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RESPONSABLES:
o Anabel Bermeo Snchez.
DOCENTE:
o Ing. Klever Granda Mora, Mg
Sc.
LOJA -ECUADOR
2015
TABLA DE CONTENIDOS
TABLA DE CONTENIDOS...................................................................................... 2
1. TEMA: Determinacin de la calidad del ADN genmico de una bacteria procariota por
espectrofotometra y electroforesis................................................................................ 4
2.
INTRODUCCION............................................................................................ 4
3.
REVISIN DE LITERATURA...........................................................................5
3.1.
Gentica Bacteriana...................................................................................... 5
3.1.1.
3.2.
Extraccin de ADN...................................................................................... 5
3.2.1.
Etapas de la tcnica................................................................................ 5
3.2.2.
Mtodos ms utilizados...........................................................................6
3.2.3.
MATERIALES Y MTODOS...........................................................................11
4.1.
4.2.
Materiales................................................................................................ 11
4.3.
4.3.1.
Extraccin del ADN genmico de una bacteria procariota mediante, Mini bacteria kit
INVITROGEN................................................................................................ 12
5.
RESULTADOS Y DISCUSIN...........................................................................16
5.1.
5.2.
Objetivo 3: caracterizar cuantitativamente el ADN genmico mediante la tcnica de
electroforesis...................................................................................................... 16
6.
CONCLUSIONES.......................................................................................... 18
7.
RECOMENDACIONES.................................................................................. 18
8.
LITERATURA CITADA.................................................................................. 19
9.
ANEXOS...................................................................................................... 20
9.1.
9.2.
9.3.
1. TEMA: Determinacin de la calidad del ADN genmico de una bacteria procariota por
espectrofotometra y electroforesis
2. INTRODUCCION
La gentica como tal es la rama de la biologa que se encarga de estudiar los genes y
mecanismos que regulan la transmisin de caracteres hereditarios Por otro lado en lo que
respecta a gentica bacteriana, su importancia recae bsicamente en que los primeros
estudios y caracterizacin del genoma se realiz en clulas bacterianas; generando como tal
bases y principios para ser aplicados en organismos ms complejos (UMMC 2014).
En la actualidad la gentica bacteriana abre paso a millones de investigaciones de diferente
carcter, por ejemplo, en el campo agronmico y de zootecnia para conocer y mejorar las
caractersticas de las diferentes especies que en estas se involucran, en el campo de la
medicina, para identificar y aislar aquellos genes de inters en el desenvolvimiento de la
salud y la prevencin y finalmente pero no menos importante en el campo ambiental, para
la generacin de productos o mecanismos ms amigables con la naturaleza, que implican el
uso directo de las caractersticas de estas clulas bacterianas y su traspaso o aislamiento de
ADN a nuevos organismos, para que adquieran las mismas peculiaridades.
Por lo tanto, con el fin de conocer la variacin gentica existente entre individuos, especies
o poblaciones as como sus patrones y procesos ecolgicos-evolutivos, y conocer a su vez
sus capacidades degradativas, acumulativas, curativas, entre otras, es necesario abordar
mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN que proporcionan informacin sobre
la variacin allica la distincin entre individuos. Por lo general se involucran tcnicas de
PCR (Reaccin continua en Polimerasa) y secuenciacin, sin embargo dichas tcnicas
empiezan con la extraccin de ADN, la misma que consiste en el aislamiento y purificacin
para conocer las caractersticas fsico qumicas de una molcula (Alejos 2014).
El aislamiento a su vez se consigue por electroforesis, proceso encaminado a la separacin
de fragmentos de ADN y ARN en funcin de su tamao, los mismos que mediante tincin
reflejan el contenido de cidos nucleicos de una muestra, consiguiendo una estimacin de
concentracin y entereza (Fierro 2014). Es por esto y dada la importancia de la prctica a
desarrollarse; en el presente trabajo de laboratorio se han planteado los siguientes objetivos.
Objetivo general
-
Objetivos especficos
-
Extraer el ADN de una bacteria procariota mediante, Mini bacteria kit INVITROGEN.
Caracterizar cuantitativamente el ADN genmico mediante espectrofotometra.
Caracterizar cualitativamente el ADN genmico mediante la tcnica de electroforesis.
3. REVISIN DE LITERATURA
3.1. Gentica Bacteriana
3.1.1. Genoma bacteriano: estructura
El cido desoxirribonucleico (ADN), macromolcula encargada de codificar toda la
informacin necesitada para programar las actividades de las clulas incluyendo la
reproduccin, el metabolismo y otras funciones especializadas, est constituida por dos
filamentos de nucletidos. Cada uno contiene un fosfato, un azcar de 5 carbones (2desoxirribo) y una de cuatro bases nitrogenadas: adenina, citosina, timina guanina.
