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Mycobacterium tuberculosis.
Las mycobacterias en general pueden variar mucho en su morfologa, desde formas
cocoides pequeas a largos filamentos, M. tuberculosis suele tener una morfologa
caracterstica, bacilo delgado de forma recta o ligeramente curvada en frotis teidos, y su
tamao suele ser de 1-4 micras de largo por 0,3-0,5 micras de ancho. Ocasionalmente,
forma ramificaciones verdaderas que se observan en cultivos enriquecidos y en frotis de
ganglios linfticos gaseosos.
Son bacilos no formadores de esporas, sin flagelos ni cpsula. La estructura celular de M.
tuberculosis consta de una gruesa pared, separada de la membrana celular por el espacio
periplsmico, con cuatro capas. La ms interna es el glicopptido o peptidoglicano con
molculas de N-acetilglucosamina y cido-N-glucolilmurmico (en lugar del habitual Nacetilmurmico) con cortas cadenas de alanina. Esta capa es el esqueleto de la bacteria que
le da forma y rigidez. Externamente, hay otras 3 capas compuestas, una por polmeros de
arabinosa y galactosa, otra formada por cidos miclicos (que son cidos grasos derivados)
y otra superficial formada por lpidos como los sulfolpidos, el cord factor, llamado as por
su aparente asociacin con la forma acordonada con que se agrupan las mycobacterias
virulentas, y los micsidos que son al igual que el anterior glicolpidos. No difiere del resto
de las bacterias en cuanto al citoplasma y el ADN nuclear. Las mycobacterias son aerobios
estrictos y no crecen en ausencia de oxgeno.
La M. tuberculosis se desarrolla de forma adecuada en medios simples que contienen una
fuente de carbono, una de nitrgeno e iones de metales esenciales entre ellos hierro y
magnesio. Para su cultivo, se requiere un medio ms complejo que contenga una base de
patata-huevo o una base de agar-suero. Los bacilos tuberculosos tienen un crecimiento muy
lento incluso en condiciones ptimas y requiere de 10 a 20 das de incubacin a 37C.
Aunque la proliferacin puede tener lugar a un pH que oscila entre 6 a 7.6, el pH ptimo de
crecimiento es de 7.
Las mycobacterias son ms resistentes a la desinfeccin con productos qumicos que otros
microorganismos no formadores de esporas, probablemente como consecuencia de su
contenido en lpidos. Son sensibles al calor hmedo y son destruidos por las temperaturas
de pasteurizacin.
Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los
extendidos, con movimientos de vaivn, hasta que observe que se desprenden los primeros
vapores blancos. No calentar con mechero.
En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.
En el trmino de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisin de
vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a
sus lpidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse
mal.
Con una pinza, levantar cuidadosamente la lmina portaobjetos desde el extremo ms
cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presin, con un frasco o un grifo.
Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solucin de
fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado tambin la parte posterior.
Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y as evitar diluir los reactivos que
se utilizarn a continuacin.
Decoloracin:
Cubrir la totalidad del extendido con solucin decolorante y dejar actuar aproximadamente
3 minutos.
Enjuagar con abundante agua a baja presin.
Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes ms gruesas del extendido a lo
sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cmulos rojos o coloracin rosada
intensa, volver a cubrir con solucin decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y
enjuagar nuevamente.
Coloracin de fondo:
Cubrir todo el extendido con solucin de azul de metileno.
Dejar actuar durante un minuto.
Enjuagar las lminas en ambas caras con agua a baja presin y limpiar parte inferior con
un algodn si ha quedado coloreada.
Observar si las lminas conservan la numeracin clara y visible. Si no es as volver a
numerarlas.
Seguir un recorrido en lneas rectas, sistemtico para recorrer el extendido evitando repetir
la lectura de algunos campos.
Observar la calidad del extendido y de la coloracin. Si no fuesen buenas, repetir
nuevamente la baciloscopia de esa muestra.
Si se observan anormalidades, identificar las Causas.
Contar el nmero de campos que ha ledo y el nmero de BAAR que ha identificado.
Para calcular el promedio de BAAR encontrados por campo, sumar el total de BAAR
contados y dividir ese total por el nmero de campos observados. Cuando los bacilos se
presentan agrupados, una estimacin aproximada del nmero de bacilos presentes en el
cmulo es suficiente para calcular este promedio.
Los campos ledos deben ser campos microscpicos tiles. Se considera campo
microscpico til a aquel en el cual se observan clulas bronquiales (leucocitos, clulas
ciliadas) o fibras mucosas, que aparecen teidos de azul.
El extendido preparado tal como fue descrito permite observar 100 campos microscpicos
en lnea recta.
Un laborotorista experimentado completa la lectura de 100 campos en aproximadamente
cinco minutos.
Al finalizar la lectura, girar el revolver de los objetivos y retirar el portaobjetos de la
platina.
Comprobar el nmero de identificacin y registrar el resultado.
Antes de examinar el portaobjetos siguiente, limpiar suavemente la lente de inmersin con
un trozo de pauelo de papel absorbente. Esto evita la transferencia de material al siguiente
frotis que se va a leer.
LOS BACILOS MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Y LA COLORACIN DE ZIEHL
NEELSE
Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y las que no, se observan de
color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste.