11/08/2015

Unidade I Engenharia Bioqumica

1. INTRODUO
1.1 Histrico e Evoluo
Desde tempos remotos o homem produz bebidas alcolicas,queijos,
coalhada e vinagre
Po fermentado por leveduras encontrado em pirmides egpcias
construdas h milnios.
Vinho Grcia antiga
Cerveja 2000 a.C.
At meados do sc. XIX, o homem no conhecia as causas da
fermentao

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Histrico e Evoluo
Em 1857 Pasteur demonstrou que a fermentao alcolica era
produzida por leveduras e que vrias doenas eram causadas por
microrganismos
No incio do sc. XX j se produzia levedura de panificao em
tanques abertos e aerados
Em 1923 Pfizer inaugurou 1. fbrica para obteno de cido ctrico
por fermentao, utilizando Aspergillus niger
Em 1928 Alexander Fleming descobriu a penicilina produzida por

bolor da famlia Penicilium

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

11/08/2015

Histrico e Evoluo
Na 2. Guerra Mundial penicilina foi industrializada e nasce a
Engenharia Bioqumica

Bioqumica Industrial

POR QUE????
Grupo de profissionais (multidisciplinar) transformou em processo
industrial a tcnica de laboratrio, ento conhecida, de produo de
penicilina por fermentao
Condies estritamente asspticas, o que levou a:
Design de novos fermentadores
Tcnicas de operao e equipamentos, de forma que perfeita
esterilidade fosse obtida

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Histrico e Evoluo

Desenvolvimento de novas tcnicas de filtrao, extrao, e

concentrao origem a tcnicas modernas de extrao e
purificao de produtos de origem biolgica.
Atualmente usadas para produo de diversos produtos
antibiticos, Vitaminas (B2, B12, C), enzimas, bioaromas, aas,
entre outros
Equipamentos e operaes empregados nos processos fermentativos
similares aos dos processos qumicos

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

11/08/2015

Unidade I Bioqumica Industrial

1.2 O que Bioqumica Industrial?
Ramo da eng. qumica combina microbiologia, bioqumica e eng.
qumica
Processos biotecnolgicos industriais = processos nos quais ocorre a
transformao de MP em produtos atravs da ao de material de
origem ou carter biolgico, ou seja, clulas (microbianas, animais ou
vegetais) ou enzimas.
Eng.

Bioqumico

microbiologistas

transforma
bioqumicos

conhecimentos
em

processos

obtidos
industriais

por

aperfeioando para aumentar sua produtividade e rendimento

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Importncia e Perspectivas
Necessrio conhecimentos de operaes unitrias, processos, cintica
de processos fermentativos, termodinmica, transferncia de calor e de
massa.
Diversidade de produtos obtidos por processos biotecnolgicos
1.3 Importncia e Perspectivas
Na indstria de alimentos Produo de bebidas alcolicas (cerveja,
vinhos, sidra, cachaa), vinagre, leites fermentados, queijos, po,
enzimas e microrganismos, fermentao ltica de hortalias e azeitonas
Na indstria farmacutica Produo de antibiticos, insulina,

vitaminas (riboflavina, cido ascrbico), vacinas, medicamentos em

geral
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

11/08/2015

Importncia e Perspectivas
Na indstria qumica Produo de lcool combustvel, solventes
orgnicos (butanol, acetona), cidos orgnicos (actico, ctrico, ltico e
glutmico).
Tratamento biolgico de resduos (lodo ativado)

Perspectivas
Uso de subprodutos de baixo custo da agricultura e da pecuria como
matrias primas das indstrias de fermentao
Com crescimento populacional e do poder aquisitivo, aumento de
consumo de alimentos e bebidas fermentados
Produo de substncias biolgicas de grande complexidade
molecular e de novos produtos.
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Unidade II Tecnologia de
Fermentao e Fermentadores
1. Introduo

Em bioqumica define-se
decomposies

qumicas

fermentao como
produzidas

nos

s trocas ou

substratos

orgnicos

mediante a atividade de MO vivos.

Existem vrias classes de fermentaes depende dos tipos de MO e
substratos envolvidos.
Processo anaerbico
Uso de cepas selecionadas de mofos, leveduras e bactrias
Processos fermentativos em escala industrial para produo de
diferentes produtos

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

11/08/2015

Unidade II Tecnologia de
Fermentao e Fermentadores
O sucesso de um dado processo fermentativo depende muito da
correta definio de 4 pontos bsicos:
Micro-organismo;

meio de cultura;
forma de conduo do processo fermentativo;
etapas de recuperao do produto.
Para produtos de alto valor agregado as operaes de recuperao
do produto podem ser responsveis por 50 a 70% do custo do produto
final.

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Processo Biotecnolgico Genrico

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

10

11/08/2015

Processo Fermentativo

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

11

Micro-0rganismos de Interesse
2. Micro-organismos de Interesse
Podem ser obtidos basicamente das seguintes formas:
a) Isolamento a partir de recursos naturais solo, gua, planta
Muito trabalho experimental alto custo
Isolamento de linhagens mais eficientes
Descoberta de novos produtos empresas de antibiticos e
enzimas
Foco inicial no que se quer produzir.

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

12

11/08/2015

Micro-organismos de Interesse
b) Compra em colees de cultura colees de cultura em vrios
pases
Contato facilitado internet
Limitao dos tipos de MO
Mais usado para obter clulas para estudo de melhoramento
gentico
- NRRL Culture Collection (EUA)
- Coleo de culturas Tropical (Campinas/SP)

13

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Micro-organismos de Interesse
c) Obteno de mutantes naturais quando uma clula prolifera, h

sempre uma pequena chance de surgimentos de mutantes naturais.

Isolar mutantes e fazer ensaios para verificar seu potencial de
produo
Alteraes

naturais

no

so

interessante

no

processo

fermentativo
d) Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
Esperar surgimento natural pode ser muito demorado
Utilizar mtodos que forcem o aparecimento de clulas
mutantes radiaes UV ou nitrosoguanidina.

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

14

11/08/2015

Micro-organismos de Interesse
e) Obteno de MO recombinantes por tcnicas de eng. gentica DNA
recombinante
Importante tcnica para produo de cl. mais produtivas ou
produtoras de produtos incomuns

Introduo de fragmentos de DNA de certas cl. em outras

Ex: sequncia metablica que leva ao acmulo de um produto de interesse (P)
a
c
b
A B C D P
Determinar a reao limitante enzima responsvel por esta reao
Identificar o gene responsvel para sntese desta enzima
Introduzir este gene em plasmdios e volt-los cl, produtora aumentar o
n de cpias do gene responsvel pela sntese da enzima = aumentar a
velocidade da reao limitante.
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

15

Micro-organismos de Interesse
3. Caractersticas desejveis de micro-organismos e meios de

cultura para aplicao industrial

O desempenho de um MO depende muito da composio do meio de cultura
em que colocado.

3.1 Caractersticas desejveis de MO

Para uma aplicao industrial MO apresentem as seguintes caractersticas
gerais:
a) Apresentar elevada eficincia na converso do S em P
principalmente devido ao custo da MP.
b) Permitir o acmulo do P no meio obter elevada concentrao do P
no caldo fermentado

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

16

11/08/2015

Microrganismos de Interesse
c) No produzir substncias incompatveis com o P de interesse
produzir uma enzima de interesse utilizando MO que tambm produz
proteases extracelulares
d) Apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico

utilizar material gentico estvel, para ter cl. competentes em termos de

acumulo de produtos
e) No ser patognico
f) No exigir condies de processo muito complexas economia do
processo
g) No exigir meios de cultura dispendiosos
h) Permitir rpida liberao do P para o meio

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

17

Meios de Cultura
3.2 Caractersticas desejveis do meio de cultura
a) Ser o mais barato possvel desde que atenda s necessidades do MO
selecionado.
b) Atender s necessidades nutricionais do MO
c) Auxiliar no controle do processo ser ligeiramente tamponado
(evitar variaes drsticas de pH), ou evitar uma excessiva formao de
espuma
d) No provocar problemas na recuperao do produto
e) Permitir algum tempo de armazenagem ter maior disponibilidade
f) Ter composio razoavelmente fixa
g) No causar dificuldades no tratamento final do efluente

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

18

11/08/2015

Inculo
3.3 Inculo
Inoculo = p-de-cuba = p-de-fermentao um volume de suspenso de
MO de concentrao adequada capaz de garantir, em condies econmicas, a
fermentao de um dado volume de mosto.

Para se ter um inoculo com capacidade produtiva elevada deve-se dar

condies para que o MO desejado seja propagado
Armazenamento de MO: conservar a cepa vivel e com capacidade produtiva,
mantendo-a com o mnimo de divises celulares quando estas ocorrem, h
possibilidade de haver mutaes.
Algumas tcnicas usadas para armazenamento de MO secagem de MO, em
terra, areia, slica ou outro material solido, conservao em agar inclinado ou
outras que limitem o metabolismo e respirao microbiana
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Inculo
Tambm pode ser por congelamento em congeladores ou em nitrognio

liquido, e remoo da gua de clulas ou esporos por liofilizao e manuteno

do material seco sob diferentes condies.
A recuperao do MO feita de diferentes maneiras o mtodo depende da
tcnica que se usou para preserv-lo.
Durante a fase de propagao do inoculo ter cuidados especiais para
evitar contaminao, e no comprometer a produo industrial.
Propagao em processos aerbios o ar fornecido ao sistema um foco
potencial de contaminao, assim deve ser esterelizado
O volume de inoculo introduzido no fermentador est normalmente ao redor
de 10% da sua capacidade til. No entanto pode variar de 0,5 a 50%.

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

10

11/08/2015

Inculo
A fase de preparo do inoculo (propagao) compreende duas fases: a de
laboratrio e a industrial.
a) A partir da cultura estoque, propaga-se o MO por meio de metodologia conveniente.
Normalmente na fase inicial passa-se do meio slido, em condies asspticas, para um
tubo de ensaio contendo meio lquido esterilizado, adequado para o desenvolvimento
microbiano.
b) Aps incubao por um determinado tempo, que depende do tipo de MO cultivado,
transfere-se o contedo desse tubo para frascos apropriados com agitadores rotativos
ou recprocos ("shakers") contendo meio esterilizado (erienmeyers lisos ou chanfrados).
c) Aps incubao, transfere-se a suspenso microbiana para frascos maiores contendo
meio nutriente esterilizado.
d) O nmero de transferncias vai depender do volume til do pr-fermentador
(germinador).

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Inculo
Todas as transferncias devem ser feitas em condies asspticas e os frascos
devidamente fechados deve permitir a entrada de ar para MO aerbios
A cada passo, os MO devem crescer rapidamente, sendo as transferncias
feitas na fase logartmica de crescimento.
Sugestes para relao entre volume que recebera a suspenso microbiana e o
volume desta nas varias etapas de propagao de inoculo so da ordem de 10
vezes, 20 vezes, mas h indicaes para valores possveis de 100 a 200 vezes.
muito importante, a indstria criar seu prprio protocolo de propagao do
inoculo.

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

11

11/08/2015

Inculo

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Mosto
3.4 Mosto
Cada MO possui condies timas de crescimento pH, temperatura, nvel de
oxignio dissolvido, entre outras.
O meio de cultivo tem influncia marcante no crescimento dos MO.
Em microbiologia chamado de meio de cultura.
Na rea de fermentaes industriais chamado de mosto
Deve possuir nutrientes requeridos para o crescimento celular, que so
classificados nos seguintes grupos:
Fontes dos elementos "principais" C, H, O e N
Fontes dos elementos "secundrios" P, K, S, Mg

Vitaminas e hormnios
Fontes de "traos" de elementos elementos em quantidades mnimas para o
crescimento microbiano - Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

12

11/08/2015

Mosto
Na formao do mosto deve-se levar em conta a necessidade desses nutrientes
O mosto alm de propiciar o desenvolvimento microbiano, deve
favorecer a formao do produto que se deseja.
A formao de um meio de cultivo deve levar em conta a composio celular, o
requerimento energtico e a necessidade de substncias especficas.
A composio elementar de uma clula microbiana depende de muitos fatores,
como condies de cultivo, espcie do MO, e at mesmo do substrato utilizado para
seu crescimento.
Um meio para crescimento microbiano deve, no mnimo, conter os elementos
presentes na clula na proporo correta.