El fosfato y el azcar componen la espina dorsal de cada filamento de ADN, mientras que
las bases son responsables de sostener los dos filamentos juntos va enlaces del hidrgeno
en una estructura llamada la hlice doble. El orden de las bases en un filamento de la ADN
contiene la informacin gentica cifrada. Toda la ADN encontrada en un organismo se
refiere colectivamente como el genoma. El genoma humano se abarca de 23 pares de
cromosomas lineares, y de aproximadamente 3000 megabases (Mb) de ADN, mientras que
el genoma de Escherichia coli consiste en un solo cromosoma de la circular del Mb (Rocha
2002).
3.2. Extraccin de ADN
Principio. Proceso mediante el cual hay separacin del ADN de un ser vivo de los dems
elementos celulares a travs del aislamiento del mismo. Se requiere del rompimiento de la
membrana celular con la finalidad de acceder al ncleo de la clula; una vez en el
citoplasma se debe cribar la membrana nuclear para dejar libre al ADN, y por ltimo es
necesario protegerlo de enzimas que puedan degradarlo (DNAsas) para retirarlo
completamente (Rocha 2002).
La extraccin bsicamente consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN,
basndose en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. En donde los grupos fosfato
al estar cargados negativamente y ser polares (ADN una carga neta negativa) permite contar
con una fuerte tendencia a repelerse, lo que permite a su vez, disolver al ADN en soluciones
acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molcula. A su vez le permite unirse a
molculas y matrices inorgnicas cargadas positivamente (Alejos 2014).
3.2.1. Etapas de la tcnica
Las etapas que generalmente que se siguen en un proceso de extraccin de ADN, es el
mismo, las variaciones por otro lado se denotan en el mtodo a emplearse y los kit o
programas a utilizarse (figura 1). Sin embargo entre las fases necesarias para que se d una
correcta extraccin y purificacin del ADN mediante un procedimiento qumico se tiene:
1. Lisis de las clulas. Las sales caotr- picas ayudan a romper la estructura
tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos
consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es
necesaria a menudo para eliminar las membranas.
Por otro lado con el pasar de los aos Alejos (2014) indica que se han diseado distintos
protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, as como
6
Mtodo tradicional. Desarrollado en los aos 50, utiliza solventes orgnicos para
separar a las protenas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por
precipitacin con etanol. Estos mtodos requieren preparar soluciones y la extraccin
puede tomar desde unas horas hasta varios das por los numerosos pasos que deben
realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas
principales: homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de protenas y lpidos,
precipitacin y redisolucin del ADN.
Mtodo moderno. Involucra el uso de kits y extractores automticos robotizados con la
mnima intervencin de operadores, que permitan mejorar la precisin, obtener
resultados reproducibles y reducir el tiempo de extraccin, en particular cuando se
requiere procesar una gran cantidad de muestras. Da como resultado un ADN ntegro y
sin contaminantes, esencial para tener xito en la obtencin de datos genticos.
de ADN genmico o de doble cadena, una densidad ptica equivale a 50 ug/ml (Leninger
1975). Se debe considerar el factor de dilucin para obtener la concentracin en
nanogramos/microlitro (ng/ul).
En el caso de algunos equipos como el espectrofotmetro Nanodrop, no es necesario diluir
la muestra y el equipo nos proporciona directamente la concentracin en ng/ul.
Considerando que para una reaccin de PCR se requieren de 10 a 200 ng debemos obtener
al menos, 5 ng/ul de ADN en cada muestra, si se recuperaron 50 ul, el rendimiento neto de
la extraccin sera de 0.25 ug. Concentraciones menores dificultan la estandarizacin de la
PCR u otras tcnicas.
Para estimar la pureza del ADN se considera la proporcin de la absorbancia a 260 nm y
280 nm.
Una proporcin de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor
indican la presencia de protenas. Una segunda valoracin de la pureza de cidos nucleicos
es la proporcin 260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la
relacin es menor indican la presencia de contaminantes como carbohidratos o fenol (Alejo
2014).
Cualificacin del ADN por electroforesis
Generalidades. La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la
movilidad de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente
las separa por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se use
(Morales 2010).
Tipos. La electroforesis abarca algunos tipos como:
-
Etapas de la tcnica. Segn Fierro (2014) la tcnica de electroforesis est dada por una
serie de siete pasos los mismos que son:
-
Una de las ventajas de utilizar mtodos tradicionales es su bajo costo, as como un alto
rendimiento. Sin embargo, en ocasiones el material obtenido est fragmentado. Estos
mtodos son susceptibles de contaminacin, variacin y errores por los mltiples pasos
de manipulacin.
El rendimiento de los kits depende del tipo de tejido y la cantidad de muestra inicial, as
como de la capacidad de unin de la membrana. La matriz permite capturar
selectivamente al ADN haciendo posible obtener un extracto de alta pureza con
molculas ntegras; al tiempo que se reduce el nmero de pasos en la extraccin y se
disminuye la posibilidad de contaminacin con ADN o ARN exgeno, con lo que se
garantiza la obtencin de resultados confiables.
