UNIVERSIDAD AUTNOMA BENITO JUREZ DE OAXACA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO

CARRERA

PLAN DE ESTUDIOS

QFB

2009

PRCTICA
NMERO

CLAVE DE LA
ASIGNATURA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA

INMUNOLOGA
NOMBRE DE LA PRCTICA

FECHA Y
DURACIN

7
Determinacin de anticuerpos contra HIV 1 y 2
1 sesin
1
INTRODUCCIN
El virus de inmunodeficiencia humana (HIV) es un retrovirus identificado en 1983 como el agente
etiolgico del Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Dos subtipos, el HIV-1 y el HIV-2,
pueden ser distinguidos. Las principales vas de trasmisin del HIV son el contacto sexual, la
contaminacion a travs de la sangre o productos sanguneos y la trasmisin de la madre al recin
nacido. Las principales clulas infectadas por el HIV son los linfocitos CD4, que desempean un papel
importante en el sistema de defensa inmunolgica del organismo. La progresiva declinacin del nivel de
CD4 durante el desarrollo de la enfermedad conduce al desarrollo de infecciones oportunistas que llegan
a compremeter la vida del husped.
El virus de HIV consiste en una molcula de RNA genmico protegida por una cpside y una envoltura.
La envoltura del HIV es el principal objetivo de la respuesta de los anticuerpos humorales. El diagnstico
serolgico de la infeccin de HIV se basa en la deteccin especfica de anticuerpos contra proteinas de
la envoltura del HIV.

2
OBJETIVOS
Determinar la presencia de anticuerpos anti HIV 1 y 2 en una muestra de sangre mediante un ensayo
inmuno-enzimtico indirecto de fase slida (EIA).

.
3
FUNDAMENTO
La prueba a desarrollar es un ensayo inmuno-enzimtico indirecto de fase slida (EIA). La fase slida es
un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente est sensibilizado en tres reas reactivas:

Punto superior anticuerpos de cabra contra inmunoglobulina humana (Control Interno).

Punto medio pptidos sintticos de HIV-2.
Punto inferior pptidos sintticos de HIV-1.

La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila contiene una solucin reactiva lista
para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una
fila a otra, con un perodo de incubacin en cada etapa. Para comenzar la prueba, se agregan muestras
de suero o plasma al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo. Luego se inserta
el Peine en los pocillos de la fila A. Los anticuerpos anti-HIV, en caso de estar presentes en las
muestras, se unirn especficamente a los pptidos sintticos en los puntos inferior y medio de los
dientes del Peine (Figura 1). Simultneamente, las inmunoglobulinas presentes en las muestras son
capturadas por los anticuerpos dirigidos contra inmunoglobulina humana del punto superior (Control
Interno). Los componentes no unidos son eliminados con un lavado en la fila B.
En la fila C y D, el capturado en los dientes reacciona con los anticuerpos anti- humano marcados con
fosfatasa alcalina (FA). En la fila siguiente, los componentes no unidos son eliminados mediante un
lavado. En la fila F, la fostafasa alcalina unida reacciona con componentes cromognicos. Los

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resultados son visibles como puntos de color azul grisceo en la superficie del diente del Peine.

Figura 1. Principio de la prueba.

El kit incluye un Control Positivo (que contiene anticuerpos de HIV-1 y HIV-2) y un Control Negativo, que
deben incluirse cada vez que se realiza la prueba. Al trmino de sta, el diente usado con el Control
Positivo debe mostrar 3 puntos de color azul grisceo y el diente usado con el Control Negativo debe
mostrar solamente el punto superior. Este punto tambin debe aparecer en los demas dientes para
confirmar que la muestra fue agregada, que el kit funciona apropiadamente y que la prueba fue realizada
correctamente.
El Peine tiene 12 dientes, uno para cada prueba (Figura 2). Cada diente es sensibilizado en tres reas
reactivas:

punto superior: anticuerpos de cabra contra inmunoglobulina humana (Control Interno).

punto medio: pptidos sintticos de HIV-2 (derivados de las secuencias env de gp36).
punto inferior: pptidos sintticos de HIV-1 (derivados de las secuencias env de gp41 y
gp120).

Figura 2. Peine.

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Bandeja de desarrollo.
La Bandeja de Desarrollo consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una (Figura 3). Los contenidos de
cada fila son los siguientes:

4
A

Fila A. Diluyente de la muestra.

