntas

Equipos de diagnstico para VDRL, Factor

Reumatoide, Reacciones Febriles y/o grupos
sanguneos
Solucin de sulfito de sodio al 14, 16 y 18 %

DIAGRAMA DE FLUJO
Obtener sangre
perifrica

Mezclar antgeno y suero en una

placa

R2
1.9 mL de sulfato de sodio, agregar
0.1 mL de suero

Separar plasma o
suero

R3

R1

R1: Aguja: Contenedor de punzocortantes, Algodn: contenedor municipal, Paquete eritrocitario:

Contenedor con hipoclorito de sodio.
R2 y R3: Contenedor con hipoclorito de sodio.

METODOLOGA
1. Extraer, con el sistema Vacutainer, un tubo de sangre perifrica, para obtener suero o
plasma.
2. Separar el suero o el plasma y colocarlo en un tubo de ensaye.

TURBIDIMETRA
3. En un tubo de ensaye colocar 1.9 mL de sulfato de amonio al 14 %; otro al 16% y uno ms
al 18%. Agregar 0.1 mL de suero o plasma a cada tubo. Mezclar y dejar en reposo 30 min.

34

PRUEBAS DE AGLUTINACIN
4. En una placa: colocar una gota del antgeno unido a ltex, en una de las divisiones. Se
usarn tantas divisiones como antgenos se tengan. Agregar a cada divisin una gota del
suero o plasma y mezclar con la punta de un palillo. La lectura de la aglutinacin debe
realizarse antes de dos minutos.

RESULTADOS
Si hay turbidez en los tres tubos de sulfato de amonio, se debe reportar una
concentracin de Igs mayor o igual a 15 mg/mL de suero.
Si hay turbidez en los tubos de sulfato de amonio al 16 y 18 %, se debe reportar una
concentracin de Igs mayor entre 5 y 15 mg/mL de suero.
Si hay turbidez solo en el tubo de sulfato de amonio al 18 %, se debe reportar una
concentracin de Igs menor o igual a 5 mg/mL de suero.
Para las reacciones de aglutinacin se reportara positivo (+) o negativo (-).

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA
1. Aguilar-Garca, Vicente. (2004). VI. Reacciones de aglutinacin. Gac Md Mx Vol. 140, Suplemento
No. 3. Pp: S50-S52.
2. Martnez Romero, Aurora y Ortega Snchez, Jos Luis. (2011). Manual de Laboratorio de
Inmunologa Bsica y Clnica. Universidad Autnoma de Chapingo y Revista electrnica de
Veterinaria [En lnea] http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n040411/041108.pdf, obtenido el 26
de agosto de 2013.
3. Morales de Ramrez, Ana Margarita Paz y Gaitn Fernndez, Isabel Cristina. (2011). Manual de
procedimientos de laboratorio: INMUNOLOGA. Universidad Mariano Galvez. Guatemala.

35

PRCTICA 6
MODELOS EXPERIMENTALES Y VAS
DE INMUNIZACIN
Dr. Salvador Fonseca Coronado

OBJETIVOS Y COMPETENCIAS

Al finalizar el procedimiento experimental es deseable que el alumno haya adquirido las

siguientes competencias:

Conocer la importancia de los modelos de experimentacin en el mbito de la investigacin

bsica, clnica y diagnstica en inmunologa.

Entender los procedimientos y manejar de manera adecuada y tica a los ratones sujetos de
experimentacin en el curso.

Conocer las vas de inoculacin de antgenos y adquirir la habilidad de realizar la

inoculacin de antgenos por va intraperitoneal.

Comprender la importancia del uso de adyuvantes en la activacin de los MID y los MED.

RELACIN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TERICO

En la unidad 3 se abordan los mecanismos especficos de defensa (MED), en esta prctica se
lleva a cabo una introduccin a la forma en que se da lugar a la activacin de los MED mediante
la inoculacin (exposicin) a agentes inmungenicos y a la importancia de los adyuvantes como
activadores de los MID.
Manejo de animales de laboratorio e identificacin de las principales vas de inoculacin
en ratn.
Importancia: Un profesional del rea debe adquirir la competencia de conocer y manejar
adecuadamente modelos experimentales y animales de experimentacin.

36

INTRODUCCIN
Un modelo experimental es un sistema que nos permite imitar un fenmeno en condiciones
controladas con la finalidad de describirlo lo ms detalladamente posible. Casi todo lo que
damos por sentado del conocimiento en inmunologa se ha estudiado y descrito a partir de
modelos experimentales tanto in vitro como in vivo.
Las lneas celulares y los cultivos primarios constituyen el principal modelo in vitro, en tanto que
el estudio en ratones es, por mucho, el modelo in vivo que ms aportaciones a dado en el
estudio de la inmunologa.
Con respecto a los modelos in vitro, en esta prctica, el alumno adquirir los conocimientos
para el establecimiento de un cultivo primario y el mantenimiento de una lnea celular. En este
punto el alumno ya ha trabajado modelos experimentales in vivo en asignaturas como
farmacologa, ahora se abordara el modelo en ratn para conocer y analizar uno de los
fenmenos ms relevantes en el campo: la reaccin antgeno-anticuerpo.
El reconocimiento Ag-Ab es una reaccin de complementariedad, se efecta a travs de
mltiples enlaces no covalentes entre una parte del antgeno (denominada eptopo) y los
aminocidos del sitio de unin del anticuerpo. La reaccin se caracteriza por su especificidad,
espontaneidad y reversibilidad.

Especificidad: Capacidad del anticuerpo de unirse al antgeno que lo estimul. La unin dada
por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos qumicos con diferencias
mnimas a pesar de su similitud; adems, permite la detencin de un slo antgeno en cuestin.

Espontaneidad: La reaccin Ag-Ab no requiere energa adicional para efectuarse.

Reversibilidad: Dado que la reaccin se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en
consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, la proporcin de Ag-Ab, el pH y
la fuerza inica.
En este primer acercamiento se conocern las principales vas de inoculacin de antgenos en
ratn y las implicaciones inmunolgicas dependientes de cada va, en particular la activacin de
linfocitos B con la consiguiente produccin de anticuerpos, los cuales sern posteriormente
obtenidos y utilizados en las pruebas de ELISA y Western blot.

37

MATERIAL Y EQUIPO

REACTIVOS

Jeringas de 1 y 3 mL
Cnulas de alimentacin oral para neonatos

cido pcrico
Adyuvante completo de Freund
Adyuvante incompleto de Freund
Solucin inyectable
Albmina Srica Bovina
Gama Globulinas Humanas

DIAGRAMA DE FLUJO
Reparticin de ratones
y aprendizaje de
manipulacin

Demostracin de las diferentes

vas de inoculacin para
animales de laboratorio:
Oral, Subcutnea, Intraperitoneal

Formacin de grupos de
experimentacin e inoculacin
intraperitoneal

Lote 1
100 L de solucin
inyectable/ratn

Lote 2
20 g de IgG purificadas
en 100L de solucin
inyectable/ratn

R1

Lote 3
20 g de IgG
purificadas en 100L
de adyuvante/ratn

R1

Mantener a los ratones e inmunizar

nuevamente a los 7, 14 y 21 das.

El da 28 se obtiene muestra de
sangre y se sacrifican los ratones

R1: Aguja (contenedor rgido para punzocortantes), Jeringas (bolsa roja)

38

METODOLOGA
Calendario de actividades de esta prctica
Actividad
Da
Manejo e inmunizacin de ratones I
puntos 1 al 5 y (6, 7 u 8)
Inmunizacin de ratones II
puntos 6, 7 o 9
Inmunizacin de ratones III
puntos 6, 7 o 9
Sacrificio y muestreo
Prctica Anatoma del Sistema Inmune

17 18 de
septiembre/2015
24 25 de
septiembre/2015
01 02 de
octubre/2015
15 16 de
octubre/2015

1. A cada equipo se le proporcionar un ratn y ser responsable de su cuidado durante el

tiempo de desarrollo del proceso experimental.
2. Se har una demostracin del manejo adecuado de los ratones y los cuidados y riesgos de
su manipulacin.
3. Se har una demostracin de las diferentes rutas de administracin de sustancias a los
ratones (oral, intramuscular, intraperitoneal, subcutnea) y cada alumno seleccionar una
ruta para practicar evitando al mximo maltratos innecesarios de los animales.
4. Se enseara a los alumnos las tcnicas de marcaje, la seleccin e importancia estadstica
de los grupos de experimentacin, y se llevar a cabo la primera inoculacin en ratones, con
las inmunoglobulinas humanas purificadas y cuantificadas en las prcticas anteriores (las
cuales se comportarn ahora como inmungenos).
5. Se formarn tres grupos de experimentacin de 6 ratones cada uno, los alumnos llevarn a
cabo el marcaje de sus animales.
6. Al grupo 1 se le administrarn 100 L de solucin inyectable a cada ratn por va
intraperitoneal.
7. Al grupo 2 se le administrarn 20 g de Igs en 100 L de solucin inyectable a cada ratn
por va intraperitoneal.
8. Al grupo 3 se le administrarn 20 g de Igs en 100 L del adyuvante seleccionado a cada
ratn por va intraperitoneal.
9. Se administrar la misma dosis a cada grupo a los 7, 14 y 21 das, solo se sustituir el
adyuvante completo por adyuvante incompleto.

39

10. Los animales sern mantenidos en condiciones adecuadas con agua y alimento ad libitum
durante todo el periodo de experimentacin.
11. El da 28 se tomara una muestra de sangre y se sacrificaran los animales, para utilizarlos en
la Prctica de Anatoma del Sistema Inmune,

Discusin
El alumno en base a la informacin previa obtenida, discutir las implicaciones de la
administracin de un determinado antgeno por cada una de las vas analizadas y que rganos
y clulas se ven implicadas en cada caso.
Los alumnos tendrn una mesa de discusin acerca de la importancia de los adyuvantes.

