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[Prcdent]

A) Introduction
1) Les Staphylocoques

1) Gnralits sur les Staphylocoques


Les staphylocoques appartiennent au rgne des bactries, qui sont des unicellulaires
procaryotes (le chromosome n'est pas dlimit par une membrane nuclaire) dpourvus de
rticulum, de mitochondries et d'appareil de Golgi. Les bactries peuvent tre diffrenties par
l'application d'une coloration appele Gram. Les bactries colores sont nommes Gram+ et
possdent une couche paisse de peptidoglycane situe au-dessus leur membrane slective
(Fig. 1). Au contraire, les bactries Gram-, qui ne sont pas ou peu colores, possdent une
mince couche de peptidoglycane entoure par une membrane interne et une externe rendue
permable par la prsence de porines. Ce sont des diffrences dans la taille et les proprits du
peptidoglycane qui permettent de diffrentier ces deux types bactriens (Gram -/Gram+) par la
coloration.

Figure 1 : Structures de la membrane et de la paroi de peptidoglycane chez les bactries


Gram+/GramLes staphylocoques font partie des bactries Gram+, sont asporules, d'un diamtre variant
de 0.5 1.5 m, et ont comme particularit de former des amas en forme de grappe. Les
bactries deviennent visibles l'oeil nu en formant des colonies sur des milieux solides
appropris (botes gloses). Chaque colonie contient des milliards de cellules filles issues
d'une cellule originale (ou d'un tout petit groupe de cellules agrges): on parle alors d'units
formant des colonies (UFC).
Les staphylocoques sont classs en deux grands groupes que l'on distingue par la
production d'un enzyme dclenchant la coagulation du plasma: la coagulase. Le premier
groupe comprend les staphylocoques coagulase-positifs dont le reprsentant principal est
Staphylococcus aureus, bien connu pour sa virulence. Le deuxime groupe comprend les
staphylocoques coagulase-ngatifs (SCN) subdiviss en une vingtaine d'espces, dont le
reprsentant principal est S. epidermidis.
S. aureus peut provoquer des infections localises, rsultant souvent de blessures ou de la
prsence de matriaux implants. Parfois, les foyers infectieux peuvent dissminer et
provoquer des septicmies, des endocardites (infection de l'endocarde), des ostomylites
(infection du tissu osseux). Malgr un arsenal assez fourni d'antibiotiques et d'antiseptiques
puissants, les infections SCN ou S. aureus sont toujours prsentes et peuvent mme causer
des mini-pidmies dans les hpitaux. Ceci s'explique en partie par l'acquisition rcente d'un
nombre croissant de dterminants de rsistances de multiples antibiotiques. Les souches

rsistantes la mticilline (un -lactamine) sont l'exemple typique d'association de


dterminants de rsistance multiples non apparents.

2) Aspects cliniques et pidmiologiques des infections causes par S. aureus

a) Introduction

S. aureus est un pathogne majeur de l'homme causant des infections nosocomiales et


pidmiques en milieu hospitalier. C'est le pathogne le plus frquemment rencontr lors de
pneumonies nosocomiales, d'infections de plaies chirurgicales, d'infections de brlures,
d'infections des corps trangers (valves cardiaques, prothses de hanche, agrafes, pacemakers,
etc.) et d'infections systmiques 1 qui sont souvent dues l'usage de cathters intravasculaires
ou la dissmination de la bactrie partir d'un autre foyer infectieux 136.
C'est en 1950 que des souches de S. aureus virulentes ont t pour la premire fois
dcrites comme responsables d'infections nosocomiales dans divers hpitaux 177. Ds 1960,
l'introduction de la mticilline a permis de diminuer le nombre d'infections, mais ds les
annes 70, des souches de S. aureus rsistantes la mticilline sont apparues. Elles se sont par
la suite dissmines travers les hpitaux provoquant une augmentation des infections
nosocomiales S. aureus 26,115. Ces souches portent l'abrviation MRSA (Methicillin Resistant
S. aureus) et sont, comme nous le verrons plus tard, trs souvent caractrises par de multiples
dterminants additionnels de rsistance divers antibiotiques/antiseptiques, en plus de la
rsistance la mticilline 40,70.
En 1995, le taux infections nosocomiales dues S. aureus dans les hpitaux amricains
tait de 13 % 1. La prvention des infections nosocomiales est aujourd'hui un objectif
prioritaire dans la plupart des hpitaux de faon rduire les cots des hospitalisations
prolonges chez les patients infects et ceux dus l'emploi intensif d'antibiotiques.

b) Les souches MRSA

Les antibiotiques appartenant la classe des -lactamines s'attaquent des enzymes


appels PBPs (penicillin binding proteins), qui sont ancrs la surface bactrienne et qui
participent la biosynthse du peptidoglycane 182,214. L'lment mec confre la souche de
staphylocoque qui le possde la facult de rsister l'ensemble des -lactamines, dont la
mticilline. Les souches MRSA se retrouvent principalement en milieu hospitalier o la
pression slective exerce par l'emploi massif des antibiotiques est importante. Les souches
MRSA ont la proprit d'accumuler des dterminants de rsistance varis et non relis (ex:
rsistance aux ammoniums quaternaires, aux fluoroquinolones etc.).
Le dterminant de rsistance mec se situe sur un lment d'ADN de 30 Kb (l'lment mec)
qui s'est insr dans le chromosome prs du gne codant la protine A 16. Seul environ 10% de
l'lment mec contribue la rsistance la mticilline. L'lment mec est retrouv dans les
souches de staphylocoques coagulase-ngatifs et semble avoir t transmis aux souches de

S. aureus par transfert horizontal 7,196. Le produit majeur du dterminant mec est un enzyme
nomm PBP2' cod par le gne mecA. PBP2' est caractris par une faible affinit pour les lactamines, par contraste avec les autres PBPs impliques dans la biosynthse du
peptidoglycane. Le gne mecA est rgule par deux gnes appartenant au dterminant mec: le
premier agit comme activateur (mecR1) et le second comme rpresseur (mecI1) 91,188. Certains
gnes appartenant au chromosome de souches sensibles ou rsistantes de S. aureus, peuvent
affecter le niveau de rsistance des MRSA. D'autres gnes impliqus dans la biosynthse du
peptidoglycane influencent fortement la rsistance la mticilline: l'inactivation des gnes
femA et femB, qui contribuent au pont transversal pentaglycine, abolit cette rsistance alors
que l'inactivation des gnes femC et femD diminue partiellement la rsistance la mticilline
191
.
Enfin, il existe des souches ne possdant pas le dterminant mec, mais exprimant un bas
niveau de rsistance la mticilline. Ces souches, aussi appeles 'borderline', sont soit
hyperproductrices de -lactamase 128, soit expriment des PBPs altres 192. En clinique ces
souches ne sont pas aussi rpandues que les MRSA. Leur identification demeure dlicate et la
recherche du gne mecA, qui code pour PBP2', permet de distinguer les 'borderline' des
MRSA.

c) Rservoirs et modes de transmission de S. aureus

i) Les rservoirs de S. aureus

Les souches de S. aureus sont introduites ou transmises dans les hpitaux par les patients
coloniss ou le personnel hospitalier 31,32,169,178,185,211. Les patients coloniss reprsentent la
source majeure de S. aureus dans les hpitaux 38,190,212,216 et leur transfert entre diffrents
hpitaux a provoqu la dissmination de certaines souches 97,106,174. Chez les personnes
colonises on dtecte souvent la prsence d'un mme clone de S. aureus dans la partie
antrieure du nez et sur la peau, reprsentant une source endogne de bactries pouvant
provoquer une infection 38,107,118,212,216 ou permettant leur dissmination sur d'autres patients
69,213
. On estime que 20-40% des adultes sains sont porteurs de S. aureus dans le nez 68.
Les membres du personnel hospitalier reprsentent un second rservoir partir duquel
S. aureus peut tre transmis aux patients 12,25,56,57,81,137,169,178,180,211,215. Ils peuvent tre soit des
porteurs occasionnels, soit des porteurs permanents 12,57,178,211. Un autre source potentielle de
contamination peut tre les blouses du personnel ou les surfaces de travail. S. aureus peut
survivre plusieurs jours sur des surface souilles 15,54,73.

ii) Modes de transmission

Le personnel colonis (mains, narines) travaillant en salle de chirurgie peut directement


transmettre une souche au patient 12,32,63,81,178,215.

Un autre mode de transmission frquent est la colonisation indirecte du patient par des
objets (gants, quipement mdical) souills 2.
Il existe aussi des possbilits de contamination par voie arienne impliquant de microgoutelettes (5 m de diamtre) ou de particules en suspension (poussire) 2,55,119,210.

d) Les facteurs de risque

Les facteurs influenant le risque de transmission de S. aureus sont : a) les caractristiques


microbiologique des souches ; b) les facteurs de risque des patients ; c) la politique
d'utilisation des antibiotiques ; d) les mesures de contrle des infections en milieu hospitalier
177
.
a) Certaines souches se transmettent plus facilement que d'autres, y compris entre diffrents
hpitaux 40,124. On a constat que les souches MRSA qui surexpriment la coagulase ou
possdent plusieurs copies du gne codant la protine A sont plus souvent la cause d'pidmies
38,80,101
.
b) La probabilit pour un patient d'tre contamin par S. aureus augmente avec : i) sa
localisation dans une unit haut risque telles que les soins intensifs, units des grands brls,
pouponnires ; ii) une intervention chirurgicale ; iii) une hospitalisation prolonge ; vi) la
prsence de cathters ou de biomatriaux implants 136,190.
c) L'utilisation d'antibiotiques large spectre augmente le risque de voir l'mergence de
germes multirsistants 59,129,157
e) Prvention et contrle des infections nosocomiales dues S. aureus

Un certain nombre de rgles (guidelines) ont t introduites dans les hpitaux pour
prvenir les infections S. aureus. Seules quelques unes d'entre-elles seront abordes ici.
Beaucoup d'hpitaux appliquent des mesures drastiques pour rduire la transmission
nosocomiale de souches MRSA. Ainsi, les patients coloniss par des souches MRSA sont
rpertoris, ce qui permet de les identifier plus rapidement lors d'une nouvelle hospitalisation.
Le screening de ces patients se fait par la recherche de S. aureus au niveau nasal ou inguinal
107
. Si le screening est positif pour MRSA, un traitement intranasal la mupirocine peut tre
tent en vue d'une radication. Ce traitement s'applique galement au personnel hospitalier
colonis. Dans la plupart des cas les patients sont mis en isolement : le personnel revt des
blouses propres, des gants, des lunettes, des masques (selon le type d'intervention). Le lavage
des mains avec une solution antiseptique avant et aprs les soins est particulirement
recommand. Le matriel de diagnostic (radio-, echographie, etc.) doit tre dsinfect avant et
aprs usage 68. La prvention implique galement une sauvegarde (conglation) des souches
MRSA rcoltes sur les patients. Le typage du MRSA peut tre entrepris par la technique de
PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) pour dterminer si un clone de S. aureus est prsent
sur diffrents patients, ce qui offre la possibilit de remonter la source de la contamination
11,160,186
. Finalement, les surfaces sont traites plus soigneusement et plus efficacement contre
les pathognes

En cas d'infection, l'antibiothrapie approprie pour traiter les patients MRSA se limite le
plus souvent la vancomycine. L'utilisation intensive de vancomycine peut contribuer
l'mergence et la dissmination de souches glycopeptides-rsistantes qui sont insensibles la
quasi totalit des antibiotiques actuellement sur le march 68.

2) Caractristiques microbiologiques expliquant la virulence de


S. aureus

1) Phases de croissance in vitro


La croissance des bactries dans un milieu liquide (bouillon de culture) se caractrise par
plusieurs phases (Fig. 2):

Figure 2 : Phases de croissance du staphylocoque in vitro


La premire (phase lag , cf. 1) est une phase d'adaptation des cellules leur milieu.
Dans la phase exponentielle (cf. 2), les bactries se multiplient par divisions
successives selon un temps de gnration constant.
A la fin de la phase exponentielle, les bactries entrent dans une phase de transition
(phase post-exponentielle, cf. 3).
Finalement, les bactries atteignent une phase de plateau dite stationnaire (cf. 4). Dans
cette phase, on admet que certaines bactries meurent alors que d'autres les
remplacent.
Aprs 24 h ou davantage, la viabilit dcrot et la culture meurt (cf. 5).

