Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Definicin
Los anticuerpos son molculas de peso molecular aproximado de 150 KDa, pertenecientes al
grupo de las Inmunoglobulinas (Ig). Son molculas capaces de reconocer otras molculas, los
antgenos. La capacidad de reconocimiento de un anticuerpo radica en las secuencias variables
de sus cadenas proteicas, generadas por recombinacin de una serie de gen cassette en el
proceso de produccin de linfocitos B durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de estas
secuencias puede producir ms de un billn de secuencias diferentes.
La estructura bsica de un anticuerpo se esquematiza en la figura 1; est formado por dos cadenas
proteicas pesadas y dos ligeras, unidas por puentes disulfuro. Se dividen en varias clases que se
identifican segn el tipo de cadena pesada en: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.
Figura 1
Los elementos estructurales de los anticuerpos que les permiten su funcionalidad son:
Fc: corresponde al extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. Este fragmento est
constituido por la regin constante de la cadena pesada y es caracterstica de cada clase
de inmunoglobulinas. Es en sta regin donde radican las funciones efectores de la
molcula. La regin Fc es caracterstica de la especie.
Fab: corresponde al N-terminal de las cadenas pesadas y ligeras.
Interaccin antgeno-anticuerpo
La interaccin entre antgeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces dbiles, como puentes
de hidrgeno, fuerzas de Van der Wals e interacciones electrostticas e hidrofbicas. La suma de
todos estos enlaces genera una interaccin estable entre el lugar de unin del anticuerpo
(paratopo) y el lugar de unin del antgeno (eptope). Estas fuerzas son inversamente
proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que
eptope y paratopo deben presentar estructuras complementarias para obtener una energa de
unin suficiente como para resistir la disrupcin termodinmica. La suma de estas fuerzas de
atraccin y de repulsin se conoce como afinidad del anticuerpo.
Figura 2
Ahora bien, adems de su altsima especificidad, es necesario reconocer otros dos atributos que
han contribuido al xito de los AcMo como reactivos analticos. En primer lugar, los AcMo son
sustancias qumicamente bien definidas, su naturaleza y estructura se conoce en detalle y ello
permite la formulacin de preparaciones estables y facilita enormemente los procedimientos para
su conjugacin a trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioistopos, oro
coloidal, molculas electrn-densas (ferritina), etc. En segundo lugar, son reactivos susceptibles de
ser preparados en forma pura, en condiciones muy controladas y en grandes cantidades.
En lo concerniente a aplicaciones biomdicas, los AcMo de primera generacin han desplazado de
muchas aplicaciones a los anticuerpos policlonales, han permitido el desarrollo y avance de
numerosas y nuevas pruebas diagnsticas y son, en la actualidad, los reactivos de eleccin para
aplicaciones analticas, tanto en el mbito de lo mdico-clnico como en distintas reas de la
investigacin en biociencias. Lo anterior es cierto para todo aquello relacionado con pruebas de
laboratorio "in vitro", tanto en clnica como en investigacin.
Anticuerpos recombinantes
En la actualidad existe la tecnologa necesaria para la produccin de anticuerpos en ausencia de
inmunizacin del animal. Es la denominada tecnologa de los anticuerpos recombinantes. Los
recientes avances en la tecnologa gnica han facilitado en gran medida la manipulacin gentica,
produccin, identificacin y conjugacin de fragmentos de anticuerpos recombinantes,
obtenindose nuevos anticuerpos multivalentes y multiespecficos.
Como se mencion, los AcMo de segunda generacin, o anticuerpos recombinantes (AcR), son
molculas producidas empleando tcnicas de biologa molecular y ADN recombinante. Dicho de
otra manera, los AcR son generados a travs de la inmortalizacin de los genes que codifican a la
molcula de Ig, en lugar de inmortalizar la clula productora del Ac, como es el caso para los AcMo
de primera generacin.
