FOTOLUMINISCENCIA

MOLECULAR

Los procesos luminiscentes se han observado en la

naturaleza desde tiempos ancestrales. Por ejemplo, el
brillo luminiscente en el ocano en la noche y bajo
ciertas condiciones dinoflagelados (algas)
Fotos de lagos
de Gippsland
(Australia) con
proliferacin
masiva del alga
Noctulina
scintillans
(dinoflagelado
inofesivo para la
salud).

Fenmenos luminiscentes
tambin se aprecian en
distintas variedades de
hongos, insectos y
organismos marinos

Corales fluorescentes
Lucirnaga
Medusa Aequorea victoria

El trmino luminiscencia
lo introdujo por primera vez el
fsico e historiador cientfico
alemn Eilhard Wiedemann
(1852-1928) en el ao 1888

Luminescencia es la emisin de luz de una

sustancia (no producida por calor)

Clasificacin
Incandescencia

Luz a partir de energa calrica. Ej:

sol
Fotoluminiscencia: fluorescencia y
fosforescencia (radiacin
electromagntica)

Luminiscencia

Quimio(bio)luminiscencia (reaccin
qumica)
Electroluminiscencia (corriente
elctrica)
Radioluminiscencia (energa
nuclear)

Fotoluminescencia
Fluorescencia
El fenmeno de la
fluorescencia nos
rodea en la vida
cotidiana: sistemas
de iluminacin tipo
fluorescentes o luces
de nen, agua tnica
que brilla con color
turquesa bajo la luz
negra, tintas,
pinturas y joyas
fluorescentes, etc.

Fotoluminescencia
Fluorescencia
Cmo reconocemos que estamos observando fluorescencia?
Luz
incandenscente

Luz
ultravioleta

Pintura
fluorescente

Los pigmentos
sensibles a la luz UV
absorven la luz
negra y devuelven
al sistema luz visible.

El tiempo de vida de fluorescencia es muy corto y se observar

fluorescencia durante la irradiacin con una luz adecuada

Fotoluminescencia
Fosforescencia
Las pinturas
fosforescentes se
usan tambin con
mucha frecuencia
en joyera,
juguetera,
adornos, etc.

Fotoluminescencia
Fosforescencia
Cmo reconocemos que estamos observando fosforescencia?

Las molculas fosforescentes emiten luz visible que persiste an

en ausencia de la luz de excitacin.
Luz incandescente Oscuridad

Oscuridad

El tiempo de vida de fosforescencia es ms largo, y veremos la seal

despus que la luz se apag

Fotoluminescencia
La diferencia macroscpica entre los dos principales
tipos
de
luminiscencia
(fluorescencia
y
fosforescencia) se relaciona con los tiempos del
proceso de emisin
Fluorescencia: tipo de luminiscencia donde la
sustancia absorbe radiacin y la re-emite
prcticamente en forma instantnea. La fluorescencia
cesa dentro de los 105 seg despus que la fuente de
energa se apaga.
Fosforescencia: persiste por un tiempo despus que
la molcula se expuso a la luz.

Fotoluminescencia
Relajacin noradiante

Absorbancia

S2

S2

Estados
electrnicos
excitados S1

S1

So

So

Estado fundamental

Luminescencia

regla de Kasha

Nivel
excitado
de
menor
energa

Singlete: Todos los

electrones en la molcula
estn apareados
Triplete: Un par de
electrones estn
desapareados

singlete

singlete*

triplete*

Diagrama de Jablonski
Diagrama parcial de niveles de energa de una
molcula fotoluminiscente
Relajacin vibracional (10-12 - 10-15 s)
Conversin interna
S2

Cruce de sistemas

S1

T1

E
N
E
R
G
I
A

Absorcin

F
(10-8 10-9 s)

(10-15 s)

S0

Conversin
externa
P

Diagrama de Jablonski
Disociacin

A veces, los fotones

absorbidos
tienen
energa suficiente para
promover a la molcula
a un estado de alta
energa vibracional que
produce la ruptura del
enlace. La molcula se
disocia y no fluoresce

Diagrama de Jablonski
Pre-disociacin

Se alcanza un nivel
vibracional de mucha
energa a travs de
conversin interna. El
enlace se rompe y la
molcula disociada
no fluoresce

RESUMEN DE LOS PROCESOS DE RELAJACIN

Relajacin vibracional
Conversin interna
Relajacin no
radiante

Conversin externa
Cruce de sistemas
Disociacin
Predisociacin

Relajacin
radiante

Fluorescencia
Fosforescencia

Relajacin no radiante
Relajacin vibracional
Transferencia de exceso de E vibracional de la
molcula al solvente. Se refleja en un ligero incremento
de la temperatura del medio.