Fila B. Solucin de lavado.
Fila C. Anticuerpos de cabra anti- humano marcados con fosfatasa alcalina.
Fila D. Anticuerpos de cabra anti- humano marcados con fosfatasa alcalina.
Fila E. Solucin de lavado.
Fila F. Solucin de sustrato cromognico conteniendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y
nitro azul tetrazolio (NBT).

PROCEDIMIENTO
EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS

REACTIVOS:
Kit para determinacin de HIV 1 y 2 EIA fase slida.
MATERIALES:

Tubos para toma mltiple sin anticoagulante con gel

separador
Agujas para venopuncin
Torniquete
Torundas de algodn

MATERIAL DE APOYO
Material comn de laboratorio.

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MATERIAL BIOLGICO:

Suero de paciente.

APARATOS E INSTRUMENTOS

Centrfuga.
Pipetas automticas de volumen variable 10 a 100 uL

B
DESARROLLO DE LA PRCTICA
PREPARACIN DE LAS MUESTRA BIOLGICA.
1. Extraccin de una muestra de sangre venosa.
a. Realizar la extraccin de una muestra de sangre total por puncin venosa en un tubo sin
anticoagulante.
b. Esperar 15 minutos para que la muestra coagule completamente.
c. Centrifugar la muestra para obtener el suero durante 5 minutos a 2500 r.p.m.
d. Concluido el proceso de centrifugacin verificar que el gel separador se encuentre entre
las dos fases de la sangre total y que el suero sea transparente y no presente hemlisis.
PROCEDIMIENTO.
Reaccin AntgenoAnticuerpo (Fila A de la Bandeja de Desarrollo).
1. Toma 50 l de la muestra con la pipeta. Perfora con la punta de la pipeta o el perforador la
cubierta de papel de aluminio de un pocillo en la fila A de la Bandeja de Desarrollo y vierte la
muestra en el fondo del pocillo. Mezcla vaciando y rellenando repetidamente la solucin con la
pipeta. Desecha la punta de la pipeta.
2. Repite el paso 1 para las dems muestras, incluyendo un control positivo y uno negativo
provistos en el kit. Usa un nuevo pocillo en la fila A y cambia la punta de la pipeta para cada
muestra o control.
3. Inserta el Peine (con el lado impreso hacia ti.) en los pocillos de la fila A que contienen las
muestras y los controles. Mezcla: Retira e inserta el Peine en los pocillos varias veces.
4. Deja el Peine en la fila A durante exactamente 10 minutos. Activa el cronmetro. Mezcla dos
veces ms durante la incubacin. Hacia el final de los 10 minutos, perfora el papel aluminio en la
fila B usando el perforador. No abras ms pocillos de los necesarios.
5. Al cumplirse los 10 minutos, saca el Peine de la fila A. Retira el lquido adherido a las puntas
de los dientes apoyndolos sobre un papel absorbente limpio. No toques la superficie frontal del
diente.
Primer Lavado (Fila B).
6. Inserta el Peine en los pocillos de la fila B. Agita: inserta y retira vigorosamente el Peine en los
pocillos durante al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repite el lavado varias
veces agitando en el transcurso de 2 minutos; mientras tanto, perfora el papel aluminio de la fila
C. Despus de dos minutos, retira el Peine y retira el lquido adherido como en el paso 5.
Unin del Conjugado (Fila C).
7. Inserta el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcla el Peine varias veces como en el paso 3.

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Programa el cronmetro para 10 minutos. Mezcla como en el paso 4. Perfora el papel aluminio
de la fila D. Despus de 10 minutos, retira el Peine y absorbe el lquido adherido.
Incubacin en el Conjugado (Fila D).
8. Inserta el Peine en los pocillos de la fila D. Agita como en el paso 7. Espera 2 minutos; mientras
tanto, perfora el papel aluminio en la fila E. Despus de dos minutos, retira el Peine y
absorbaeel lquido adherido.
Lavado (Fila E).
9. Inserta el Peine en los pocillos de la fila E. Agita. Espere 2 minutos; mientras tanto, perfora el
papel aluminio de la fila F. Despus de dos minutos, retira el Peine y absorbe el lquido
adherido.
Reaccin de Color (Fila F).
10. Inserta el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcla como en el paso 3. Programa el cronmetro
para 10 minutos. Mezcla como en el paso 4. Despus de 10 minutos, retira el Peine.
Detencin de la Reaccin (Fila E).
11. Inserta de nuevo el Peine en la fila E. Despus de un minuto, retira el Peine y djalo secar al
aire.
C
EXPRESIN DE RESULTADOS E INFORME DE LA PRUEBA.
Validacin.
A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son vlidos,
deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5):
1. El Control Positivo debe producir tres puntos en el diente del Peine.
2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control Interno) y no otros puntos.
3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior (Control Interno). Esto tambin
confirma que la muestra ha sido agregada.
Si cualquiera de estas tres condiciones no se cumple, los resultados de la prueba no son vlidos y las
muestras y controles deben ser reexaminados.