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Mosto
As fontes de nitrognio podem ser orgnicas ou inorgnicas e de modo algum
devem faltar na composio do meio de cultivo, sob pena de limitar o crescimento

celular.
Quanto a substncias orgnicas, tais como vitaminas e aminocidos, devem fazer
parte da constituio do mosto se os MO no os sintetizarem.
Os MO, para seu crescimento, coordenam o catabolismo (que tem como funes
principais fornecer energia) e o anabolismo (onde se d a formao de
biomolculas que faro parte da constituio do MO, tais como polissacardeos,
lipdeos, protenas e cidos nuclicos).
Substrato limitante (S) para MO alm de ser a fonte de energia para as vias

do metabolismo, devem suprir necessidades da clula de C, O e H , que integraro

a composio celular e/ou o produto.

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

13

11/08/2015

Mosto
A quantidade de S no mosto ser uma funo de quanto se deseja produzir de
MO, ou de produto
No entanto, no se pode ter um mosto com [S] nestas condies, pode se
tomar inibitrio para o crescimento microbiano.
2 tipos de mostos naturais e sintticos
Naturais obtidos a partir de extratos de plantas ou animais
Exemplos: extrato de levedura (autolisado de leveduras), extrato de carne,
extrato de malte, peptona (hidrolisado de ptns), suco de uva, leite, gua de
macerao de milho, caldo de cana
meios quimicamente complexos meios bastante ricos e geralmente no
necessitam de complementao para sua utilizao como mosto.
composio varivel e indefinida durante estocagem e entres lotes

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Mosto
Sintticos elaborados quimicamente
Composio qumica bem conhecida e pode ser reproduzida a qualquer
instante.
So geralmente mais onerosos, porm podem permitir maior economia nas
etapas de recuperao do produto.
Do ponto de vista industrial, vrios fatores devem ser considerados na escolha do
mosto a ser utilizado
O custo do substrato pode ser crucial, devendo tambm ser levada em conta a
quantidade de carbono disponvel, bem corno as exigncias para sua fermentao
O custo o fator limitante da utilizao de meios sintticos em escala industrial.
Suprimento do substrato

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

14

11/08/2015

Unidade de Fermentao
Disponibilidade, variabilidade na composio da matria-prima, condies de
armazenamento, dificuldades de esterilizao do mosto, fermentescibilidade,
exigncia de tratamentos para tornar o substrato presente na matria-prima
fermentescvel e comportamento do mosto durante e aps a fermentao.
4. Caractersticas de uma unidade de fermentao
Laboratrio de microbiologia: fornece inculos e acompanha a evoluo
microbiolgica do processo evitar contaminaes
Planta de fermentao fermentadores e controles
Laboratrio de controle anlises qumicas e bioqumicas (acares
redutores, N disponvel, produtos, pH)

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

Unidade de Fermentao
Servios:
gua limpa e tratada para preparao do meio e limpeza;

gua fria para controle de temperatura

ar comprimido estril para aerao
vapor alta presso para esterilizao
eletricidade para equipamentos
sistema adequado para disposio de resduos
Estoque insumos, embalagens
Lab. de pesquisa e desenvolvimento
rea de recuperao usa os mais diversos processos, como destilao,

cromatografia, precipitao, cristalizao, etc.

Vendas contato com clientes, assistncia tcnica

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

30

15

11/08/2015

Unidade de Fermentao

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

31

Tipos de Fermentao
5. Equipamentos e mtodos empregados em fermentaes

industriais
5.1 Tipos de fermentao
Existem, de forma geral, 2 tipos de fermentao:
1) Fermentao semi-slida
2) Fermentao submersa
1. Fermentao semi-slida
So processos que referem-se cultura de MO sobre ou dentro de partculas
em matriz slida, onde o contedo de lquido ligado a ela est a um nvel de Aw
que assegure o crescimento e metabolismo das clulas, porm no exceda
mxima capacidade de ligao da gua com a matriz slida, segundo DURANT
et al. (1988).