Referencias
1. Delgado, N; Revuelta, M. (1993). Gua Prctica para el Manejo de Animales de Laboratorio. UNAM.
Facultad de estudios Superiores Cuautitln. Mxico, D.F. 115 p.
2. Donovan, J. C. and Brown, P. (2007). Care and Handling of Laboratory Animals. Current Protocols in
Immunology. 76:1.0.11.0.4. DOI: 10.1002/0471142735.im0100s76
3. Shevach, E. M. (2010). Animal Models for Infectious Diseases. Current Protocols in Immunology.
91:19.0.119.0.4. DOI: 10.1002/0471142735.im1900s91

40

PRCTICA 7
CITOMETRA DE FLUJO
Dr. Salvador Fonseca Coronado

OBJETIVO

Comprender los fundamentos de la Citometra de flujo y sus aplicaciones en la

determinacin de marcadores celulares en investigacin bsica, clnica y diagnstica.

RELACIN CON LOS CONTENIDOS TEORICOS DEL PROGRAMA

Se relaciona con los Mecanismos Especficos de Defensa, con la estructura y funcin de los
receptores celulares para el antgeno, con la estructura y funcin de inmunoglobulinas y con la
interaccin antgeno-anticuerpo.

FUNDAMENTOS
La citometra de flujo (CF) es un mtodo que permite el anlisis de mltiples caractersticas
celulares como su morfologa, la presencia de molculas de superficie, intracelulares y
secretadas, as como su dinmica de expresin, tanto de clulas eucariotas como procariotas.
El equipo utilizado para estos fines es el citofluormetro de flujo (denominado FACS, del ingls:
Fluorescence Activated Cell Sorter), el cual permite la deteccin de los parmetros de tamao,
granularidad (o complejidad de la clula) y la emisin de fluorescencia.
El principio bsico de la CF (Figura 1) consiste en obtener una suspensin celular (las clulas
se pueden marcar con anticuerpos u otras protenas acopladas a fluorocromos capaces de
unirse en la superficie o intracelularmente a las molculas a evaluar) y hacerlas pasar de forma
individual a travs de un capilar, a una cmara donde incide sobre ellas un rayo lser. El haz de
luz lser cuando atraviesa una clula sufre una dispersin que puede ser evidenciada en un
fotodetector situado enfrente de la fuente emisora, como una disminucin de la luz incidente. El
tiempo que dure el corte en la llegada de fotones al detector ser proporcional al dimetro, y por
tanto al volumen o tamao celular. Este estudio de interrupcin frontal del haz lser se
denomina como Forward Scatter (FSC). Adems del detector de luz situado frente al haz lser,

41

existe otro grupo ptico, que detecta la luz dispersada por las clulas y que se coloca formando
un ngulo de 90 con el haz lser. Esta luz es descompuesta, mediante los filtros apropiados
para poder estudiar tanto la dispersin de luz de la misma longitud de onda del lser como la
emitida por los fluorocromos. La mayor o menor dispersin de la luz y por tanto la mayor o
menor deteccin de luz en ste detector, ser proporcional a la complejidad de la superficie
celular y a las estructuras y organelos celulares, denominndose Side Scatter (SSC); con estos
parmetros, el equipo amplifica las seales elctricas y las convierte, mediante un sistema de
tarjetas electrnicas, en un grfico en dos dimensiones que permite la separacin de las
diferentes poblaciones celulares de acuerdo a su tamao y granularidad (Figura 2).

Figura 1. Esquema de los sistemas de deteccin del citmetro de flujo.

Como se observa en la figura 1, existen una serie de detectores incorporados en el citmetro
que permiten detectar estas seales de fluorescencia. El marcaje de toda una amplia gama de
molculas, permite que la CF sea una herramienta poderosa para realizar la caracterizacin de
mltiples funciones celulares.

42

Figura 2. Diagrama de tamao vs granularidad (DOT-PLOT) de una muestra

de sangre perifrica donde se muestra la capacidad de separacin de las
diferentes poblaciones celulares mediante los sistemas detectores FSC y
SSC.
Como se mencion, las clulas pueden ser marcadas con fluorocromos libres o acoplados a
molculas con afinidad por el componente celular que se desee evaluar, las molculas ms
utilizadas para este fin son los anticuerpos (debido a su especificidad), mediante los cuales es
posible analizar marcadores de la superficie celular (CD4, CD8 y todos los marcadores de
identidad); marcadores intracelulares (citocinas, caspasas, cinasas, protenas virales, etc.) y
marcadores nucleares (DNA, RNA).
Los fluorocromos son una serie de compuestos qumicos que tienen la capacidad de absorber
la luz del rayo lser en forma de fotones y emitirlos con menor energa (mayor longitud de
onda), si estos compuestos se encuentran acoplados a anticuerpos contra una molcula en
particular, la intensidad de la emisin ser directamente proporcional a la concentracin o
cantidad de la citada molcula. En la figura 3 se muestra el espectro de emisin de algunos
fluorocromos utilizados en CF.

43

Figura 3. Principales fluorocromos utilizados en CF, se muestran los excitados

por un rayo lser de argn (488 nm) y de helio-Nen (630 nm). FITC:
Isotiocianato de fluorescena, PE: Ficoeritrina, ECD: Electron Coupled Dye
A partir de la grafica FSC vs SSC se pueden generar regiones para realizar el anlisis de
poblaciones en particular, por ejemplo, en la figura, 1 se seala en rojo la regin
correspondiente a los linfocitos, si se marc esta suspensin con anticuerpos acoplados a
fluorocromos contra las subpoblaciones de linfocitos cooperadores (CD4-PE) y citotxicos
(CD8-FITC), estos se pueden visualizar en un grfico denominado histograma en el que se
grafica la intensidad del fluorocromo en cuestin contra el nmero de eventos (clulas) positivos
a dicha molcula (Figura 4).

Figura 4. Histogramas de la regin correspondiente a los linfocitos donde se

observan las poblaciones positivas a CD8 y a CD4

44

A partir del diagrama FSC vs SSC tambin se puede generar un grfico Dot Plot donde se
esquematice la emisin de dos fluorocromos de manera simultnea, por ejemplo, si la muestra
marcada con el anticuerpo anti CD4-PE, se marca tambin con un anticuerpo anti CD69-FITC
(el cual es un marcador de activacin celular), se puede identificar en el dot-plot el porcentaje
de clulas CD4 que estn activadas (cuadrante superior derecho) de las que no lo estn
(cuadrante superior izquierdo), figura 5.

La CF tiene mltiples aplicaciones en investigacin bsica, en la clnica y en la teraputica de

las cuales se mencionan algunas a continuacin:

ALTERACIONES EN LA MORFOLOGIA CELULAR:

Cambios en tamao
Cambios en granularidad
ALTERACIONES EN EL INMUNOFENOTIPO:
Inmunoproliferacin/ Inmunodeficiencia
Inmunodisfuncin
ALTERACIONES EN EL GENOTIPO:
Cambios en el contenido de ADN (ploida)
Cambios en la expresin de genes
ALTERACIONES EN LA BIOQUIMICA INTRACELULAR:
Cambios en la sntesis y concentracin de molculas
Cambios en la actividad de enzimas y en el flujo a travs de rutas de activacin
Alteraciones en el nmero y la funcin de orgnelos subcelulares
Cambios en la respuesta bioqumica a estmulos controlados

45

DETECCION DE CELULAS INFRECUENTES (CELULAS RARAS)

Deteccin de clulas tumorales circulantes
Deteccin de clulas fetales en sangre materna
Deteccin de clulas activadas o antgeno-especficas circulantes
PARAMETROS IMPLICADOS DIRECTAMENTE EN EL PROCESO PATOLOGICO:
Anlisis de parmetros especficos de la patologa
SELECCION DE CELULAS EN LA TERAPIA CELULAR:
Anlisis de progenitores en el transplante autlogo
Pruebas cruzadas (cross-match) en transplantes heterlogos
Deteccin y cuantificacin de leucocitos residuales en hemopreparados
ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL CELULAR:
Cambios en parmetros estructurales
Cambios en parmetros funcionales
ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL DEL PACIENTE:
Deteccin de recidivas y enfermedad mnima residual
Establecimiento de patrones pronsticos de xito teraputico
DETECCION Y ANALISIS DE RESISTENCIA A LA TERAPIA:
Anlisis de la captacin y retencin de frmacos (fenotipo MDR)
Anlisis del metabolismo de frmacos
CARACTERIZACION DE LOS MECANISMOS DE MUERTE CELULAR:
Identificacin y anlisis de clulas apoptticas
Identificacin de clulas necrticas

Discusin
Discuta con sus compaeros otras aplicaciones de la citometra de flujo como la cuantificacin
de citocinas con perlas fluorescentes, estudios del ciclo celular, purificacin de
subpoblaciones celulares, identificacin de vas de sealizacin, etc.

REFERENCIAS
1. Shevach, Ethan M. (2009). Immunofluorescence and Cell Sorting. Current Protocols in Immunology
5.0.1-5.0.3, Published online November 2009 in Wiley Interscience (www.interscience.wiley.com).
DOI: 10.1002/0471142735.im0500s87
2. Darzynkiewicz, Z., Robinson, J.P., and Crissman, H.A. (eds.) (1994). Flow Cytometry, 2nd ed.
Methods Cell Biol.: 41 & 42. Academic Press, San Diego.
3. Mason, D.W. and Williams, A.F. (1980). The kinetics of antibody binding to membrane antigens in
solution and at the cell surface. Biochem. J.187:1-9.
4. Shapiro, H. M. (1988). Practical Flow Cytometry, 2nd ed. Wiley-Liss, New York.

