Pre$lecture)slides:))Unit)4,)Part)1:))The)Cytoskeleton)

The)cytoskeleton:))an)overview:)

Physical)proper=es)of)cytoplasm:)
$$viscoelas=c)
$$thixotropic)
$$)crowded)

These)features)of)
cytoplasm)are)largely)
due)to)components)of)
the)cytoskeleton.)

How)would)you)measure)these)
proper=es?)

Elastic: Spring-like

Elastic: Spring-like

Deforming force

Elastic: Spring-like

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Deforming force

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Demonstra=on)that)cytoplasm)is)thixotropic:))
1.))Feed)macrophage)
iron)par=cle)

2.))Use)magne=c)eld)to)
move)phagocytosed)
par=cle)back)and)forth)at)
varied)speeds.)

Result:)At)low)shear)stress,)cytoplasm)is)quite)s=;))at)high)
shear)stress,)viscosity)of)cytoplasm)is)low)and)exhibits)liPle)
resistance)to)bead)movement.)I.e.,)cytoplasm)is)thixotropic.)
What)might)explain)this)property)at)the)molecular)level)re.)
cytoskeletal)interac=ons?)

Experimental,analysis,of,,diusion,barriers/crowdedness,of,
cytoplasm:,
1. Prepare)uniform$sized)prepara=ons)
of)uorescent)dextran)par=cles)of)
dierent)sizes)from)5$100)nm)in)
diameter.)
2. Micro$inject)into)cultured)cell.)
3. Measure)diusion)coecient.)
Result:))dextran)par=cles)with)diameter)
<)50)nm)exhibited)free)diusion.)>50)
nm)exhibited)signicantly)slower)
diusion)rates)than)in)free)solu=on.)
In)cytoskeleton$rich)regions,)size)
limit)was)even)smaller)(~20)nm).)

What)may)be)some)
consequences)of)
crowdedness)re.)
cytoskeletal)func=ons?)
What)is)the)signicance)of))
the)>50)nm)barrier?)

K.)Porters)microtrabecular)lacce)model)of)cytoplasm:)Based)on)high)
voltage)TEM)of)whole)mount)views)of)cells)grown)on)EM)grids.)

The)Major)brous)polymers)of)the)cytoskeleton:)

Fibrous,Elements,of,Cytoplasm:,
Microtubules)(24nm)diam.):))Composed)of)polymerized)alpha$beta)
tubulin)dimers)and)associated)binding)proteins.)
Intermediate)laments)(10)nm)diam):)Polymerized)IF)subunits)
(many)dierent)types))and)associated)binding)proteins.)
Ac=n/microlaments)(7)nm)diam):)Polymerized)globular)(G)$ac=n)
and)associated)binding)proteins.))
Ac=n)laments)and)MTs)are)polarized)polymers;)IFs)are)apolar.)
))))))))))))))))))plus))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))minus)

Ac=n/MT)polarity)is)a)cri=cal)property)with)respect)to)func=ons)for)
these)polymers)both)with)respect)to)assembly/disassembly)driven)
processes)and)molecular)motor)dependent)processes.)))

Side)view)of)a)crawling)broblast)

Lamellipodium/leading)
edge)

There)are)several)dis=nct)types)of)ac=n)lament)arrays:)
a))uniformly)polarized)bundles)within)microvilli)b))mixed)
polarity)ac=n)bundles)termed)stress)bers.)c))loosely)
ordered)cor=cal)ac=n)and)d))sheet$like)branched)arrays)of)
rapidly)turning)over)laments)that)extend)the)
lamellipodium)of)a)crawling)cell.)
Lamellipodium/leading)
edge)

Intermediate)laments)course)out)from)surface)
of)nucleus))to)the)plasma)membrane.)

Microtubules)extend)out)from)a)perinuclear)MT)
organizing)center:)the)centrosome.))

Epithelial)Cell))

Ac=n)laments)

Mixed)
polarity)
contrac=le)
ring)of)
laments)

Unipolar)ac=n)
bundles)

Intermediate)laments,)desmosomes)and)
hemidesmosomes)

MTs)break)away)from)centrosome)and)are)oriented)along)long)
axis)of)cell)with)minus)ends)pointed)apically)

What)are)some)of)the)func=ons)of)the)
cytoskeleton?)))
Cellular stuctures
Intercellular Connectivity
Organelle movement
Cell Motility
Signal Transduction
Cell Division
Storage/organization of cellular activities
Membrane dynamics (e.g. lipid anchoring)
mRNA localization/transport; regulation of translation
host cell-microbial pathogen interactions
Exocytic and Endocytic membrane traffic
Tension generation, transmission and sensing, both intra and intercellularly

Modes,of,regula=ng,cytoskeletal,func=ons,
)changes)in)cytosolic)[Ca2+]))

)changes)in)cytosolic)[H)+])
)phosphoryla=on/dephosphoryla=on)
)proteolysis)
)lipid)binding)(e.g.)PI)lipids))
)Tension)
)All)of)the)above)can)lead)to)long)term)changes)in)
gene)expression.))

Plasma)membrane)and)ER)Calcium))
pumps)eject)Ca)ions)from)cytosol.)
Regulated)Ca$channels)allow)transient)
increases)in)cytosolic)[Ca2+])

Free)and)total
[Ca2+]=))10$3)M)
Ca2+)

Mitochondria)
provide)high)
capacity,)low)
anity)store)for)
Ca2+)(driven)by)
H+)gradient))
high)anity)Ca$binding)
proteins)buer)cytosolic)
Ca)2+);)e.g.)calmodulin))

[Ca2+])total=)10$4M)
[Ca2+]free=))10$7)10$5)M)
Ca2+)

Ca2+)
SER)
+Ca2+)

Ca2+$calmodulin)clamped)around)the)
alpha)helical)calmodulin)binding)domain)
of)a)kinase)ac=vated)by)calmodulin.)

Calcium,and,regula=on,of,,the,cytoskeleton,,
@@Conforma=onal)changes)of)cytoskeletal)proteins)induced)by)Ca2+)
binding/dissocia=on.)
$$Conforma=onal/ac=vity)changes)induced)by)binding/release)of))
apo$calmodulin)or))Ca2+)$calmodulin.))
$$Ca2+)ac=va=on/inac=va=on)of)modifying)enzymes)(e.g.)kinases;)
lipases;)proteases)
$$Ca2+)$calmodulin)ac=va=on/inac=va=on)of)modifying)enzymes.)

Ac=n$based)cytoskeleton:))
Overview)of)func=ons)
Ac=n)lament)structure;)Ac=n)assembly)kine=cs)
Classes)of)Ac=n)binding)proteins)
Myosin)II)and)contrac=on)of)skeletal)muscle,)purse)
string)contrac=on)of)cytokine=c)contrac=le)ring/
cleavage)furrow)
Overview)of)myosin)superfamily)

A))visual)tour)of)the)ac=n)cytoskeleton)

A)nega=vely)stained)TEM)image)of)ac=n)
laments)

Nega=ve)stain)TEM)
1. Apply)sample)to)coated)EM)grid.)
2. Wick)dry)
3. Add)a)drop)of)heavy)metal)
solu=on)(e.g.)1%)uranyl)acetate))
4. Incubate)with)stain)for)short)
=me)
5. Wick)dry)
6. View)in)TEM)
Macromolecule)excludes)stain
hence)the)nega=ve)contrast)
Good)for)viewing)
macromolecule)complexes;)not)
useful)for)larger)structures)(e.g.)
whole)cells,)nuclei,)))

Examples,will,highlight,func=ons,for,ac=n,
laments,
$in)genera=on)of)cellular)structures)
$$in)serving)as)tracks)for)movement)of)organelles)
$$media=ng)cellular)contrac=lity))
$$forma=on)of)cellular)protrusions)through)
dynamic)ac=n)assembly)
$facilita=on)of)bacterial)or)virus)infec=on)of)host)
cells)

The)brush)border)surface)of)an)intes=nal)epithelial)cell.)Microvilli)
are)supported)by)a)bundle)of)ac=n)laments)

TEM)of)the)
brush)border;)
note)the)bundle)
of)ac=n)
laments)in)each)
microvillus.))Plus)
ends)of)
laments)are)at)
the)=p)of)the)
microvillus.)

Vesicle)
transport)
along)ac=n)
bundles)in)
an)
intes=nal)
epithelial)
cell.)

There)are)at)
least)12)
dierent)
members)of)
the)myosin)
family)of))
ac=n)based)
motors)
associated)
with)this)
ac=n)
cytoskeleton.)

Contracted)
skeletal)
muscle.)
Sarcomeres)
of)two)
adjacent)
myobrils)
are)shown.)

SEM)of)cleavage)furrow)of)a)dividing)frog)egg.)This)is)mediated)by)a)
contrac=le)ring)of)ac=n$myosin$II)

Lamellar,)ac=n)lled)extensions)at)leading)edge)of)crawling)cell.)
Extension)is)driven)by)ac=n)lament)polymeriza=on.)