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

32

16

11/08/2015

Fermentao Semi-Slida
Fermentador
Usa-se o fermentador de bandejas (Mtodo de Koji) uma estufa
com temperatura e umidade controlvel, onde so colocadas bandejas
contendo o meio de cultura e inoculado com o respectivo MO.

Tambores rotativos
MO usados
Fungos

filamentosos:

Rhizopus,

Trichoderma,

Penicillium

ou

Aspergillus (ptns e enzimas), e Fusarium ou Giberella (cido

giberlico)
Bactrias: Bacillus thuringiensis (bioinseticidas), linhagens de
Bacillus (-amilase), Zymomonas mobilis (lcool)
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

33

Fermentao Semi-Slida
Substratos
Quando o suporte slido atua ele prprio como fonte de nutrientes;
Nutrientes so solveis em gua e os MO esto aderidos a uma matriz slida,
inerte ou no, que ir absorver o meio de cultura lquido.
Ex.:soluo de glicose e de nutrientes umedecendo bagao de cana para
produo de cido ltico.
Os materiais utilizados so provenientes de MP, produtos e/ou resduos
agroindustriais:
Farelo e palha de trigo, farinha e farelo de soja, farinha e resduos
slidos do processamento da mandioca, bagao de cana (enzimas)

soja (shoyu) para elaborao de condimentos orientais, etc...

Exemplos de aplicao (cogumelos comestveis, compostagem, enzimas)
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

34

17

11/08/2015

Fermentao Submersa
2. Fermentao submersa
Processo em que o mosto lquido e o MO desenvolve-se dentro deste meio.

Fermentadores
1) Para culturas aerbicas

constitudo por uma cuba ou dorna, fechada, que pode ser esterilizada,
aerada, agitada e com T(C) e pH controlados.
Pode ser equipado com defletores ou chicanas e com sistemas de agitao
atravs de ps.
O ar estril introduzido na parte inferior do fermentador, de forma a ser
bem espalhado pelos agitadores.
2) Para culturas anaerbicas ou micro-aerbicas sem agitao e
aerao
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

35

COMPARAO ENTRE PROCESSOS

Fermentao semi-slida

Fermentao submersa

Precisa de muito espao

Fermentadores compactos

Uso de muita mo de obra

Mnima mo de obra

Ar a baixa presso

Ar a alta presso

Pouco consumo de energia

Alto consumo de energia

Requer pouco controle

Requer controle rigoroso

Pouco
problema
contaminao

de Problemas de contaminao

Obteno: extrao, filtrao Obteno:

filtrao
ou
ou centrifugao, evaporao centrifugao e evaporao ou
ou precipitao
precipitao
Pouca aplicao industrial

Muito usada industrialmente

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

36

18

11/08/2015

Mtodos de Extrao
6. Mtodos de Extrao / Recuperao
As diferentes fases de processos de recuperao podem envolver
vrias operaes unitrias, como filtrao, centrifugao, destilao,
entre outras

1 etapa Eliminao de insolveis

A) Separao dos insolveis
a.1) Filtros: Uso de filtros rotativos a vcuo, ou filtro prensa.
a.2) Decantadores
a.3) Centrfugas: permite eliminar ou separar MO que sejam bactrias,
leveduras ou fungos.
a.4) Outros mtodos: floculao (formao de flocos de clulas)

Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

37

Mtodos de Extrao
2 etapa Extrao por solvente
Normalmente usam-se solventes orgnicos
Ex.: penicilina, extrada em meio cido (pH = 2), com acetato de amila ou
butila.

3 e 4 Etapas Concentrao / Purificao

a) Extrao por troca inica
b) Precipitao
c) Filtrao em gis
d) Extrao de produtos intra-celulares

e) Secagem
f)

Destilao
Bioqumica Industrial - Professora Cristina Fantini

38

19