Figura 5. Validacin de la prueba.

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Interpretacin de los Resultados.

La presencia exclusiva del punto superior (Control Interno) indica que la muestra no reacciona a los
anticuerpos contra HIV-1 y HIV-2 (Figura 6a). Un punto medio circular, de color uniforme, indica la
presencia de anticuerpos contra HIV-2 (Figura 6b).
Un punto inferior circular, de color uniforme, indica la presencia de anticuerpos contra HIV-1 (Figura
6c). Dada la estrecha similitud entre HIV-1 y HIV-2, existe la posibilidad de reactividad cruzada de
anticuerpos, la que podra generar positividad en ambos puntos de reaccin. Sin embargo en este caso
debe compararse la intensidad de los dos puntos, el de mayor intensidad indica el tipo de HIV (ver
Figura 6d para altas concentraciones de HIV-1), slo en caso de que la intensidad sea idntica en
ambos puntos, puede considerarse como un caso de rara co-infeccin por HIV-1 y HIV-2.

Figura 6. Resultados de la prueba.

Importante:
1. La presencia de anticuerpos contra HIV-1 o HIV-2 en las muestras analizadas debe ser
confirmada con una prueba confirmatoria.
2. Cualquier coloracion dbil en el diente debe ser considerada sospechosa de representar una
reaccin positiva y debe ser reanalizada.
Documentacin de los Resultados.
Debido a que el color que aparece en el Peine es estable, es posible archivar los Peines para consulta
posterior.

5
INTERPRETACIN Y CONCLUSIONES
Se elaboraran de acuerdo a los resultados obtenidos y la importancia diagnstica de la prueba.
6

ANEXOS

REFERENCIAS

Gnann Beelaert G et. al. 2002. Comparative evaluation of eight commercial enzyme linked immunosorbent assays and 14 simple

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assays for detection of antibodies to HIV. Journal of Virology Methods, 105 (2): 197-206.
Constantine NT. 1999. HIV antibody testing, p. 105-112. In P.T. Cohen, M.A. Sande, and P.A. Volberding (ed.), The AIDS
knowledge base, 3rd ed. Lippincott-Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.
Gilmore, N. 1996. Blood and blood product safety, p. 287-301. In J. Mann and D. Tarantola (ed.), AIDS in the World, vol II. Oxford
University Press, Oxford, England.
Grant AD, De Cock KM. 2001. HIV infection and AIDS in the developing world. British Med. Journal, 322: 1475- 1478.
Janssen RS et al. 1998. New testing strategy to detect early HIV-1 infection for use in incidence estimates and for clinical and
prevention purposes. JAMA 280:42-48.
Schacer TW, Hugu JP, Shea T, et al. 1998. Biological and virological characteristics of primary HIV infection. Ann. Intern. Med.
128: 613-620.
UNAIDS/WHO. 2002. Joint UN programme on HIV/AIDS (UNAIDS) Report on the Global HIV/AIDS epidemic, p. 1-226. Geneva.

8
MECANISMO DE EVALUACIN
Puntualidad y asistencia
40%
Bitcora
20%
Reporte
20%
Conocimientos previos
20%
9

MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

1. Se deber utilizar antifaz de seguridad.
2. Se deber tener el cuidado respectivo al manejo de material a altas temperaturas, materiales
corrosivos y txicos.
3. Al pesar o medir reactivos evite tirarlo o derramarlos en el sitio donde se encuentre, en caso de
hacerlo limpiar perfectamente el lugar.
4. Al medir las muestras biolgicas evite tirarlas o derramarlas y sigue los procedimientos
generales de manipulacin para evitar cualquier riesgo biolgico.
5. Cubrir las medidas de seguridad bsicas para el laboratorio.
En caso de accidente (por pequeo que este sea) debe comunicarse de inmediato al maestro
responsable del laboratorio.

10

DISPOSICIN DE DESECHOS QUMICOS, FSICOS Y BIOLGICOS.

1. Los recipientes que tengan residuos de naturaleza lipdica, se limpiarn con papel absorbente
antes de lavarlos en la tarja y estos papeles se tirarn en el bote de basura del laboratorio.
2. Los residuos de origen orgnico se tiraran en el bote de basura respectivo.
3. Los RPBI se desecharn en los contenedores destinados para ello.