Laboratorios de Microfotnica

Departamento de Inmunologa y Oncologa

Centro Nacional de Biotecnologa - CSIC
Madrid (Spain)

PROTOCOLOS PARA MICROSCOPA

1. INMUNOTINCIN
El objetivo de ste, y el resto, de los protocolos, es dar una idea general de la tcnica, de sus posibilidades
y limitaciones. Las condiciones que comentamos son completamente orientativas, y aunque pueden
funcionar perfectamente en la mayora de las situaciones, cada experimento necesitara ajustar los
parmetros correspondientes.
Se asume que el lector tiene unos conocimientos elementales de los conceptos y tcnicas bsicos de
biologa celular.
PREPARACIN DE LAS CLULAS.
Las muestras se obtienen por cortes de tejidos o de cultivos celulares. Las clulas cultivadas se siembran
sobre lminas cubreobjetos o directamente sobre portas preparados a una densidad de unas 100000-30000
por ml (un pocillo de placa de 24) y se dejan adherir al menos 6-8 horas antes de procesarlas. Los cortes
de tejidos se procesan como se describe en los protocolos de histologa.
Fijacin
Dependiendo de la molcula que deseemos estudiar, las condiciones de fijacin varian ampliamente.
Los dos fijadores ms empleados son los aldehidos, sobre todo el formaldehido (FA), y el etanol.
El fijador ms versatil es el formaldehido diluido al 3,7% en PBS (de no indicarse otra cosa el pH del
PBS es 7,4). Se prepara diluyendo la solucin comercial de formol (viene con un 37% de pureza) 1:10 en
PBS. Algunos usuarios prefieren utilizar el parafolmaldehido (viene en polvo) al 4% en PBS que da unos
resultados idnticos al formol pero es mucho ms dificil de preparar y debe almacenarse a 20C. El FA
fija las clulas manteniendo la permeabilidad de la membrana, si se desea acceder a moleculas
intracelulares es preciso permeabilizar la membrana con un detergente (como el triton) o un divolvente de
lpidos (como la acetona). El etanol, si permeabiliza las membranas y permite que nos ahorremos ese
paso.
Una fijacin estandar se hace:
1. Retirar el medio de cultivo (solo para clulas cultivadas).
2. Lavar dos veces con PBS (30 s cada vez)
3. Aadir la solucin de fijador y dejar 5 minutos. Para muestras gruesas, dejar 10 min.
4. Lavar dos veces, 5 minutos, con PBS.
5. Permeabilizar si es necesario. La mejor opcin es el Tritn X-100 al 0,05 % en PBS cinco minutos.
Es posible emplear otros detergentes (como el Tween-20) pero no son tan eficientes y a las
concentraciones necesarias en el proceso pueden alterar los resultados finales. Tras permeabilizar
lavar con PBS durante 10 minutos.
Bloqueo
En el interior de la clula existen molculas que pueden unirse inespecficamente a proteinas (como los
anticuerpos) por interacciones no inmunes y dar falsos positivos. Para evitarlos se procede a la
neutralizacin de este tipo de interacciones por medio de la solucin de bloqueo.
Existen diferentes soluciones de bloqueo tanto comerciales como artesanas: Albmina bobina BSA en
PBS, leche descremada, sueros de cabra o conejo diluidos en PBS o incluso el suero bobino fetal, etc. La
ms empleada es PBS con un 1% de BSA y 10 % de suero de cabra al que se aade un 0,01 % de tritn
X-100 en el caso de que sean clulas permeabilizadas.
Autofluorescencia
Las clulas son autofluorescentes debido a que existen productos del metabolismo celular que son
fluorescentes (el principal de ellos es el Flavin adenin dinucletido), pero cuando se fijan con aldehidos la
autofluorescencia aumenta, llegando a ser espectacular en el caso del glutaraldehido. Esta fluorescencia
inespecfica puede, tanto llegar a ser considerada como un falso positivo, como enmascarar seales
especficas dbiles. La autofluorescencia debe ser eliminada en la medida de lo posible.

Para inhibir la autofluorescencia podemos realizar un lavado de las muestras recin fijadas, durante 10
minutos, con una de las dos soluciones ms empleadas:
1. Borohidruro de sodio al 0.1 % (recin preparado) en PBS pH 8.0.
2. Cloruro amnico 50 mM en PBS pH 8.0.
TECNICA DE INMUNODETECCION DIRECTA.
Se utilizan anticuerpos especficos contra antgenos concretos que vienen ya marcados con el fluorocromo
correspondiente (u otro marcador) en su presentacin comercial.
1. Diluir el anticuerpo en tampn de bloqueo a la concentracin sugerida por el fabricante.
2. Incubar 30 minutos en atmsfera saturada de humedad, a la temperatura que indique el fabricante. .
Si no se indica nada suele ser suficiente 30 minutos a temperatura ambiente en atmsfera saturada de
humedad ya que que prcticamente todos los anticuerpos trabajan bien en un rango entre 18 y 37C.
No obstante, la temperatura ideal es 4C (hay menos uniones inespecficas) y si el anticuerpo
funciona a esa temperatura deberamos incubar en fro.
3. Lavar tres veces con PBS (con 0,01 % de tritn X-100 si las clulas estaban permeabilizadas), 10
minutos cada vez.
TECNICA DE INMUNODETECCION INDIRECTA
Es muy comn que los anticuerpos contra los principales marcadores de superficie ya vengan conjugados
con fluorocromos y otros marcadores (peroxidasa, fosfatasa, etc.), pero muchos anticuerpos, sobretodo si
son poco comunes, no estn disponibles en formas conjugadas, para poder visualizar la unin de stos a
su correspondiente antgeno es preciso recurrir a marcajes indirectos.
Un marcaje indirecto consiste en utilizar una molcula conjugada con un marcador (fluorocromo u
enzima) que reconoce al anticuerpo primario de modo que se detecta la presencia de ste y, de ese modo
indirecto, la de la molcula que reconoci. Vamos a describir la tcnica de inmunodeteccin por
inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos conjugados con fluorocromos, aunque existen otras, como
la avidina-biotina, que se explican en otro lugar.
Anticuerpo primario.
1. Lavar las muetras 10 min con PBS para retirar los restos del inhibidor de autofluorescencia
2. Diluir el anticuerpo primario, en solucin de bloqueo, a la concentracin adecuada.
3. Incubar en atmsfera hmeda a la temperatura y tiempo sugeridos por el suministrador del
anticuerpo. De no indicarse nada, hacerlo a temperatura ambiente 30 minutos.
4. Retirar el anticuerpo y lavar tres veces con PBS (con 0,01 % de tritn X-100 si las clulas estaban
permeabilizadas), 10 minutos cada vez.
Anticuerpo secundario.
1. Preparar la dilucin sugerida por el fabricante (en PBS), aadir a las muestras e incubar 1 hora.
2. Retirar el anticuerpo y lavar tres veces con PBS.
PREPARACION DE LAS MUESTRAS PARA OBSERVACION
Almacenamiento
Guardar a 4 hasta el momento de la observacin.
Si las clulas no se van a observar en un plazo corto (72 h) deberan ser refijadas 10 minutos con FA al
3,7% en PBS y luego retratadas para bloquear la autofluorescencia.
Montaje para la observacin
Colocar 20 ul de medio de montaje entre porta y cubre. Existen diferentes medios de montaje, el ms
empleado para una observacin rpida es el glicerol al 75% en PBS.