2) Les facteurs de virulence chez S. aureus

a) Les toxines

Tableau 1: Principaux enzymes et toxines produits par les Staphylocoques


Toxines

Mode d'action

Effets biologiques

Leucocidine

Toxine formant des pores

Lyse les neutrophiles

TSST 1

Superantigne->
sensibilit

Exfoliative toxine

Toxine formant des pores

Epidermolyse

-toxine

Toxine formant des pores

Hmolysines et formation

-toxine

Toxine formant des pores

de pores dans les

-toxine

Toxine formant des pores

membranes de nombreux

-toxine

Toxine formant des pores

types cellulaires

Hyper

Entrotoxines

Activation des leucocytes. Scrtion


des interleukines (Il1, 2 et TNF),
choc toxique.

Intoxications alimentaires

Coagulase

Activation de la prothrombine

Formation du caillot fibrineux

Staphylokinase

Dislocation des caillots

Dissmination de micro-emboles

Hydrolyse de leur substrat


Nuclase,
Lipase,
Lsions tissulaires, lsions cutanes,
respectif (ADN, lipides, ac.
Estrase Hyaluronidase
lsions du tissu conjonctif
Hyaluronique)
Les staphylocoques scrtent une quantit impressionnante de toxines et d'enzymes
hydrolysant diffrents constituants cellulaires. Ces toxines et enzymes extracellulaire (cf.
Tableau 1) contribuent la pathognie des staphylocoques.
Les principales toxines sont les hmolysines, la leucocidine, exfoliatine, des
entrotoxines, et la toxine de choc toxique TSST-1 206.
Les principaux enzymes extracellulaires sont la dsoxyribonuclase, lipase, phosphatase,
protase, catalase, hyaluronidase, et coagulase.

b) Les adhsines

i) Structure des adhsines

S. aureus possde des composantes de surface, appeles adhsines, reconnaissant


diffrentes protines du plasma et/ou de la matrice extracellulaire (Fig. 4). Les adhsines les
mieux caractrises sont celles qui reconnaissent le fibrinogne ou la fibrine, le collagne, ou
la fibronectine. La structure commune de ces adhsines qui sont aussi appeles MSCRAMMs
(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) 79,150 est montre sur la
figure 3.

Figure 3 : Protines de Surface de S. aureus : Cna : adhsine du collagne ; ClfA :


adhsine du fibrinogne ; FnBP : adhsine la fibronectine.
Les MSCRAMMs ont en commun plusieurs domaines 79: une squence signal (domaine S)
en position N-terminale adressant l'adhsine no-synthtyse au niveau de la membrane
plasmique ; en position C-terminale se trouvent des rgions hydrophobes W et M spares par
une squence dont le motif consensus est LPXTG ; l'extrmit C-terminale contient une
rgion charge positivement. L'adhsine au collagne (Cna) possde un site de liaison son
ligand dans le domaine A. Le nombre de domaines B, qui ne lient pas le collagne, varie de 1
4. L'adhsine au fibrinogne (ClfA) contient galement un site de liaison au ligand dans le
domaine A. Le domaine R, est une rgion contenant de nombreuses rptitions du dipeptide
Asp-Ser permettant l'exposition du domaine A pour permettre l'interaction avec le ligand. Les
adhsines la fibronectine (FnBPA et FnBPB) possdent un site de liaison au ligand en

position C-terminale. Ce site est situ dans la rgion D contenant une squence rpte trois
fois et partiellement une quatrime fois (d'o son nom de D1-D4) 96.

ii) Maturation des adhsines

Lorsque l'adhsine arrive au niveau de la membrane plasmique, un enzyme nomm 'signal


peptidase' permet la translocation de l'adhsine au travers de la membrane, aprs clivage du
peptide signal (Fig. 3, 4) 79. Le motif LPXTG est reconnu par un enzyme appel sortase qui va
lier covalemment l'adhsine au pptidoglycane parital 127,193,194.

Figure 4 : Structure et maturation des adhsines


c) Interaction de S. aureus avec la fibronectine

i) Structure de la fibronectine

Avant de dcrire en dtail les deux adhsines la fibronectine, quelques proprits de la


fibronectine seront rappeles. Cette protine multifonctionnelle de la matrice extracellulaire et
du plasma (300 mg/L) est aussi une composante mineure des caillots sanguins. Cette protine

comprend plusieurs domaines fonctionnels ayant chacun une activit spcifique et


indpendante des autres domaines (Figure 5).

Figure 5: Structure de la fibronectine humaine


Le domaine amino-terminal est capable de lier plusieurs catgories de macromolcules
(fibrine, hparine) et les staphylocoques. Le domaine suivant lie le collagne (glatine), puis
un autre domaine contribue l'attachement cellulaire par son motif RGDS (Arg-Gly-AspSer), qui est reconnu par les intgrines des cellules eucaryotes 170. Les deux domaines
carboxy-terminaux reconnaissent l'un l'hparine et l'autre la fibrine.
La structure molculaire de la fibronectine comprend trois types de squences rptes. Le
type I a une longueur de 45 acides amins et se trouve aux extrmits de la protine (N- et Cterminale). Le type II comprend 60 acides amins rpts deux fois. Le type III a 90 acides
amins et est rpt de 15 17 fois; une de ces squences contient le motif RGDS.
L'association des chanes A et B de la fibronectine est ralise par deux ponts S-S situs
l'extrmit C-terminale de chaque chane.

ii) Structure et proprits des adhsines la fibronectine (fibronectin-binding proteins :


FnBPs)

Les adhsines la fibronectine n'ont pas pu tre caractrises aisment par voie
biochimique 72,112,172. Leur structure a t dtermine partir de 1987 par le clonage et
squenage du gne de la premire (FnBPA) des deux FnBPs prsentes dans la souche de
laboratoire 8325-4 183. La deuxime FnBP (FnBPB) a t clone en 1991 et localise la suite
du gne codant pour la FnBPA 77.

Figure 6 : Homologies entre les protines FnBP A et FnBP B


Les deux protines FnBP prsentent des rgions hautement conserves, particulirement
dans la squence de liaison la fibronectine.
(Les pourcentages d'homologie sont indiqus entre les rgions dlimites par les lignes
pointilles verticales).
S : peptide signal. A, B, C, D : Rgions extracellulaires. Wr, Wc : Rgions paritales. M :
Rgion membranaire. + : Rgion cytoplasmique charge positivement.
La comparaison des squences de FnBPA et FnBPB a montr une grande similarit (Fig.
6).

iii) Mutagense des adhsines la fibronectine

La mutagense par transposition a t utilise sur la souche 8325-4 de S. aureus pour


tudier la contribution des deux gnes fnbA et fnbB dans l'adhrence la fibronectine
dposes sur des lamelles. Des mutants dficients pour une ou pour les deux adhsines la
fibronectine ont ainsi t produits. L'expression des adhsines A et B a t contrle par
Western Immunoblot (Fig. 7). Les mutants dficients pour une seule de ces deux FnBP
conservent leur proprit d'adhrence, alors que le double mutant a perdu toute possibilit
d'attachement la fibronectine immobilise 85. La complmentation du double mutant avec
fnbA ou fnbB clon sur un plasmide multicopie permet la restauration du phnotype sauvage
d'adhrence.

Figure 7 : Etude molculaire et fonctionnelle des gnes fnbA et fnbB de S. aureus


d) Rle des adhsines dans la virulence de S. aureus

i) Etudes dcrivant le rle des adhsines

Dans un model canin de shunt artrioveineux (ex vivo), l'adhrence d'un mutant clfA
(codant l'adhsine au fibrinogne) aux surfaces exposes au sang est rduite. La
complmentation de ce mutant par le gne sauvage clfA permet de restaurer l'attachement de
S. aureus au niveau parental 202. De mme, dans un modle in vivo d'endocardite chez le rat, le
mutant clfA est moins infectieux 130.
Dans un model d'arthrite septique, un mutant dficient dans la production de l'adhsine au
collagne (Cna, cf. figure 4) s'est montr moins infectieux que son parent producteur de Cna
152
.
Les tudes in vivo sur le rle de l'adhsine la fibronectine dans la virulence de S. aureus
sont controverses. Dans une tude, un mutant dficient dans la production de FnBP a t
compar la souche parentale pour son adhrence des valves cardiaques 113. Le mutant
dfectif dans la production de l'adhsine a montr une adhrence beaucoup plus faible que
celle du parent ainsi qu'une capacit rduite induire une infection de l'endocarde. Au
contraire, un autre groupe n'a pas trouv de diffrences dans l'infectivit du mutant et celle de
la souche sauvage 78.
L'adhrence la fibronectine a t particulirement tudie dans le contexte des infections
au matriaux artificiels implants (ou biomatriaux). Des tudes ex vivo utilisant du matriel

explant ont montr le rle important jou par la fibronectine dpose pour permettre
l'adhrence de S. aureus 60,76.

ii) Le rle des adhsines dans l'infection staphylococcique sur biomatriaux implants

L'utilisation croissante des matriaux temporaires (ex : cathters) ou permanents (ex :


prothses orthopdiques, valves cardiaques) a augment la frquence des infections
staphylocoques 158,159. Ces infections ont souvent des consquences svres pour les patients et
concernent tous les biomatriaux. Leur gurison est particulirement difficile si l'implant reste
en place 3.
Lors d'une infection bactrienne, S. aureus reconnat et s'attache de manire spcifique
des protines dposes la surface des biomatriaux qu'il colonise (Fig. 8). Cette adhrence
reprsente une premire tape menant la colonisation, et ventuellement l'invasion de
l'hte. Les protines les plus actives pour cet attachement bactrien proviennent du plasma ou
de la matrice extracellulaire. Les plus importantes sont le fibrinogne ou la fibrine (lments
du caillot sanguin) 46,89, et la la fibronectine 89,195,199-201. D'autres protines de l'hte
ventuellement adsorbes sur les biomatriaux pourraient aussi contribuer l'attachement,
mais leur rle n'a pas t dmontr de faon rigoureuse. Parmi ces protines, la
thrombospondine (scrte par les plaquettes) 88, la vitronectine 50,117,155, 203, le collagne
92,151,153,154
et la laminine 89 pourraient jouer un rle important.

Figure 8 : L'adhrence de S. aureus la matrice extracellulaire est une premire tape


menant l'invasion (chelle non respecte)

Un modle exprimental d'infections sur corps trangers a t dvelopp ds 1980 par le


laboratoire de la DMI pour tudier les caractristiques de l'attachement bactrien et les
mcanismes de dfenses de l'hte. Dans ce modle, des cylindres perfors en Tflon ('cages')
sont implants sous anesthsie dans l'espace sous-cutane de cobayes. Quatre semaines aprs
l'implantation et aprs la phase aigu de la raction inflammatoire, un inoculum de 100-1000
bactries est inject dans le liquide inflammatoire accumul dans les 'cages'. Cet inoculum
suffit pour dclencher une infection aigu qui persiste pendant 1-2 semaines. Si l'infection est
trs importante, la cage est expulse de l'animal et l'infection staphylocoques se gurit
spontanment (sans traitement antibiotique). Ceci est d la disparition du corps tranger.
Le modle des 'cages' implantes sous-cutanes, qui se rapproche des conditions
d'infections sur implants chez les humains, a fourni trois informations importantes:
1) un faible inoculum de S. aureus ou de S. epidermidis est suffisant pour provoquer une
infection chronique.
2) L'infection peut tre vite par l'utilisation d'antibiotiques administrs prophylactiquement,
c'est--dire avant l'infection. Par contre, l'infection ne peut pas tre radique si les
antibiotiques sont administrs 12-24 h aprs le dbut de l'infection.
3) Les expriences effectues ont montr que les neutrophiles sont localement dficients dans
l'limination des germes qu'ils ont phagocyts. Ceci s'explique par une diminution de leur
production en radicaux oxydants utiliss comme agents bactricides 52,121,149,225,226.
4) Des lamelles implantes l'intrieur des cages sous-cutanes ont t recouvertes d'une
matrice extracellulaire riche en fibronectine. Le rle cl de cette fibronectine dans
l'attachement de S. aureus a t dmontr soit par des anticorps bloquant la fibronectine 200,
soit par l'adhrence rduite du double mutant fnbA fnbB compare celle de son parent 85.