La concepcin, el diseo y la ingeniera de molculas artificiales, basadas en Ig, se ha facilitado
enormemente gracias a dos caractersticas de estas protenas. A nivel gentico, los genes
estructurales que codifican las Ig se prestan para hacer el trabajo de biologa molecular. Estos
genes se organizan en la forma de exones discretos, los cuales corresponden a dominios
completos en la protena (Figura 2), encontrndose separados por regiones intrnicas. Resulta as,
por ejemplo, relativamente fcil manipular las secuencias intrnicas para aadir cambios que
permitan la introduccin en el gen de nuevas secuencias en lugares especficos, seleccionados
previamente, sin implicar riesgo alguno de alterar la secuencia codificadora presente en los
exones. De igual manera, a nivel proteico, la organizacin estructural-funcional de las Ig en la
forma de estos mdulos discretos, llamados dominios, en donde se encuentra almacenada la
informacin necesaria para realizar una funcin especfica, ha facilitado enormemente el logro de
estos objetivos. Sin embargo, un elemento adicional, que no se puede dejar de mencionar y que ha
tenido un impacto tremendo en el desarrollo de los AcR, lo constituyen, sin lugar a dudas, los
avances ocurridos en el campo de la biologa molecular, especialmente en lo relacionado con el
desarrollo de mtodos para la creacin de molculas de ADN recombinante basados en la reaccin
en cadena de polimerasa (PCR).
Anticuerpos quimricos
Un anticuerpo quimrico (AcQ) es una molcula artificial en la cual, las porciones constantes de las
cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables V H y VL son
obtenidas de un AcMo mrido (Figura 5). El objetivo perseguido con la construccin de un AcQ es
reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratn o rata, pero sin afectar la
especificidad del Ac. Es conocido que las porciones ms inmunognicas de la molcula de Ig estn
asociadas a la porcin constante de la molcula, en particular a la regin Fc. Al reemplazar estas
regiones por las equivalentes de origen humano se busca que la molcula resultante sea menos
"extraa" para los seres humanos y as facilitar su uso in vivo para la profilaxis y tratamiento de
enfermedades humanas (Figura 5). Adicionalmente, ya que la fisiologa, catabolismo y las
funciones efectoras de un Ac estn asociadas al fragmento Fc, los AcQ debieran comportarse en
forma ptima al ser administrados en humanos.
La tcnica de "quimerizacin" fue desarrollada por Morrison y col. y Boulliane a mediados de los
aos 80. El procedimiento implica la clonacin de los genes V H y VL mridos y la insercin de los
genes clonados en vectores de expresin eucariota a los que, previamente, se ha incorporado los
genes codificadores de la porcin constante de las cadenas pesada y liviana humanas. Estos
vectores son finalmente transfectados en forma estable en una lnea celular seleccionada. La
clonacin de los genes VH y VL se realiza mediante RT-PCR (Figura 5) utilizando como molde ARN
total o ARN mensajero (ARNm) obtenido de un hibridoma secretor de la especificidad de inters y
oligonucletidos complementarios a los extremos 3 y 5 de cada gen como iniciadores.
Una serie de vectores tipo "cassette" estn disponibles donde los genes V pueden ser fcilmente
clonados en el contexto de cualquier isotipo de cadena liviana y pesada humana. De forma similar,
avances en el campo de la tecnologa de transferencia de genes tambin han facilitado, y hecho
ms eficiente, el proceso de insercin de ADN forneo en diferentes lneas celulares eucariotas.
En distintos trabajos, se ha demostrado, que los AcQ, ensamblados apropiadamente, son capaces
de reconocer y ligar el antgeno y median, eficientemente, funciones efectoras como activacin de
complemento y reconocimiento de receptores Fc. Ms an, al compararse con los monoclonales
equivalentes, se pudo documentar una reduccin de la inmunogenicidad.
