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Anticuerpos

Definicin
Los anticuerpos son molculas de peso molecular aproximado de 150 KDa, pertenecientes al
grupo de las Inmunoglobulinas (Ig). Son molculas capaces de reconocer otras molculas, los
antgenos. La capacidad de reconocimiento de un anticuerpo radica en las secuencias variables
de sus cadenas proteicas, generadas por recombinacin de una serie de gen cassette en el
proceso de produccin de linfocitos B durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de estas
secuencias puede producir ms de un billn de secuencias diferentes.
La estructura bsica de un anticuerpo se esquematiza en la figura 1; est formado por dos cadenas
proteicas pesadas y dos ligeras, unidas por puentes disulfuro. Se dividen en varias clases que se
identifican segn el tipo de cadena pesada en: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.

Figura 1

Los elementos estructurales de los anticuerpos que les permiten su funcionalidad son:
Fc: corresponde al extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. Este fragmento est
constituido por la regin constante de la cadena pesada y es caracterstica de cada clase
de inmunoglobulinas. Es en sta regin donde radican las funciones efectores de la
molcula. La regin Fc es caracterstica de la especie.
Fab: corresponde al N-terminal de las cadenas pesadas y ligeras.

Antgenos, antigenicidad e inmunogenicidad


Virtualmente toda molcula ajena a un determinado organismo se comporta frente a ste como un
antgeno, Se pueden diferenciar dos caractersticas primordiales en un antgeno. Por una parte la
inmunogenicidad o capacidad que presenta una molcula para generar una respuesta inmune en
un organismo dado y la antigenicidad o particularidad del antgeno que hace que ste sea
reconocido por un determinado anticuerpo. Ambas propiedades pueden o no estar presentes en un
determinado antgeno. Molculas de pequeo tamao (haptenos o pptidos) son poco
inmunognicas y por ello se asocian a protenas transportadoras de alto peso molecular o 'carriers'
para inducir una respuesta inmune adecuada.

A la regin del antgeno reconocida por un anticuerpo se le denomina eptope o determinante


antignico. Un antgeno puede presentar un nmero variable de eptopes de estructura nica o
repetitiva. La complejidad estructural de las protenas favorece que stas presenten por lo general
un nmero elevado de eptopes distintos, mientras que los cidos nucleicos y los polisacridos,
dada su repetitividad estructural, poseen un nmero escaso de eptopes diferentes.

Interaccin antgeno-anticuerpo
La interaccin entre antgeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces dbiles, como puentes
de hidrgeno, fuerzas de Van der Wals e interacciones electrostticas e hidrofbicas. La suma de
todos estos enlaces genera una interaccin estable entre el lugar de unin del anticuerpo
(paratopo) y el lugar de unin del antgeno (eptope). Estas fuerzas son inversamente
proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que
eptope y paratopo deben presentar estructuras complementarias para obtener una energa de
unin suficiente como para resistir la disrupcin termodinmica. La suma de estas fuerzas de
atraccin y de repulsin se conoce como afinidad del anticuerpo.

Anticuerpos policlonales y monoclonales


Cuando se inmuniza un animal con un antgeno y se provoca una respuesta inmune aumenta
notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig especficas del antgeno empleado. Esto es
la consecuencia de la seleccin clonal de los limfocitos B que producen anticuerpos contra el
antgeno. Como hemos visto un antgeno puede presentar diferentes eptopos, y cada uno de ellos
ser reconocido por un clon de linfocitos B que producir molculas Ig con una secuencia
caracterstica. Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un nmero desconocido,
posiblemente elevado, de diferentes molculas de Ig especficas en mayor o menor medida de
nuestro antgeno. Se trata de un suero producido por la accin de sntesis de numerosos clones de
linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal.
El trmino anticuerpo monoclonal (AcMo) se usa para referirse a una poblacin de molculas de Ac
(anticuerpos), todas idnticas, las cuales consecuentemente, poseen todas la misma especificidad.
De lo anterior se desprende que, en una prueba analtica, el chance de obtener falsos positivos, es
decir, "reconocer lo que no es como si lo fuera" es mucho menor cuando se usan reactivos
monoclonales.
En 1975, en un trabajo que posteriormente les vali el premio Nobel, G. Kohler y C. Milstein
demostraron la posibilidad de producir AcMo mediante la fusin de linfocitos B con clulas
mielomatosas (clulas tumorales inmortales). Ellos demostraron que los hbridos resultantes de tal
fusin heredan la capacidad para crecer indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y
que, adems, es posible aislar del producto heterogneo de fusin aquellos hbridos secretores del
anticuerpo en el cual se est interesado. As nacieron los AcMo, posteriormente denominados de
primera generacin, para distinguirlos de los anticuerpos producidos mediante tcnicas de biologa
molecular y ADN recombinante, que han sido llamados de segunda generacin.
La tcnica original descrita por Kohler y Milstein (Figura 2) permite la obtencin de AcMo de ratn.
De manera resumida, el proceso se inicia con la inmunizacin de ratones de laboratorio (cepa
Balb/c) con el antgeno para el cual se desea producir los anticuerpos. Una vez que se tiene la
certeza del status inmune de estos animales (por lo general esto se establece tomando muestras
de sangre y examinando y/o cuantificando la presencia de anticuerpos especficos en el suero
inmune), los mismos son sacrificados y se obtiene el bazo, en el cual se encuentra una poblacin
numerosa de linfocitos B. A continuacin, los esplenocitos se fusionan con clulas mielomatosas
inmortales que son mantenidas en el laboratorio en la forma de lneas celulares gracias a su
capacidad para crecer indefinidamente en cultivo. La fusin, fenmeno poco comn en clulas