Nega=ve)stain)of)ac=n)lament)arrays)of)lamellar)extension)
(membrane)removed)with)detergent).))from)V.)Small.)

A model for lamellar extension through actin filament assembly at

the leading edge and disassembly at the rear. (T Pollard and
others)

EM
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Fig. 38-8

Echinoderm)sperm)have)to)get)their)plasma)membrane)
through)a)very)thick)(up)to)100)um))extracellular)matrix)
to)eect)fer=liza=on)

Acrosomal)reac=on)and)fer=liza=on)of)egg)by)a)sea)cucumber)sperm.)

movie)frames)depic=ng)acrosomal)process)forma=on.)=me)elapsed~)5)
sec.!!)(this)process)is)nearly)100)um)long))and)is)powered)by)the)
explosive)polyermiza=on)of)an)ac=n)lament)bundle)

Prolac=n)cup)consists)
in)part)of)G)ac=n)
complexed)with)prolin.)
Contact)with)oocyte)
s=mulates)exocytosis)of)
acrosomal)vesicle)(A))
and)assembly)of)ac=n)
bundle.))Acrosome)is)
just)a)secretory)granule)
lled)with)enzymes)to)
digest)a)hole)in)the)jelly)
layer)surrounding)the)
oocyte.))

Long.)and)cross)sec=on)of)acrosomal)process)

Intracellular)movement)and)cell$cell)infec=on)by)Listeria)is)driven)by)a)
comet)tail)of)ac=n)

What)is)an)
advantage)of)
this)type)of)
cell$cell)
transmission/
infec=on?)

Directed)assembly)of)ac=n)pushes)these)viruses)out)of)the)cell.)

Globular)(G)$ac=n)Mr:)42kDa)
ac=n)monomer)binds)1)molecule)
of)ATP)or)ADP)(hydrolysis)occurs)
axer)addi=on)to)polymer))
The)subunit)is)oriented)with)
plus/barbed)end)surface)at)the)
boPom.))
(note,)in)mammals)there)are)
mul=ple)ac=n)genes)but)we)will)
consider)them)as)essen=ally)
iden=cal)in)structure)and)
assembly)proper=es))

A)nega=vely)stained)TEM)image)of)ac=n)laments)

Ac=n)
lament)
structure.)

Experimental)determina=on)of)ac=n)lament)polarity:)myosin)
head/)motor)domain)decora=on)of)the)ac=n)lament)

Proteoly=c)fragments)of)
muscle)myosin$II:)The)
motor)(S1))domain)can)
be)used)to)determine)
ac=n)lament)polarity)
by)adding)to)the)
lament)in)the)absence)
of)ATP)to)form)
arrowhead)decorated)
laments.)

nega=vely)stained)lament)with)arrowhead)decora=on)resul=ng)from)
binding)of)myosin)head)domain)to)each)subunit)in)the)lament.)

Oppositely)oriented)myosin)head)decorated)laments)

+/)barbed)

$/pointed)

The)arrowheads)are)a)two)dimensional)projec=on)of)the)helical)
array)of)myosin)heads)bound)to)the)helically)ordered)ac=n)
subunits:)each)arrowhead)consists)of)13$14)myosin)heads.)
Myosin)head)bound)to)
each)ac=n)monomer)

barbed/+)end)
from)R.)Milligan)

pointed/$)end)

Func=onal)signicance)of)ac=n)lament)polarity)
$$Plus)end)grows)faster)and)at)a)5$10)fold)lower))
cri=cal)concentra=on)than)the)minus/pointed)end.)
$$Polarity)dictates)direc=on)a)myosin)can)pull)on)
or)walk)along)an)ac=n)lament.))Most)known)
myosins)are)plus$end)directed)motors.))The)one))
excep=on:))myosin)VI.))

A.,Key,features,of,,ac=n,lament,and,microtubule,(MT),assembly:)
Cri=cal)Concentra=on:))Subunit)concentra=on)above)which)
polymeriza=on)will)occur.)The)concentra=on)of)subunit)(ac=n)
monomer;)tubulin)dimer))that)is)in)equilibrium)with)polymer))once)
polymeriza=on)has)reached)steady)state)equilibrium.)
)How,do,you,measure,polymer,concentra=on?,

Co)for)pure)tubulin:)~)10)uM;)ac=n:)0.2)uM)

[polymer])

Cri=cal)Concentra=on,)Co)
0)))))))))))
Total)subunit)concentra=on)(tubulin)dimer/)ac=n)monomer))