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4. MATERIALES Y MTODOS
4.1. Ubicacin poltica y geogrfica
El Laboratorio del Centro de Biotecnologa de la Direccin de Investigaciones de la
Universidad Nacional de Loja se encuentra ubicado en la Ciudad Universitaria Guillermo
Falcon Espinosa, La Argelia, Avenida Reinaldo Espinoza y Avenida Pio Jaramillo
Alvarado. En cuanto a sus coordenadas geogrficas
Latitud: 3 59 0 S,
Longitud: 79 12 0 W
Centro de biotecnologa
4.2. Materiales
En la presente prctica de laboratorio se emplearon los siguientes materiales.
Materiales de laboratorio: los materiales a emplearse estn divididos de acuerdo al
procedimiento que se realiz.
Extraccin del ADN genmico (Mini bacteria kit INVITROGEN): reactivos: RNasa,
buffer de resuspensin (R4), buffer de lisis (L14), buffer de unin (B8), buffer de lavado
(W12), buffer de elucin (E5), lisosima, Proteinasa K; instrumentos de laboratorio: Bao
Mara, incubadora, centrifugadora, micropipetas (50, 100 y 1000 l), vortex, Perlas
Magneticas del Kit ChargeSwitch, gradilla magntica, tubos de 5ml, tubos eppendorf.
Proceso de espectrofotometra: reactivos: ADN diluido en el buffer (ADN de ganglios);
instrumentos de laboratorio: toallas clean tissue micropipeta (1000 l), Nanodrop
(espectofotmetro).
Proceso de electroforesis: reactivos: Syber safe, agarosa grado molecular, TBE 10X y
agua destilada, azul de bromofenol; instrumentos de laboratorio: micropipetas, puntas para
micropipetas, tubos tipo eppendorf, cmara de electroforesis horizontal, peines para las
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bandejas, bandeja para la preparacin del gel, fuente de poder, probetas de 50mL, 100mL y
1000mL, botella de vidrio con ms de dos veces el volumen de la solucin de agarosa a
preparar, guantes de ltex, guantes para calor.
Materiales de oficina: cuaderno de apuntes, computador, red, rotulador.
4.3. Mtodos analticos y estadsticos
Con el fin de cumplir los objetivos establecidos en la prctica se ha credo conveniente
establecer y detallar la metodologa que se sigui en base a los objetivos ya planteados. La
metodologa que se emple la explic el Ing. Klever Granda, Mg, Sc y la Dra. Loidy
Zamora.
4.3.1. Extraccin del ADN genmico de una bacteria procariota mediante, Mini
bacteria kit INVITROGEN.
Para el aislamiento del ADN genmico el procedimiento se rigi bsicamente a seis pasos,
tal como se detalla a continuacin (anexo 1):
1. Antes de comenzar
a) Adicionar el contenido RNasa A al buffer de resuspensin (R4). Mezclarlo bien. Marcar
el frasco para saber que se ha adicionado la RNasa A. Almacenar el buffer con RNasa a
4C.
b) Adicionar 5 l de lisosima fresca (50 mg/ml) a 100 l de buffer de resuspensin con
RNasa A para cada muestra.
2. Lisis de clulas bacterianas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
2. Adicionar 40 l de los tubos de Perlas Magnticas a las muestras del paso 10 del
protocolo anterior.
3. Pipetiar progresivamente para mezclar sin formar burbujas.
4. Adicionar 300 l del buffer de unin (B8) y mezclar usando 5-6 pulsos cortos en el
vrtex.
5. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto.
6. Ubicar las muestras en la gradilla magntica durante 1 minuto o hasta que las perlas
magnticas hayan formado un pellet.
7. Sin sacar los tubos de la gradilla magntica, pipetear el sobrenadante cuidando no
mover el pellet de perlas magnticas pegado a la gradilla magntica.
8. Procede inmediatamente a lavar el ADN.
4. Lavado del ADN
1. Sacar los tubos de la gradilla magntica conteniendo el pellet.
2. Adicionar 1 ml del buffer de lavado (W12) a cada muestra y pipetear gentilmente 3
veces sin formar burbujas.
3. Ubicar las muestras en la gradilla magntica durante 1 minuto o hasta que las perlas
magnticas hayan formado un pellet.
4. Sin sacar los tubos de la gradilla magntica, pipetear el sobrenadante cuidando no
mover el pellet de perlas magnticas pegado a la gradilla magntica.
5. Sacar los tubos de la gradilla magntica conteniendo el pellet.
6. Proceder inmediatamente a elidir el ADN.
5. Eluyendo (liberando) el ADN
1. Sacar los tubos de la gradilla magntica conteniendo el pellet.
2. Adicionar 200 l del buffer de elucin (E5) a cada muestra y pipetear gentilmente 5-10
veces para mezclar sin formar burbujas.
