1.

9 APLICACIONES DE LA BIOLOGA MOLECULAR

Los conocimientos generados y las tcnicas empleadas por la ingeniera gentica
y la biologa molecular, han tenido un importante alcance en el desarrollo de otras
reas como: la medicina, ciencias forenses, la agricultura, la ganadera, la
farmacia, entre otras. En la agricultura los alimentos transgnicos y en la
ganadera (la mejora de las razas) derivan de los organismos genticamente
modificados. En el campo de la medicina los adelantos en diagnsticos clnicos
ms precisos y en tiempos cortos, se deben al uso de las ltimas tcnicas y
equipo empledo en biologa molecular generando incluso la rama de biomedicina,
en est area tambin se trabaja la terapia gnica con protenas recombinantes y
uno de los proyectos ms ambiciosos de los ltimos aos la secuenciacin del
Genoma Humano. Otra importante rea es la gentica forense que se conoce
como una especialidad que engloba la aplicacin de las tcnicas de biologa
molecular para anlisis del DNA y la relacin con el poder judicial.

1.9.1. ESTUDIO EN LA EXPRESIN GENTICA MEDIANTE GENES

REPORTEROS.
Los genes reporteros son secuencias que codifican para protenas de simple
deteccin. Se usan para reemplazar productos gnicos difciles de medir y
determinar actividad promotora.

Genes reporteros

CAT (cloramfenicol acetiltransferasa).

Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.
La deteccin se da por cromatografa en capa delgada o extraccin
orgnica.
GAL (-galactosidasa).
Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo que se
cuantifica.
SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase).
Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible.
LUC (luciferasa).
Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un
luminmetro o una cmara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay
diferentes luciferasas dispoinibles.
GFP (green fluorescent protein).
Fluoresce por irradiacin con UV se observa con microscopio de
fluorescencia.

Ejemplo del diseo bsico de un gen reportero utilizando la

Luciferasa-Dual.
-El estudio comienza por clonacin de los elementos de regulacin del gen
de inters de la luciferasa.

Los elementos reguladores pueden incluir los posibles promotores,

promotores desconocidos, porciones del promotor o respuesta conocida y

elementos potenciadores.

- Esto se puede lograr usando variedad de plsmidos, incluyendo los

vectores pGL4.

Unin con el

plsmido.

-El plsmido con los elementos reguladores se transfecta en la lnea celular

de eleccin.

-En este momento, un plsmido de control que contiene luciferasa de

Renilla es co-transfectada.

Este plsmido
un promotor
constitutivamente activo y proporciona una diferencia para comparar
los resultados en contra. El uso de este plsmido de control reduce el
error debido a las variaciones experimentales, tales como la
transfeccin y la manipulacin de clulas.
-El ARNm es transcrito por los promotores activos una vez que el plsmido
se encuentra en el ncleo.

ARNm

-Si el promotor no es activo o tiene muy poca actividad, entonces nada o

muy poco ARNm ser producido.

-Un promotor fuerte generar mayor cantidad de ARNm.

-Las vas de transduccin de seales necesitan ser activadas con elementos

reguladores para inducir una expresin adecuada.

Todos llegan aqu

-Cada ARNm reportero se traduce en protena activa.

-La cantidad de luciferasa depende de la actividad del promotor o elemento

regulador que se est estudiando.

La

produccin de luciferasa de Renilla es independiente del promotor experimental o

actividad del elemento regulador.

La luciferasa de Renilla puede ser medida fcilmente utilizando el

Dual-Luciferase (aparato con positos donde se pone el agente reactivo
del mismo), y posteriormente leyendo los resultados en un
luminmetro.

1.9.2. RATONES KNOCK-OUT, KNOCK IN Y TRANSGNICOS

RATN KNOCKOUT

Un ratn knockout o ratn KO, es un ratn modificado por una ingeniera gentica
para que uno o ms de sus genes estn inactivados mediante una tcnica llamada
gen knockout.
Su propsito es comprender el papel de un gen que ha sido secuenciado pero del
que se desconoce su funcin o se conoce de forma incompleta. Inactivando el gen
y estudiando las diferencias que presenta el ratn afectado, los investigadores
pueden inferir la probable funcin de ese gen.
Noquear la actividad de un gen proporciona informacin sobre la tarea normal de
ese gen. Los seres humanos compartimos genes con el ratn. Por tanto, observar
las caractersticas de un ratn knockout proporciona informacin que se puede
utilizar para comprender mejor como un gen semejante puede provocar o
contribuir a la aparicin de enfermedades en humanos.
Muchos de estos ratones modelo reciben el nombre del gen que se ha inactivado
en ellos.