46

PRCTICA 8

ENSAYO INMUNO ENZIMTICO (ELISA)

Dr. Marco Antonio Vega Lpez

OBJETIVO

Determinar la presencia de anticuerpos en muestras biolgicas, para el diagnstico indirecto

de patologas como el sarampin a travs del inmunoensayo enzimtico ELISA.

INTRODUCCIN
Los inmunoanlisis ligados a enzimas son tcnicas en las cuales uno de los reactantes, el
anticuerpo o el antgeno, se fija en un soporte slido, casi siempre una placa de plstico, antes
de su interaccin con la muestra del paciente y el reactante revelador de la reaccin que, por lo
general, es un anticuerpo conjugado a una enzima que acta sobre un substrato-cromgeno,
que indica y detecta la presencia del reactante a analizar virando a un color.
Las pruebas de ELISA o EIA, (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay), se basan en dos
fenmenos biolgicos importantes:
1 La especificidad de los anticuerpos (Ab).
2 La amplificacin de la seal generada a travs de la accin de una enzima.
La sencillez metodolgica del ELISA y sus reducidos requerimientos de equipos especiales,
sumada a la especificidad de los Ab monoclonales (MAb), hace que sean sencillos, baratos y de
sensibilidad aceptable para su uso en el laboratorio, por encima de los basados en la utilizacin
de un trazador radiactivo, (radioinmunoanlisis RIA-), un trazador emisor de luz
(quimioluminiscencia) o un trazador fluorescente (fluorografa).
Clasificacin de las pruebas inmuno enzimticas:
Las pruebas inmuno enzimticas pueden clasificarse en:
a) Homogneas.
b) Heterogneas.

47

Las primeras se realizan exclusivamente en fase liquida y con los reactivos aadidos en forma
simultnea. Se emplean para aparatos automatizados y no son de uso comn. Las segundas
emplean un soporte slido para inmovilizar a uno de los inmunorreactantes y, a partir de ello, se
realiza la reaccin especfica de deteccin. Estas ltimas son las de mayor uso en el
laboratorio.
En las pruebas heterogneas, existen muchas variantes, dependiendo del tipo de analito que se
busque. Las pruebas ms comunes son las de deteccin indirecta, donde se busca la presencia
de anticuerpos (Ab) en los pacientes. En ellas se fija el Ag de inters (de un virus o bacteria) en
la placa y sobre l se aplica la muestra (suero, saliva, lquido cefalorraqudeo, etc.). Los
anticuerpos especficos en la muestra (anticuerpo primario) se fijarn en el Ag y se harn
evidentes usando otro anticuerpo (secundario) que reconozca al primero y que est conjugado
con una enzima. El Ab secundario reaccionar con el sustrato, que debe ser incoloro y soluble y
ste, al ser degradado, deber convertirse en un producto colorido y soluble, cuya
concentracin se medir por espectrofotometra.
Tambin existe la variante de sndwich, donde se fija en la placa un anticuerpo primario (Ab
de captura), especfico para el analito que se busca (por ejemplo citocinas), se coloca la
muestra y el analito capturado por el Ab primario se identifica mediante otro Ab que est
conjugado con una enzima y que tambin reacciona con el analito, pero en otro eptopo. El
revelado se hace como ya se explic.
Finalmente, existe la variante competitiva, donde se trata de cuantificar la cantidad de analito de
inters. En este caso se usa una variante de la tcnica de sndwich, donde al pozo con el Ab
de captura se aade tanto la muestra como una cantidad conocida del analito marcado con un
fluorocromo o una enzima. Esto establecer una competencia entre el analito de la muestra y el
que nosotros aadimos en cantidades conocidas. En este caso, si la muestra no contiene al
analito, nuestro conjugado se unir por completo al Ab de captura y tendremos la mxima seal.
Si la muestra contiene cantidades altas del analito, ste competir con el conjugado que
aadimos y evitar que se fije al Ab de captura, de esta manera, entre ms concentracin de
analito tenga nuestra muestra, menos seal tendremos porque no se fijar el conjugado.
Haciendo curvas de concentracin puede cuantificarse la cantidad de analito en la muestra.

48

Diagrama con los componentes principales de las pruebas de ELISA. Se

esquematiza la prueba de sndwich.
Sistemas alternativos de reconocimiento.
Es posible aumentar la sensibilidad de la tcnica usando conjugados con otras protenas
distintas a los Abs. Uno de esos sistemas involucra a la estreptavidina que es una protena
producida por estreptococos y ciertas levaduras y que tiene elevada afinidad por la biotina
(Ka = 1015 M 1 ). Debido a que la biotina puede conjugarse fcilmente a distintas protenas (entre
ellas, Ab y enzimas) por unin covalente, sin afectar su actividad biolgica, se han desarrollado
mtodos inmunoenzimticos basados en la interaccin estreptavidina/biotina.
Protena A.
Es una protena de la pared de Staphylococus aureus (cepa Cowan I) que tiene alta afinidad
(Ka = 108 M 1 ) por el Fc de algunos isotipos de las Ig. Tiene 4 sitios de unin pero usualmente
slo reaccionan dos. Estas propiedades permitieron el desarrollo de diversos ELISA con
protena A.
En la presente prctica se realizar un ELISA indirecto, que consiste en buscar Ab contra Ag
conocidos, los pozos se recubren con el Ag, despus se lavan y se tratan con protena
bloqueadora irrelevante y luego se incuban con en el suero problema. Los Ab, retenidos por el
Ag se detectan por adicin de un segundo Ab conjugado a una enzima (conjugado), que
despus se revela adicionando el substrato de la enzima y un cromgeno. El resultado de la
reaccin es la formacin de un producto coloreado soluble, se realiza para diagnosticar
sarampin.

49

MATERIAL

REACTIVOS

1 gradilla con 10 tubos de ensayo de 12x75

1 placa con micropozos
1 Juego de micropipetas
1 Pipeta multicanal (8 12 puntas)
Cubetas para micropipetas
Puntas para micropipetas
Estufa de incubacin

IgG humana purificada por Salting Out

Suero de ratn inmunizado con IgG humana
Leche descremada al 5 % en PBS
Solucin de lavado (PBS-Tween 20)
Conjugado de cabra anti-IgG de Ratn
Sustrato para peroxidasa
Solucin de paro (HCl 2 N)

DIAGRAMA DE FLUJO

IgG Humana diluida en

amortiguador de carbonatos

Placa de micropozos

Incubar

Lavar
Solucin bloqueadora
Incubar

Lavar
Suero de ratn diluido
Incubar

Lavar
Conjugado
Incubar

Lavar
Sustrato/cromgeno
Incubar
Sustrato/cromgeno
Leer absorbancia
R1: Sobrenadantes y residuos de los lavados al contenedor con agua clorada

50

R1

METODOLOGA
Bsqueda de Ab de ratn contra -Globulina Humana, IgG)
Los pasos 1 al 6 se realizan previamente en otra sesin
1. Sensibilizar una placa de micropozos con 100 L de IgG humana (50 g/pozo) en
amortiguador de carbonatos pH 9.6, incubar durante 1 hora a 37 C (o toda la noche a 4 C).
2. Vaciar el contenido en recipiente con cloro, sacudir contra papel absorbente.
3. Agregar 300 L de la solucin de lavado, vaciar el contenido al recipiente con cloro (lavar
tres veces).
4. Agregar 200 L de casena (leche descremada) al 5 % en PBS-Tween, incubar durante
1 hora a 37 C (o toda la noche a 4 C).
5. Vaciar el contenido en un recipiente con cloro, sacudir contra papel absorbente.
6. Agregar 300 L de la solucin de lavado, vaciar el contenido al recipiente con cloro (tres
veces). Dejar secar, cubrir con papel parafilm hasta el momento de su uso y guardar en
refrigeracin.
El da de la prctica
7. Realizar una serie de diluciones dobles, empezando por 1/10 de suero de ratn (inmunizado
con IgG); el volumen final de cada dilucin debe ser de 100 L.
8. Colocar 100 L de los sueros diluidos en cada pozo. Cubrir los pozos con papel parafilm,
agitar suavemente 15 segundos. Incubar 40 minutos a temperatura ambiente.
9. Vaciar el contenido en recipiente con cloro, sacudir contra papel absorbente.
10. Agregar 300 L de la solucin de lavado (PBS-Tween), vaciar el contenido al recipiente con
cloro (lavar tres veces).
11. Agregar 100 L del conjugado (anti IgG de ratn, producido en cabra, unido a peroxidasa)
diluido 1/10 000 con solucin bloqueadora a cada pozo. Agitar suavemente 15 segundos,
incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
12. Vaciar el contenido en recipiente con cloro, sacudir contra papel absorbente.

51

13. Agregar 300 L de la solucin de lavado, vaciar el contenido al recipiente con cloro (tres
veces).
14. Agregar 50 L de solucin reveladora (diaminobencidina/perxido de hidrgeno) a cada
pozo. Agitar suavemente 15 segundos. Incubar 10 minutos en obscuridad.
15. Agregar 50 L de la solucin de paro a cada pozo.
16. Una coloracin amarilla indica prueba positiva y negativa si es incolora.

RESULTADOS
Si se cuenta con un lector de ELISA el resultado (+) se asignar a la lectura mayor del valor de
la densidad ptica por sobre los controles, en caso de no contar con el lector de ELISA se har
la lectura de manera visual.