3) Rgulation de la virulence chez S. aureus et rponses au stress


chez les bactries

1) Introduction
Durant les diffrentes tapes de croissance, et surtout la fin de la phase exponentielle, les
bactries doivent continuellement rorganiser l'expression de gnes housekeeping et
d'autres gnes dits accessoires, qui n'interviennent que dans certaines situations. La figure 8
illustre cette situation, en particulier l'expression temporelle des adhsines et des facteurs de
virulence relchs par S. aureus (toxines, enzymes divers, etc.). Cette expression temporelle
de facteurs de virulence est contrle par des rgulateurs globaux dont les mieux connus sont
agr (accessory gene regulator) et sar (staphylococcal accessory regulator). La raction du
quorum-sensing dans les populations bactrienne de densit croissante joue un rle cl
dans l'expression temporelle du rgulateur global agr.
Les bactries possdent des systmes trs labors (rponses aux stress) pour rparer les
dommages causs par certains agents physiques ou chimiques qui menacent l'intgrit de

l'ADN ou la fonction des protines. Les bactries confrontes un choc thermique produisent
une srie d'enzymes (chaperones) contribuant au repliement correct des protines dnatures.
Les gnes codant pour ces enzymes sont sous un contrle gntique particulier. Leur rgion
promotrice, caractrise par des motifs -10 et -35 spcifiques, est reconnue par le facteur
sigma B qui est une sous-unit de l'ARN polymrase. Ce facteur sigma est galement activ
durant la phase stationnaire. Pour la rparation de l'ADN, ce sont plutt les systmes SOS et
de recombinaison homologue qui sont activs.

2) Les rgulateurs globaux de S. aureus

a) Le systme agr

Comme illustr sur la figure 9 on remarque que S. aureus synthtise surtout des adhsines
pendant la phase exponentielle, alors qu'il labore et relche ses principales toxines et
enzymes hydrolytiques pendant la phase post-exponentielle. Le systme agr contribue de
manire majeure cette rgulation 108,163. En particulier, on constate que la synthse de
protine A et des FnBPs, qui est prdominante dans la phase exponentielle, est rprime
durant la phase post-exponentielle 108,173. Le contrle du rgulateur global agr a t dmontr
par l'inactivation de ce locus, qui a produit une drgulation des protines de surface. Le
contrle du rgulateur global agr sur les toxines et les enzymes hydrolytiques a galement t
dmontr par inactivation spcifique de ce locus. Durant la phase post-exponentielle, les
mutants agr perdent la facult d'exprimer les principales toxines et autres facteurs de
virulence scrts 47,108.

Figure 9 : Expression temporelle des adhsines et des facteurs de virulence de S. aureus.


i) L'organisation du locus agr

Trois rgions promotrices ont t identifies dans le locus agr (P1, P2 et P3) (Fig. 10)
. Le promoteur P1 est faiblement actif tout au long du cycle cellulaire 145 et contribue la
transcription de agrA 156. Le promoteur P2 permet la transcription d'un ARN polycistronique
de 3.5 Kb appel ARN II. L'ARN II code pour AgrA, AgrB, AgrC et AgrD. Finalement le
promoteur P3 initie, dans la direction oppose, la transcription de l'ARN III (0.5 Kb) dont les
160 premiers nuclotides codent pour la -hmolysine, qui ne contribue pas l'activit de
l'agr. L'activit des promoteurs P2 et P3 augmente progressivement pendant la croissance
exponentielle pour atteindre un maximum en phase post-exponentielle.
108,131

Figure 10: Organisation du locus agr

La transcription de l'ARN III dpend du produit des gnes cods par l'ARN II
III semble tre l'effecteur principal du systme agr.

8,144

. L'ARN

ii) L'ARN III est responsable de l'activit agr

Une dltion de 39 pb dans l'ORF codant pour la -hmolysine et n'altrant pas la


squence des codons en aval (in-frame), a permis de montrer que cette squence n'est pas
implique dans le phnotype agr 108. La transformation d'une souche agr- avec le gne codant
l'ARN III d'une autre espce de staphylocoque (S. lugdunensis), qui ne possde pas la hmolysine, restaure en grande partie la fonction de l'agr chez S. aureus 17. On constate donc
que l'ARN III est seul responsable de l'activit agr permettant l'expression des protines
scrtes dans le milieu. Des tudes ultrieures ont montr que l'ARN III agirait comme
activateur de la transcription et mme de la traduction du gne de l'-toxine 133,145. En
revanche, on ne sait pas comment l'ARN III peut intervenir dans la rgulation des adhsines.

iii) L'agr contient un systme de transduction du signal deux composantes

L'tude des diffrents gnes du locus agr a mis en vidence un modle de transduction
d'un signal deux composantes (Fig. 11): la faible activit constitutive du promoteur P2
permet la production d'un octapeptide cod par le gne agrD 10,100,126 et scrt dans le milieu
s'accumulant jusqu'en fin de phase exponentielle. Le gne agrB codant la protine de
membrane permet la translocation de l'octapeptide vers le milieu externe 99,100,126. Cet
octapeptide se lie la protine transmembranaire AgrC (46 Kda) provoquant son
autophosphorylation dans le compartiment cytosolique 120,144. Le groupement phosphate est
ensuite transfr sur la protine cytosolique AgrA 132. La phosphorylation de AgrA est
suppose augmenter l'activit transcriptionnelle des promoteurs P2 et P3 120 avec le concours
du produit majeur du locus sar (cf. plus loin) 132.

Figure 11: Modle de l'activation de la transcription de l'ARN III


b) Le systme sar

sar est un autre rgulateur global capable d'influencer l'expression des protines scrtes
dans le milieu 47. Le phnotype d'un mutant sar se distingue de celui d'un mutant agr par une
diminution de certaines adhsines (ClfA, FnBPs, etc.) et par une augmentation de la
production de protases 41,45,47. Le clonage de ce locus a rvl la prsence d'un opron, dont le
gne principal est nomm sarA, codant pour la protine effectrice SarA de 13.5 KDa 13,48,51,87.
Plusieurs tudes ont mis jour la prsence de trois transcrits (0.58, 0.84 et 1.15 Kb) initis par
les promoteurs P1, P2 et P3 et nomms sarB, sarC et sarA (Fig. 12) 13,51. Chacun de ces
transcrits possde le mme point de terminaison de la transcription situ la fin du gne sarA.

Figure 12: Organisation du locus sar

Les transcrits sarA et sarB sont produits en phase exponentielle, mais sont remplacs en
phase stationnaire par le transcrit sarC absent auparavant 13,123. Ce contrle multiple de
l'opron sar module la quantit de protine rgulatrice SarA. Des tudes rcentes ont montr
la liaison de SarA aux promoteurs P2 et P3 de l'agr permettant leur activation 44,134.

c) Rgulation des facteurs de virulence par agr et sar

agr et sar augmentent ou diminuent la synthse de certaines adhsines comme les FnBPs.
Ces activits dpendent de la phase de croissance et aboutissent soit des effets synergiques
soit antagonistes tels que dmontres sur des mutants simples ou combins d'agr et de sar 219.
Une diminution de la rsistance la mticilline a galement t montre chez les souches
double mutantes agr sar 66, sans que PBP2' soit affecte par la double mutation agr sar.
Les rles respectifs de l'agr et du sar ont t explors dans diffrents modles animaux en
comparant des souches sauvages leurs mutants respectifs. Les doubles mutants agr sar sont
moins infectieux dans l'endocardite exprimentale 45,49. Dans d'autres modles animaux
d'infection (ostomylites, arthrite septique, endophtalmites), l'absence de agr ou de sar peut
mener a une diminution de la virulence et de l'infectiosit de S. aureus 4,24,83. En rsum, les
effets des mutations inactivant agr et sar sont tellement complexes que leur interprtation au
niveau molculaire est trs dlicate.

3) La rponse au choc thermique (heat-shock)

a) Gnralits

La rponse heat-shock (choc thermique) est universelle. Toutefois, cette rponse ne se


limite pas l'agression thermique mais d'autres agents tels que l'thanol, les oxydants et
l'hyperosmolarit. On la retrouve aussi bien chez les eucaryotes que chez les procaryotes
139,140
. Les tudes trs labores faites chez E. coli ont montr qu'en augmentant la temprature
de 37C 42C on observait une augmentation d'un petit nombre de protines sur des gels
d'lectrophorse deux dimensions 140. Ces protines induites par le choc thermique (ex.
GroES, GroEL, DnaK, GrpE, DnaJ etc.) agissent pour replier correctement des protines en
formation ou dnatures par la chaleur et dans la structuration correcte des protines destines
a tre scrtes. D'autres sont responsables (ex. ClpA/ClpB) de l'limination des protines
trop endommages.
Chez S. aureus, on a retrouv certains gnes de la rponse heat-shock, homologues ceux
dcrit chez E. coli, par exemple les gnes codant pour Hsp10 et Hsp60 (respectivement 55%
homologue GroES et 63% homologue GroEL de E. coli) 147,148 ; Hsp70 (75% homologue
DnaK de E. coli) et Hsp40; une protine X ayant 25% d'homologie avec ClpB de E. coli (une
protase semblable ClpA 220) et HSP20 (homologue GrpE de E. coli) 148. D'autres protines
rgules par le choc thermique chez S. aureus n'ont pas d'homologues connus chez E. coli 148.

b) Importance du facteur B

Le facteur B, un facteur sigma alternatif, a t rcemment identifi chez B. subtilis


21,103,217
. C'est un facteur qui serait l'homologue de 32 (facteur sigma du choc thermique) de E.
coli. On le dtecte lorsque la population bactrienne entre en phase stationnaire 28,30,98,217 ou est
expose des stress divers (choc thermique, thanol, oxydants et hyperosmolarit) 20,27,205. Le
gne sigB codant B se trouve au sein d'un opron comprenant 4 gnes (rsbV-rsbW-sigB-rsbX)
dont la transcription dpend de B lui-mme 103. La rgulation de B est surtout posttranscriptionelle. La protine RsbW est un facteur anti- B rgulant ngativement l'activit de
B en bloquant son interaction avec l'ARN polymrase (Fig. 13) 19,29. Lors d'un stress, la
protine RsbV contrecarre RsbW et restaure l'activit de B 18,27,29,65. Cette activation de B
semble galement impliquer les cofacteurs RsbU (une phosphatase) 82,204, et RsbX 204.

Figure 13 : rgulation de B [...]


Le facteur B de S. aureus a t clon, et des squences homologues avec celles de
l'opron sigB de B. subtilis (codant B) ont t rvles (Fig. 14) 110,221.

Figure 14 Homologies de squences de l'opron sigB chez B. subtilis et S. aureus

Malgr les homologies constates entre B. subtilis et S. aureus, on constate des diffrences
significatives entre les deux espces dans l'organisation et la rgulation de leur opron sigB 110.

c) Contribution de B l'expression de la virulence chez S. aureus

L'inactivation de sigB chez S. aureus provoque la disparition de la pigmentation


caractristique de S. aureus (staphyloxanthine). D'autres protines, comme la protine de choc
alcalin 23 82,111 ou la lipase et la thermonuclase sont soit rgules positivement ou
ngativement par B 111. Comme mentionn plus haut, le promoteur P3 de sar possde une
squence caractristique reconnue par le facteur B 123.
Le rle de B dans la virulence reste controvers 42. Une tude trs rcente indique un rle
important de B dans la rgulation de la production de biofilm par S. aureus 164.

4) La rponse SOS et la recombinaison homologue

a) Gnralits

Le systme SOS, largement dcrit chez E. coli, est mis en route par l'interaction de deux
protines (RecA et LexA), qui dclenche l'activation spcifique d'une vingtaine de gnes
impliqus dans la rparation de l'ADN. La protine RecA, qui joue un rle primordial dans la
rponse SOS, est galement un facteur cl d'un autre systme de rparation de l'ADN qui est
la recombinaison homologue 53 catalysant les ractions de synapse (association de brins
d'ADN homologues en dbut de division) et d'change de brins de chromatine 166.
La rponse SOS et la recombinaison homologue ont t trs tudies chez E. coli mais trs
peu chez S. aureus.

b) La rponse SOS et la recombinaison chez E. coli

Le systme de rparation SOS intervient lors d'agressions particulirement graves de


l'ADN et augmente le nombre d'erreurs dans les squences rpares (error-prone repair) 207.
Cet effet secondaire du systme SOS joue peut tre un rle important dans l'volution des
espces bactriennes 208,218.
Les premires expriences menes chez E. coli ont montr que des mutations dans chacun
des gnes lexA et recA inhibent l'induction du systme SOS, indiquant le rle essentiel de ces
deux gnes dans l'activation de ce systme 94,135,167,168,218.
Les principaux gnes rguls par le systme SOS, part recA et lexA, sont:

uvrABCD, impliqus dans la rparation des dimres de pyrimidines crs par


l'exposition aux UVs 208 ;
recN, recF, ruvABC, impliqus dans la rparation de cassures de la double hlice 208.
La plupart de ces gnes interviennent galement lors de la recombinaison homologue
pour rparer les dommages subit par l'ADN (error-free repair) (ex : recA, recBCD,
recF, ruvABC, etc.) 114.

