PRACTICA N 8

SEMINARIO: PCR EN TIEMPO REAL (qPCR) COMO TECNICA DE DIAGNOSTICO EN

ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y ONCOLOGICAS
1. Prepare una tabla en la que compare las siguientes tcnicas moleculares: PCR, qPCR, LCR,
bDNA, TMA, Q Replicasa y Captura Hibrida, con respecto al tipo de amplificacin, diana
que utiliza como acido nucleico, el tipo de amplicon y las enzimas principales para cada
tipo.
TIPIFICACION DIANA
TIPO DE
PRINCIPALES
UTILIZADA
AMPLICON
ENZIMAS
PCR
Amplificacin
secuencia de
Secuencias de Taq Polimerasa
de pequeas
ADN concreta
ADN o ARN
regiones
especficas de
ADN
Qpcr
Se aade un
secuencia de
Secuencias de Taq Polimerasa
componente
ADN concreta
ADN o ARN
fluorescente
que permite
medir la luz. A
ms luz, ms
cantidad del
ADN
detectado
LCR
Se basa en la
secuencia de
Secuencias de Ligasa de
funcin de una ADN concreta
ADN o ARN
Thermus
ligasa
aquaticus
termoestable
Se puede
Bdna
Secuencia de
Secuencias de Taq Polimerasa
utilizar PCR
ARN viral
ADN
competitiva o
PCR
cuantitativa
TMA
Se estudia 1
Un gen en un
Secuencias de
gen (o su
gran nmero
ADN o ARN
producto) en
de tumores.
un gran
nmero de
tumores
Qb
se amplifica la Secuencia de
Secuencias de Q replicasa
REPLICASA
sonda
inters
ADN o ARN
especfica que
se une a la
secuencia de
inters
CATURA
Permite
ARN del virus
Secuencias de

HIBRICA

identificar la
presencia del
virus en las
clulas y
determinar el
grupo al que
pertenece

ADN o ARN

2. Dos muestras de ADN, A y B, son sujetas a un experimento de qPCR en el cual se analiza el gen B-

Actina. La muestra A produce un valor de Ct de 21,8. La muestra B produce un valor de Ct de 23,2.

Cuntas veces esta la cantidad de diana en la muestra A aumentada sobre la de la muestra B?

Se utiliz la siguiente formula

(ct pct ref )

Reemplazando en la formula

2(23,221,8)

= 0,37

3. El kit de cuantificacin absoluta para DNA humano Quantifiler TM Human DNA Quantificaction
Kitcomercializado por Life Technologies para la cuantificacin de muestras e DNA forenses contiene
un DNA humano estndar con una concentracin de 200ng/uL. El protocolo requiere que haga una serie
de ocho diluciones del estndar en tampn TE(Tris/EDTA). Las muestras diluidas tendrn
concentraciones de DNA de 50, 16.7, 5.56, 1.85, 0.62, 0.21, 0.068 y 0.023 ng/uL. Para cada muestra,
prepara las diluciones dispensando 10uL de un tubo en el siguiente.

a Cul es el factor de dilucin necesario para preparar el primer

tubo con DNA a una concentracin de 50ng/uL?
Usamos la formula C.V= C.V

200

ng
ng
?=50 10 ul =2.5
ul
ul

Fd=

10 ul
=4
2.5 ul

b Cul es el factor de dilucin del segundo tubo con DNA a una

concentracin de 16.7 ng/ul?
200

ng
ng
?=16.7
10 ul =0.835
ul
ul

Fd=

10 ul
=11.9760
0.835 ul

c En que volumen el tampn TE deberan ser dispensados

10uL de la solucin de DNA humano stock (a 200ng/uL)
para generar el primer estndar con una concentracin de
DNA de 50ng/uL?

102.5=8.5 ul

d En qu volumen tampn TE deberan ser dispensados 10uL

de la dilucin a 50ng/uL para preparar el segundo tubo con
dilucin estndar de manera que su concentracin sea 16.7
ng/uL?

50

ng
ng
?=16.7
10 ul =3,34
ul
ul

103.34=6.66 ul de tampon .

e Cules son las diluciones que necesita hacer para preparar

toda la serie de diluciones?

Dilucin 50 ng/ul
200

ul

Dilucin 16.7 ng/ul.

200

ng
ng
?=50 10 ul =2,25
ul
ul

ng
ng
?=16.7
10 ul =0.835 ul
ul
ul

Dilucin 5.56 ng/ul

200

Dilucin 1.85 ng/ul.

200

ng
ng
?=0.21 10ul =0.0105 ul
ul
ul

Dilucion 0.068 ng/ul

200

ng
ng
?=0.62 10ul =0.031 ul
ul
ul

Dilucion 0.21 ng/ul

200

ng
ng
?=1.85 10ul =0.093 ul
ul
ul

Dilucion 0.62 ng/ul

200

ng
ng
?=5.56
10 ul =0.278 ul
ul
ul

ng
ng
?=0.068 10 ul =0.0034 ul
ul
ul

Dilucion 0.023 ng/ul

200

ng
ng
?=0.023 10 ul =0.0225 ul
ul
ul