BIBLIOGRAFA
1. Aguilar Torrenta, Faviola. (2001). Manual del Curso Practico de Inmunologa, 1 edicin, Editorial
ENCB IPN, Mxico DF, 204 pp.
2. Margini, Ricardo, Anibal. (1996). Inmunologa e Inmunoqumica. 5 edicin. Editorial Panamericana.
Buenos Aires, Argentina. 976 pp.
3. Rojas Espinosa, Oscar. (2001). Inmunologa (de memoria), 2 edicin, Editorial Panamericana.
Mxico, DF. 374 pp.
4. Campbell, MA. (2002). ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay). [En lnea]
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/ELISA.html consultado el 30 de enero 2014.
5. The Biology Project Home. (2000). Introduction to ELISA Activity. [En lnea]
http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/technique.html consultado el 30 de enero
2014.

52

PRCTICA 9
ANATOMA DEL SISTEMA INMUNITARIO
MVZ ngel Germn Martnez Sosa

OBJETIVOS

Que el estudiante identifique in situ los rganos linfticos visibles del ratn (ganglios
linfticos axilares, inguinales y mesentricos; timo, bazo y placas de Peyer) haciendo
nfasis en su posicin anatmica, apariencia, color y textura.

Que logren la separacin de clulas de un rgano linfoide primario (timo) y uno secundario
(bazo y placas de Peyer) y su identificacin.

RELACIN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TERICO

En la unidad Mecanismos especficos de defensa, los rganos primarios y secundarios del
sistema inmune y la circulacin de clulas del sistema inmune son analizados; y a su vez
complementados con el desarrollo experimental de esta prctica.

INTRODUCCIN
El Sistema Inmune est formado por clulas, tejidos y rganos con un origen embriolgico
comn: el mesodermo; est constituido por alrededor de 1011 linfocitos B y 1018 linfocitos T
con diferentes receptores para el antgeno, que realizan una funcin de patrullaje o vigilancia de
antgenos procedentes tanto de nuestro medio ambiente interno como externo.
Los rganos linfticos primarios, centrales o independientes son el Timo para los linfocitos T
y la Bursa de Fabricio, dependiendo de la especie animal, para los linfocitos B; su funcin
primordial es la maduracin de las clulas, con la eliminacin por apoptosis de las clulas
autorreactivas.
Los rganos linfticos secundarios, perifricos o antgeno-dependientes son los ganglios
linfticos que constituyen cadenas ganglionares en diversas partes del cuerpo, el bazo y las
placas de Peyer; su funcin primordial es filtrar la linfa formada durante los procesos

53

inflamatorios en los tejidos circunvecinos; en su interior se activa y desarrolla la respuesta

inmune y mediante los vasos linfticos eferentes egresan los linfocitos B y T activados/memoria
para posteriormente ingresar a la circulacin sangunea sistmica.
Los rganos linfticos terciarios son aquellos que alojan a las clulas de memoria y en los
procesos inflamatorios crnicos son los sitios ectpicos donde se organizan estructuras linfoides
in situ.
A nivel celular es importante tener presente que cada estirpe celular, as como sus diferentes
estadios funcionales se caracterizan por la expresin de un fenotipo o marcadores celulares
especficos; los cuales debemos conocer para su identificacin y purificacin que pueden
realizarse tanto por de citometra de flujo, como por purificacin por perlas magnticas MACS
(del ingls: Magnetic Antibody Cell Sorter).

MATERIAL

REACTIVOS

Equipo de diseccin
1 gradilla con 10 tubos de ensayo de 13x100
3 pipetas Pasteur
3 coladeras y 3 mbolos de jeringa
2 cajas Petri y 3 portaobjetos
2 pipetas de 2 mL
Microscopio

100 mL de SSF o PBS pH 7.4

Tincin de Giemsa

DIAGRAMA DE FLUJO
Sacrificar un ratn por
dislocacin cervical

Incidir en la piel para localizar e identificar

los ganglios linfticos inguinales y axilares
R1

Macerar y lavar las clulas

obtenidas

Obtener bazo, timo y

placas de Peyer

Resuspender en 1 mL de
PBS

Realizar frotis y teir con

Giemsa

R2

Observar a 100X para

realizar conteo diferencial
R1: Los cadveres de ratn y rganos, envolverlos en papel y depositarlos en bolsa amarilla para
congelarlos hasta el momento de su incineracin.
R2: Todos los residuos lquidos depositarlos en el contenedor que contiene agua con cloro.
R3:Contenedor para residuos de Giemsa o Wright.

54

METODOLOGA
1. Sacrificar un ratn por alumno, por dislocacin
cervical.
2. Cortar la piel sin interesar rganos internos, desde
la laringe hasta la pelvis, para localizar e
identificar los ganglios linfticos inguinales y
axilares.
3. Realizar la identificacin y diseccin de los
siguientes rganos, bazo, timo y placas de Peyer,
colocndolos en una caja de Petri con un poco de
SSF.
4. Macerar individualmente los rganos anteriores
en una coladera, con el extremo plano del mbolo
de una jeringa, agregar 1 2 mL de SSF.
5. Lavar, centrifugando 2 veces con SSF.
6. Resuspender las clulas en 1 mL de SSF.
7. Realizar un frotis con cada una de las poblaciones
celulares obtenidas y teir con Giemsa o Wright.

RESULTADOS
Describir el aspecto macroscpico de los ganglios y rganos linfticos del ratnReportar lo observado en los frotis de cada suspensin celular.

BIBLIOGRAFA
1. Goldsby, RA.; Kindt, TJ.; Osborne, BA. & Kuby, J. (2004). Inmunobiologa. Quinta edicin Mc Graw
Hill, Iztapalapa, Mxico D.F.; 665 pp.
2. Roitt, I. (2000). Inmunologa. Quinta edicin Harcourt Editions; Madrid, Espaa. 423 pp.

55

PRCTICA 10
HISTOLOGA E INMUNOCITOQUMICA
M. en C. Erik Gonzlez Ballesteros

OBJETIVO
Conocer

comprender

los

fundamentos

metodologa

bsicos

de

las

tcnicas

inmunocitoqumicas e inmunohistoqumicas, as como sus aplicaciones en la inmunologa

bsica, clnica y diagnstica.

RELACIN CON LOS CONTENIDOS TEORICOS DEL PROGRAMA

Morfologa y fisiologa de los rganos y tejidos del sistema inmune e interaccin antgeno
anticuerpo.

INTRODUCCIN
Se

conocen

como

inmunohistoqumicas

tcnicas
a

inmunocitoqumicas

aquellas

metodologas

e Tabla 1. Historia de la inmunohistoqumica

que

permiten la deteccin y localizacin de antgenos

determinados en preparaciones citolgicas e histolgicas,
esto mediante el uso de anticuerpos especficos y
sistemas de deteccin conjugados principalmente con
molculas fluorescentes o enzimas, y que en mayor o
menor grado permiten la observacin simultanea de las
caractersticas

morfolgicas

celulares

tisulares

utilizando varios tipos de microscopa.

La inmunohistoqumica comienza a utilizarse en la
dcada de 1940 con tcnicas de inmunofluorescencia en
cortes de tejidos congelados y es hasta la dcada de
1990 que adquiere mayor relevancia sobre todo por su
utilidad en patologa quirrgica para la clasificacin y
diagnstico de neoplasias, gracias a una serie de

56

avances tcnicos que de manera acumulada permitieron mejorar diversos aspectos de la

metodologa.La posibilidad de conjugar anticuerpos con enzimas como la peroxidasa de rbano
y su empleo en conjunto con diferentes sustratos cromognicos, permitieron la localizacin de
los antgenos al poder observar las preparaciones en el microscopio otico compuesto
convencional, en tcnicas comnmente conocidas como de inmunoperoxidasa. Otros de estos
avances tcnicos fueron la posibilidad de detectar antgenos en muestras fijadas con formalina
y embebidas en parafina, as como la capacidad de incrementar la sensibilidad de las tcnicas
empleando marcajes indirectos que emplean anticuerpos secundarios, sistemas de deteccin
con avidina o estreptavidina - biotina, y ms recientemente uso de sistemas de amplificacin
basados en polmeros con los que se logra una elevada sensibilidad. El desarrollo de la
tecnologa para producir anticuerpos monoclonales impacto de manera similar a lo observado
con la mayora de las tcnicas inmunolgicas: incrementando la especificidad y la
reproducibilidad de las tcnicas en las cuales son empleados estos reactivos.

FUNDAMENTOS TECNICOS
Origen, seleccin y preparacin de la muestra.
El origen de las clulas y tejidos pueden ser muestras de rganos obtenidas postmortem,
biopsias obtenidas en procedimientos quirrgicos incluyendo la obtencin en el transoperatorio
o en cirugas ambulatorias, improntas de tejidos o mucosas, aspirados de rganos
parenquimatosos, frotis de lquidos corporales, preparaciones obtenidas por citocentrifugacin a
partir de lquidos con baja concentracin celular o a partir de cultivos celulares. Las muestras
empleadas en tcnicas de inmunohistoqumica o inmunocitoqumica en la mayora de los casos
se encuentran fijadas mediante el uso de agentes qumicos como formaldehdo y etanol con el
fin de preservar la morfologa celular y tisular, pero con el inconveniente de la probable prdida
de las caractersticas antignicas de las clulas de la muestra. A pesar de los problemas que
representa la perdida y necesaria recuperacin de antgenos la formalina amortiguada con pH
neutro contina representando la mejor opcin para conservar las caractersticas morfolgicas
del tejido y la retencin de molculas de bajo peso molecular que podran perderse en los
procesos subsecuentes. En casos donde no se conozca el resultado sobre la antigenicidad
despus de la fijacin de la muestra, se podran emplear preparaciones hechas a partir de
cortes de tejido congelado en las cuales la morfologa puede alterarse en diferentes grados pero
garantizando el reconocimiento de los antgenos de inters con los anticuerpos disponibles. En
la actualidad muchos de los reactivos que se encuentran disponibles en el mercado son
obtenidos con metodologas que garantizan la utilidad de los mismos en muestras fijadas y
embebidas en parafina.