En comparant les promoteurs de ces diffrents gnes on a mis en vidence une squence
consensus sur laquelle se lie LexA 207. L'affinit de la liaison de LexA aux diffrents
oprateurs varie fortement 36,67. Malgr la rpression des gnes cibles par LexA, certains
d'entre eux sont tout de mme exprims de manire significative lorsque la bactrie n'est pas
stresse 207,209. Ainsi, RecA (produit par le gne recA) se trouve en concentration suffisante
pour remplir son rle dans la recombinaison homologue 104.
La nature du signal dclenchant les systmes de rparation de l'ADN semble tre
l'exposition de brins libres d'ADN, qui rsultent d'une cassure simple ou double brin du
chromosome circulaire bactrien. RecA et d'autres cofacteurs se lient ces brins d'ADN 208 et
d'autre part activent le clivage du rpresseur LexA, ce qui permet l'expression des gnes SOS
207,209
. Lorsque le facteur de stress disparat, RecA n'est plus activ et le pool de LexA est
ramen la normale, ce qui permet de rprimer les gnes de la rponses SOS 207,209.

c) La rponse SOS et la recombinaison chez S. aureus

Les composantes molculaires des systmes de rparation de l'ADN chez S. aureus sont
encore incompltement dcrits. Un mutant ayant le phnotype recA- 222 189 a t dcrit 14,84. Des
fragments de recA de S. aureus ont t clons chez E. coli 14 ce qui a permis le squenage de
ce gne. Le gne recA de S. aureus a 85 % d'homologie avec celui de B. subtilis 14. Les
similarits dans les rgions promotrices des gnes recA de S. aureus et B. subtilis suggrent
une rgulation et une fonction similaire de ces gnes 14.
En dehors de recA on connat trs peu de choses sur les composantes de la recombinaison
homologue chez S. aureus, l'exception de recG 143.

5) Conclusion
Les rponses aux stress qui peuvent affecter l'expression des facteurs de virulence chez
S. aureus sont surtout dduites de ce qu'on a observ chez E. coli et B. subtilis. Par contre, sur
un plan exprimental les donnes disponibles sont trs minces chez S. aureus.
Mme si les rgulateurs globaux spcifiques S. aureus tels qu'agr et sar sont assez bien
dcrits in vitro leur importance in vivo et leur interaction avec les rponses aux stress telles
que heat-shock, SOS et recombinaison homologue sont trs mal connues. Alors que ces
diffrents systmes de rgulation ont t prsents dans des chapitres spars, il est peu
probable qu'ils agissent de manire isole. On peut au contraire penser que ces diffrents
processus agissent de manire concerte pour la survie des bactries dans les diffrents
environnements auxquels elles sont soumises. On sait par exemple que :

L'expression de sar dpend en partie du facteur sigma (B) spcifique de la rponse de choc
thermique
certains agents chimiques peuvent dclencher simultanment plusieurs systmes de rponse
aux stress (ex : ac. nalidixique dclenchant une rponse SOS puis une rponse de type choc
thermique) 198,
La rponse SOS peu dclencher l'expression de certains gnes de la rponse de choc thermique
109
.
L'tude de ces systmes de rgulation est importante pour comprendre la pathognse de
S. aureus chez l'humain.

4) Modes d'action des fluoroquinolones et mcanismes de


rsistance

1) Introduction
Les antibiotiques se rpartissent en trois catgories selon leur mode d'action:

Ceux qui inhibent la synthse de la paroi (pnicilline, carbapenems, cphalosporines,


bacitracine, vancomycine, teicoplanine, etc.)
Ceux qui inhibent la synthse des protines bactriennes au niveau ribosomal ou des
ARN de transferts (chloramphnicol, ttracycline, rythromycine, streptomycine,
gentamicine, tobramycine).
Ceux qui ont pour cible les topoisomrases de type II (fluoroquinolones).

2) Mcanismes gnraux de rsistance aux antibiotiques


Les bactries ont dvelopp diffrents mcanismes pour contrecarrer l'action des
antibiotiques:

Des enzymes hydrolysant les composs -lactamines (-lactamase) ou modifiant les


aminoglycosides (par transfert de divers groupes chimiques) (Fig. 15A).
Un changement de permabilit bloquant l'influx des antimicrobiens (changement des
pores dans la membrane externe des Gram-) (Fig. 15B).
Une augmentation de l'efflux des antibiotiques (ac. fusidique, streptomycine,
ttracyclines, fluoroquinolones, etc.) ou antiseptiques (ammoniums quaternaires, etc.)
(Fig. 15B).
Une modification ou une substitution des cibles des antibiotiques (cf.
fluoroquinolones, Fig 15 C ; mticilline, Fig. 15 D).

Figure 15 : Mcanismes de rsistance aux antibiotiques chez les bactries


(tir de 'La Recherche' N314, p.63)
3) Mcanismes spcifiques des fluoroquinolones sur l'enroulement de l'ADN

a) Introduction

La premire fluoroquinolone est la norfloxacine (FLQ) efficace dans le traitement


d'infections urinaires (Fig. 16). Les composantes de la seconde gnration de FLQ, par
exemple la ciprofloxacine et la pefloxacine, sont caractrises par une plus grande activit
antibactrienne, un plus large spectre (action contre les Gram + galement), une adsorption
intestinale optimale pour l'administration orale, et des proprits pharmacocintiques
permettant de traiter une grande varit d'infections systmiques.

Figure 16: Structure chimique de certains fluoroquinolones


b) Les mcanismes d'enroulement de l'ADN: rle des topoisomrases

Pour tre emmagasin dans la cellule, l'ADN doit tre condens dans une forme trs
compacte qui est dfinie par le terme de super-enroulement ('supercoiling') (Fig. 17). Cet tat
superenroul est contrl en grande partie par une catgorie spciale d'enzymes: les
topoisomrases. De plus ces enzymes jouent un rle important pour la rplication et la
transcription de l'ADN. Le droulement de l'ADN par les topoisomrases facilite l'accs des
diffrents enzymes de transcription ou de rplication.
Les topoisomrases modifient le super-enroulement de l'ADN en le coupant puis en le
recollant. On les classe dans trois grands groupes:

Les topoisomrases de type I ne coupent qu'un seul des deux brins de la double hlice
d'ADN et permettent la relaxation de super-enroulements ngatifs.
Par contre les topoisomrases de type II (gyrase et topoisomrase IV) coupent les
deux brins de la double hlice.

Figure 17 :Forme superenroule de l'ADN


Des topoisomrases particulires sont impliques dans la transposition et l'excision de
phages de l'ADN.

Les topoisomrases de type II, dont fait partie la Gyrase, possdent 4 sous-units: deux A
(Gyr A), et deux B (Gyr B) (Fig. 19). Les sous-units B ont une activit ATPasique qui est
inhibe par la novobiocine. Au sein de la sous-unit A de la Gyrase, le rsidu Tyr en position
122 est responsable de la coupure transitoire dans l'ADN. Il en rsulte une phospho-tyrosinegyrase sur chacun des brins permettant le passage d'une double hlice au travers de cette
double coupure.
La topoisomrase IV contribue la dcatnation des deux chromatides filles et leur
rpartition dans les deux cellules filles 223.

c) Effets des fluoroquinolones sur l'interaction Gyrase-ADN

L'interaction entre les fluoroquinolones et le complexe Gyrase-ADN peut tre dcrite en


quatre tapes:

Les Topoisomrases de type II droulent l'ADN (Fig. 18 et 19, point 1).


Le modle de Shen et al 179 postule que les fluoroquinolones s'auto-associent et
stabilisent le complexe Gyrase-ADN (Fig. 18 et 19, point 2). Ils empchent ainsi la
religation de l'ADN coup par la gyrase 5,6,43,179. Ceci dsorganise la rplication du

chromosome bactrien et peut mener la mort cellulaire par des mcanismes encore
mal dfinis.

Figure 18: Activit de la gyrase et interaction avec un fluoroquinolone ( fluoroquinolone


auto-associ, cf. en bas droite de la figure, d'aprs Shen et al 179
Un autre modle, celui de Drilica et al 64 dcrit les mcanismes menant la mort
cellulaire (Fig. 19). Dans l'tape n3 (Fig. 19) les complexes Topoisomrase IIfluoroquinolones sont librs laissant des bouts d'ADN clivs. Cette raction est
sensible un inhibiteur de la synthse de protines (chloramphnicol), suggrant leur
ncessit pour cette raction. Certaines de ces protines font peut tre partie des
systmes de rparation de l'ADN.
A trs hautes concentrations, les fluoroquinolones pourraient provoquer la dissociation
des sous-units des Topoisomrases II ce qui entranerait la libration de l'ADN
doublement coup. Cette raction est insensible au chloramphnicol, n'impliquerait
pas de nosynthse de protines (CAM-insensible) (Fig. 19, point 4).

Figure 19: Effets des fluoroquinolones sur l'interaction Topoisomrases II-ADN (CAM,
chloramphnicol ; d'aprs Drilica et Zhao 64)
4) Les mcanismes de rsistance aux fluoroquinolones chez S. aureus
Des observations rcentes 197 74,75, ont montr que l'tape primaire d'acquisition de
rsistance aux fluoroquinolones n'impliquait pas de mutation dans les gnes gyrA ou B, mais
dans la sous-unit A de la topoisomrase IV, code par le locus grlA. Cette topoisomrase
apparente la gyrase subit des mutations dans une rgion qu'on appelle QRDR (Quinolone
Resistance Determining Region) analogue celle du gne gyrA (voir tableau 2). Un modle
dcrivant l'acquisition progressive de niveaux croissants de rsistance aux fluoroquinolones a
t propos (ex. ciprofloxacine, voir tableau 2) 74,75. Lors de la premire tape, les mutants
modrment rsistants aux fluoroquinolones montrent un changement d'acide amin (Ser
88Tyr ou Glu 84 Lys) dans la sous-unit A (grlA) de la topoisomrase IV 74.

Tableau 2: modle d'acquisition de la rsistance aux fluoroquinolones chez S. aureus


Mutations
Mutant/Sauvage

gyrA

grlA (topo IV)

CMI
Ciprofloxacine(g/ml)

de

Souche sensible

---

---

Mutant1re tape

---

Ser 80-> ;Tyr ou


2
Glu 84-> ;Lys

Mutant2me tape

Glu 88-> ;LysouSer


Ser 80-> ;Tyr/Phe
84-> ;Leu

Mutant3me tape avec


Ser 84-> ;Leu
norA

0.25

32

Ser 80-> ;Tyr ou


128
Glu 84-> ;Leu

Lors de la deuxime tape, les mutants grlA acquirent une seconde mutation dans le gne
gyrA (Glu 88Lys ou Ser 84->Leu) 74. La coexistence de ces deux mutations est
indispensable pour obtenir un haut niveau de rsistance aux fluoroquinolones chez S. aureus.
Paradoxalement, une mutation survenant seulement dans le gne gyrA est n'augmente pas la
rsistance, la CMI de ciprofloxacine pour S. aureus restant identique celle du parent sensible
142
.
Indpendamment de cette mutation dans le gne gyrA, certaines souches de S. aureus sont
galement capables d'augmenter l'efflux de fluoroquinolones par une pompe
transmembranaire appele NorA 142. Cette pompe est responsable de l'expulsion de
fluoroquinolones hydrophiles (comme la ciprofloxacine) du milieu intracellulaire par un
mcanisme actif 39,93,187 utilisant le gradient de protons transmembranaire 141. Une mutation du
promoteur de norA affecterait la liaison sur cette rgion d'une protine rgulatrice augmentant
ainsi l'expression de norA. De mme, une mutation de la protine rgulatrice pourrait
expliquer le phnotype de surexpression de NorA chez une souche n'ayant pas d'altrations
dans le promoteur de norA 102.
On constate que mme les doubles mutants rsistants dans les gnes grlA et gyrA peuvent
acqurir cette troisime mutation lie l'activation du gne norA. Ces triples mutants, qui ont
une accumulation rduite de fluoroquinolones hydrophiles, montrent une rsistance accrue
ces composs 74.