somticas, es facilitada mediante la adicin de agentes virales (virus Sendai), qumicos


(polietilenglicol) o fsicos (electricidad), de los cuales el ms usado es la sustancia qumica
denominada polietilenglicol (PEG). El producto de la fusin entre un esplenocito y una clula
mielomatosa es denominado hibridoma. Los hibridomas heredan caractersticas fenotpicas de
ambas clulas parentales de manera tal que son capaces de crecer indefinidamente y de producir
el anticuerpo codificado en los genes del esplenocito pariente. Obviamente, la poblacin de
hibridomas obtenida mediante una fusin, como la descrita anteriormente, es heterognea en
cuanto a los anticuerpos secretados por ella. Con el objeto de seleccionar los hbridos productores
del anticuerpo de inters se realiza clonacin celular. Esta clonacin consiste en sembrar los
hibridomas en microcultivos a una densidad celular tan baja que se garantiza que las clulas
integrantes de la poblacin obtenida en cada microcultivo sean todas idnticas, es decir, conformen
un clon. Los anticuerpos secretados por estas poblaciones clonales de hibridomas son anticuerpos
monoclonales. Utilizando un principio, similar al antes descrito, se han preparado reactivos
monoclonales provenientes de otras especies, inclusive humanos.

Figura 2
Ahora bien, adems de su altsima especificidad, es necesario reconocer otros dos atributos que
han contribuido al xito de los AcMo como reactivos analticos. En primer lugar, los AcMo son
sustancias qumicamente bien definidas, su naturaleza y estructura se conoce en detalle y ello
permite la formulacin de preparaciones estables y facilita enormemente los procedimientos para
su conjugacin a trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioistopos, oro
coloidal, molculas electrn-densas (ferritina), etc. En segundo lugar, son reactivos susceptibles de
ser preparados en forma pura, en condiciones muy controladas y en grandes cantidades.
En lo concerniente a aplicaciones biomdicas, los AcMo de primera generacin han desplazado de
muchas aplicaciones a los anticuerpos policlonales, han permitido el desarrollo y avance de
numerosas y nuevas pruebas diagnsticas y son, en la actualidad, los reactivos de eleccin para
aplicaciones analticas, tanto en el mbito de lo mdico-clnico como en distintas reas de la
investigacin en biociencias. Lo anterior es cierto para todo aquello relacionado con pruebas de
laboratorio "in vitro", tanto en clnica como en investigacin.

Anticuerpos recombinantes
En la actualidad existe la tecnologa necesaria para la produccin de anticuerpos en ausencia de
inmunizacin del animal. Es la denominada tecnologa de los anticuerpos recombinantes. Los
recientes avances en la tecnologa gnica han facilitado en gran medida la manipulacin gentica,
produccin, identificacin y conjugacin de fragmentos de anticuerpos recombinantes,
obtenindose nuevos anticuerpos multivalentes y multiespecficos.

