Universidade Estadual de Campinas

Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA)

TA514-Bioquimica de Alimentos

Aula Prtica 7- Estudo da Termoestabilidade de uma Enzima

Grupo 04:
Gabriele Aparecida Peron Broglio 148564
Karoline Urbano

146789

Professor Responsavl :
Hlia Harumi Sato

:
Campinas, 13 de maio, de 2015

1-INTRODUO
As enzimas em geral so mais estavis em temperatura baixa e apresentam
diferente susceptibilidade ao calor.
Na indstria de alimentos o tratamento trmico utilizado para destruio de
micro organismos e para a inativao de enzimas deteriorativas. Em geral o
aumento da temperatura causa na atividade enzimtica dois efeitos opostos :
aumentando a temperatura o efeito predominante ser o aumento da
velocidade da reao e a partir de certo ponto , ocorre uma diminuio na
velocidade de reao devido desnaturao enzimtica onde as enzimas
perdem sua estrutura nativa, o que leva perda de funo. A temperatura ou
faixa de temperatura onde a atividade enzimtica mxima chamada de
temperatura tima e a faixa onde a enzima retm sua capacidade cataltica
denominada temperatura de estabilidade .
O conceito de termoestabilidade est ligado ao poder que a enzima tem de
manter pelo menos 90% de sua atividade por 30 minutos. Quando uma enzima
submetida a uma determinada temperatura por um tempo prolongado,
mesmo esta sendo a sua temperatura tima, a enzima tende a perder atividade
por desnaturao trmica da estrutura protica, podendo provocar a formao
de floculos e sua precipitao. A termoestabilidade um critrio que as
indstrias usam para caracterizar as enzimas como de aplicao em seus
processos.
As enzimas termoestveis, de maneira geral, apresentam vantagens para a
aplicao na indstria, visto que processos biotecnolgicos conduzidos em
elevadas temperaturas tm o risco de contaminao por microrganismos
mesfilos, que so a maioria em um ambiente industrial, significativamente
reduzido. Por outro lado, as temperaturas mais elevadas favorecem a

solubilidade de substratos e produtos, e aumentam as taxas de reao por

reduo da viscosidade e por aumento do coeficiente de difuso dos
substratos.

2-OBJETIVO
Determinar a termoestabilidade da -amilase fngica (Aspergillus oryzae) e amilase bacteriana (Bacillus licheniformis).
3-MATERIAIS E MTODOS
3.1-Materiais:
-Grupos 1 a 5 : Amostra A (10 L -amilase fngica comercial em 200 mL de
gua destilada)
-Grupos 6 a 10: Amostra B (1 mL -amilase bacteriana comercial em 2100 mL
de gua destilada )
-Grupos 11 a 15: Amostra C (1 mL -amilase bacteriana comercial em 2100 mL
de gua destilada contendo 60 ppM de CaCl 2
-Soluo de Amido pH 6,0 .O substrato foi preparado previamente pela mistura
de soluo de amido 1% em gua destilada (aquecida durante 5 minutos em
ebulio e resfriada a temperatura ambiente): tampo fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0 :
gua destilada na proporo 5:1:2 (v:v).
-Soluo de Iodo KI (0,3% I2 + 3% KI em gua destilada)
-Soluo HCl 0,1 Mol/L
-gua destilada
-tubos de ensaio
-Pipetas graduadas
-pera
-espectrofotmetro
3.2-Mtodos:
3.2.1-Tratamento trmico da enzima:

Primeiramente foi pipetado 0,2 mL da soluo de -amilase nos tubos de

ensaio identificados com a temperatura de tratamento trmico (sem tratamento,

30C ,50C ,60C ,70C ,80C ,temperatura de ebulio) , os tubos foram

tampados com filme plstico e levados para incubao , cada em sua
respectivas temperaturas , durante 15 minutos. (o tubo sem tratamento no foi
incubado).
Aps a incubao, os tubos foram retirados dos banhos termostatizados e
foram resfriados em um bquer com gua destilada .
3.2.2-Determinao da atividade de -amilase residual:
Foram adicionados 0,8 mL de substrato de amido ( previamente incubado a
50C para a amostra de -amilase fngica e a 70C para a amostra de amilase bacteriana) nos 7 tubos de ensaio contendo a enzima tratada a
diferentes temperaturas. Os tubos foram agitados e incubados durante 5
minutos a 50C ou a 70C.
Aps a incubao , foram adicionados 0,5 mL de HCl 0,1 Mol/L em cada tubo
de ensaio para paralisar a reao .
Foram adicionados 0,1 mL de soluo de iodo KI nos tubos de ensaio e
completados com gua destilada para obter 15 mL de soluo. Foram
tampados e misturados por inverso.
Na preparao do tubo branco foram pipetados 0,1 mL de soluo de Iodo KI
+ 14,9 Ml de gua destilada em tubo de ensaio , e realizado o mesmo
procedimento de tampar e misturar por inverso.
Na preparao do tubo controle foram pipetados 0,8 mL de substrato + 0,5
mL de HCl 0,1 Mol/L + 0,1 mL de soluo de iodo KI em tubo de ensaio e
agitado para homogeneizar. Em seguida , foram adicionado 13,6 mL de gua
destilada no tubo controle para completar o volume para 15 mL , e novamente
foi tampado e misturado por inverso.
O espectrofotmetro foi calibrado com a soluo do tubo branco e foi medida
a absorbncia das amostras dos tubos teste e da soluo do tubo controle a
620 nm.
4-RESULTADOS E DISCUSSO
Tabela 1: Termoestabilidade da -amilase fngica
Temperatura
Sem
Tratamento
30C
50C
60C

Abs
nm
0,071
0,005
0,127
0,026

620 Unidades
de
atividade (U/mL)
43.000.000
44.320.000
41.880.000
43.900.000

%
Atividade
Residual
97,02
100
94,49
99,05

70C
80C
Temp.
Ebulio
Tubo Controle

0,9
1,483
1,208
2,221

26.420.000
14.760.000

59,61
33,30

20.260.000
0

45,71
0

Tabela 2: Termoestabilidade da -amilase bacteriana de gua destilada

Temperatura
Sem
Tratamento
30C
50C
60C
70C
80C
Temp.
Ebulio
Tubo Controle

Abs
nm
0,04
0,053
0,078
0,125
0,173
0,103
0,88
2,398

620 Unidades
de
atividade (U/mL)

%
Atividade
Residual

4.964.211
4.936.842
4.884.211
4.785.263
4.684.211
4.831.579

100
99,45
98,39
96,40
94,36
97,33

3.195.789
0

64,37659
0

Tabela 3: Termoestabilidade da -amilase bacteriana com 660ppm de CaCl 2

Temperatura
Sem
Tratamento
30C
50C
60C
70C
80C
Temp.
Ebulio
Tubo Controle

Abs
nm
0,055
0,054
0,025
0,013
0,037
0,036
1,698
1,863

620 Unidades
de
atividade (U/mL)

%
Atividade
Residual

3.806.316
3.808.421
3.869.474
3.894.737
3.844.211
3.846.316

97,73
97,78
99,35
100
98,70
98,76

347.368,4
0

8,92
0

Figura 1. % Atividade Relativa X Temperatura

120
100
80

% Atividade Relativa

60

Fngica
Bacteriana agua

40

Bacteriana CaCl2

20
0
20

40

60

80

100

120

Temperatura C

A partir da observao da Figura 1, pode-se determinar a faixa de

temperatura da termoestabilidade da -amilase fngica, entre 20C e 60C, da
-amilase bacteriana em gua destilada, entre 20C e 80C, e da -amilase
bacteriana com 60ppm CaCl2, entre 20C e 80C, indicando que a -amilase
bacteriana apresenta maior termoestabilidade que a -amilase fngica.
A enzima -amilase pode ser de origem cereal, bacteriana ou fngica,
apresentando algumas caractersticas em comum, como relativa estabilidade
trmica (70C 15 minutos), labilidade cida (todas so inativadas a pH 3,6 por
curto tempo), e aumento da estabilidade na presena de ons de clcio.
Podemos observar ento que os resultados obtidos esto prximos dos
estabelecidos na literatura.
Segundo Fogarty (1990), as -amilases de origem fngica so mais
termosensveis que as de origem bacteriana. Isto pde ser observado na figura
1, em que nas temperaturas acima de 60C a enzima fngica tem uma queda
em sua atividade relativa.
A enzima -amilase uma metaloprotena que contm pelo menos um
on Ca2+ (VALLEE et al., 1959). A afinidade da -amilase por Ca2+ mais forte
do que por qualquer outro on. As amilases de diferentes origens se
diferenciam pela fora de ligao com o clcio.