57

Con el fin de lograr un resultado ptimo en

las

tcnicas

inmunocitoqumicas

Tabla 2. Esquema de estandarizacin para recuperacin de

antgenos

inmunohistoqumicas es necesario realizar

un proceso de recuperacin de antgenos
con el fin de que los anticuerpos puedan
reconocer los determinantes antignicos
conformacionales que resulten alterados
por la accin del agente fijador, ya sea
que acte coagulando y precipitando
(etanol y metanol) o formando ligamientos
cruzados (formaldehdo y glutaraldehdo)
en las protenas celulares.
Existen mltiples mtodos para la recuperacin de antgenos que principalmente se basan en
aplicacin de calor, pH o accin de enzimas proteolticas para lograr revertir el efecto del agente
fijador particularmente el ligamiento cruzado provocado por el formaldehdo.Las condiciones
particulares de estos dos factores para cada caso dependern de las caractersticas de la
muestra, el mtodo de fijacin empleado, objetivo de la tincin y antgeno en estudio. Se
colocan las preparaciones en agua destilada o diversas soluciones con pH cido o bsico y se
calientan temperaturas alrededor a los 100 C dado que las protenas fijadas resisten ms altas
temperaturas que las protenas nativas e incluso se puede emplear un horno de microondas
convencional para calentar la muestra, aunque se debe estandarizar la metodologa en cada
laboratorio.

Proceso de tincin y reactivos utilizados.

Dependiendo de las clulas o tejidos utilizados se debern realizar uno o varios pasos de
bloqueo con los cuales se busca reducir al mximo el fondo por uniones inespecficas en la
tincin. En algunos casos se buscar bloquear sitios de unin inespecficos empleando
soluciones con protenas ajenas al sistema, esto es no relacionadas con el antgeno o con los
reactivos de deteccin, por ejemplo soluciones de leche descremada o suero normal de la
especie en las cual se gener el anticuerpo secundario.
En otros casos se deber bloquear la actividad endgena de enzimas en el tejido como es el
caso de peroxidasas o la presencia de biotina que podra interferir con el paso de deteccin en
caso de utilizar el sistema avidina o estreptavidina con biotina.

58

Despus de cada uno de los pasos que requieran

incubacin con alguno de los reactivos se debern
realizar lavados adecuados comnmente con soluciones
isotnicas balanceadas y neutras como alguna de las
diferentes formulaciones de PBS. Una vez que se tiene
la muestra bloqueada comnmente se utiliza un
anticuerpo primario monoclonal o policlonal especfico
para los antgenos que se busca detectar y dependiendo
de

la

disponibilidad

de

reactivos

si

de

las

caractersticas y objetivo de la tincin, se busque

incrementar la sensibilidad o la especificidad de la
tcnica. A pesar de que el emplear tcnicas indirectas
puede incrementar el fondo de la tincin, en muchos
casos es necesario incrementar la sensibilidad para
conseguir la deteccin del antgeno en cuestin.
Tambin cabe mencionar que muchas de las tcnicas
tienen como objetivo la deteccin de anticuerpos
especficos en el suero de los individuos, como sucede
en fenmenos de autoinmunidad. En cualquiera de los
casos se deben estandarizar los periodos y temperatura
de incubacin con cada uno de los reactivos, as como
realizar la titulacin de los mismos con el fin de
determinar la concentracin ptima obtener en la tincin
la

mxima

seal

especfica

el

menor

fondo

inespecfico. En todos los casos en la incubacin se

debe evitar que la muestra se deshidrate mediante el
empleo de cmaras hmedas, ya que si la muestra se
seca en cualquiera de los pasos de incubacin se
incrementar el pegado inespecfico y con ello el fondo
de la tincin.
Figura 1. Sistemas de deteccin en
inmunohistoqumica

59

La incubacin con los reactivos para deteccin sigue los mismos principios que los
mencionados para los anticuerpos primarios, con la diferencia que en la mayora o
prcticamente todos los casos los anticuerpos empleados son de tipo policlonal. Tambin
pueden emplearse avidina o estreptavidina como sistema de deteccin cuando el anticuerpo
primario se encuentra conjugado con biotina. Existen sistemas de deteccin que utilizan
molculas con las cules se permite que exista un mayor nmero de anticuerpos conjugados
que detecten los antgenos, como ejemplo se tiene a molculas de dextrana con mltiples
anticuerpos unidos a ella y permiten la amplificacin de la seal, sobretodo cuando los
antgenos a detectar se encuentran en baja cantidad en la muestra. En todos los casos estos
reactivos secundarios estarn conjugados con molculas que permitan la deteccin del
antgeno en la muestra directamente o mediante la adicin posterior de una solucin reveladora
que contendr por ejemplo el sustrato y una sustancia cromognica en caso de que el sistema
de deteccin dependa de la accin de una o varias enzimas en el caso de la tincin mltiple. Es
importante en este paso que la totalidad de la muestra este inmersa o cubierta con la dilucin
del conjugado.

Despus de lavar adecuadamente las preparaciones para eliminar al mximo el exceso de

conjugado si la tcnica es inmunoenzimtica se procede a agregar la solucin reveladora que
contiene el sustrato y el cromgeno especficos para la enzima del sistema de deteccin.
Existen varias sustancias cromognicas utilizadas en las tinciones inmunohistoqumicas que
pueden ser utilizadas con las enzimas ms comnmente utilizadas como peroxidasa de rbano,
fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa, y que tienen diferentes caractersticas de color y
solubilidad, lo que permite implementar tcnicas de tincin doble con la seleccin adecuada de
reactivos para detectar dos antgenos simultneamente en la misma preparacin. Es importante
la estandarizacin de los tiempos necesarios para el desarrollo de la coloracin ptima de la
tincin, frecuentemente esto se realiza directamente con la observacin de las laminillas en el
microscopio. Tambin se pueden realizar tinciones dobles empleando conjugados fluorescentes
en las cuales se detectan los antgenos diferentes empleando fluorocromos que se exciten con
luz de la misma o diferente longitud de onda y que emitan luz con diferente longitud de onda,
para realizar el anlisis de microscopia de fluorescencia e incluso por microscopia confocal para
determinar colocalizacin.

La preparacin finalmente debe ser contrateida en las tcnicas que permitan la observacin
simultanea de los detalles morfolgicos de las clulas o tejidos estudiados, como sucede en

60

tcnicas enzimticas, en las cuales comnmente se utiliza hematoxilina para evidenciar los
ncleos de las clulas y en este caso tambin debe estandarizarse el tiempo ptimo para la
contratincin o tincin de contraste. En esta caso se debe considerar el solvente en el cual se
encuentra preparado el colorante para no eliminar de la muestra el cromgeno en caso de que
el producto colorido sea soluble en dicho solvente, por ello en muchos casos se prefiere evitar
tinciones con hematoxilina en alcohol. Otra consideracin en este tipo de tcnicas es el inters
en poder conservar las preparaciones mediante montaje permanente, para lo cual tambin se
debe tomar en cuenta las caractersticas de solubilidad en alcohol del producto colorido. Como
en toda prueba o tcnica para diagnstico o investigacin es importante el contemplar controles
positivos, negativos y otros que sean necesarios para dar soporte a los resultados obtenidos.

Tabla 3: Cromgenos utilizados en

inmunohistoqumica.

Figura 2. Tincin inmunohistoqumica doble. Se

muestra la tincin secuencial con peroxidasa de rbano y
fosfatasa alcalina de un corte de linfonodo para la
deteccin de cadenas ligeras y .

61

USOS DE LAS TCNICAS INMUNOCITOQUMICAS E INMUNOHISTOQUMICAS

Las tcnicas de inmunocitoqumica e inmunohistoqumica tienen diversas aplicaciones en
diferentes campos de las ciencias biomdicas sin limitarse a uno de ellos en particular tanto en
estudios in vitro como in vivo. En inmunologa tiene aplicaciones en inmunologa bsica
utilizndose en una gran variedad de estudios morfolgicos y fisiolgicos de clulas, tejidos y
rganos del sistema inmune; induccin y activacin de la respuesta inmune, ontogenia y
filogenia del sistema inmune o en estudios de inmunologa comparada; en inmunologa clnica
en

estudios

de

inmunopatologa

como

en

hipersensibilidades,

autoinmunidad

inmunodeficiencias; en inmunologa diagnstica para el diagnstico de enfermedades

infecciosas virales, bacterianas, micticas y parasitarias. En biologa celular y molecular para
estudios de morfologa y fisiologa celular como aquellos que involucran el citoesqueleto,
marcadores celulares, ciclo celular, etc. Una de las reas con mayor desarrollo en el campo de
la inmunocitoqumica e inmunohistoqumica es la patologa, en particular en estudios
oncolgicos que permiten el diagnstico, clasificacin y determinacin del grado de malignidad
de neoplasias a partir de biopsias o aspirados de tejido neoplsico o de linfonodos regionales
con el fin de determinar metstasis a partir del tumor primario, deteccin de las alteraciones a
nivel gentico asociadas con diferentes neoplasias para lo cual pueden complementarse con
tcnicas moleculares como hibridacin in situ, deteccin de marcadores de linaje o
diferenciacin celular.