Como se mencion, los AcMo de segunda generacin, o anticuerpos recombinantes (AcR), son
molculas producidas empleando tcnicas de biologa molecular y ADN recombinante. Dicho de
otra manera, los AcR son generados a travs de la inmortalizacin de los genes que codifican a la
molcula de Ig, en lugar de inmortalizar la clula productora del Ac, como es el caso para los AcMo
de primera generacin.
La concepcin, el diseo y la ingeniera de molculas artificiales, basadas en Ig, se ha facilitado
enormemente gracias a dos caractersticas de estas protenas. A nivel gentico, los genes
estructurales que codifican las Ig se prestan para hacer el trabajo de biologa molecular. Estos
genes se organizan en la forma de exones discretos, los cuales corresponden a dominios
completos en la protena (Figura 2), encontrndose separados por regiones intrnicas. Resulta as,
por ejemplo, relativamente fcil manipular las secuencias intrnicas para aadir cambios que
permitan la introduccin en el gen de nuevas secuencias en lugares especficos, seleccionados
previamente, sin implicar riesgo alguno de alterar la secuencia codificadora presente en los
exones. De igual manera, a nivel proteico, la organizacin estructural-funcional de las Ig en la
forma de estos mdulos discretos, llamados dominios, en donde se encuentra almacenada la
informacin necesaria para realizar una funcin especfica, ha facilitado enormemente el logro de
estos objetivos. Sin embargo, un elemento adicional, que no se puede dejar de mencionar y que ha
tenido un impacto tremendo en el desarrollo de los AcR, lo constituyen, sin lugar a dudas, los
avances ocurridos en el campo de la biologa molecular, especialmente en lo relacionado con el
desarrollo de mtodos para la creacin de molculas de ADN recombinante basados en la reaccin
en cadena de polimerasa (PCR).

de esta forma, es posible clonar regiones responsables de una especificidad de inters y


ensamblarla en la forma de un anticuerpo funcional en el contexto de, prcticamente, cualquier
clase o subclase de IG humana.
Los AcR constituyen, entonces, un conjunto bastante heterogneo de protenas artificiales en el
que se pueden distinguir dos grandes grupos. El primero incluye molculas completas de Ac,
similares a las conseguidas en forma natural, en las cuales estn presentes los dos elementos
estructurales, permitiendo as la funcionalidad de la molcula; esto es, las porciones Fab y Fc
(Figura 2a). Los Ac quimricos y humanizados son ejemplos representativos de este grupo. El otro

grupo est formado por un conjunto ms heterogneo de protenas noveles, basadas en la


estructura de las Ig. stas pueden encontrarse en la forma de entidades recombinantes autnomas
(fragmentos tipo Fab, Fv de cadena sencilla -scFv-, "diabodies", "triabodies", etc.), o como
protenas de fusin (molculas en las que se combina la porcin Fc o Fab con propiedades nuevas
provistas por una toxina, una enzima, un receptor celular, una citoquina, etc.).

Anticuerpos quimricos
Un anticuerpo quimrico (AcQ) es una molcula artificial en la cual, las porciones constantes de las
cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables V H y VL son
obtenidas de un AcMo mrido (Figura 5). El objetivo perseguido con la construccin de un AcQ es
reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratn o rata, pero sin afectar la
especificidad del Ac. Es conocido que las porciones ms inmunognicas de la molcula de Ig estn
asociadas a la porcin constante de la molcula, en particular a la regin Fc. Al reemplazar estas
regiones por las equivalentes de origen humano se busca que la molcula resultante sea menos
"extraa" para los seres humanos y as facilitar su uso in vivo para la profilaxis y tratamiento de
enfermedades humanas (Figura 5). Adicionalmente, ya que la fisiologa, catabolismo y las
funciones efectoras de un Ac estn asociadas al fragmento Fc, los AcQ debieran comportarse en
forma ptima al ser administrados en humanos.

La tcnica de "quimerizacin" fue desarrollada por Morrison y col. y Boulliane a mediados de los
aos 80. El procedimiento implica la clonacin de los genes V H y VL mridos y la insercin de los
genes clonados en vectores de expresin eucariota a los que, previamente, se ha incorporado los
genes codificadores de la porcin constante de las cadenas pesada y liviana humanas. Estos
vectores son finalmente transfectados en forma estable en una lnea celular seleccionada. La
clonacin de los genes VH y VL se realiza mediante RT-PCR (Figura 5) utilizando como molde ARN
total o ARN mensajero (ARNm) obtenido de un hibridoma secretor de la especificidad de inters y
oligonucletidos complementarios a los extremos 3 y 5 de cada gen como iniciadores.

Una serie de vectores tipo "cassette" estn disponibles donde los genes V pueden ser fcilmente
clonados en el contexto de cualquier isotipo de cadena liviana y pesada humana. De forma similar,
avances en el campo de la tecnologa de transferencia de genes tambin han facilitado, y hecho
ms eficiente, el proceso de insercin de ADN forneo en diferentes lneas celulares eucariotas.
En distintos trabajos, se ha demostrado, que los AcQ, ensamblados apropiadamente, son capaces
de reconocer y ligar el antgeno y median, eficientemente, funciones efectoras como activacin de
complemento y reconocimiento de receptores Fc. Ms an, al compararse con los monoclonales
equivalentes, se pudo documentar una reduccin de la inmunogenicidad.

Molculas recombinantes derivadas de anticuerpos


Hasta este punto, hemos tratado la produccin de molculas completas de anticuerpos
recombinantes. Adicionalmente, la biologa molecular ha sido utilizada para desarrollar molculas
noveles, basadas en la estructura de Ac, ya sea como entidades recombinantes autnomas o como
protenas de fusin. A continuacin, revisaremos los ejemplos ms significativos de este tipo de
molculas, las maneras como ellas fueron creadas y sus aplicaciones potenciales.

Fragmentos de anticuerpos
Mientras la expresin de AcQ se logra ms fcilmente en hospedadores eucariotas, tales como
clulas de mamfero o de plantas, la bacteria es el husped preferido para la produccin de
fragmentos recombinantes de Ac. En virtud de las ventajas indiscutibles que ofrece en cuanto a
manipulacin, transformacin, cintica de crecimiento y condiciones de fermentacin, E. coli es en
la actualidad el sistema de expresin ms accesible y amigable para la produccin de fragmentos
de Ac.
Existen dos tipos de fragmentos con la capacidad de combinarse al antgeno, stos son el Fv y el
Fab (Figura 2A). Versiones funcionales de Fv y Fab fueron producidos en forma recombinante, por
vez primera, en E. coli en 1988. Estos trabajos marcaron un hito en la produccin de AcR, pues en
ellos se demostr que la expresin en el espacio periplsmico de la bacteria permite la obtencin,
en forma relativamente sencilla, de molculas de Ac completamente funcionales y con un alto
rendimiento. Hasta ese momento, la mayor parte de los intentos persiguieron la expresin intracitoplasmtica, enfrentndose al problema del microambiente intracelular de la bacteria, el cual no
es apropiado para el procesamiento post-traduccin (plegamiento, formacin de puentes disulfuro y
glicosilacin de las cadenas polipeptdicas nacientes). Esto trae como consecuencia la formacin
de cuerpos de inclusin en el citoplasma de la bacteria que contienen la protena en una forma no
funcional y de los cuales la recuperacin es bastante ineficiente. La expresin de fragmentos de Ac
en el periplasma de la bacteria, por el contrario, sigue una va de ensamblaje similar a la que
ocurre durante la produccin de Ac convencionales en el retculo endoplsmico de una clula B.
Ello permite producir molculas activas en un pequeo volumen y en un compartimiento subcelular,
el cual est relativamente libre de enzimas proteolticas activas.

Single chain Fv (scFv)


1988 fue un ao importante para la produccin de AcR, no slo por la aparicin de los trabajos en
los que se describi la expresin periplsmica como una va eficiente para la produccin de AcR en
bacterias. Dos artculos fueron publicados ese mismo ao en los cuales se report la produccin en
E. coli de una versin recombinante del fragmento Fv en la que los dominios V H y VL se
encontraban unidos fsicamente a travs de un "linker" peptdico, pequeo y flexible. Este "linker"
(~ 15 aminocidos) tiene la longitud y flexibilidad necesarias para permitir el arreglo espacial
adecuado de los dominios VH y VL, generndose un Fv funcional (Figura 6B). Tales construcciones
fueron denominadas Fv de cadena sencilla (del ingls single chain Fv, scFv), son ms estables, en
comparacin con el Fv convencional, y conservan la capacidad de reconocer y ligar anfgenos.
Posteriormente, scFv han sido expresados en otros hospedadores adems de E. coli, como la

levadura P. pastoris, hongos filamentosos, clulas de insecto y clulas de mamfero, convirtindose


en uno de los formatos preferidos para producir fragmentos recombinantes de Ac con capacidad
para ligar antgenos, para preparar protenas de fusin en las que se desea especificidad
antignica y para construir genotecas de Ac.