5) Impact des fluoroquinolones et autres antibiotiques sur l'expression des


facteurs de virulence chez S. aureus
L'introduction de chaque nouvelle catgorie d'antibiotique a t gnralement suivie plus
ou moins long terme par l'mergence de la rsistance chez S. aureus et la plupart des bactries
pathognes 71,171. Une question qui est frquemment pose est l'impact sur la virulence de
concentrations sous-inhibitrices sur l'expression de divers facteurs de virulence (toxines, des
adhsines, etc.). Un certain nombre de travaux tendent dmontrer que les concentrations
sous-inhibitrices d'antibiotiques (fluoroquinolones, macrolides) diminuent la virulence des
bactries, dont S. aureus 175,176,181,184. On a ainsi pu observer une diminution de l'adhrence
bactrienne sur des pithlia, une augmentation de leur phagocytose et de leur destruction
intracellulaire par les polymorphonuclaires (PMN) 33-35,61. D'autres groupes ont tudi l'effet
de concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques sur l'expression des adhsines liant la
fibronectine ou le collagne chez S. aureus. Alors que les lincosamines, l'erythromycine, le

chloramphnicol et la clindamycine diminuent le nombre d'adhsines la fibronectine ou au


collagne 37, les -lactames et la vancomycine en augmentent le nombre 161,162.
Par contraste avec ces observations, certaines tudes ont montr l'augmentation de certains
facteurs de virulence pendant la croissance bactrienne en prsence de concentrations sousinhibitrices d'antibiotiques. Par exemple, la nafcilline 105 ou d'autres -lactames 146 peuvent
augmenter considrablement la production d'-toxine ou activer son gne chez S. aureus.
D'autres observations rcentes montrent l'induction de l'opron icaADBC chez S. epidermidis
par la tetracycline ou la quinupristin-dalfopristin 165. Les fluoroquinolones peuvent aussi
activer la production de la toxine Shiga 2 de E. coli 0157 224.
Ces tudes dmontrent que les concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques peuvent
avoir des effets trs contrasts. Vu l'importance des fluoroquinolones dans la thrapie humaine
et le fait qu'elles perturbent le fonctionnement de l'ADN, il nous a paru important d'valuer en
dtail leur impact sur la virulence de S. aureus.
Dans un contexte assez diffrent, des tudes cliniques suggrent une relation entre
l'emploi de la ciprofloxacine et l'mergence de souches multirsistantes de S. aureus. Une
tude en soins intensifs a montr que l'emploi de la ciprofloxacine chez des patients
prsentant une infection pulmonaire entranait frquemment une surinfection par des germes
rsistants (MRSA) 122. Dans une tude multivarie, les auteurs ont mis jour une corrlation
entre l'incidence de souches MRSA nosocomiales et l'augmentation de l'utilisation de
ceftazidime/cefsulodine, amoxicilline/ac. clavulanique, et des fluoroquinolones 58. Enfin, une
tude trs rcente a analys les facteurs de risque pour le portage de MRSA et conclu qu'une
exposition des fluoroquinolone prdisposait les patients la colonisation par MRSA 86.

5) Buts de la recherche
Le but de ce travail a t d'tudier l'interaction entre les mcanismes de rsistance aux
antibiotiques, les antimicrobiens eux-mmes et l'expression de l'adhrence chez S. aureus. Les
rsultats sont prsents sous la forme d'articles dj publis ou d'un manuscrit soumis
publication, trouvs en annexe la fin de cette thse.
Les rsultats dcrits en dtails dans ces publications seront brivement rsums dans les
chapitres suivants :
Le premier article dcrira un modle simplifi qui a permis de tester l'impact des
fluoroquinolones en concentrations sous-inhibitrices sur l'adhrence la fibronectine des
S. aureus rsistants aux fluoroquinolones. En testant une srie de mutants dont les loci de
rsistance aux fluoroquinolones portent des mutations spcifiques, nous avons montr une
augmentation de l'expression des adhsines la fibronectine chez les bactries ayant fait leur
croissance en prsence de ciprofloxacine.
Dans le deuxime article, nous examinerons si l'observation paradoxale de surexpression
des adhsines se produit aussi sur des souches cliniques en particulier des MRSA
frquemment retrouvs dans l'environnement hospitalier. Un autre objectif a t d'tudier au
niveau molculaire l'activation par la ciprofloxacine des promoteurs codant les adhsines la

fibronectine de type A ou B. Cette activation a t tudie grce au gne rapporteur lucifrase


fusionn chacun des promoteurs des adhsines la fibronectine.
Dans la troisime article, nous avons recherch les mcanismes cellulaires impliqus dans
l'activation des adhsines la fibronectine par l'exposition aux fluoroquinolones. L'impact de
la ciprofloxacine sur les rgulateurs globaux de S. aureus ou sur les voies mtaboliques de
rponses aux stress a t test grce des mutants de ces rgulateurs globaux agr, sar ou
facteurs de stress. Un rle intressant pour le facteur de rponse au stress recA dans la rponse
de S. aureus la ciprofloxacine a t mis en vidence.
Une dernire partie dcrira une tude en cours comparant l'impact de plusieurs
fluoroquinolones sur l'activation du promoteur des adhsines la fibronectine ainsi que sur le
phnotype d'adhrence.
Ces observations apportent un nouvel outil de travail qui permettra peut-tre d'explorer les
mcanismes d'attachement et de colonisation des souches multirsistantes de S. aureus
(MRSA), en relation possible avec l'exposition frquentes des patients hospitaliss des
fluoroquinolones large spectre.
Une autre avance de ce travail est de mettre jour le rle des rponses aux stress, telles
qu'illustres par le facteur recA, dans l'expression des facteurs de virulence par des souches
multirsistantes de S. aureus. Une telle exploration nous permettra peut-tre de mieux
comprendre comment ces souches multirsistantes colonisent progressivement
l'environnement hospitalier.

B) Bref rappel mthodologique


1) Avant-propos
Ce chapitre rcapitule brivement les techniques non conventionnelles qui ont t
employes pour ce travail et sont adaptes aux staphylocoques. Les autres techniques ayant un
emploi courant en laboratoire ne seront pas voques car elles sont dcrites dans les articles
figurant en annexe.

2) Mesure de l'adhrence de S. aureus


Des stocks des diffrentes souches bactriennes sont conservs sous forme congele dans
un milieu skim milk -70C. Pour obtenir une culture bactrienne en phase stationnaire (~
1*109 UFC), quelques colonies sont prleves d'une glose et ensemences dans des tubes
contenant 1 ml de milieu liquide Mller-Hinton (MHB). Aprs ~16 h de croissance 37C,
les cultures sont centrifuges et le culot bactrien est rinc dans du NaCl physiologique (0.9
%). Pour obtenir une suspension bactrienne radiomarque un aliquot de la culture de 16 h est

ensemenc dans 1 ml de MHB contenant 25 Ci de 3H-thymidine (Fig. 22). Un autre aliquot


est inocul dans le mme milieu additionn de ciprofloxacine en concentrations sousinhibitrices ( ou 1/8 de la CMI). Aprs 5 h de croissance 37 C, les bactries
radiomarques sont laves de leur milieu radioactif par deux centrifugations.

Figure 20 : Mesure de l'adhrence


Des lamelles en plastique (PMMA) recouvertes de glatine sont incubes avec des
concentrations croissantes de fibronectine humaine purifie (2 g/ml; 1 g/ml; 0.5 g/ml; 0
g/ml), ce qui permet l'adsorption linaire de fibronectine sur les lamelles. Puis, les lamelles
recouvertes de fibronectine sont incubes avec chaque souche bactrienne radiomarque,
provenant d'une culture avec ou sans fluoroquinolone. Aprs 1 h, le nombre de bactries
adhrentes est compt en transfrant chaque lamelle rince dans des flacons de radioactivit.

2) Evaluation des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI)


Les CMI de chaque antibiotique pour les diffrentes souches sensibles ou rsistantes aux
fluoroquinolones ont t values par la technique dite de macro-dilution en milieu liquide
138
(fig. 21):
X reprsente la conc de l'antibiotique.

Figure 21 : Mesure de la CMI


Une quantit X de l'antibiotique tester est d'abord dilue en srie dans le milieu MHB.
Puis un inoculum bactrien contenant ~1*106 UFC est ajout chaque tube. Aprs 24 h
d'incubation 37C, on procde la lecture des tubes troubles (dans lesquels il y a eu
croissance bactrienne) ou translucides (dans lesquels il n'y a pas eu de croissance
bactrienne). Un tube contrle, o seul l'inoculum bactrien est prsent, permet de vrifier que
la croissance bactrienne se droule normalement dans ce milieu.

3) Extraction et analyse des protines des lysats bactriens


L'analyse des protines prsentes dans diffrentes fractions sub-cellulaires (paroi,
membrane, cytoplasme) est complique par le relchement de protases trs puissantes qui
ncessite l'usage d'un cocktail d'anti-protases trs large spectre 23. Le peptidoglycan de
S. aureus est digr par un enzyme spcifique, la lysostaphine, ce qui fait exploser par choc
osmotique la bactrie prive de sa paroi protectrice. Pour diminuer la viscosit du lysat, on
ajoute de la Dnase. Finalement, on rcupre les protines et autres composants cellulaires et
membranaires par centrifugations. L'analyse des protines par lectrophorse en gels SDS et
Immunoblots se fait par des techniques standard.

4) Production de phages et transduction


La transduction de gnes chromosomiques ou de plasmides a utilis des phages
spcifiques de S. aureus ainsi que des techniques bien tablies 9. En rsum, la souche
donneuse du plasmide/marqueur chromosomique, associ une rsistance antibiotique, est
infecte par le phage. Au bout d'une nuit des plages de lyse apparaissent et les phages produits
sont rcolts et concentrs par centrifugation. Ils vont servir infecter une culture de la
souche cible (~109-1010 CFU/ml). Les transductants apparatront 36-48 h plus tard sur des
gloses contenant l'antibiotique de slection.

5) Extraction de l'ADN bactrien


Quelques colonies sont rcupres d'une glose et ajoutes 1 ml de PBS contenant 1mM
CaCl2 et 0.5mM de MgCl2. Cette culture est mise en prsence de lysostaphine et de lysozyme
(digestion de la paroi) 22. La protinase K est ensuite ajoute pour liminer la composante
protique 125. L'extraction de l'ADN se fait en prsence de phnol:chloroforme:isoamyl-alcool
(25:24:1). L'ADN rcolt est ensuite prcipit et quantifi par spectophotomtrie.

6) Clonage et complmentation l'aide d'un plasmide suicide


Pour viter un effet toxique de copies multiples du gne recA clon dans E. coli comme
dcrit prcdemment 14, nous avons utilis un plasmide particulier prsent en faible copies
dans E. coli, qui ne peut subsister dans S. aureus que par son intgration spcifique
( suicide ) dans le gne codant la lipase dans la souche CYL316 de S. aureus restriction
dficiente 116. Cette intgration est rendue possible par les homologies de squences sur le
plasmide et dans le gne chromosomique codant la lipase ainsi que par la production d'un
enzyme favorisant cette recombinaison (intgrase) se trouvant sur un second vecteur prsent
dans la bactrie ( helper ) 116. Ainsi, le mutant RA1recA a pu tre complment par
l'introduction dans le gne codant la lipase d'une copie fonctionelle de ce gne (Fig. 22).
Les autres techniques lies au clonage telles que la PCR et le squenage de l'ADN
proviennent de source commerciale. De mme, l'insertion de 5 nuclotides dans la squence
codante de recA a utilis la technique de Quick change mutagenesis (Stratagene) (Fig. 23)

Figure 22 : Stratgie de clonage de recA S. aureus

Figure 23 : Mutagnse du gne clon recA

7) Activation des promoteurs des gnes fnbA et fnbB par des


concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine
Pour mesurer au niveau transcriptionnel l'induction des FnBPs par des concentrations
sous-inhibitrices de ciprolfloxacine, nous avons transfr dans le double mutant grlA, gyrA
EN1252a un plasmide contenant la fusion du promoteur du gne fnbA ou fnbB avec le gne
rapporteur luxAB exprimant la lucifrase (Fig. 24).

Figure 24: Systme rapporteur utilisant la lucifrase


Le premier protocole exprimental a mesur l'activation du promoteur de chaque fnb
priodiquement durant 5 heures, chez les souches incubes en absence ou prsence de
ciprofloxacine (1/4 ou 1/8 de la CMI). Les mesures de luminescence effectues aprs chaque
heure ont t normalises par la densit optique (OD 540nm) des cultures en croissance (Fig. 25)
et exprimes en SLU (specific light units).

Figure 25: Protocole utilis pour mesurer l'activation des promoteurs fnb durant 5
heures
Dans la deuxime srie d'expriences, nous avons modifi le protocole pour tudier l'effet
de la ciprofloxacine durant les premires 20 40 min. (Fig. 26). Aprs 4 heures de croissance
sans antibiotique chaque souche a t mise en prsence pendant 20-40 min de concentrations
sous-inhibitrices de fluoroquinolones (1/4 ou 1/8 de la CMI).

Figure 26: Protocole utilis pour mesurer l'activation des promoteurs fnb durant 20-40
min.

C) Augmentation de l'Adhrence de S. aureus


Rsistants aux Fluoroquinolones par des
Concentrations Sous-Inhibitrices de Ciprofloxacine
(Article N1)

1) Avant-propos
Ce chapitre prsente un rsum succinct des rsultats dcrits en dtail dans l'article n1.
Pour cette tude, nous avons dispos d'une srie de mutants (gracieusement fournis par le
Prof. D. Hooper, Boston) affectant spcifiquement chacun des loci de rsistance aux
fluoroquinolones (grlA, gyrA, norA, Tableau 3).