DESPARAFINIZADO Y TINCIN DE DE MUESTRAS EMBEBIDAS EN PARAFINA

POR INMUNOHISTOQUMICA (Tcnica empleada en CINVESTAV)
Todas las incubaciones se hacen en cmara hmeda y debe evitarse que la muestra se seque
una vez desparafinizada.
1. La laminilla deber haber estado a 40 C toda la noche en horno para adherir bien el tejido
al vidrio.
2. La laminilla se sumerge en xilol por 15 y se repite la operacin en otro bao de xilol.
3. Se procede a rehidratar la muestra 2 veces en alcohol absoluto.
4. Se bloquea la peroxidasa endgena en metanol absoluto adicionado con 2 % de perxido
de hidrgeno, por 45.
5. El tejido se lava con PBS tres veces (3 c/u) y se pone suero normal de cabra (frasco 1) por
45 en cmara hmeda.
6. Se decanta el suero y se pone el anticuerpo monoclonal (MAb) a la concentracin ptima.
Se incuba 2 hrs en cmara hmeda.
7. Se lava con PBS, tres veces y se incuba con el anticuerpo secundario (cabra anti-ratn
biotinilado, frasco 2), 45 en cmara hmeda.

62

8. Se vuelve a lavar con PBS, tres veces, y se incuba con estreptavidina-peroxidasa (frasco 3)
por 45 en cmara hmeda.
9. Se lava 3 veces con PBS y se aade el substrato (DAB), vigilando la reaccin bajo
microscopio y detenindola sumergiendo la laminilla en PBS o agua.
10. Se contratie con hematoxilina de Harris por unos segundos, se azulea con agua de la llave
y, de ser necesario, se destie con alcohol cido.
11. La laminilla se deshidrata con alcoholes seriados (70-100 %) y en xilol dos veces.
12. Se monta en resina sinttica y se deja secar 12 hrs.
Con esta tcnica las clulas que fueron reconocidas por el anticuerpo, y que posteriormente son
reveladas con DAB se tien de color caf y la hematoxilina nos sirve como color de contraste.

METODOLOGA
Se observaran al microscopio diferentes cortes histolgicos de rganos y/o tejidos teidos como
se describi en la tcnica.

BIBLIOGRAFA
1. Dabbs DJ. (2010). Diagnostic Immunohistochemistry.. Theranostics and Genomic Applications, 3rd
edition. Saunders Elsevier, USA.
2. Hofman FM & Taylo CR. (2013). Immunohistochemistry. En Current Protocols in Immunology 21.4.2121.4.26, DOI: 10.1002/0471142735.im2104s103, John Wiley & Sons, Inc. USA
3. Taylor, CR. & Rudbeck L. (editors). (2013). Immunochemical Staining Methods Handbook, 6rd edition.
Dako, Agilent Technologies. USA.

63

PRCTICA 11

ELECTROFORESIS
Dr. Marco Antonio Vega Lpez y QFB Ladislao Palomar Morales

OBJETIVO

Realizar la separacin de una mezcla de protenas sometindolas a un campo elctrico

utilizando como soporte un gel de poliacrilamida.

RELACIN CON LOS CONTENIDOS TEORICOS DEL PROGRAMA

En la Unidad tres se estudian los Mecanismos Especficos de Defensa, abordndose en el
punto 3.3 y 3.10 los conceptos de Antgeno e inmunoglobulinas, respectivamente, ambos de
naturaleza protenica principalmente. Plantendose adems como contenido prctico la
separacin y purificacin de anticuerpos.

INTRODUCCIN
La electroforesis puede definirse como un tamizado molecular a travs de un gel de corrimiento.
En algunos geles, como los de agarosa, los poros no son homogneos y son suficientemente
grandes como para no impedir la migracin de la mayora de las molculas protenicas, por lo
que aqu la separacin depender fundamentalmente de su carga neta. En los geles de
poliacrilamida, modificando las condiciones de la polimerizacin, pueden producirse poros de
diferentes dimetros, por lo que, para un gel de determinado poro, el tamao molecular y la
carga neta sern los factores determinantes de la separacin de las molculas de una mezcla.
Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerizacin, de la acrilamida
(CH 2 CH CO NH2 ) y

de

su

entrecruzamiento

con

la

N-N-metilen

bisacrilamida

(CH2 CH CO NH CH2 NH CO CH CH 2 ) . El poro del gel formado depender de las

concentraciones relativas de ambos reactivos durante la polimerizacin. La polimerizacin de la

acrilamida necesita de un iniciador del proceso. Los ms comnmente usados son el persulfato

64

de amonio y la riboflavina. Se aade, adems, como catalizador N,N,N',N'-tetrametil

etilendiamina (TEMED). El persulfato de amonio-TEMED cataliza la formacin de radicales
libres, lo que inicia la polimerizacin. La base libre TEMED retarda la polimerizacin.
La electroforesis en geles de poliacrilamida se realiza en condiciones fijas de pH, conteniendo
dodecilsulfato de sodio (SDS),para eliminar la carga intrnseca del pptido ante el exceso de
carga negativa del SDS; como consecuencia, la carga de todas las molculas ser
prcticamente idntica, por lo que su desplazamiento en un campo elctrico, en un gel de
determinada porosidad, depender exclusivamente de su tamao molecular. Por lo que
comparando su movilidad con sustancias de peso molecular conocido, que se corren
simultneamente, se determina el peso molecular relativo de las protenas a analizar.
La electroforesis en gel de poliacrilamida se desarrolla usando sistema amortiguadores
continuos o discontinuos. En el primer caso, los iones que constituyen la solucin
amortiguadora durante todo el recorrido de la muestra (gel separador) son los mismos y el pH
es constante. En algunas situaciones slo puede variar la concentracin inica en los vasos de
contencin o tanques. Cuando se usan estos sistemas, las muestras a analizar se colocan
directamente en el gel separador. En los sistemas discontinuos, la solucin amortiguadora de
los geles y el de los tanques de los electrodos son diferentes. Normalmente el pH de ambas
soluciones amortiguadoras es diferente. Las muestras a analizar se colocan en un gel de poro
grueso (gel concentrador), que se ha hecho polimerizar sobre el gel separador (pH 8.8). La
solucin amortiguadora del recipiente que contiene el ctodo es Tris-glicina con pH 8.3.
Si la muestra ha sido reducida con 2-mercaptoetanol (u otro reductor como el ditiotreitol), los
enlaces disulfuro intra e intercatenarios se disocian, la estructura cuaternaria se pierde y las
subunidades se separan como cadenas polipeptdicas individuales.

TINCIN CON AZUL DE COOMASSIE

Una vez terminado el corrimiento electrofortico, el gel se coloca en azul de Coomassie, para
teir las protenas corridas. Este colorante permite detectar de cantidades hasta a 0.1 g de
cualquier protena en una banda fina. Dado que el colorante es preparado con cido actico, la
fijacin de las protenas y su coloracin ocurren al mismo tiempo.

65

MATERIAL

REACTIVOS

Cmara de electroforesis con accesorios

Fuente de poder
2 vasos de precipitados de 50 mL
2 vasos de precipitados de 200 mL
1 vaso de precipitados de 500 mL
1 matraz Erlenmeyer
1 pipeta Pasteur y propipeta
1 tringulo de porcelana
1 tripie
Tela de asbesto
Mechero
Tubos Eppendorf
Micropipetas y puntas para micropipetas
Gradilla de unicel para colocar muestras
Bao Mara
Recipiente hermtico
Agitador
Embudo y tringulo de porcelana
Transluminador
Regla

Solucin de monmeros
TEMED
SDS al 10%
Persulfato de amonio al 10%
Amortiguador TRIS-HCl pH = 6.8 y pH = 8.8.
Agar noble al 1%
Agua destilada
Solucin reguladora de corrimiento
Solucin reguladora de muestra
Marcadores de peso molecular
Muestras a separar
Solucin de azul de Coomassie
Soluciones decolorantes I y II
Carbn activado

*Opcional
2-mercaptoetanol, urea 6 M o enzimas

DIAGRAMA DE FLUJO
Preparacin
de las
muestras

Preparacin
de la cmara

R1

Colocar las muestras en

la cmara

R2

R3

Correr la
electroforesis

Teir el gel

Determinar el Rf de las
diferentes protenas y
calcular sus pesos
moleculares

R1:El polmero de acrilamida aunque no es un residuo peligroso, se debe incinerar

R2:La solucin de corrimiento del tanque inferior puede reutilizarse dos o tres veces; la del tanque
superior deber neutralizarse antes de ser desechada al drenaje

66

R3: Los decolorantes I y II deben filtrarse con carbn activado para su recuperacin y posterior
reutilizacin; En caso de desecharse deben guardarse en contenedores destinados para ello. El
papel filtro debe ser incinerado.

METODOLOGA
5. Ensamblar los cristales de la cmara de electroforesis, sellar tres lados con agar y dejar
secar.
6. Preparar el gel separador, a la concentracin deseada (ver tabla en el anexo), el persulfato
de amonio y el TEMED, se agregan a la mezcla justo antes de verterla en la cmara; verter
el gel hasta una altura de aproximadamente 75% de la cmara, cubrir con 150 l de
isopropanol, dejar gelificar y desechar el isopropanol.
7. Preparacin del gel concentrador, en forma semejante al gel separador, y verter en la
cmara; colocar el peine para formar los carriles.
8. En tubos Eppendorf colocar de 20 a 30 g de la muestra a separar y agregar el mismo
volumen de la solucin reguladora de muestra; hervir 3 minutos en bao Mara.
9. Llenar los tanques superior e inferior con la solucin de corrimiento.
10. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular, en los carriles, con micropipeta.
11. Conectar los cables de la corriente elctrica en los polos correspondientes, prender la
fuente de poder a 100 volts, dejar correr hasta la separacin total de los antgenos.
12. Una vez terminada la electroforesis desmontar la cmara y retirar el gel; teir el gel con azul
de Coomassie.
13. Desteir el gel con el decolorante I (cido actico, metanol y agua), se deben observar
bandas de antgeno reveladas y finalmente colocar en decolorante II.
14. Colocar en el transluminador y medir la distancia recorrida por el frente del disolvente y
cada una de las muestras, para calcular el Rf de cada protena y de los marcadores de
peso molecular.