A remoo do clcio pode levar queda da atividade enzimtica e

aumentar a susceptibilidade da enzima degradao proteoltica (SABOURY e
KARBASSI, 2000).
O clcio no influi somente na atividade da enzima como tambm
aumenta sua estabilidade frente a trocas de temperatura e de pH. Portanto, o
clcio no participa diretamente na formao do complexo enzima-substrato,
mas mantm a molcula da enzima na conformao tima para a mxima
atividade e estabilidade (LVQUE et al., 2001).
Na prtica, importante a presena de clcio para garantir que a enzima
permanea completamente ativa. Na verdade, traos de clcio presentes no
amido so geralmente suficientes para compensar as enzimas, sem a
necessidade de adicion-lo. Entretanto, a adio de sais de clcio
recomendada

para

alcanar

mxima

proteo

das

enzimas

contra

desnaturao pelo calor (LVQUE et al., 2001).

Analisando os resultados obtidos podemos observar que no houve
diferena significativa na porcentagem de atividade relativa entre as amostras
de -amilase bacterianas, mas que a amostra com clcio apresenta menor
atividade relativa em temperaturas superiores a 80C do que a amostra com
gua. Tal fato pode estar associado a erros na execuo da anlise, dado que
o tempo de incubao necessitava de certa exatido, alm da falta de
experincia dos analisadores.
Alm disso, h estudos em que diversos pesquisadores verificaram que
o Ca2+ no tem nenhum efeito sobre a atividade da -amilase, ou ainda pode
ter um efeito inibitrio quando utilizado em altas concentraes. Alguns estudos
mostram tambm que a estabilidade da -amilase comprometida na
presena de pequenas quantidades deste on (YANG e LIU, 2004;
BERNHARDSDOTTER et al., 2005; HASHIM et al., 2005).

Principais aplicaes:

Produo de xaropes de amido e acares.

Panificao: complementao da farinha; -amilase fngica quando
combinada com amiloglucosidase assegura a quantidade suficiente de
acares fermentveis para o levedo, auxiliando dessa maneira na

produo de massas refrigeradas e congeladas; alfa-amilase bacteriana

ou, ainda, uma -amilase com estabilidade trmica intermediria
promove retardamento do processo de envelhecimento dos pes e

produtos similares.
Cervejaria: substituio e/ou complementao das enzimas do malte,

auxilia na liquefao dos agregados.

Produo de sucos de frutas com alto teor de amido: por exemplo,
ma, maracuj.

5- CLCULOS
5.1- Termoestabilidade da -amilase fngica
Clculo da Unidade de Atividade:
Abs(controle) Abs(amostras) = 2,221 0,071 = 2,150
1 U ______ 0,001
X U ______ 2,15

X = 2150 U

Considerando as diluies da -amilase:

10 L ______ 200 mL
Y L _______ 0,2 mL

Y = 0,01 L

1000 L _______ 1 mL
0,01 L ________ Y mL

Y = 0,00001 mL

Unidade de Atividade =

2150 U
5 min 0,00001mL = 43.000.000 U/min.mL

Clculo da Porcentagem de Atividade Relativa:

Tomando o maior valor calculado de unidade de atividade (U/mim.mL)
como 100%, obtm-se:
44.320.000 U/ml _______ 100%
43.000.000 U/mL ______ P

P = 97,02 %

Aplicando este mesmo procedimento para os demais valores de

absorbncia lidos, obtm-se os valores apresentados na Tabela 1.