Tableau 3: Mutants isogniques de S. aureus

2) Profils d'adhrence
Lorsque la ciprofloxacine est absente du milieu de culture, les mutants exprimant
diffrents niveaux de rsistance prsentent nanmoins des profils d'adhrence la fibronectine
uniformes et semblables leurs parents respectifs (Fig. 27A). Le mutant grlA est le seul
montrer une adhrence un peu rduite, pour des raisons indtermines. On constate galement
que la prsence ou l'absence du marqueur de rsistance la novobiocine dans les souches
parentales, utilis pour faciliter les constructions des mutants, n'affecte pas du tout leur niveau
d'adhrence.
La figure 27B nous montre qu'aprs croissance en prsence de ciprofloxacine (1/4 CMI),
les diffrents mutants et leurs parents ne changent pas leur niveau d'adhrence par rapport aux
conditions de croissance sans antibiotique (Fig. 27A). Ceci est aussi valable pour le mutant
flqB affectant le gne norA (pompe d'efflux), qui n'augmente pas son adhrence aprs
exposition la ciprofloxacine (Fig. 27).

Figure 27: Adhrence la fibronectine des mutants exprimant une faible rsistance la
ciprofloxacine
Par contraste, avec les mutants de bas niveau de rsistance et leurs parents sensibles la
ciprofloxacine, nous avons observ que la croissance en prsence de de la CMI de
ciprofloxacine augmentait fortement l'adhrence des souches exprimant un haut niveau de
rsistance, tels que les doubles (grlA, gyrA) ou triple mutants (grlA, gyrA, flqB) (Fig. 28A,
28).

Figure 28: Adhrence la fibronectine de mutants combins exprimant une rsistance


leve la ciprofloxacine

3) Analyse quantitative des adhsines la fibronectine par Western


Blot et densitomtrie
L'immunodtection et quantification des FnBPs montre une augmentation substantielle de
ces adhsines chez le double mutant (grlA, gyrA) par rapport aux simples mutants et aux
parents, aprs croissance en prsence de CMI de ciprofloxacine (Fig. 29). De mme, la
souche triple mutante exprime une quantit accrue de FnBPs aprs croissance en prsence de
ciprofloxacine.

Figure 29: Expression des adhsines la fibronectine (FnBPs) chez le parent sensible
(Cipros) et le mutant grlA gyrA (Cipror) aprs croissance avec ou sans Cipro (1/4 CMI)
Vu le poids molculaire similaire des FnBP, ce type d'approche ne permet pas de
distinguer laquelle des deux adhsines la fibronectine est la plus stimule. Malgr l'emploi
d'un cocktail d'antiprotases pour limiter au maximum la digestion de ces adhsines on
distingue sur les Western blots une bande identifie comme un produit majeur de dgradation
(FnBP tronque, ~135 KDa) en plus de l'adhsine native (~190 KDa).

D) Induction des Adhsines la Fibronectine par la


Ciprofloxacine chez S. aureus rsistants aux
fluroroquinolones (Article N2)
1) Avant-propos
Les buts de cette seconde tude taient de :
confirmer la surexpression des FnBPs sur un chantillon de souches cliniques (10 MRSA et 6
MSSA) rsistantes aux fluroquinolones, aprs croissance en prsence de concentrations sousinhibitrices de ciprofloxacine,
valuer l'augmentation par la ciprofloxacine de l'adhrence de souches fluoroquinolonesrsistantes sur des lamelles explantes des animaux,
mesurer l'induction des FnBPs par des concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine au
niveau transcriptionel.

2) L'adhrence de souches cliniques rsistantes est aussi


augmente aprs croissance en prsence de ciprofloxacine
Seize souches cliniques rsistantes aux fluoroquinolones provenant soit de Boston, de
l'Institut pasteur ou du Laboratoire de Bactriologie de l'HCUG ont t tudies. Certaines de
ces souches sont sensibles la mticilline (MSSA) et d'autres rsistantes la mticilline
(MRSA). Toutes ont t squences au niveau des loci gyrA et grlA responsables de la
rsistance aux fluoroquinolones (tableau 4). Ce squenage a montr la prsence d'une grande
diversit de mutations, indiquant qu'il n'y avait pas de clone prdominant dans cet chantillon
de taille restreinte.

Tableau 4: Souches cliniques de S. aureus rsistantes la ciprofloxacine


Souches
S. aureus

de Profil de rsistance Changements


antibiotique
d'a.a.:GrlA GyrA

CMI (g/ml) %
augmentation
de Cipro
d'adhrence

MRSA
4613

Mcr, Gmr, Fosr, Cipr

S80F,
E84K

E88K

64

149

4673

Mcr, Gmr, Cipr

S80F,
S81P

S84L,
E88A

128

4753

Mcr, Gmr, Fosr, Cipr

S80F,
S81P

S84L

128

17

4718

Mcr, Gmr, Cipr

S80F

S84L,
E88A

128

61

4623

Mcr, Gmr, Cipr

S80F

E88K

128

104

95067

Mcr, Gmr, Fosr, SgAr,


S80F
Cipr

S84A

16

353

BM10762

Mcr, Gmr, Fosr, SgAr,


S80F
SgBr, Rf r, Far, Cipr

S84L

64

206

95057

Mcr, Gmr, Fosr, SgAr, S80F,


SgBr, Rf r, Cipr
E84K

S84L

128

73

BM10835

Mcr, Gmr, Fosr, SgAr, S80F,


Rf r, Cipr
E84K

S84L

128

27

We

Mcr, Gmr, Cipr

S80Y

S84L

16

29

Ch

Cipr

S80F,
I45M

---

16

Mc

Cipr

S80F

---

MSSA

Mu

Cipr

E84K

---

46

Av

Cipr

S80F,
I45M

S84A

22

Dec

Cipr

S80F

S84L

16

112

Ki

Cipr

S80F

S84A

16

66

Abrviations: Mc, Methicilline; Gm, Gentamicine; Fos, Fosfomycine; SgA,


Streptogramine A; SgB, Streptogramine B; Rf, Rifampine; Fa, Acide Fusidique; Cip,
Ciprofloxacine.
12 souches cliniques sur 16 montrent une augmentation significative de l'adhrence aprs
croissance en prsence de ciprofloxacine (1/4 de la CMI), les souches MRSA de manire plus
marque que les MSSA (Tableau 4, Fig. 30).

Figure 30 : Augmentation de l'adhrence des MRSA/MSSA aprs croissance en prsence


de ciprofloxacine (les symboles ferms reprsentent chaque souche dont l'adhrence est
significativement augmente).
Deux des souches MRSA (BM10762 et 95067), gracieusement fournies par l'Institut
Pasteur, retrouves dans plusieurs hpitaux grce des marqueurs de rsistance antibiotique

atypiques quinupristin-dalfopristin et donc considres comme pidmiques, montrent une


augmentation particulirement forte de leur adhrence aprs croissance en prsence de
ciprofloxacine. Les niveaux d'augmentations atteignent respectivement 206 et 353 % (Tableau
4).
La dose-rponse d'adhrence de la souche pidmique 95067 montre une trs forte
augmentation aprs croissance en prsence de ciprofloxacine (Fig. 31A). En parallle la
quantit de FnBPs estime par Western Blot augmente galement aprs culture en prsence de
ciprofloxacine (Fig. 31A).

Figure 31: Augmentation de l'adhrence la fibronectine et de la production de FnBPs


(inserts) chez les souches rsistantes en prsence de concentrations sous-inhibitrices de
ciprofloxacine
La figure 31B montre par comparaison la dose-rponse de stimulation de l'adhrence du
double mutant grlA gyrA EN1252a en fonction de concentrations variables de ciprofloxacine.
Cette exprience nous a permis de dterminer le seuil de stimulation de l'adhrence par les
concentrations sous-inhibitrices de la fluoroquinolone. Cette exprience a clairement
dmontr que le seuil de stimulation se situait entre 1/16 et 1/8 de la CMI de ciprofloxacine.
Par contre, la stimulation de l'adhrence par la ciprofloxacine n'a plus montr d'augmentation
en passant de 1/8 (4 g/ml) (8 g/ml) de la CMI de cet antibiotique. Cette observation a
t dterminante pour la suite du travail o nous avons choisi d'utiliser 1/8 de la CMI de
ciprofloxacine, parcequ'elle n'altre pas du tout la vitesse de croissance des souches testes.

3) Adhrence de souches de S. aureus rsistantes aux


fluoroquinolones sur des lamelles explantes des animaux

L'adhrence de la souche pidmique 95067 des lamelles retires de l'espace sous-cutan


du cobaye, recouvertes d'une matrice extracellulaire naturelle, est significativement stimule
aprs croissance en prsence de 1/4 de la CMI de ciprofloxacine (Fig. 32A). De mme, le
double mutant grlA, gyrA EN1252a augmente significativement son adhrence aux lamelles
explantes, aprs croissance en milieu ciprofloxacine, ce qui n'est pas le cas de la souche
parentale sensible ISP794 (Fig. 32B).

Figure 32: Adhrence sur des lamelles explantes de la souche clinique 95067, du mutant
isognique EN1252a et de sa souche parentale ISP794

4) Activation des promoteurs des gnes fnbA et fnbB par des


concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine
Pour mesurer au niveau transcriptionnel l'induction des FnBPs par des concentrations
sous-inhibitrices de ciprofloxacine, nous avons transfr dans le double mutant grlA, gyrA
EN1252a un plasmide contenant la fusion du promoteur du gne fnbA ou fnbB avec le gne
rapporteur luxAB exprimant la lucifrase Comme montr prcdemment 85 le promoteur du
gne fnbA a montr une activit deux trois fois plus faible que le promoteur du gne fnbB.
De plus, le promoteur de fnbA n'a pas montr une activation significative en prsence de
ciprofloxacine et n'a donc pas t tudi en dtail.
En revanche, le promoteur du gne fnbB a montr une activation significative pendant 5
heures d'incubation avec de la CMI de ciprofloxacine chez le double mutant EN1252a,
mais pas chez son parent ISP794 (Fig. 33).

Figure 33: Activation du promoteur fnbB chez le double grlA gyrA mutant ou son parent
sensible, incubes pendant 5 h en prsence ou absence de ciprofloxacine
La cintique d'activation du promoteur fnbB durant les premire 40 minutes suivant
l'addition de fluoroquinolone a aussi t tudie en dtail. Seuls les rsultats 20 min. sont
prsents, les rsultats aprs 40 min. ne montrant pas de changements significatifs.
20 min. aprs l'addition de ciprofloxacine soit (8 g/ml) ou 1/8 (4 g/ml) de sa CMI
pour la souche double mutante EN1252a, le promoteur du gne fnbB est significativement
activ, par rapport au milieu sans antibiotique (Fig. 34A). Par contre, le promoteur du gne
fnbB n'est pas significativement activ chez le parent sensible ISP794 (Fig. 34B).
En pr-traitant les souches fluoroquinolone-rsistantes ou fluoroquinolones-sensibles la
rifampicine (un inhibiteur de la transcription) 5 min. avant l'addition de ciprofloxacine, on
bloque l'effet de cette fluoroquinolone sur le gne rapporteur. Ceci confirme que la
ciprofloxacine agit bien au niveau de la transcription du gne fnbB et que le gne rapporteur
luxAB donne une bonne reprsentation de ce phnomne

Figure 34: Activation du promoteur fnbB chez la souche double mutante ou sensible en
prsence de de la CMI de Cipro.

5) L'agr n'intervient pas dans l'activation du gne fnbB par la


ciprofloxacine
Comme nous l'avons vu au chapitre A-III (point 2), les rgulateurs globaux agr et sar
peuvent modifier l'expression des adhsines, dont les FnBPs. Le rle de l'agr a t tudi
indirectement, en introduisant une mutation knockout de ce rgulateur global dans le double
mutant grlA, gyrA EN1252a. La figure 35A montre que l'adhrence la fibronectine reste
stimule dans le mutant agr de EN1252a. En parallle, la figure 35B montre que l'activation
du promoteur du gne fnbB mesure par le systme rapporteur luxAB est conserve dans le
mutant agr de EN1252a.
Donc, le rgulateur global agr n'exerce aucune influence sur l'activation du promoteur du
gne fnbB ni sur l'augmentation de l'adhrence du double mutant EN1252a incub avec la
ciprofloxacine.

Figure 35: Augmentation de l'adhrence la fibronectine et activation du promoteur


fnbB par de la CMI de Cipro chez le mutant agr de EN1252a.