Rf

distancia recorrida por la muestra

distancia del frente de corrimiento

67

Ejemplo de bandas de Protenas en una electroforesis

RESULTADOS
Grafica de Rf vs. Log del peso molecular de los marcadores de peso molecular.
Tabla de Rf y peso molecular de las protenas de las muestras.

PRECAUCIONES
1. La cmara de electroforesis debe quedar bien ensamblada y bien sellada con el
agar.
2. Manejar con guantes la acrilamida y bisacrilamida, ya que son carcingenos.
3. Preparar correctamente los geles, ya que pueden fragmentarse, no gelificar o no
separar adecuadamente las protenas.
4. Cuidar el proceso de decoloracin, para evitar decolorar totalmente las protenas

DISCUSIN
Discutir la importancia de la electroforesis para la separacin, purificacin e identificacin de
antgenos y anticuerpos.

BIBLIOGRAFA
1. Cultek. (2006). Soluciones Western Blot. [En lnea]
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/CULTEK-TecnicaWB.pdf, obtenida el 31 de junio de 2011.
2. Laemmli, V. K. (1970). Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head
Bacteriophage t. Nature. 227: 680-685.
3. Margini, Ricardo Anibal. (1996). Inmunologa e Inmunoqumica. 5 edicin. Editorial Panamericana.
Buenos Aires, Argentina. p. 976.
4. Towbin. H. Stahehelin, T, Gordon. (1979). Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide
Gels to Nitrocellulose-Sheets; procedure and some applications, proc, Nat, Acad. Sci, USA, 76 (9):
4350-4354.

68

APNDICE: PREPARACIN DE REACTIVOS

Tris/HCl 1.5 M pH 8.8
Pesar 18.15 g de Tris
Disolver el Tris en 50 mL de agua destilada
Aadir gota a gota HCl concentrado para ajustar el pH a 8.8
Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL)
Tris/HCl 1 M pH 6.8
Pesar 12.1 g de Tris
Disolver el Tris en 50 mL de agua destilada
Aadir gota a gota HCl concentrado para ajustar el pH a 6.8
Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL)
SDS 10 % (p/v)
Pesar 10 g de SDS
Aadir agua destilada hasta completar el volumen de 100 mL
Glicerol 50 % (v/v)
Tomar un volumen de 50 mL de glicerol al 100 %
Aadir 50 mL de agua destilada
Azul de bromofenol 1 % (p/v)
Pesar 100 mg de azul de bromofenol
Completar con agua destilada hasta 10 mL y mezclar hasta disolver
Filtrar la solucin en papel Whatman No 1 para eliminar el colorante no disuelto
Acrilamida 30%
La solucin de acrilamida al 30 % (p/v) es una mezcla de acrilamida (29.2 g) y bisacrilamida
(0.8 g).
Pesar ambos reactivos y aadir agua destilada hasta 100 mL
Filtrar en papel de filtro Whatman No1
Persulfato de amonio al 10 % (p/v)
Pesar 0.5 g de sulfato de amonio
Disolver en 5 mL de agua destilada
Solucin Amortiguadora de Corrimiento
Pesar 3 g de Tris (25 mM)
Pesar 14.4 g de glicina (192 mM)
Pesar 1 g de SDS (0.1 %)
Aadir agua destilada hasta completar 1 L
NOTA: El pH debera ser de aproximadamente 8.3. Se puede preparar una solucin 10
veces ms concentrada y diluir el volumen necesario en el momento del corrimiento. Esta
solucin puede almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente.
Solucin Reguladora de muestra 2X
0.24 mL de Tris/HCl 1M pH 6.8
2 mL de Glicerol 50 %
0.8 mL de SDS 10 %
0.5 mL de 2-mercaptoetanol* Opcional
0.5 mL de azul de bromofenol
0.96 mL de agua destilada

69

CANTIDADES PARA LA PREPARACIN DE GELES POLIACRILAMIDA.

Gel Separador
6%

Cantidad a preparar
5 mL

10mL

15 mL

20 mL

25 mL

30 mL

40 mL

50 mL

H2O

2.7

5.3

8.0

10.6

13.3

15.9

21.1

26.5

30 % Acrilamida Mix
1.5 M Tris (pH 8.8)

1.0
1.3

2.0
2.5

3.0
3.8

4.0
5.0

5.0
6.3

6.0
7.5

8.0
10.0

10.0
12.5

10 % SDS
10 % APS

0.05
0.05

0.1
0.1

0.15
0.15

0.2
0.2

0.25
0.25

0.3
0.3

0.4
0.4

0.5
0.5

TEMED

0.004

0.008

0.012

0.016

0.02

0.024

0.032

0.04

5 mL

10mL

15 mL

20 mL

30 mL

40 mL

8%

25 mL

50 mL

H2O

2.3

4.6

7.0

9.3

11.6

13.9

18.6

23.2

30 % Acrilamida Mix
1.5 M Tris (pH 8.8)

1.3
1.3

2.7
2.5

4.0
3.8

5.3
5.0

6.7
6.3

8.0
7.5

10.7
10.0

13.4
12.5

10 % SDS
10 % APS

0.05
0.05

0.1
0.1

0.15
0.15

0.2
0.2

0.25
0.25

0.3
0.3

0.4
0.4

0.5
0.5

TEMED

0.003

0.006

0.009

0.012

0.015

0.018

0.024

0.03

5 mL

10mL

15 mL

20 mL

25 mL

30 mL

40 mL

50 mL

H2O

2.0

4.0

5.9

7.9

9.9

11.9

15.8

20.0

30 % Acrilamida Mix
1.5 M Tris (pH 8.8)

1.7
1.3

3.3
2.5

5.0
3.8

6.7
5.0

8.3
6.3

10.0
7.5

13.3
10.0

16.6
12.5

10 % SDS
10 % APS

0.05
0.05

0.1
0.1

0.15
0.15

0.2
0.2

0.25
0.25

0.3
0.3

0.4
0.4

0.5
0.5

TEMED

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.016

0.02

10%

5 mL

10mL

15 mL

20 mL

25 mL

30 mL

40 mL

50 mL

H2O

12%

1.7

3.3

5.0

6.6

8.3

9.9

13.2

16.4

30 % Acrilamida Mix
1.5 M Tris (pH 8.8)

2.0
1.3

4.0
2.5

6.0
3.8

8.0
5.0

10.0
6.3

12.0
7.5

14.0
10.0

20.0
12.5

10 % SDS
10 % APS

0.05
0.05

0.1
0.1

0.15
0.15

0.2
0.2

0.25
0.25

0.3
0.3

0.4
0.4

0.5
0.5

TEMED

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.016

0.02

5 mL

10mL

15 mL

20 mL

25 mL

30 mL

40 mL

50 mL

H2O

15%

1.2

2.3

3.5

4.6

5.7

6.9

9.2

11.4

30 % Acrilamida Mix
1.5 M Tris (pH 8.8)

2.5
1.3

5.0
2.5

7.5
3.8

10.0
5.0

12.5
6.3

15.0
7.5

20.0
10.0

25.0
12.5

10 % SDS

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.4

0.5

10 % APS

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.4

0.5

TEMED

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.016

0.02

Gel Concentrador

1 mL

2 mL

3 mL

4 mL

5 mL

6 mL

8 mL

10 mL

H2O
30 % Acrilamida Mix
1.0 M Tris (pH 6.8)
10 % SDS
10 % APS
TEMED

0.68
0.17
0.13
0.01
0.01
0.001

1.4
0.33
0.25
0.02
0.02
0.002

2.1
0.5
0.38
0.03
0.03
0.003

2.7
0.67
0.5
0.04
0.04
0.004

3.4
0.83
0.63
0.05
0.05
0.005

4.1
1.0
0.75
0.06
0.06
0.006

5.5
1.3
1.0
0.08
0.08
0.008

6.8
1.7
1.25
0.1
0.1
0.01

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PRCTICA 12
INMUNOELECTROTRANSFERENCIA
QFB Ladislao Palomar Morales

OBJETIVO

Realizar la transferencia de protenas separadas electroforticamente de un gel de

poliacrilamida hacia una membrana, de tal manera que se conserve el perfil electrofortico.

Realizar el reconocimiento de protenas, separadas por electroforesis y transferidas a un

soporte slido (por ejemplo: papel de nitrocelulosa), por medio de anticuerpos y su posterior
revelado con el uso de conjugados, sustratos y cromgenos.

RELACIN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TERICO

En la Unidad 3 se estudian los Mecanismos Especficos de Defensa (MED); en los puntos 3.3
antgenos y antigenicidad, 3.10 Estructura y funcin de inmunoglobulinas y 3.11 reaccin
antgeno cognato, plantendose adems como prctica de laboratorio la conjugacin y
manipulacin de inmunoglobulinas.

INTRODUCCIN
La inmunoelectrotransferencia (o Western blot) se realiza en tres etapas:
1. Electroforesis
2. Transferencia
3. Revelado
La primera de ellas, la electroforesis, es semejante a la realizada la clase pasada. La
electroforesis difiere en que slo se forman dos carriles en el gel; uno pequeo para los
marcadores de peso molecular y otro grande para la muestra.
La segunda de ellas, la transferencia de protenas o botn supone la inmovilizacin de las
protenas sobre membranas sintticas, seguido de la deteccin empleando sistemas
especialmente diseados para la tincin de blogs.