NOTA: esto es lo mismo que viene en las diapos, pero explicado mas
sencillo, igual si quieren comparar y checar .
RATN KNOCKOUT CONDICIONADO
Los ratones knockout condicionados poseen una modificacin en el gen de inters
que podramos denominar silenciosa. Dicha modificacin consiste en un

mecanismo interruptor que provoca la inactivacin del gen que se est estudiando
solo en un tejido o en un tipo celular concreto.
En la actualidad, los sistemas knockout condicionados estn basados en la
recombinacin especfica del sitio; en el caso de estos knockout condicionados, el
sistema de recombinacin ms conocido y utilizado es el llamado Cre/loxP.
Este sistema de recombinacin procede de un virus que infecta bacterias, en este
caso el bacterifago P1. La belleza del sistema radica, en su simplicidad: una
recombinasa llamada Cre, que reconoce dos secuencias cortas iguales que
flanquean el fragmento gentico a recombinar, llamados sitios loxP. Utilizando un
simil familiar, la recombinasa sera el equivalente a una tijera y a un pegamento al
mismo tiempo, mientras que los sitios loxP seran las seales donde hay que
cortar y pegar en la secuencia gentica.

Para formar ratones condicionados, se necesita un ratn que tenga la

recombinasa Cre y un ratn que tenga fragmento gentiico loxP. Bueno pues estas

se combinan, llegando la protena Cre a hacer un corte donde se desea modificar

el fragmento gentico. En este caso se removi uno de los fragmentos loxP del
ratn y la funcin de dicho gen fue interrumpida. A partir de ese momento, todas
las clulas llevan una copia del gen modificado loxP X, una copia del gen X
knockout y genes Cre.

RATN KNOCKIN
Esta tecnologa se basa en la insercin o reemplazo de una secuencia de DNA en
un sitio definido del genoma del animal, utilizando, al igual que la tecnologa de
KO, la recombinacin homloga en clulas.

La humanizacin de ratones mediante la tecnologa KI, se ha convertido en una

herramienta muy importante para evaluar in vivo la eficacia, perfiles
farmacocinticos y toxicolgicos de inumerables drogas. La tecnologa KI tambin
se utiliza para introducir mutaciones puntuales y modelar enfermedades humanas
en el ratn, inactivar regiones esenciales de una protena, como el dominio
cataltico de una quinasa, o el sitio de unin a drogas de la protena blanco.

Les pondr un ejemplo ya explicado, cualquier cosa me preguntan.

RATN TRANSGNICO
Un ratn transgnico es un ratn al que se le ha modificado su ADN y por tanto su
informacin gentica. Frecuentemente estas modificaciones consisten en la
introduccin o en la eliminacin de un gen (fragmento de ADN que codifica la

informacin para producir una protena). Mientras que insertando un gen de otro
organismo podemos obtener ratones que producen protenas que antes no
producan, eliminando un gen podemos averiguar qu funcin desempeaba la
protena que codificaba.
Una de las tcnicas ms conocidas en el campo de la biomedicina y en la biologa
del desarrollo es la microinyeccin. Un gen de un organismo puede insertarse en
un vector, que sirve como vehculo de transporte, y ser introducido en una
bacteria. Sucesivas divisiones de la bacteria darn como resultado una poblacin
(un clon) que porta el vector con el gen que hemos introducido. Existen mtodos
sencillos de extraccin de estos vectores. El gen puede ser liberado de nuevo de
estos vectores empleando enzimas de restriccin que catalizan el corte del ADN
en puntos con secuencias especficas. Obtenemos de este modo un gran nmero
de copias del gen que queremos insertar en el ratn. El ADN lineal que incluye el
gen a estudiar es entonces inyectado en uno de los proncleos (generalmente el
masculino, por ser de mayor tamao) de un ovocito de ratn fecundado, en una
fase anterior a la fusin pronuclear. El paso posterior es la fusin de los
proncleos. El fragmento de ADN inyectado puede integrarse al azar en el ADN
del ratn. El desarrollo del embrin conducir a la obtencin del ratn transgnico
en aquellos casos en los que se den las condiciones adecuadas.
Nota: Les dejar un video donde explica exactamente lo que les acabo de
poner. Tambin pueden compararlo con la imagen del profe, es lo mismo .