Diabodies, anticuerpos biespecficos, triabodies y minibodies


Como se trata de molculas que poseen un solo sitio de combinacin al antgeno (monovalentes),
los fragmentos Fab y scFv pudieran ser de uso limitado para ciertas aplicaciones en las cuales se
requiere una afinidad elevada. Versiones multivalentes de estos fragmentos debieran presentar una
afinidad funcional o avidez mayor. Adems, AcR que combinen dos especificidades distintas lucen
particularmente atractivos para ciertas aplicaciones como inmunodiagnstico e inmunoterapia.
Diversas estrategias han sido evaluadas para producir dmeros o polmeros de AcR. En muchas de
ellas se utiliza el entrecruzamiento por medios qumicos de dos fragmentos individuales,
anteriormente, preparados y purificados por separado. Esto tiene obvios problemas en cuanto a
rendimiento, purificacin del fragmento deseado y cantidad de tiempo y trabajo empleado.
Una estrategia ms efectiva, basada en tcnicas de ADN recombinante, ha sido desarrollada. Esta
estrategia se basa en la construccin scFv, slo que la longitud del "linker" es menor en
comparacin la del scFv original. Esta reduccin del "linker" (a tan solo 5 aminocidos) imposibilita
la formacin de un Fv funcional entre dos dominios VH y VL en una misma molcula. Ello conduce a
la interaccin de dos molculas de scFv , formndose un dmero, el cual posee dos sitios de
combinacin con el antgeno (Figura 6B). Si la especificidad de los dominios VH y VL es la misma, el
producto obtenido es un homodmero bivalente conocido como "diabody" (la traduccin ms
apropiada de "diabody" pudiera ser "fragmento bivalente").
Ahora bien, utilizando el mismo formato, es posible producir molculas recombinantes con dos
especificidades diferentes. Por ejemplo, si se desea combinar en una misma molcula las
especificidades A y B de dos anticuerpos diferentes, se disean dos construcciones tipo scFv. Una
de ellas tendr la forma VHA-VLB y la otra VHB-VLA (ambas pueden encontrarse en el mismo
vector). En forma similar a como ocurre con los "diabodies", los polipptidos producidos a partir de
estas construcciones son incapaces de formar scFv funcionales de manera individual. No obstante,
s son capaces de aparearse apropiadamente para generar heterodmeros en donde ambas
especificidades A y B son restauradas y se encuentran fsicamente asociadas (Figura 6B). Estas
molculas artificiales han sido bautizadas con el nombre de anticuerpos biespecficos.
Si el pptido que sirve de "linker" entre los dominios V H y VL es eliminado completamente y ambas
regiones son expresadas como un polipptido continuo, entonces, el resultado es la formacin de
un trmero funcional con capacidad para ligar tres determinantes antignicos (Figura 6B). A estos
fragmentos se les ha designado "triabodies". De manera anloga al "diabody", quizs la mejor
traduccin de "triabody" sea "fragmento trivalente".

Los "minibodies" constituyen un caso interesante en el que dos grupos de molculas artificiales,
completamente diferentes, han sido designados con el mismo nombre. En 1994, Tramontano y col.
describieron el diseo de un polipptido artificial cuya estructura se basa en el dominio V de Ig ), al
cual bautizaron "minibody". Este pptido tiene una longitud de 61 residuos de aminocido, adopta
una conformacin tipo hoja beta plegada con dos asas que corresponden a regiones hipervariables
y exhibe capacidad para ligar determinantes antignicos. Adems, retiene otras caractersticas
deseables del dominio V de la molcula de Ac, como tolerancia a variabilidad de la secuencia en
regiones especficas de la protena y, en consecuencia, la capacidad para "evolucionar".

Protenas de fusin
La tecnologa de ADN recombinante ha hecho posible la concepcin, diseo y elaboracin de
molculas artificiales llamadas protenas de fusin, en las cuales, motivos estructurales y/o
funcionales, provenientes de dos o ms protenas naturales, son combinados. Varias
caractersticas hacen a la molcula de Ac un candidato ideal para la elaboracin de protenas de
fusin. En primer lugar, su diversidad y exquisita especificidad es deseable para la deteccin de un
nmero virtualmente ilimitado de molculas "target" con un riesgo marginal de reacciones cruzadas
o no especficas. En segundo lugar, sus propiedades biolgicas son atractivas para ciertas
aplicaciones en las que se requieren molculas recombinantes con propiedades especficas tales
como vida media, talla y funciones efectoras. Finalmente, la organizacin modular de los
anticuerpos, y los genes que los codifican, facilita grandemente el diseo y elaboracin de
molculas recombinantes hbridas.
De esta manera, no sorprende que exista un importante nmero de protenas de fusin donde se
combinan porciones de molculas de Ac diferentes, o con toxinas, interleuquinas, molculas de
adhesin, componentes de la matriz extracelular, hormonas, factores de crecimiento, etc.

Bibliografa

www.ub.es/biocel/wbc/tcnicas/anticuerpos
caibco.ucv.vital.vital Siet/Articulos/inmunologia/ArchivosHTML/SegGener.htm

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