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El mtodo para protenas ms potente es el denominado Western blot en el que las protenas
son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes Y posteriormente se transfieren a una membrana, mediante la
aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel (electroblotting). Una vez completada esta
operacin las protenas de inters son reveladas por el agregado de un anticuerpo especfico.
El nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Brete
(Analytical Biochemistry, 112:195-203, 1981) como un juego de palabras por los nombres
Southern y Northern de las tcnicas que se usan con el mismo fin pero que son aplicadas a los
cidos nucleicos. Luego que Edwin Southern diseara la tcnica que lleva su nombre para
detectar ADN, por oposicin se denomin Northern a la tcnica aplicada al ARN. Finalmente
como una broma, la tcnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para protenas fue
denominada Western
El electroblotting es el mtodo donde las protenas son transferidas desde el gel a la membrana
electroforticamente. El procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja
plana papel de filtro empapado en buffer de transferencia, el gel, la membrana en contacto
directo con el gel, ms papel de filtro y finalmente una esponja plana. Este conjunto se recoge
entre dos capas de plstico perforado (cartucho) y se introduce en una cmara en la que se
encuentra una solucin amortiguadora de transferencia y dos electrodos planos (diseados para
conseguir un campo uniforme en toda la superficie del gel). Se dispone de forma que el gel
quede hacia el nodo (-) y la membrana hacia el ctodo (+) (figura 1). La carga neta de las
protenas en el caso de los geles de SDS-PAGE es negativa debida a la carga del SDS.

Figura 1. Armado del cartucho de transferencia

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La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separacin entre electrodos), que suele
corresponder a 0.3 a 2 Ampere, de 1 a 4 horas. La velocidad de transferencia es inversamente
proporcional al tamao de la protena. El proceso provoca un fuerte calentamiento de la
solucin por lo que se recomienda refrigerar el sistema y recircular el amortiguador.
Una vez realizada la transferencia la membrana se puede analizar inmediatamente o bien
conservarla en fro (2 a 8 C) durante meses.
La tercera etapa consta de tres reacciones sobre la membrana, las primeras dos de ellas son
reacciones inmunolgicas, cuya velocidad puede ser modificada por factores como: La
concentracin de los reactivos, la temperatura, el pH, etc.
En la primera reaccin el antgeno pegado al papel de nitrocelulosa interacciona con su
anticuerpo especfico:
Ag + Ab AgAb

Una segunda reaccin ocurre entre este complejo y un anticuerpo ligado a una molcula para
hacer visible la reaccin:
AgAb + AbM AgAbAbM

Y finalmente esta molcula reacciona para hacer visible la reaccin.

Esta molcula puede ser una enzima, un flourocromo, o un istopo radiactivo:
En el caso de la enzima se agrega el sustrato y un cromgeno;
En el caso de un flourocromo se hace incidir luz de determinada longitud de onda.

Figura 2. Esquema de las reacciones en el papel de nitrocelulosa

73

Parte importante de esta tcnica es la eliminacin de las molculas que no han reaccionado,
formando enlaces permanentes (covalentes), mediante el uso de tensoactivos suaves como el
tween 20.

DIAGRAMA DE FLUJO
Electroforesis de
IgG Humana

Formar el cartucho
para transferir

Transferir

Hidratar membrana de
nitrocelulosa, papel filtro y
esponjas en amortiguador de
transferencia

R2

R1
Revisar la transferencia
con rojo de Ponceau

R3

R3

Eliminar el colorante con

agua destilada

Bloquear la membrana con

Leche descremada

R5

Diluir el suero de
ratn con solucin
de bloqueo

Cortar el papel de nitrocelulosa

en tiras de3 a 5 mm
Colocar el nmero de tiras
necesarias en los carriles

Agregar el suero problema e

incubar. Lavar
Diluir el conjugado
con solucin de
bloqueo

Preparar el
sustrato/cromgeno

R4

R6

Agregar el conjugado e
incubar

Agregar el sustrato y cromgeno

Detener la reaccin

R7

R8

R1: Residuos de electroforesis, ver prctica anterior.

R2: Amortiguador de transferencia, puede ser reutilizado dos o tres veces, el residuo final se coloca en un
contenedor adecuado.
R3: La solucin de rojo de Ponceau, puede ser reutilizada varias veces.
R3a: El agua de los lavados del rojo de Ponceau, se puede tirar al drenaje.
R4, R5, R6, R7 y R8: Se colocan en la palangana con cloro, antes de desecharlos al drenaje.

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MATERIAL

REACTIVOS

Cmara de electroforesis con accesorios

Cmara de transferencia con accesorios
Micropipetas y puntas para micropipetas
Papel de nitrocelulosa
Fuente de poder
2 vasos de precipitados de 50 mL
2 vasos de precipitados de 200 mL
1 vaso de precipitados de 500 mL
1 matraz Erlenmeyer
1 pipeta Pasteur y propipeta
1 tringulo de porcelana
1 tripie
Tela de asbesto
Mechero
Tubos Eppendorf
Gradilla de unicel para colocar muestras
Bao Mara
Pipeta.
Pinzas y Bistur.
Regla
Placa de pozos para tiras de papel de
nitrocelulosa
Agitador

Solucin de monmeros
TEMED
SDS al 10%
Persulfato de amonio al 10%
Amortiguador TRIS-HCl pH = 6.8 y pH = 8.8.
Muestras a separar (IgG humana purificada)
Marcadores de peso molecular
Agar noble al 1 %
Agua destilada
Solucin reguladora de corrimiento
Solucin reguladora de muestra
Amortiguador de transferencia
Tiras de papel de nitrocelulosa
Rojo de Ponceau
Solucin bloqueadora
Sueros problema
Conjugado (anticuerpo-enzima)
Solucin de lavado: PBS-tween 20
Sustrato para la enzima y cromgeno

*Opcional
2-mercaptoetanol, urea 6 M o enzimas

METODOLOGA
1. Una vez terminada la electroforesis, desmontar el gel y colocar en solucin reguladora de
transferencia
2. Hidratar la membrana de nitrocelulosa durante 10 segundos en metanol, aclarar en agua
destilada y poner en la solucin reguladora de transferencia.
3. Hidratar en la solucin reguladora de transferencia las esponjas y el papel filtro.
4. Llenar con la solucin amortiguadora de transferencia la cmara de transferencia hasta el
85 %.
5. Colocar en la posicin adecuada en funcin de los electrodos, una esponja, un papel de
filtro y el gel PAGE-SDS.
6. Sobre el gel perfectamente plano, colocar cuidadosamente la nitrocelulosa, y alisar varias
veces MUY CUIDADOSAMENTE con un tubo de ensayo para eliminar las burbujas de aire.
7. Cubrir de nuevo con papel de filtro y esponja. Colocar el cartucho en la cmara de
transferencia; Transferir a 125 mA, por 1 hora.

75

8. Teir el papel de nitrocelulosa con rojo de Ponceau, para comprobar si se realiz la

transferencia.
9. Decolorar con agua destilada, incubar con la solucin bloqueadora durante 2 Hr a
temperatura ambiente o toda la noche a 4 C.
10. Cortar el papel de nitrocelulosa en tiras de 3 a 5 mm de ancho.
11. Colocar las tiras de papel de nitrocelulosa en los carriles de la placa.
12. Incubar las tiras de papel, con 1.5 mL de los sueros problema diluidos 1/100 con solucin
bloqueadora, e incubar 20 minutos a temperatura ambiente; decantar el sobrenadante.
13. Lavar 5 veces, con la solucin de lavado, por 1 minuto cada vez.
14. Incubar las tiras de papel, con 1.5 mL del conjugado diluido 1/10 000 en solucin
bloqueadora, por 20 minutos a temperatura ambiente; decantar el sobrenadante.
15. Lavar 5 veces con la solucin de lavado, por 1 minuto cada vez.
16. Incubar las tiras de papel, con 1.5 mL de la mezcla sustrato/cromgeno hasta la aparicin
de las bandas.
17. Agregar 0.5 mL de la solucin de paro; decantar el sobrenadante.
18. Secar las tiras al aire.

RESULTADOS
Indicar el PM de las protenas del extracto antignico que son reconocidas por cada uno de los
sueros problemas.

BIBLIOGRAFA
1. CulteK. (2006). Soluciones Western Blot. [En lnea]
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/CULTEK-TecnicaWB.pdf, obtenida el 31 de junio de 2011.
2. Laemmli, V. K. (1970). Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head
Bacteriophage Nature . 227: 680-685 pp.
3. Margini, Ricardo (Anibal). 1996 Inmunologa e Inmunoqumica. 5 edicin. Editorial Panamericana.
Buenos Aires, Argentina. 976 pp.
4. Towbin. H. Stahehelin, T, Gordon. (1979). Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide
Gels to Nirtocellulose-Sheets; procedure and some applications, proc Nat Acad Sci, USA, 76 (9):
4350-4354 pp.

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ANEXO PREPARACIN DE REACTIVOS

Reactivos para la electroforesis
Ver prctica anterior
Amortiguador de transferencia (segn Laemmli)
Tris -HCL 50 mM, glicina 0.196 M, pH 8,3 con 20 % de metanol aadido
Solucin de rojo de Ponceau
Rojo Ponceau S al 0.5 % y cido tricloroactico al 5 % en agua destilada.
Solucin Bloqueadora
Debe ser una protena inerte al sistema inmune, las ms usadas son albmina, casena o
gelatina.
Albmina bovina al 1 % (casena al 1% o gelatina al 1 %) en PBS pH 7.2; no utilizar azida de
sodio (inhibe la peroxidasa). Para algunos procedimientos se puede agregar Tween 20 al
0.05 %.
Sueros y anticuerpos
Todos los sueros y anticuerpos deben ser diluidos en solucin bloqueadora.
Solucin de lavado
PBS pH 7.2 con Tween-20 al 0.05%.
Solucin de paro
cido sulfrico 2N.
Solucin de sustrato cromgeno (para peroxidasa)
Para 60 mL, disolver 30 mg de 4-Cloro-1-naftol en 10 mL de metanol (proteger de la luz).
Agregar 50 mL del amortiguador Tris pH 7.5 y 25 L de perxido de hidrgeno concentrado
(35 %).

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