3. Incubar a 55C durante 5 minutos.
4. Ubicar las muestras en la gradilla magntica durante 1 minuto o hasta que las perlas
magnticas hayan formado un pellet.
5. Sin sacar los tubos de la gradilla magntica, transferir cuidadosamente el sobrenadante
conteniendo el ADN a un nuevo tubo eppendorf. Tener cuidado y no mover el pellet
para que no se adicionen perlas magnticas al ADN. Si el sobrenadante presenta un
color caf, repetir los pasos 4 y 5 de esta seccin del protocolo.
6. Almacenamiento del ADN
a) Para uso inmediato almacenar a 4C, de lo contrario almacenar a -20C.
4.3.2. Caracterizacin cuantitativa del ADN genmico mediante espectrofotometra.
Para determinar la caracterizacin cuantitativa del ADN genmico, se utiliz una muestra
de ADN de ganglios, dado que el ADN extrado no fue cuantitativamente representativo. La
metodologa a desarrollarse fue (anexo 2):
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5. RESULTADOS Y DISCUSIN
Los resultados de la prctica al igual que la metodologa fueron planteados y deducidos en
base a los objetivos del presente trabajo.
5.1. Objetivo 2: caracterizar
espectrofotometra.
cuantitativamente
el
ADN
genmico
mediante
Relacin**
1,91
1,88
1,90
1,90
1,82
1,92
1,89
17
6. CONCLUSIONES
En el presente trabajo se ha llegado a las siguientes conclusiones:
La extraccin de ADN genmico, permite identificar las caractersticas de un
organismo, pudiendo identificar su gnero y especie.
La caracterizacin cuantitativa refleja la pureza del ADN, en cuanto a la concentracin
y relacin que esta presente; en el trabajo prctico las siete muestras podan
considerarse como puras.
La caracterizacin cualitativa permite estimar la integridad y la concentracin de ADN,
por el despliegue de bandas como resultado; en esta ocasin nicamente una muestra se
consider como ADN ntegro.
La caracterizacin cuantitativa y cualitativa tuvieron diferentes resultados pese a que las
muestras eran las mismas, debido a la falta de calibracin del espectofotmetro
Nanodrop 2000.
7. RECOMENDACIONES
Como algunas consideraciones en cuanto al comportamiento y actividades en el laboratorio
se han planteada las siguientes recomendaciones.
Al momento de realizar la extraccin de ADN, se debe tener cuidado con la formacin
del pellet y su posible contacto con este con instrumentos como las puntas de la
micropipeta, ya que perjudicara la prctica como tal y sus resultados.
Los equipos deben estar bien calibrados, para que los procesos y resultados como tal
sean confiables.
Es necesario utilizar proteccin manual al momento de realizar el proceso de
electroforesis, ya que el Syber Safe exhibe tambin un efecto mutagnico, pero que es
menor al de bromuro de etidio.
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8. LITERATURA CITADA
Alejos, P; Aragn, M; Cornejo, A. 2014. Extraccin y Purificacin del ADN. Universidad
Nacional
Autnoma
de
Mxico
(en
lnea)
Disponible
en:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf (consultado julio 29,
2015).
Fierro, F. 2014. Electroforesis de ADN. Departamento de biotecnologa. Divisin de
ciencias Biolgicas y de la Salud. Universidad Autnoma Metropolitana. Mxico (en lnea)
Disponible
en:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf
(consultado julio 29, 2015).
Institute for Health and Consumer Protection. 2003. Anlisis de la Presencia de Organismos
Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos: Extraccin y Purificacin de ADN.
Espaa
(en
lnea)
Disponible
en:
http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf
(consultado julio 29, 2015).
Morales, I. 2010. Electroforesis. Universidad Central de Quito-Ecuador (en lnea)
Disponible
en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Exposicion_electroforesis_5087.pdf
(consultado julio 29, 2015).
Radstrom, P. 2009. La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR. Mitos y
realidades. Newsletter Microbial (en lnea) Disponible en: http://www.microbialsystems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf (consultado julio 29, 2015).
Rocha, P. 2002. Teora y prctica para la extraccin y purificacin del ADN de palma de
aceite. Laboratorio de marcadores moleculares. Bogot-Colombia (en lnea) Disponible en:
http://www.geocities.ws/pedrojrocha/pr/rocha23_3.pdfADNpdf (consultado julio 29, 2015).
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9. ANEXOS
9.1. Anexo 1. Fotografas de la extraccin de ADN genmico.
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F
FFigura 4. Procedimiento por espectrofotometra
9.3. Anexo 3. Fotografas de la caracterizacin cualitativa del ADN por electroforesis.
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