E) L'Effet de la Ciprofloxacine sur l'Augmentation de


l'Adhrence la Ciprofloxacine Dpend de l'Activit
du Gne recA. (Article N3)
1) Avant-propos

Figure 36 : Mcanismes ventuels expliquant l'augmentation de l'adhrence en prsence


de fluoroquinolones
La figure 36 montre les mcanismes potentiellement impliqus dans l'activation du
promoteur fnbB par les concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine. Ces systmes de
rgulation pourraient tre soit des rgulateurs globaux de S. aureus, en particulier le rgulon
sar non test prcdemment, ou bien des mcanismes de modification du superenroulement
ou de rponses aux stress (protines heat-shock , rponse SOS, etc.) (Fig. 36 et chap A-III,
pts.3-4).
Pour valuer la contribution de ces diffrents systmes de rgulation nous avons construit
des mutants knockout de leur composantes cl.

2) sar n'est pas impliqu dans la stimulation du promoteur fnbB et


dans l'augmentation de l'adhrence en prsence de
ciprofloxacine
L'introduction d'une mutation knockout du rgulateur global sar dans le double mutant
grlA gyrA RA1 a permis d'tudier si son adhrence restait stimulable par la ciprofloxacine. La
figure 37 montre l'adhrence la fibronectine de RA1sar compare son parent RA1 ou au
mutant Ra1agr aprs croissance en prsence ou absence de 1/8 de la CMI de ciprofloxacine (4
g/ml). Il est signaler que la CMI de ciprofloxacine de RA1sar comme d'ailleurs de
RA1agr est identique celle de leur parent RA1.

Figure 37 : Adhrence du double mutant et de ses mutants agr, sar en prsence ou


absence de ciprofloxacine (1/8) de la CMI.
Aprs croissance en absence de ciprofloxacine, on constate que le mutant sar adhre 3 fois
moins la fibronectine que son parent RA1 ou le mutant RA1agr. Ceci confirme une autre
observation rcemment publie, montrant que pendant la phase exponentielle, la production
des FnBPs est active par le locus sar 219.
Aprs croissance en prsence de ciprofloxacine, on remarque que les trois souches testes
atteignent le mme niveau surlev d'adhrence (Fig. 38). Il est donc frappant de constater
que l'adhrence du mutant sar est beaucoup plus fortement stimule (>600 %) par la
croissance en prsence de ciprofloxacine par rapport aux conditions sans antibiotique que les
deux autres souches RA1 et RA1agr dont l'adhrence n'augmente que d'environ 100 %.
La figure 38 montre l'activation du promoteur fnbB dans les souches RA1sar et RA1,
aprs incubation en prsence de ou 1/8 de la CMI de ciprofloxacine. Mme si l'activation
du promoteur fnbB par la ciprofloxacine est conserve dans la souche RA1sar par rapport
son parent RA1, cette activation n'est pas significativement plus leve chez le mutant sar.
En rsum, l'activation par la ciprofloxacine du promoteur fnbB et de l'adhrence de
S. aureus fluoroquinolone-rsistant ne semble pas faire intervenir le locus sar.

Figure 38 : Activation du promoteur fnbB aprs 20 min en absence ou prsence de ou


1/8 de la CMI de ciprofloxacine chez le double mutant et le mutant sar

3) Evidence pour l'implication de recA dans la stimulation du


promoteur fnbB et dans l'augmentation de l'adhrence en
prsence de ciprofloxacine
Une mutation inactivant le locus recA 14 a t introduite dans la souche RA1. Les
transductants recA montrent une hypersensibilit aux rayons UVs (Fig. 40) et une diminution
spectaculaire de leur CMI la ciprofloxacine qui chute de 32 2 g/ml.
L'adhrence de RA1recA aprs croissance en prsence ou absence d' 1/4 de la CMI de
ciprofloxacine est montre sur la figure 39, par comparaison avec celle du parent RA1. On
constate que l'adhrence de RA1recA ne peut plus tre stimule par la croissance en prsence
de ciprofloxacine, au contraire du parent RA1.

Fig. 39 : Adhrence de la souche RA1 et RA1recA en absence ou prsence de de la


CMI de ciprofloxacine.

4) Clonage de recA et complmentation du mutant dfectif


De manire clarifier le rle de recA, nous avons clon ce locus et complment la
souche mutante pour recA. Le clonage de recA a ncessit l'emploi d'une stratgie diffrente
de celle suivie prcdemment par un autre groupe, qui n'est pas parvenu cloner l'intgralit
de ce gne sur un plasmide multi-copies de E. coli 14. La squence obtenue par ce groupe
rsulte du clonage de diffrentes parties du gne recA. Pour cloner l'intgralit du gne recA,
nous avons utilis un plasmide (pCL84) dont le nombre de copies dans E. coli est trs limit
116
. Le gne recA de la souche double mutante a t amplifi et clon dans ce plasmide qui a
ensuite t propag dans E. coli. La squence de recA s'est rvle identique celle publie
prcdemment sauf pour une base qui n'affecte pas la protine (codon 260 : CT). Le plasmide
portant recA a t purifi et utilis pour transformer la souche CYL316 de S. aureus,
restriction dficiente et portant un plasmide helper (pYL112 19). Le plasmide de clonage
(pCL84) n'a pas la possibilit de se diviser dans S. aureus, mais peut s'insrer par homologies
de squences dans un site prcis situ dans le gne lipase l'aide d'une intgrase code sur le
plasmide helper .
La figure 40 dmontre que les souches complmentes par une copie fonctionnelle de
recA+ redeviennent rsistantes aux UVs. De plus, la CMI de ciprofloxacine vis--vis de
RA1recA/recA+attB est restaure 32 g/ml.

Figure 40: Test de survie une exposition croissante de rayons UVs


La figure 41 montre la restauration de l'adhrence stimule par la ciprofloxacine chez
RA1recA/recA+attB de manire quivalente celle du parent original RA1. Pour confirmer la
validit de la technique de complmentation ainsi que le rle de recA+ dans la restauration du
phnotype induit par la ciprofloxacine, nous avons test deux souches additionnelles servant
de contrle : l'une d'entre elles est complmente avec le plasmide sans insert alors que l'autre
est complmente avec le plasmide contenant une copie non fonctionnelle de recA (grce
une insertion de 5 nuclotides dans la rgion 5'-codante de recA, provoquant une modification
du cadre de lecture de recA).
Les deux souches servant de contrle la procdure de complmentation,
RA1recA/pCL84attB et RA1recA/recA(+5)attB restent phnotypiquement identiques au mutant
RA1recA. Elles ont la mme hypersensibilit aux UVs et CMI de ciprofloxacine abaisse 2
g/ml que la souche non complmente RA1recA. Finalement, leur adhrence n'est pas non
plus stimule aprs croissance en prsence de 1/8 de la CMI de ciprofloxacine, comme leur
mutant RA1recA (Fig. 41).

Figure 41 : Comparaison de l'augmentation (%) de l'adhrence de la souche double


mutante, de son mutant recA, et des souches complmentes avec recA sauvage,
recA(+5) et le vecteur de clonage pCL84
Ceci a permis de valider les techniques de clonage et de complmentation du gne recA
dans la souche fluoroquinolone-rsistante RA1.

5) La ciprofloxacine induit une transcription rapide du gne recA et


du gne fnbB dans la souche parentale RA1
Comme le plasmide portant la construction fnbB-luxAB n'a pas pu tre introduit et
maintenu dans la souche RA1recA pour des raisons inconnues, nous avons utilis la RT-PCR
en temps rel (Taqman) pour valuer les niveaux d'ARNm cods aux loci recA, fnbB, ou fnbA
utilis comme contrle. Aprs 20 min. en prsence de ciprofloxacine (1/8 de la CMI), le
niveau ( steady-state ) d'ARNm transcrit par le locus recA augmente de plus de 2 cycles
(Fig. 42).

Figure 42 : Amplification par RT-PCR du messager de recA en prsence ou absence de


ciprofloxacine

Figure 43 : Diffrence de cycles de RT-PCR pour dtecter l'ARNm spcifique entre


l'absence ou la prsence de ciprofloxacine (1/8 de la CMI)

Ceci correspond une augmentation moyenne de 5.5 fois dans la quantit d'ARNm de
recA induite par la ciprofloxacine (Fig. 43). En comparaison, la quantit d'ARNm de fnbB
induite par la ciprofloxacine augmente de 2.7 fois, ce qui n'est pas le cas pour la fnbA dont la
quantit reste inchange (Fig. 43). Finalement, on retrouve la mme quantit d'ARNr 16S
contrle en prsence ou absence de ciprofloxacine (Fig. 43).
Ces donnes montrent que la ciprofloxacine active rapidement la transcription des gnes
recA et fnbB. L'activation de recA semble mener par des chemins mtaboliques encore
indtermins l'activation de fnbB et la surexpression du phnotype d'adhrence (cf.
Discussion).

F) Stimulation par Diffrentes Fluoroquinolones de


l'Activit des gnes fnBs et de l'Adhrence de
S. aureus. (travail en cours)
1) Avant-propos
Les fluoroquinolones de seconde gnration telles que la norfloxacine et la ciprofloxacine
ont t suivies plus rcemment de drivs encore plus actifs contre les bactries gram+. Parmi
ces fluoroquinolones plus rcentes, on trouve la levofloxacine, la sparfloxacine, la
trovafloxacine, et la moxifloxacine. Certains de ces composs (sparfloxacine, trovafloxacine)
ne sont plus utiliss intensivement pour des raisons de toxicit. Bien que les cibles gyrase et
topoisomrase IV aient une affinit variable pour chacune de ces fluoroquinolones rcentes,
elles ont nanmoins des CMI sur S. aureus assez proches les unes des autres. De plus, les
fluoroquinolones rcentes perdent galement une partie plus ou moins substantielle de leur
activit contre des souches rsistantes la ciprofloxacine.
Les buts de cette tude sont de comparer les effets de concentrations sous-inhibitrices de
plusieurs de ces fluoroquinolones rcentes sur i) l'activation du promoteur du gne fnbB dans
le double mutante grlA, gyrA EN1252a ; ii) l'augmentation de l'adhrence la fibronectine.

2) Activation du promoteur fnbB chez EN1252a par des


concentrations sous-inhibitrices de diffrentes
fluoroquinolones
L'activation des promoteurs fnbA et fnbB par les diffrentes fluoroquinolones en
concentrations sous-inhibitrices a t tudie avec le systme rapporteur lucifrase.
Des expriences pilotes ont compar l'activation par chacune des 6 quinolones et la
ciprofloxacine utilise comme contrle sur 2 diffrents temps d'incubation (20 et 40 min.) et

deux fractions (1/4 et 1/8) de leur CMI contre le mutant grlA gyrA EN1252a. La figure 44
montre que les 2 temps d'incubation (20 et 40 min.) ont donn des rsultats quivalents pour
la souche EN1252a expose 1/8 de la CMI de chaque fluoroquinolone. De plus, les rsultats
(non montrs) de la CMI ce sont aussi montrs quivalents ceux produits par 1/8 de la
CMI de chaque fluoroquinolone. Pour voir si les diffrences observes entre fluoroquinolones
(Fig. 44) taient reproductibles et significatives nous avons effectu un groupe de 3
expriences avec une seule concentration sous-inhibitrice de fluoroquinolone et un seul temps
d'incubation. De plus, nous n'avons test que l'activation du promoteur fnbB, puisque le
promoteur fnbA n'tait pas significativement activ par les fluoroquinolones.

Figure 44 : Activation du promoteur fnbB chez EN1252a par des concentrations sousinhibitrices de diffrentes fluoroquinolones
Afin de simplifier l'analyse comparative, nous avons rparti les diffrentes
fluoroquinolones dans deux diffrents groupes qui tous les deux contenaient la ciprofloxacine
comme agent de rfrence. Le premier groupe comprenait la trovafloxacine, la moxifloxacine,
et le Bay3118 alors que le second groupe comprenait la levofloxacine, la sparfloxacine et la
norfloxacine.
La figure 45A compare l'activation du promoteur fnbB par une fluoroquinolone en
dveloppement (Bay3118), la moxifloxacine (MOX), la trovafloxacine (TVX) la
ciprofloxacine (CFX). On se rend compte que par rapport au milieu contrle sans antibiotique
(CTL), 3/4 quinolones (MOX, TVX, CFX) activent significativement le promoteur fnbB. La
figure 45B, qui compare l'activation du promoteur fnbB par 3 autres fluoroquinolones et la
ciprofloxacine montre que la sparfloxacine (SPX) et la norfloxacine (NFX) sont tout aussi
actives que la ciprofloxacine (CFX). En revanche, la levofoxacine (LVX) produit une
activation significativement plus basse du promoteur fnbB.