5.2- Termoestabilidade da -amilase bacteriana de gua destilada

Clculo da Unidade de Atividade:
Abs(controle) Abs(amostras) = 2,398 0,04 = 2,358
1 U ______ 0,001
X U ______ 3,358

X = 2358 U

Considerando as diluies da -amilase:

1 mL _______ 2100 mL
Y mL _______ 0,2 mL

Unidade de Atividade =

2358 U
5 min 0,000095 mL

Y = 0,000095 mL

= 4.964.211 U/min.mL

Clculo da Porcentagem de Atividade Relativa:

Tomando o maior valor calculado de unidade de atividade (3.381.053

U/mim.mL) como 100%, obtm-se:
4.964.211 U/ml _______ 100%
4.936.842 U/mL ______ P

P = 99,45 %

Aplicando este mesmo procedimento para os demais valores de

absorbncia lidos, obtm-se os valores apresentados na Tabela 2.

5.3- Termoestabilidade da -amilase bacteriana com 660ppm de CaCl2

Abs(controle) Abs(amostras) = 1,863 0,055 = 1,808
1 U ______ 0,001
X U ______ 1,808

X = 1808 U

Considerando as diluies da -amilase:

1 mL _______ 2100 mL
Y mL _______ 0,2 mL

Unidade de Atividade =

1808 U
5 min 0,000095 mL

Y = 0,000095 mL

= 3.806.316 U/min.mL

Clculo da Porcentagem de Atividade Relativa:

Tomando o maior valor calculado de unidade de atividade como 100%,
obtm-se:
3.894.737 U/ml _______ 100%
3.806.316 U/mL ______ P

P = 97,73 %

Aplicando este mesmo procedimento para os demais valores de

absorbncia lidos, obtm-se os valores apresentados na Tabela 3.

6- CONCLUSO
Atravs da curva de atividade relativa X temperatura construda foi
possvel observar a faixa de temperatura de termoestabilidade da enzima, a
qual foi comparada com a literatura.
A faixa de temperatura de termoestabilidade da -amilase fngica ficou
entre 20C e 60C e a de ambas as -amilases bacterianas ficou entre 20C e
80C. Estes resultados possibilitam afirmar que a -amilase bacteriana
apresenta maior termoestabilidade que a -amilase fngica.
Da literatura, tem-se: temperatura tima de atividade -amilase
Aspergillus oryzae de 50 a 60C; temperatura tima de atividade -amilase
Bacillus licheniformis de 90C.
Atravs desse experimento podemos notar que a determinao da
termoestabilidade de enzimas de suma importncia, pois a partir disto
possvel aperfeioar os processos industriais.

7-BIBLIOGRAFIA
BERNHADSDOTTER, E.C.M.J., NG, J.D., GARRIOT, O.K., PUSEY, M.L.
(2005) Enzymic properties of an alkaline chelator-resistant a-amylase from an
alkaliphilic Bacillus sp. isolate L1711. Process Biochemistry, 40:24012408.
FOGARTY, W.M. & KELLY, C.T. Microbial enzymes and biotechnology. 2nd
Ed., New York, Applied Science Publishers, 1990.

GOMES, E., GUEZ, M. A. U., MARTIN, N., SILVA, R., Enzimas termoestveis:
fontes,

produo

aplicao

industrial;

2007.

Disponvel

em

<http://www.scielo.br/pdf/qn/v30n1/24.pdf>. Acesso em 012 de maio de 2015

HASHIM, S.O., DELGADO, O.D., MARTNEZ, M.A., KAUL, R.H., FRANCIS
J.M., MATTIASON, B. (2005) Alkaline active maltohexaose-forming -amylase
from Bacillus halodurans LBK 34. Enzyme and Microbial Technology, 36:139
146.
LVQUE, E., JANECEK, S., HAYE, B., BELABRBI, A. (2000) Thermophilic
archaeal amylolytic enzymes. Enzyme Microb. Technol. 26:3-14.
SABOURY, A.A., KARBASSI, F. (2000) Thermodynamic studies on the
interaction of calcium with alpha-amylase. Thermochimica acta, 362:121-129.
VALLEE, B.L., STEIN, E.A., SUMMERWELL, W.M., FISCHER, E.M. (1959)
Metal content of -amylases of various origins. J. Biol. Chem. 231:2901-2905.
YANG, C.H., LIU, W.H. (2004) Purification and properties of a maltotrioseproducing -amylase from Thermobifida fusca. Enzyme and Microbial
Technology, 35:254-260.