Conversin interna
Relaciona 2 estados electrnicos de = multiplicidad
(S2S1, T2T1, etc). Se solapan niveles vibracionales de
= E pero distintos niveles electrnicos.

Conversin externa
Choques de molculas excitadas con molculas de
solvente o vecinas.

Relajacin no radiante
Cruce de sistemas
Transicin entre estados de distinta multiplicidad de
espn.

Disociacin
Excitacin directa a un estado vibracional alto,
produciendo la ruptura del enlace.

Predisociacin
Alcance de un estado vibracional alto a travs de
conversin interna.

Relajacin radiante
Fluorescencia
Emisin de radiacin electromagntica a
partir del estado excitado singlete S1*
Fosforescencia
Emisin de radiacin electromagntica a
partir del estado excitado triplete T1*

Factores que influyen en la seal

fluorescente
tipo de transicin
concentracin

estructura
solvente

LUMINISCENCIA
EN SOLUCIN

temperatura

pH

apagadores
qumicos

Factores que influyen en la seal

fluorescente

tipos de transicin

Compuestos aromticos,
estructuras con dobles enlaces
conjugados, anillos aromticos
fusionados. Rigidez. Sustituyentes

estructura

C
H2

fluoreno

bifenilo

Factores que influyen en la seal

fluorescente
Solvente

Temperatura

Efectos generales (ndice

de refraccin, constante
dielctrica) y especficos
Su aumento, disminuye la
intensidad de fluorescencia
por aumento de probabilidad
de conversin externa

Factores que influyen en la seal

fluorescente
La fluorescencia de compuestos
aromticos con propiedades cidobase es generalmente pH-dependiente

pH
H

H
N

H H
N

anilina

Apagadores
qumicos

+
N

N+

ion anilinio

Apagamiento dinmico y esttico

BANDAS DEL ESPECTRO

F
EXCITACIN

EMISIN

Corrimiento de
Stokes

S1

S1

So

So

BANDAS DEL ESPECTRO

F

RAYLEIGH
F
RAMAN

RAYLEIGH
2orden

RAMAN
2orden

S1

S0
RAYLEIGH

RAMAN

ANLISIS CUANTITATIVO

= No fotones emitidos/No fotones absorbidos

= IF/IA
IF = IA =
= (Io IT) =
= Io (1 IT/Io) =
= Io (1 e-2.303bC) = Io (1 e-kbC)

ANLISIS CUANTITATIVO

IF = Io (1 e-kbC)
Recordando que:
e-x

2
3
x
x
x
= 1+
+
1! 2! 3!

si x es muy pequeo: e-x = 1-x

IF = Io (1 1 + kbC) = Io kbC
K

IF = KC

ANLISIS CUANTITATIVO
IF vs C (a bajas concentraciones de analito)
F

IF = KC
C
Anlisis cuantitativo directo: se determina la cc de
una especie a partir de la seal que ella produce.
Anlisis cuantitativo indirecto: se determina la cc de
una especie a partir del apagamiento que produce
en otro compuesto fluorescente (grfico de SternVolmer)

ESPECTROFLUORMETRO

ESPECTROFLUORMETRO

monocromador
fuente
atenuador
del haz

fotomultiplicador
de referencia

M
monocromador
fotomultiplicador
de muestra
amplificador
dispositivo de lectura

OBTENCIN DE ESPECTROS DE EXCITACIN

Y EMISIN
F

EXCITACIN

EMISIN

1) Obtencin del espectro de absorbancia para

determinar la longitud de onda de absorcin
2) Fijar el monocromador de excitacin a esta y
obtener el espectro de emisin
3) Fijar el monocromador de emisin a la
seleccionada en el punto 2 y obtener el espectro
de excitacin.

CAUSAS DE DESVO DE LINEALIDAD

IF = Io (1 e-kbC)
Si kbC es grande (absorbancia > 0.02)
(kbc)2 (kbc)3 ...
IF = Io [kbc
- ]
+
2
6
F

Trmino lineal
Lineal+cuadrtico+cbico
Lineal+cuadrtico
C

FILTRO INTERNO
Afecta la linealidad de la curva de calibrado y el
perfil de los espectros de excitacin y/o emisin
Producido por el propio analito (alta cc)
- Variacin de potencia de luz incidente en el trayecto
- Autoapagamiento
- Autoabsorcin

Producido por otra sustancia

- Sustancia que absorbe en la regin de de excitacin
o emisin del analito

FILTRO INTERNO

Baja concentracin:
emisin uniforme

Alta concentracin: la
emisin disminuye en el
trayecto de la luz incidente

Excitacin

Deteccin
de la
emisin

Deteccin
de la
emisin

Curva de calibracin de sulfato de

quinina
F

10

ppm
100

200

300

Linealidad

Trmino cbico o
mayor

Filtro interno

ppm