Figure 45 : Activation du promoteur fnbB aprs 20 min. en prsence de 1/8 de la CMI de


diffrents fluoroquinolones
Pour faciliter la comparaison des rsultats entre les deux groupes, nous avons cherch
normaliser ces rsultats en prenant comme 0% d'activation les rsultats mesurs dans le tube
CTL et le 100% d'activation comme celui produit par la ciprofloxacine. En utilisant cette
chelle, on constate que la plus forte augmentation est due la sparfloxacine (132%), suivie
par la norfloxacine (130%), la trovafloxacine (118%), la moxifloxacine (96%), la
levofloxacine (33%), et le Bay3118 (19%). Toutes ces augmentations sont significatives par
rapport au CTL sauf la levofloxacine et le Bay3118.

3) Stimulation de l'adhrence du mutant EN1252a aprs croissance


en prsence de 5 diffrentes fluoroquinolones
La figure 46 montre que la prsence de 1/8 de la CMI de ciprofloxacine ou de
norfloxacine dans le milieu de croissance augmente significativement l'adhrence du mutant
EN1252a la fibronectine. Par contre, aucune des 3 autres fluoroquinolones (LVX, TVX et
MOX) produit un accroissement significatif de cette adhrence.

Figure 46 : Adhrence du mutant EN1252a aprs croissance en prsence de 1/8 de la


CMI de 5 diffrentes fluoroquinolones (Abrviations : MHB :milieu sans antibiotique ;
CFX :ciprofloxacine ; NFX :norfloxacine ; LVX :levofloxacine ; TVX :trovafloxacine ;
MOX :moxifloxacine)
Ces rsultats nous indiquent que la plupart des fluoroquinolones l'exception de la
levofloxacine et le compos exprimental Bay3118 sont capables d'activer court terme le
promoteur fnbB du double mutant EN1252a. Par contre, lorsque l'incubation avec chaque
fluoroquinolone est prolonge pour une priode de 5 heures, qui est requise pour les tests
d'adhrence, on constate que seules la norfloxacine et la ciprofloxacine sont capables de
stimuler l'adhrence de la souche fluoroquinolone-rsistante de S. aureus.

G) Discussion et conclusion
Les infections nosocomiales dues aux staphylocoques reprsentent un problme
hospitalier important. La prsence de souches multirsistantes au sein des S. aureus colonisant
de nombreux patients est une difficult additionnelle pour le contrle de ces infections. Les
souches MRSA sont non seulement rsistantes la mticilline comme d'autres -lactamines,
mais elles rsistent aussi des catgories trs varies d'antibiotiques y compris les
glycopeptides 90. La rsistance aux fluoroquinolones est apparue peu de temps aprs leur mise

sur le march, surtout chez les souches MRSA. Pour des raisons encore obscures, prs de 90
% des souches MRSA sont aussi rsistantes aux fluoroquinolones.
La dcouverte inattendue que les souches exprimant un haut niveau de rsistance aux
fluoroquinolones taient galement stimules dans leur adhrence la fibronectine aprs
exposition des quantits sous-inhibitrices de ciprofloxacine a constitu le point de dpart de
tous ces travaux. L'analyse de mutants bien caractriss au niveau de leur mutations dans la
Topoisomrase IV et la Gyrase a prouv que seules les souches ayant des mutations
combines dans ces deux loci taient stimules par la ciprofloxacine. Grce une technique
amliore d'extraction de protines bactriennes rduisant l'impact de la protolyse, nous
avons pu montrer par immunodtection et densitomtrie que les bactries augmentaient leur
production de FnBPs aprs exposition la ciprofloxacine. Ceci contredisait les conclusions
d'un grand nombre d'tudes antrieures qui tendaient prouver l'effet bnfique des
concentrations sous-inhibitrices d'antibiotique au niveau thrapeutique. En effet, diverses
observations in vitro nous indique que les fluoroquinolones ainsi que d'autres antibiotiques en
concentrations sous-inhibitrices peuvent altrer la morphologie et l'adhrence bactrienne
des epithelia ou augmenter leur phagocytose 33,62,181,184.
Par contre, une srie d'tudes rcentes semblent contredire le concept que les
concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques diminuent la virulence. Par exemple, la
nafcilline 105 ou d'autres -lactamines 146 augmentent significativement la production d'toxine au niveau transcriptionnel chez S. aureus. D'autres observations rcentes montrent
l'induction de l'opron icaADBC chez S. epidermidis par la tetracycline ou la quinupristindalfopristin 165. Les fluoroquinolones peuvent aussi activer la production de la toxine Shiga 2
de E. coli 0157 224.
Dans ce contexte, notre tude indique un lien possible entre la rsistance antibiotique,
l'exposition certaines fluoroquinolones, et l'augmentation de facteurs de virulence chez
S. aureus. On peut mettre l'hypothse que l'augmentation de l'adhrence de souches
rsistantes de S. aureus stimule par des concentrations sous-inhibitrices de fluoroquinolones
contribue au dveloppement et la slection de souches multirsistantes de MRSA, bien
adaptes l'environnement hospitalier. Des arguments en faveur de cette hypothse sont
fournis dans la seconde tude dans laquelle une forte majorit de souches cliniques, en
particulier MRSA, augmentent leur adhrence la fibronectine aprs croissance en prsence
de de la CMI de ciprofloxacine. Finalement, nous avons galement observ chez les
souches MRSA une tendance augmenter plus fortement leur adhrence en prsence de
ciprofloxacine que chez les MSSA, en particulier pour deux souches pidmiques
multirsistantes provenant de l'Institut Pasteur.
L'effet inducteur de la ciprofloxacine sur l'adhrence de la souche pidmique 95067 et
celle du double mutant EN1252a a t confirm sur des lamelles recouvertes d'une matrice
extracellulaire naturelle, forme pendant leur implantation dans l'espace sous-cutan des
cobayes. Ces lamelles sont non seulement recouvertes de concentrations variables de
fibronectine, mais aussi d'un nombre important d'autres protines insolubles qui pourraient
aussi moduler l'adhrence de S. aureus. Ces circonstances expliquent pourquoi nous
observons une large distribution des valeurs d'adhrence sur ces lamelles retires du cobaye.
Cette variabilit rend difficile la mise en vidence de diffrences significatives entre bactries
incubes en prsence ou en absence de ciprofloxacine. Ceci pourrait expliquer pourquoi
seulement et non 1/8 de la CMI stimule l'adhrence de S. aureus rsistants aux
fluoroquinolones d'une manire significative.

Pour valuer l'impact de la ciprofloxacine sur la transcription des gnes fnb nous avons
utilis un systme rapporteur codant la lucifrase. Ce systme simple a permis de confirmer
que le promoteur de l'adhsine de type A tait moins activ que celui de type B. L'activation
du promoteur fnbB par la ciprofloxacine est observe aprs 20 min. d'incubation et semble
persister pendant plusieurs heures dans les souches fluoroquinolones-rsistantes de S. aureus.
L'effet de la ciprofloxacin sur la transcription du gne fnbB a t vrifi en utilisant comme
inhibiteur de la transcription la rifampine qui a compltement bloqu ce phnomne. Enfin,
nous avons montr que cet effet n'impliquait pas le rgulateur global agr.
Dans l'tape suivante (3me article), nous avons valu la contribution du rgulateur
global sar ainsi que de recA qui est un rgulateur central de la rparation de l'ADN.
L'inactivation du locus sar dans S. aureus fluoroquinolone-rsistant n'a pas eu d'impact
significatif sur l'activation du gne fnbB et l'accroissement de l'adhrence par les
concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine. En revanche, l'inactivation du locus recA a
compltement supprim la rponse de S. aureus fluoroquinolone-rsistant la ciprofloxacine.
Les expriences de complmentation du mutant recA, rendues possible par le clonage d'une
copie entire du gne sauvage recA, ont permis de dmontrer que seule la prsence du gne
recA fonctionnel restaurait la rponse de S. aureus fluoroquinolone-rsistant la
ciprofloxacine. La russite de cette dmarche gntique a t facilite par l'emploi d'un
plasmide prsent en petit nombre de copies dans E. coli et s'intgrant dans le chromosome de
S. aureus. Ce systme a permis d'viter les effets toxiques observs par un autre groupe 14,
tentant de cloner sans succs recA sur un plasmide multicopies de E. coli.
L'augmentation due la ciprofloxacine de l'ARNm du gne recA a t mis en vidence par
une RT-PCR en temps rel. Un autre avantage de cette technique a t de confirmer
l'augmentation, aussi induite par la ciprofloxacine, de l'ARNm transcrit par le gne fnbB.
Au vu de ce que nous savons sur le rle de la protine RecA dans plusieurs mcanismes
essentiels de rparation de l'ADN (recombinaison homologue, rponse SOS), le lien entre la
synthse induite de cette protine et la stimulation du gne fnbB ne sera compris que pas des
tudes trs labores au niveau molculaire. Il faudra en particulier identifier d'autres
composantes des systmes de recombinaison homologue et de rponse SOS. L'lucidation de
l'ensemble du gnome de S. aureus facilitera le travail d'identification de gnes orthologues
ceux dj identifis chez E. coli et/ou B. subtilis. De plus, le criblage des transcriptomes de
S. aureus sur des microarrays, en collaboration avec des groupes experts, permettra
d'identifier plus rapidement les voies mtaboliques actives par la ciprofloxacine ou d'autres
fluoroquinolones.
Un des mcanismes qui retient notre attention est l'activation par RecA de la protolyse de
LexA. En effet, LexA, ou son analogue DinR chez B. subtilis, est dcrit dans E. coli comme
exerant une rgulation ngative sur l'ensemble des gnes du systme SOS. Nous avons
observ dans la rgion promotrice des gnes fnb de S. aureus une partie de la squence
consensus reconnue par LexA dans les gnes classiques du systme SOS chez B. subtilis. La
possibilit que la protine LexA de S. aureus interagisse avec les promoteurs des gnes fnb va
tre teste par des expriences de 'Band-Shift' incubant chacun de ces promoteurs avec la
protine LexA recombinante (dont le gne est actuellement en cours de clonage). Un modle
expliquant l'augmentation de l'adhrence par la ciprofloxacine, via le clivage de LexA est
propos sur la figure 47 en accord avec des donnes publies chez E. coli 95. Ce modle
propose que le clivage de LexA librerait les promoteurs fnb en augmentant leur transcription,
en particulier celle de fnbB. L'exposition de brins libres d'ADN due l'agression des

fluoroquinolones, non dmontre dans notre tude, serait la cause directe de l'augmentation
rapide de la transcription de recA. D'autres tudes sont galement envisages pour examiner
l'activation potentielle au travers de RecA du systme de recombinaison homologue., qui lui
aussi contribue la rparation de l'ADN.

Figure 47 : Modle expliquant l'augmentation de l'adhrence en prsence de


fluoroquinolones
La dcouverte des mcanismes de rponse cellulaire contribuant l'activation du gne
fnbB sera galement essentielle pour comprendre pourquoi seuleument la norfloxacine et la
ciprofloxacine, mais pas d'autres fluoroquinolones (sparfloxacine, trovafloxacine,
moxifloxacine), peuvent augmenter l'adhrence la fibronectine.
Finalement, la proprit qu'ont certaines souches cliniques multirsistantes de S. aureus
d'augmenter leur adhrence la fibronectine en prsence de ciprofloxacine sera aussi value
sur des collections de souches mieux documentes. En particulier, nous chercherons tablir
si une prexposition aux fluoroquinolones favoris la slection de certains clones de MRSA
particulirement bien adapts l'environnement hospitalier grce des proprits de
colonisation renforce. Ceci sera valu en collaboration avec des groupes experts en
pidmiologie (Prof. Pittet, Genve) ou ayant collect un grand nombre de souches de
S. aureus au niveau europen (Prof. Schmitz, Allemagne), dont certaines ont montr un
caractre pidmique trs marqu.
Les rsultats de ce travail mettent en lumire par une approche originale le problme
rcurrent d'une surconsommation d'antibiotiques dans la mdecine d'ajourd'hui. Les
techniques d'analyses que nous avons proposes devraient faciliter l'identification des
antibiotiques risquant de favoriser l'mergence de souches plus rsistantes et plus virulentes.
Elles devraient aussi contribuer une prise de conscience sur un emploi raisonnable et bien
cibl des antibiotiques en gnral, et des fluoroquinolones en particulier 122.

[Prcdent] [Suivant]

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Annexe 1
Increased Expression of Fibronectin-Binding Proteins by Fluoroquinolone-Resistant
Staphylococcus aureus Exposed to Subinhibitory Levels of Ciprofloxacin.
[vide]
[Prcdent]