B.,,Key,features,of,MT/ac=n,assembly,
Kine=cs)of)MT/ac=n)assembly)
,,Subunit)concentra=on)must)be)>)Co)
))Assembly)occurs)in)three)dis=nct)kine=c)stages:)
)Nuclea=on:))rate)limi=ng)step;)extremely)slow)for)pure))
tubulin)assembly;)very)slow)for)ac=n)assembly)
)Elonga=on;)rapid)linear)forma=on)of)polymer)mediated)by)
end$on)addi=on)of)subunits)to)both)end)of)growing)polymer.)
)Steady)state)equilibrium:))Although)there)is)no)net)change)
in)polymer)concentra=on;)polymer)is)in)constant)exchange)
with)the)Co)pool)of)subunits)at)both)ends)of)the)polymer.)
[Polymer])))))))))[s.u.]Co,

Kine=cs)of)MT/ac=n)assembly:))Assume)this)curve)is)for)
assembly)of)2)uM)ac=n)and)that)[Co])is)0.2)uM;)what)is)
the)[polymer])at)steady)state?)))

Steady)state)equilibrium)
elonga=on)
[polymer])
Nuclea=on)

=me)

Kine=cs)of)MT/ac=n)assembly:))Assume)this)curve)is)for)
assembly)of)2)uM)ac=n)and)that)[Co])is)0.2)uM;)what)is)
the)[polymer])at)steady)state?)))

Steady)state)equilibrium)
1.8)
uM)

elonga=on)
[polymer])
Nuclea=on)

=me)

Ac=n)lament)nuclea=on)is)rate)limi=ng)and)occurs)through)
forma=on)rst)of)a)highly)unstable)dimer,)and)then)a)trimer)
which)can)then)elongate)by)subunit)addi=on)onto)both)
ends.)

From)Pollard)and)Earnshaw)text)

C.,,Key,Features,of,ac=n/MT,Assembly:))
During)elonga=on)phase)rate)of)polymer)elonga=on)is)
linear)and)is)linearly)dependent)on)the)total)subunit)
concentra=on.)
Rate)of)polymer)elonga=on)is)faster)at)the)plus)end)(also)
called)barbed)end)for)ac=n)lament))than)at)the)minus)
(pointed))end)of)the)polymer.)
The)Co)for)subunit)addi=on)is)also)lower)at)the)plus)end)
than)at)the)minus)end,)although)this)dierence)is)much)
greater)and)func=onally)more)important)for)ac=n.)
)The)plus)end)is)also)the)fast)disassembly)end)for)both)MTs)
and)ac=n)laments.)

The)plus/
barbed)end)
grows)faster)
and)at)a)lower)
cri=cal)
concentra=on)
than)the)minus/
pointed)end.))

minus)

plus)

,D.,,Key,Features,of,MT/ac=n,Assembly:,Lag,in,hydrolysis,of,
bound,nucleo=de,aMer,s;ubunit,addiiton,to,polymer)
)For)both)G$ac=n)and)tubulin)dimer,)nucleo=de)(NTP))
hydrolysis)occurs)upon)incorpora=on)into)polymer.)
)However,)this)hydrolysis)occurs)at)a)rate)slower)than)
subunit)addi=on)under)condi=ons)of)high)free)subunits)
available)for)addi=on,)at)least)at)the)growing)plus)end.)
))Thus,)at)the)plus)end,)there)is)an)NTP)cap)of)NTP)
containing)subunits)under)condi=ons)of)rapid)assembly)
)However,)if)the)available)pool)of)subunits)is)at)or)below)
the)Co,)then)the)plus)end)will)contain)subunits)with)NDP)
rather)than)NTP;)(key)for)MT)assembly)dynamics);)for)ac=n)
laments,)regions)of)the)lament)containing)ADP)bound)
subunits)are)structurally)dierent)from)subunits)with)bound)
ATP)or)ADP.Pi.)

Ac=n)laments)age)from)+$>$)end)axer)subunit)addi=on)at)the)+)
end)because)ATP)hydrolysis)and)then)release)of)Pi)are)slow)processes)

As)a)growing)lament)ages,)subunits)in)the)oldest)part)of)the)
lament)will)contain)the)most)ADP)subunits)

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Actin drugs: inhibitors and filament stabilizers

Cytochalasins:

Bind barbed/plus ends, inhibits

polymerization

Latrunculin:

Binds monomers and inhibits

polymerization, will induce
depolymerization

Phalloidin/jasplakinolide: Bind and stabilize filaments,

phalloidin can be labeled with a
fluorescent dye, making it very
useful for staining actin filaments
in cells. Jas. is cell permeable
and can be used on live cells.