Fragmentos de anticuerpos
Mientras la expresin de AcQ se logra ms fcilmente en hospedadores eucariotas, tales como
clulas de mamfero o de plantas, la bacteria es el husped preferido para la produccin de
fragmentos recombinantes de Ac. En virtud de las ventajas indiscutibles que ofrece en cuanto a
manipulacin, transformacin, cintica de crecimiento y condiciones de fermentacin, E. coli es en
la actualidad el sistema de expresin ms accesible y amigable para la produccin de fragmentos
de Ac.
Existen dos tipos de fragmentos con la capacidad de combinarse al antgeno, stos son el Fv y el
Fab (Figura 2A). Versiones funcionales de Fv y Fab fueron producidos en forma recombinante, por
vez primera, en E. coli en 1988. Estos trabajos marcaron un hito en la produccin de AcR, pues en
ellos se demostr que la expresin en el espacio periplsmico de la bacteria permite la obtencin,
en forma relativamente sencilla, de molculas de Ac completamente funcionales y con un alto
rendimiento. Hasta ese momento, la mayor parte de los intentos persiguieron la expresin intracitoplasmtica, enfrentndose al problema del microambiente intracelular de la bacteria, el cual no
es apropiado para el procesamiento post-traduccin (plegamiento, formacin de puentes disulfuro y
glicosilacin de las cadenas polipeptdicas nacientes). Esto trae como consecuencia la formacin
de cuerpos de inclusin en el citoplasma de la bacteria que contienen la protena en una forma no
funcional y de los cuales la recuperacin es bastante ineficiente. La expresin de fragmentos de Ac
en el periplasma de la bacteria, por el contrario, sigue una va de ensamblaje similar a la que
ocurre durante la produccin de Ac convencionales en el retculo endoplsmico de una clula B.
Ello permite producir molculas activas en un pequeo volumen y en un compartimiento subcelular,
el cual est relativamente libre de enzimas proteolticas activas.
Los "minibodies" constituyen un caso interesante en el que dos grupos de molculas artificiales,
completamente diferentes, han sido designados con el mismo nombre. En 1994, Tramontano y col.
describieron el diseo de un polipptido artificial cuya estructura se basa en el dominio V de Ig ), al
cual bautizaron "minibody". Este pptido tiene una longitud de 61 residuos de aminocido, adopta
una conformacin tipo hoja beta plegada con dos asas que corresponden a regiones hipervariables
y exhibe capacidad para ligar determinantes antignicos. Adems, retiene otras caractersticas
deseables del dominio V de la molcula de Ac, como tolerancia a variabilidad de la secuencia en
regiones especficas de la protena y, en consecuencia, la capacidad para "evolucionar".
Protenas de fusin
La tecnologa de ADN recombinante ha hecho posible la concepcin, diseo y elaboracin de
molculas artificiales llamadas protenas de fusin, en las cuales, motivos estructurales y/o
funcionales, provenientes de dos o ms protenas naturales, son combinados. Varias
caractersticas hacen a la molcula de Ac un candidato ideal para la elaboracin de protenas de
fusin. En primer lugar, su diversidad y exquisita especificidad es deseable para la deteccin de un
nmero virtualmente ilimitado de molculas "target" con un riesgo marginal de reacciones cruzadas
o no especficas. En segundo lugar, sus propiedades biolgicas son atractivas para ciertas
aplicaciones en las que se requieren molculas recombinantes con propiedades especficas tales
como vida media, talla y funciones efectoras. Finalmente, la organizacin modular de los
anticuerpos, y los genes que los codifican, facilita grandemente el diseo y elaboracin de
molculas recombinantes hbridas.
De esta manera, no sorprende que exista un importante nmero de protenas de fusin donde se
combinan porciones de molculas de Ac diferentes, o con toxinas, interleuquinas, molculas de
adhesin, componentes de la matriz extracelular, hormonas, factores de crecimiento, etc.
Bibliografa
www.ub.es/biocel/wbc/tcnicas/anticuerpos
caibco.ucv.vital.vital Siet/Articulos/inmunologia/ArchivosHTML/SegGener.htm
10